FI91072B - Menetelmä terapeuttisesti aktiivisten heterosyklisten peptidien valmistamiseksi ja niiden valmistuksessa käyttökelpoisia välituotteita - Google Patents

Description

91072

Menetelmä terapeuttisesti aktiivisten heterosyklisten peptidien valmistamiseksi ja niiden valmistuksessa käyttökelpoisia välituotteita 5 Elastaasityyppiä olevien proteolyyttisten entsyy mien aktiivisuuden on todettu liittyvän useisiin patologisiin tiloihin, esimerkiksi niveltulehdukseen ja keuhko-laajentumaan. Elastaasientsyymin farmakologisen inhiboin-nin olettaisi estävän tai parantavan siihen liittyvää 10 patologista tilaa. EP-patenttihakemuksessa julkaisunumero 189 305 A2 on kuvattu trifluorimetyyliketonisubstituoitu-ja peptidijohdannaisia, jotka ovat ihmisen leukosyyttie-lastaasin (HLE) inhibiittoreita. HLE-inhibiittoreina aktiivisia peptidejä on kuvattu myös FI-patenttihakemukses-15 sa 841601 ja 862434. Kaikissa FI-hakemuksessa 841601 kuvatuissa yhdisteissä on aldehydipääteryhmä (-CH0) ja kaikissa FI-hakemuksessa 862434 kuvatuissa yhdisteissä on a pääteyrhmänä difluoriketoniryhmä -COCF2R .

Tämä keksintö koskee menetelmää oksatsoli-, bent-20 soksatsoli-, tiatsoli- tai bentsotiatsolipääteryhmän omaavien peptidien valmistamiseksi, jotka ovat ihmisen leukosyyttielastaasin (HLE) inhibiittoreita, minkä johdosta ne ovat hyödyllisiä milloin tahansa, kun halutaan tällaista inhibitiota kuten esimerkiksi tutkimuksen vä-25 lineinä farmakologisissa, diagnostisissa ja vastaavissa tutkimuksissa ja kudosrappiosairauksien, kuten esimerkiksi keuhkolaajentuman, hoitamisessa imettäväisillä. Keksintö koskee myös välituotteita, jotka ovat hyödyllisiä näiden heterosyklisten peptidien synteesissä.

30 Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetaan yh disteitä, joilla on kaava (I) r*_l_a-n<0t,n"TSi''*V'( V (I) 35 I I A X/ 2 4 . 5 jossa R on ryhmä, jolla on kaava R -SC^-NH-CO-, R5.S02.NH.C0.NH- tai CF3.S02.NH-, joissa R5 on (l-6C)al-kyyli, fenyyli tai halogeenifenyyli; L on para-fenyleeni; A on karbonyyli; X on happi tai rikki; ja Q on orto-feny-5 leeni, jossa voi olla substituenttina hydroksi, halogeeni, trifluorimetyyli, (1-4C)alkoksi, hydroksi(1-3C)alkyy-li, karboksi, syaani, karbamoyyli tai [(1-4C)alkoksi]kar-bonyyli, tai Q on cis-vinyleeni, ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja.

10 Tässä selityksessä ja patenttivaatimuksissa käyte tään seuraavia määritelmiä ellei toisin ole kuvattu:

Halogeeni on fluori, kloori, bromi tai jodi.

Alkyyli, tarkoittaa sekä suoraketjuisia että haarautuneita ryhmiä.

4 .

15 Ryhmät R , L ja Q voivat sisältää kiraalikeskuk- sia. Keksinnön mukaisesti valmistettuihin yhdisteisiin sisältyvät kaavan I mukaiset yhdisteet, joissa R :n, L:n ja Q:n sisältämät kiraalikeskukset omaavat R- ja/tai S-konf iguraatiot.

20 Kaavan I mukaisia yhdisteitä voidaan pitää tripep- tidoyyliheterosykleinä. Yleensä on parhaina pidetyillä kaavan I mukaisilla yhdisteillä luonnossa esiintyvä L-aminohapon konfiguraatio kiraalikeskuksissa, jotka on identifioitu merkinnällä * kaavassa I. Alla kuvatuissa 25 synteesimenetelmissä voidaan saada diastereomeeriseos seurauksena siitä, että läsnä on merkinnällä # kaavassa I identifioidussa kiraalikeskuksessa sekä R- että S-konfi-guraation omaavia tuotteita. Vaikka nämä diastereomeerit voidaan erottaa, ei ole välttämätöntä tehdä niin. Parhai-30 na pidetään sellaisia yhdisteitä, joilla on S-konfiguraa-tio merkinnällä # identifioidussa kiraalikeskuksessa.

Kuten alan asiantuntijat ymmärtävät, ei eri isomeerien aktiivisuus ole samanlainen, ja sen vuoksi käytetään mieluimmin hyväksi aktiivisempaa isomeeriä. Keksin-35 nön mukaisesti valmistettuihin yhdisteisiin kuuluvat sekä diastereomeerien seokset että aktiiviset S- ja R-isomee-rit.

Il 91072 3

Erityinen merkitys Q:ssa mahdollisesti olevalle substituentille (l-4C)alkoksi on esimerkiksi metoksi, etoksi, propoksi, isopropoksi, 2-metyylipropoksi tai -t-butoksi. Erityinen merkitys mahdolliselle Q:ssa olevalla 5 substituentille [(1-4C)alkoksi]karbonyyli on esimerkiksi metoksikarbonyyli, etoksikarbonyyli, isopropoksikarbonyy-li tai t-butoksikarbonyyli. Erityinen merkitys mahdolliselle Q:ssa olevalle substituentille halogeeni on esimerkiksi fluori, kloori tai bromi.

10 Erityinen merkitys Q:ssa mahdollisesti olevalle (1-3C)hydroksialkyylisubstituentille on esimerkiksi hyd-roksimetyyli, 2-hydroksietyyli tai 1,1-dimetyylihydroksi-metyyli.

. . . . . . 5

Erityisiä merkityksiä (1-6C)alkyyliryhmälle R

15 ovat esimerkiksi metyyli, etyyli, propyyli, isopropyyli, t-butyyli tai 4-metyylipentyyli.

Keksinnön I mukaisiin yhdisteisiin kuuluvat alaryhmät, joissa N:n, Q:n ja X:n sisältävä heterosyklinen rengasjärjestelmä on: 20 (a) bentsoksatsoli, kun X on happi ja Q on edellä määritelty o-fenyleeni; (b) oksatsoli, kun X on happi ja Q on cis-vinylee- ni; (c) bentsotiatsoli, kun X on rikki ja Q on edellä 25 määritelty o-fenyleeni; ja (d) tiatsoli, kun X on rikki ja Q on cis-vinylee- ni.

Erityisiä kaavan I mukaisia yhdisteitä on kuvattu oheisissa esimerkeissä. Parhaina pidettyjä yhdisteitä 3 0 ovat: (i) [4—[(4-kloorifenyyli)sulfonyyliaminokarbonyy-li]bentsoyyli]-L-valyyli-N-[1-(5-hydroksibentsoksatsol-2-yy1i)karbonyy1i-2-metyy1ipropyy1i]-L-proliiniamidi; (ii) [4-[(4-kloorifenyyli)sulfonyyliaminokarbonyy- 35 li]bentsoyyli]-L-valyyli-N-[1-[5-(aminokarbonyyli)bentso- ksatsol-2-yyli]karbonyyli-2-metyylipropyyli]-L-proliini-amidi; ja 4 (iii) [4-[(4-kloorifenyyli)sulfonyyliaminokarbo-nyyli]bentsoyyli]-L-valyyli-N-[1-[5-(hydroksimetyyli)-bentsoksatsol-2-yyli]karbonyyli-2-metyylipropyyli]-L-pro-liiniamidi.

5 Kaavan I mukaisten yhdisteiden suolat käsittävät farmaseuttisesti hyväksyttäviä emäsadditiosuoloja, kuten esimerkiksi sellaisia, jotka on saatu käyttäen alkalime-tallihydroksideja, kuten natriumhydroksidia, alkalimetal-likarbonaatteja ja -bikarbonaatteja, maa-alkalimetalli- 10 hydroksideja ja orgaanisia amiineja. Sellaisia suoloja voidaan valmistaa liuottamalla heterosyklinen ketoni veden ja veteen sekoittuvan orgaanisen liuottimen seokseen, lisäämällä emäksen vesiliuos ja ottamalla suola talteen vesiliuoksesta.

15 Kaavan I mukaiset yhdisteet voidaan valmistaa me netelmillä, jotka ovat analogisia rakenteeltaan saman tapaisten heterosyklisten ja peptidiyhdisteiden valmistamista koskevassa kemiassa tunnetuille menetelmille. Keksinnön mukaiselle menetelmälle kaavan I mukaisen yhdis- 20 teen valmistamiseksi on tunnusomaista, että (A) hapetetaan vastaava alkoholi, jolla on kaava (III) R*— l.—A—N (Γ f* /* n-T-n I 0/ \ I ui* \/ (III) H H H0 * (B) kaavan I mukaisen yhdisteen saamiseksi, jossa 4 5 .

30 R on R SO-NHCO-, vastaava yhdiste, jolla on kaava (IV) R—l—A—Ν'!!-/4 "VS1 ΤΓΛ V (iv>

35 « I, Ä V

II

91072 5 7 , ... . .

jossa R on karboksi (jota yhdistettä seuraavassa nimitetään kaavan IV mukaiseksi hapoksi) , saatetaan regoimaan kaavan R ·SO^'NH^ mukaisen sulfonamidijohdannaisen kanssa dehydratointiaineen läsnä ollessa tai kaavan IV mukaisen 5 hapon reaktiivinen johdannainen saatetaan reagoimaan kaa- van R · SC>2 ‘ NHj mukaisen sulfonamidi johdannaisen tai sen suolan kanssa tai ... 4 (C) kytketään happo, jolla on kaava R -L-COOH, tai sen reaktiivinen johdannainen aminoketonin kanssa, jolla 10 on kaava (V) 15 i o / \ I ΓΛ/* h \y A o x/ (v) 20 minkä jälkeen haluttaessa kaavan I mukainen yhdiste, jossa Q on hydroksiryhmällä substituoitu orto-fenyleeni, dealkyloidaaan vastaava kaavan I mukainen yhdiste, jossa Q on (1-4C)alkoksiryhmällä substituoitu orto-fenyleeni, ja/tai haluttaessa farmaseuttisesti hyväksyttävä suola 25 saatetaan kaavan I mukaisen yhdisteen happomuoto reagoimaan emäksen kanssa, joka antaa fysiologisesti hyväksyttävän kationin.

Menetelmässä (A) käyttökelpoisiin menetelmiin kuuluu oksalyylikloridin, dimetyylisulfoksidin ja tertiääri-30 sen amiinin käyttö (katso Marx, M. et ai., J. Org. Chem., 49, 788-793 (1984)); etikkahappoanhydridin ja dimetyylisulfoksidin käyttö; dimetyylisulfoksidin, l-(3-dimetyyli-aminopropyyli)-3-etyylikarbodi-imidihydrokloridin ja di-kloorietikkahapon käyttö esimerkiksi tolueenissa (katso 35 esim. esimerkki 19); kromitrioksidipyridiinikompleksin käyttö metyleenikloridissä; ja Dess-Martinin perjodinanin [1,1,l-triasetoksi-2,l-bentoksjodol-3-(3H)-oni] käyttö 6 (D.B. Dessin et ai. menetelmä, J. Org. Chem., 48, 4155-4156 (1983)). Kun Q on edellä määritelty orto-fenyleeni ja X on happi, pidetään yleensä erityisen hyvänä hapetti-mena Dess-Martinin perjodinania; kun Q:ssa karbamoyyli-5 ryhmä, pidetään kuitenkin parempana käyttää kromitrioksi-dipyridiinikompleksia tai dimetyylisulfoksidia, l-(3-di-metyyliaminopropyyli)-3-etyylikarbodi-imidihydrokloridia ja dikloorietikkahappoa. Kun kaavan III mukainen alkoholi sisältää emäksisen typen, on yleensä parempi käyttää 10 vaihtoehtoista menetelmää tai suojata emäksinen typpi ennen hapetusta ja poistaa siitä suojaus hapettamisen jälkeen, jotta saataisiin vastaava kaavan I mukainen yhdiste.

Menetelmässä (B) kaavan IV mukainen vapaa happo 15 voidaan saattaa reagoimaan sopivan vedenpoistoaineen, esimerkiksi disykloheksyyli-karbodi-imidin tai l-(3-dime- tyyliaminopropyyli)-3-etyylikarbodi-imidin tai niiden hydrokloridi-tai hydrobromidisuolan kanssa, mahdollisesti yhdessä orgaanisen emäksen, esimerkiksi 4-dimetyyliamino-... 5 20 pyridimin, kanssa, ja kaavan R ,S02.NH2 mukaisen sulfo-namidin kanssa sopivan liuottimen tai laimennusaineen, esimerkiksi dikloorimetaanin, läsnä ollessa, lämpötilassa, joka on esimerkiksi väliltä 0-50 °C, mutta mieluummin ympäristön lämpötilassa tai lähellä sitä.

25 Vaihtoehtoisesti voidaan antaa kaavan IV mukaisen hapon reaktiivisen johdannaisen, esimerkiksi happohaloge-nidin (kuten esimerkiksi happokloridin), happoanhydridin tai sekahappoanhydridin (kuten esimerkiksi sellaisen, joka on muodostettu Ν,Ν-difenyylikarbamiinihaposta ja 30 kaavan IV mukaisesta haposta antamalla jälkimmäisen hapon natriumsuolan reagoida Ν,Ν-difenyylikarbamoyylipyridini- 5 umklondm kanssa), reagoida kaavan R .S02.NH2 mukaisen sopivan sulfonamidin alkalimetallisuolan (kuten esimerkiksi litium-, natrium- tai kaliumsuolan) kanssa, sopi-35 vasti ympäristön lämpötilassa tai lähellä sitä ja sopi-

II

91072 7 vassa liuottimessa tai laimennusaineessa, esimerkiksi tetrahydrofuraanissa, Ν,Ν-dimetyyliformamidissa tai di-kloorimetaanissa.

Menetelmässä (C) voidaan kytkeminen suorittaa esi-5 merkiksi käyttäen 1-(3-dimetyyliaminopropyyli)-3-etyyli- karbodi-imidihydrokloridia ja 4-dimetyyliaminopyridiiniä tai l-hydroksibentsotriatsolia sellaisessa inertissä liuottimessa kuin esimerkiksi tetrahydrofuraanissa.

Voidaan haluta mahdollisesti käyttää suojaavaa 10 ryhmää koko yllä kuvattujen menetelmien tai osien niistä ajan; suojaava ryhmä voidaan sitten poistaa, kun on muodostettu lopullinen yhdiste tai haluttu lähtöaine, esimerkiksi kuten on kuvattu esimerkeissä 5 ja 7.

Sen jälkeen voidaan missä tahansa yllä olevista 15 menetelmistä, kun halutaan farmaseuttisesti hyväksyttävä suola, saada se antamalla kaavan I mukaisen yhdisteen happaman muodon reagoida sellaisen emäksen kanssa, jonka muodostaa fysiologisesti hyväksyttävä kationi ja fysiologisesti hyväksyttävä anioni ja joka antaa fysiologisesti 20 hyväksyttävän kationin, tai millä tahansa muulla tavan-oma ise1la menetelmä11ä.

Edellä esitetyissä menetelmissä tarvittavia lähtöaineita, joita ei ole kaupallisesti saatavissa, voidaan valmistaa menetelmillä, jotka on valittu heterosyklien 25 kemian ja peptidikemian yleisistä menetelmistä, sellaisista menetelmistä, jotka vastaavat tunnettujen, rakenteeltaan samankaltaisten yhdisteiden synteesiä, ja menetelmistä, jotka vastaavat yllä kuvattuja menetelmiä tai esimerkeissä kuvattuja menetelmiä.

30 Kuten alan asiantuntijalle on selvää, on lähtöai neiden valmistamista varten käytettävissä monia eri reak-tioteitä. Yhden käytettävissä olevan reitin mukaan voidaan kaavan XI mukainen avainvälituote valmistaa kuten on esitetty kaaviossa I (esitetty esimerkkien jälkeisillä 35 sivuilla) aloittaen valinolista (kaava VII) ja käyttäen hyväksi kaavojen VIII, IX ja X mukaisia välituotteita kuten on kuvattu esimerkissä 1. Vaihtoehtoisesti voidaan 8 valinoli (kaava VII) kytkeä yhteen kaavan IX mukaisen hapon kanssa, jolloin saadaan kaavan XII mukainen alkoholi; ja kaavan XII mukainen alkoholi voidaan hapettaa, jolloin saadaan kaavan XI mukainen aldehydi avainväli-5 tuotteena.

Kuten on esitetty kaaviossa II (esitetty esimerkkien jälkeisillä sivuilla), voidaan kaavan XI mukainen välituote aldehydi muuttaa kaavan III mukaiseksi lähtöai-nealkoholiksi, kaavan IV mukaiseksi lähtöaineketoniksi 10 tai kaavan V mukaiseksi lähtöaineaminoketoniksi.

Kaavan XI mukaisen aldehydin voidaan antaa reagoida esimerkiksi alkalimetallisyanidin, kuten esimerkiksi natriumsyanidin tai kaliumsyanidin, kanssa, jolloin muodostuu kaavan XIII mukainen syaanihydriini, jossa W on 15 CN. Mieluummin voidaan kaavan XI mukainen aldehydi muuttaa kaavan XIII mukaiseksi syaanihydriiniksi, jossa W on CN, käsittelemällä asetonisyaanihydriinillä, esimerkiksi kuten on kuvattu esimerkissä 4a. Lisäksi voidaan muuttamiseen käyttää trimetyylisilyylisyanidia, jolloin trime-20 tyylisilyyliryhmä poistetaan happokäsittelyssä. Sellaisen syaanihydriinin hydroksiryhmä voi haluttaessa olla suojattu esimerkiksi asetyyliryhmällä tai trimetyylisilyyli-ryhmällä tai t-butyylidimetyylisilyyliryhmällä.

Kaavan XIII mukainen syaanihydriini, jossa W on 25 CN, voidaan muuttaa vastaavaksi kaavan XIV mukaiseksi heterosykliseksi alkoholiksi, joko suoraan tai eristetyn välituotteen kautta käyttäen tavanomaista menetelmää. Esimerkiksi voidaan kaavan XIII mukaisen yhdisteen, jossa W on CN, muuttaminen vastaavaksi kaavan XIV mukaiseksi 30 yhdisteeksi, jossa Q on edellä määritelty o-fenyleeni, suorittaa käyttäen samankaltaista menetelmää kuin, jonka ovat kuvanneet Hölljes, E.L. ja Wagner, E.C., J. Org. Chem., (1944), 9, 31. Kaavan XIII mukaisen yhdisteen, jossa W on CN, muuttaminen vastaavaksi kaavan XIV mukai-35 seksi yhdisteeksi, jossa Q on cis-vinyleeni, voidaan suorittaa käyttäen samankaltaista menetelmää kuin se, joka on kuvattu julkaisussa Lora-Tamato, M. et ai., Chem.

Il 91072 9

Ber., (1964), 97, 2230, 2234, tai julkaisussa Kitatani, K. et ai., Tetrah. Lett., (1974), 1531.

Vaihtoehtoisesti voidaan kaavan XIII mukainen sy-aanihydriini, jossa W on CN, muuttaa kaavan XIII mukai-5 seksi imidaatiksi, jossa W on -C(NH)0R ja R esimerkiksi metyyli tai etyyli, mieluimmin sen esimerkiksi hydroklo-ridisuolana. Kaavan XIII mukainen imidaatti, jossa W on -C(NH)0R, voidaan muuttaa vastaavaksi kaavan XIV mukaiseksi heterosykliseksi alkoholiksi; välituoteimidaatti voi-10 daan haluttaessa eristää. Imidaattien kemiaa on selostettu julkaisuissa "The Chemistry of Amidines and Imidates",

Saul Patai, toim., John Wiley and Sons. N.Y., 1975, s.

385 ja Roger, R. ja Nielson, D.G. Chem. Rev., (1961), 61, 1979. Kaavan XIII mukaisen imidaatin, jossa W on 15 -C(NH)0R, muuttaminen vastaavaksi kaavan XIV mukaiseksi yhdisteeksi, jossa Q on edellä määritelty o-fenyleeni, voidaan suorittaa käyttäen samankaltaista menetelmää kuin on kuvattu julkaisussa King, F.E. ja Acheson, R.M., J.

Chem. Soc., (1949), 1396; tai julkaisussa Reid, W. et 20 ai., Liebigs Ann. Chem., (1964), 676, 114. Kaavan XIII

mukaisen yhdisteen, jossa W on -C(NH)OR, muuttaminen vastaavaksi kaavan XIV mukaiseksi yhdisteeksi, jossa Q on cis-vinyleeni ja X on happi, voidaan suorittaa käyttäen samankaltaista menetelmää kuin on kuvattu julkaisussa 25 Wiley, R.H., Chem. Rev., (1945), 37, 401; tai julkaisuissa Cornforth, J.W. ja Cornforth, R.H., J. Chem. Soc., (1947), 96; (1953), 93.

Lisäksi voidaan vaihtoehtoisesti kaavan XIII mukainen imidaatti, jossa W on -C(NH)OR, hydrolysoida vas-30 taavaksi kaavan XIII mukaiseksi esteriksi, jossa W on -C00R. Käyttämällä kaavan XIII mukaista esteriä, jossa W on -C00R, vastaavaa kaavan XIII mukaista happoa, jossa W on -C00H (voidaan saada hydrolysoimalla esteri tavanomaisesti), tai erilaista kaavan XIII mukaisen hapon, jossa W 35 on -C00H, aktivoitua johdannaista ja tavanomaista mene- 10 telmää voidaan valmistaa vastaava kaavan XIV mukainen yhdiste. Esimerkiksi sellaisen kaavan XIV mukaisen yhdisteen saamiseksi, jossa Q on edellä määritelty o-fenylee-ni, voidaan käyttää samankaltaista menetelmää kuin on 5 kuvattu julkaisussa Landenberg, A., Chem. Ber., (1876), 9, 1524; Galatis, L.C., J. Amer. Chem. Soc., (1948), 70, 1967; "Heterocyclic Compounds", osa 5., R.C. Elderfield, toim., J. Wiley & Sons, N.Y., 1957, s. 421; Lankezma, H.P. ja Knauf, A.E., J. Amer. Chem. Soc., (1931), 53, 309 10 ja 2654; Lankezma, H.P. ja Vopicka, E., ibid., (1936), 58, 609; tai "The Chemistry of Heterocyclic Compounds", P.N. Preston, toim., (1981), 40, 6-12. Esimerkiksi sellaisen kaavan XIV mukaisen yhdisteen saamiseksi, jossa Q on cis-vinyleeni ja X on happi, voidaan käyttää samankal-15 täistä menetelmää kuin on kuvattu julkaisussa Wasserman, H.H. ja Lu, T.-J., Tetrah. Lett., (1982), 3831; Davidson, D. et ai., J. Org. Chem. (1937), 2, 328; tai Weigand, E. E. ja Rathburn, D.W., Synthesis, (1970), 648 ja J.

Chem. Eng. Data, (1973), 18, 237. Esimerkiksi sellaisen 20 kaavan XIV mukaisen yhdisteen saamiseksi, jossa Q on cis-vinyleeni ja X on rikki, voidaan käyttää samankaltaista menetelmää kuin on kuvattu julkaisussa Gabriel, S., Chem. Ber., (1910), 43, 134 ja 1283; Bachstez, M., ibid.

(1947), 47, 3163; tai Wiley, R.H. et ai, Org. Reactions, 25 (1951), 6, 367.

Vielä yksi vaihtoehto eräiden kaavan XIV mukaisten yhdisteiden, joissa X on rikki, valmistamiseksi, on käyttää kaavan XIII mukaista tioamidia, jossa W on -CSNH2* Kaavan XIII mukainen tioamidi, jossa W on -CSNH2 voidaan 30 saada esimerkiksi käsittelemällä rikkivedyllä, mahdolli sesti käyttäen emäksistä katalysaattoria, kuten esimerkiksi trietyyliamiinia. Siten esimerkiksi kaavan XIII mukainen tioamidi, jossa W on -CSNH2 voidaan muuttaa vastaavaksi kaavan XIV mukaiseksi yhdisteeksi, jossa Q on 35 cis-vinyleeni ja X on rikki, käyttämällä samankaltaista 11 91072 11 menetelmää kuin on kuvattu julkaisussa Schmidt, V. et ai., Synthesis, (1986), 992, tai julkaisussa Wiley, R.H. et ai., Org. Reactions, (1957), 6, 367 ja 378.

Erääseen erilaiseen reittiin kaavan XI mukaisesta 5 aldehydistä kaavan XIV mukaiseksi heterosykliseksi alkoholiksi sisältyy etukäteen muodostetun heterosyklisen reagenssin käyttö. Esimerkiksi kaavan XVI mukaisen li-tium-orgaanisen reagenssin, jossa Y on litium, voidaan antaa reagoida suoraan kaavan XI mukaisen aldehydin kansio sa, jolloin saadaan vastaava kaavan XIV mukainen alkoho li. Kun X on happi, voidaan pitää parempana tai välttämättömänä käyttää erilaista menetelmää. Kaavan XVI mukaisia reagensseja, joissa Y on litium, voidaan valmistaa ja käyttää kuten on kuvattu esimerkiksi julkaisuissa Wasser-15 man, H.H. et ai., Tetrah. Lett., (1981), 22, 1737;

Schroeder, R. et ai., Liebigs Ann. Chem., (1975), 533;

Beraud, J. ja Metzger, J., Bull. Soc. Chem. France, (1962), 2072; Shirlet, D.A. ja Alley, P.W., J.Amer. Chem. Soc., (1957), 79, 4922; Ogura, H. ja Takahashi, H., 20 J.Org. Chem., (1974), 39, 1374; Justin, P. ja Hoffmann, H.J., Chem. Ber., (1973), 106, 594; ja Justi, P. ja Sak-riss, W., ibid. (1973), 106, 2815.

Vaihtoehtoisesti voidaan esimerkiksi kaavan XVI mukainen 2-trimetyylisilyyli-heterosyklinen reagenssi, 25 jossa Y on trimetyylisilyyli, kondensoida kaavan XI mukaisen aldehydin kanssa, jolloin saadaan välituotteena kaavan XIV mukaisen vastaavan alkoholin o-trimetyylisi-lyylijohdannainen. Kaavan XIV mukainen alkoholi voidaan sitten saada poistamalla trimetyylisilyyliryhmä käyttäen 30 tavanomaista menetelmää. Kaavan XVI mukaisia reagensseja, joissa Y on trimetyylisilyyli, voidaan valmistaa ja käyttää samalla tavoin kuin on kuvattu esimerkiksi 4-metyyli- 2-trimetyylisilyylioksatsolia, 2-trimetyylisilyylibentso-tiatsolia ja 2-trimetyylisilyylitiatsolia varten julkai-35 suissa A. Dondoni et ai., Tetrah. Lett., (1985), 26, 5477; A. Dondoni et ai., J. Chem. Soc., Chem. Commun., (1984), 258; ja A. Medici et ai., Tetrah. Lett., (1983), 12 24, 2901.

Käyttämällä saman kaltaista menetelmää kuin on kuvattu julkaisussa Levin, J.I. ja Weinreb, S.M., J. Org. Chem., (1984), 49, 4325, voidaan kaavan XIV mukainen ok-5 satsoli, jossa X on happi ja Q on cis-vinyleeni, valmistaa vastaavasta oksatsoliinista (4,5-dihydro-oksatsoli). Oksatsoliini voidaan valmistaa esimerkiksi tavanomaisesti vastaavasta kaavan XIII mukaisesta välituotteesta, jossa W on CN, -C(NH)OR, -C00R tai -C00H tai antamalla sopivan 10 metalli-orgaanisen reagenssin reagoida kaavan XI mukaisen vastaavan yhdisteen kanssa. (Tiatsoliineja voidaan valmistaa samalla tavoin ja dehydrata, jolloin saadaan kaavan XIV mukaisia tiatsoleja, joissa X on rikki ja Q on cis-vinyleeni.) 15 Kaavan XIV mukainen alkoholi voidaan muuttaa vas taavaksi kaavan XV mukaiseksi aminoalkoholiksi poistamalla CBZ-ryhmä käyttäen tavanomaista menetelmää, kuten esimerkiksi hydrogenolyysiä palladioitu hiili-katalysaattorin avulla noin 3 barin paineessa ja ympäristön lämpöti-20 lassa sopivassa liuottimessa, kuten esimerkiksi etanolissa.

Kaavan XV mukainen aminoalkoholi voidaan muuttaa

kaavan III mukaiseksi lähtöaineeksi antamalla kaavan XV

mukaisen aminoalkoholin reagoida sopivan asyloimisaineen 25 kanssa. Sopivia asyloimisaineita ovat esimerkiksi kaavan 4 R .L.COOH mukaisten happojen aktivoidut johdannaiset, esimerkiksi niiden aktivoidut johdannaiset, jotka muodostuvat in situ käytettäessä tavanomaisia kytkemisreagens-seja, kuten esimerkiksi l-(3-dimetyyliaminopropyyli)-3-30 etyylikarbodi-imidihydrokloridia ja 1-hydroksibentsotri- atsolia tai 4-dimetyyliaminopyridiiniä, samoin kuin esi- 4 merkiksi kaavan R .L.C0C1 mukaiset happokloridit. Yleensä asylointi suoritetaan inertissä laimennusaineessa tai liuottimessa, kuten esimerkiksi dikloorimetaanissa, tet-35 rahydrofuraanissa tai dioksaanissa ja lämpötilassa, joka on esimerkiksi väliltä 0 - 60 eC. Voidaan myös sopivasti käyttää orgaanista tai epäorgaanista emästä, kuten esi- il 91072 13 merkiksi trietyyliamiinia, 4-metyylimorfoliinia, 4-dimetyyli- aminopyridiiniä, kaliumkarbonaattia tai natriumhydroksidia hapon vastaanottajana, milloin se on tarkoituksenmukaista.

Kaavan IV mukaiset lähtöaineketonit voidaan myös 5 saada kaavan XV mukaisesta alkoholivälituotteesta kuten on esitetty kaaviossa II. Siten voidaan esimerkiksi sellaisen kaavan IV mukaisen lähtöaineen saamiseksi, jossa R^:llä on merkitys Rz02C-, H2N.S02~ tai R^NH ja RZ:lla on jäljempänä määritelty merkitys, muuttaa kaavan XV mukainen 10 aminoalkoholi vastaavaksi kaavan XVII mukaiseksi alkoholiksi käyttämällä menetelmää, joka vastaa yllä kaavan III mukaisen yhdisteen valmistamista varten kuvattua, ja vastaavaa rea- 7 7 genssia, kuten esimerkiksi reagenssia R .L.COOH, R .L.COC1, 7 7 R .L.NCO tai R .L.0.C0C1. Sitten voidaan samankaltaista ha-15 petusmenetelmää käyttäen kuin on kuvattu menetelmässä (A) hapettaa kaavan XVII mukainen alkoholi, jolloin saadaan kaavan IV mukainen ketonilähtöaine. Kaavan IV mukainen keto- 7 nilähtöaine, jossa R :llä on merkitys -NCO, voidaan valmistaa vastaavasta kaavan IV mukaisesta ketonista, jossa R^ on 20 karboksi, käyttämällä muunnettua Curtius-reaktiota käyttäen esimerkiksi difenyylifosforyyliatsidia ja trietyyliamiinia bentseenissä tai tolueenissa 80°C:ssa (katso T. Shioiri, K. Ninomiya ja S. Yamada, J. Amer. Chem. Soc., (1972), 94, 6203). Kaavan IV mukainen lähtöaine, jossa R^:llä on merki-25 tys karboksi, voidaan valmistaa hajottamalla sopiva vastaa- 7 va kaavan IV mukainen esteri, jossa R :llä on merkitys z z R 02C-, jossa R on helposti poistettava hapon suojaryhmä, esimerkiksi fenyyli, bentsyyli tai (1-6C)alkyyli, jossa on mahdollisesti asetoksi-, (1-4C)alkoksi- tai (1-4C)alkyyli-30 tiosubstituentti.

Erityinen merkitys RZ:lle on esimerkiksi metyyli, etyyli, propyyli, t-butyyli, asetoksimetyyli, metoksimetyyli, 2-metoksietyyli, metyylitiometyyli, fenyyli tai bentsyyli.

7 z

Kaavan IV mukaisen esterin, jossa R on R 02C-, ha-35 jottaminen voidaan ymmärrettävästi suorittaa käyttäen mitä 14 tahansa monista erilaisista orgaanisen kemian alalla tunnetuista menetelmistä. Siten se voidaan suorittaa esimerkiksi tavanomaisen hydrolyysin avulla happamissa tai emäksisissä olosuhteissa, jotka on säädetty sellaisiksi kuin on tarpeen, 5 jotta rajoitettaisiin mahdollisimman vähiin muiden molekyylissä olevien funktionaalisten ryhmien hydrolyyttinen poistaminen. Vaihtoehtoisesti voidaan eräissä olosuhteissa, esi-z merkiksi, kun R on t-butyyli, pitää parempana suorittaa hajottaminen käyttäen happokatalyysiä, esimerkiksi käsittele-mällä kaavan IV mukaista esteriä esimerkiksi trifluorietikka-hapolla esimerkiksi lämpötilassa 0-40°C, sopivassa liuotti-messa tai laimennusaineessa, kuten esimerkiksi dikloori-metaanissa. Lisäksi voidaan, kun R on t-butyyli, hajottaminen suorittaa esimerkiksi käyttäen trimetyylisilyylitri-15 flaattia ja sitten vettä, yleiseen tapaan. Ja vielä voi eräissä olosuhteissa, esimerkiksi kun Rz on bentsyyli, olla mahdollista suorittaa hajottaminen pelkistämisen avulla, esimerkiksi käyttäen vetyä paineen ollessa noin kolme baria, sopivan katalysaattorin, kuten esimerkiksi palladiumin tai 2 Π υ platinan, läsnä ollessa, sopivasti hiilen ollessa sen kantaja-aineena.

Kaavan V mukaiset lähtöaineaminoketonit voidaan saada vastaavista kaavan XIV mukaisista alkoholeista vastaavien kaavan VI mukaisten ketonien kautta. Siten voidaan saman ^5 kaltaista hapetusmenetelmää käyttämällä kuin on kuvattu yllä menetelmässä (A), hapettaa kaavan XIV mukainen alkoholi vastaavaksi kaavan VI mukaiseksi ketoniksi, esimerkiksi kuten on kuvattu esimerkissä 7d ja esimerkissä 8b. Poistamalla N-suojaryhmä kaavan VI mukaisesta ketonista saadaan sitten 50 vastaava kaavan V mukainen aminoketonilähtöaine. Suojaryhmä voidaan sopivasti poistaa käyttämällä esimerkiksi trifluori-metaanisulfonihappoa dikloorimetaanissa ympäristön lämpötilassa. Näin valmistettu kaavan V mukainen aminoketoni voidaan sopivasti eristää sen raakana trifluorimetaanisulfoni-55 happosuolana ja käyttää se suoraan vastaavan kaavan I mukaisen tuotteen valmistamiseen, esimerkiksi kuten on kuvattu

II

91072 15 esimerkissä 7f. Jos kaavan V mukainen aminoketoni eristetään sen vapaan emäksen muodossa, esimerkiksi kuten on kuvattu esimerkissä 8c, on parempi käyttää materiaali heti vapaan emäksen rajoittuneen stabiiliuden vuoksi.

5 Kaavan IV mukaiset lähtöaineketonit voidaan myös val mistaa vastaavista kaavan V mukaisista aminoketoneista käyttäen vastaavia menetelmiä kuin ne, jotka on kuvattu yllä kaavan XVII mukaisten alkoholien valmistamiseksi vastaavista kaavan XV mukaisista alkoholeista.

10 Vaihtoehtoinen, vastaava mahdollisuus saada kaavojen III, IV ja V mukaiset lähtöaineet on esitetty pääpiirteittäin kaaviossa III (esitetty esimerkkien jälkeisillä sivuilla). Suojattu valinaali, esimerkiksi CBZ-valinaali, voidaan muuttaa vastaavaksi suojatuksi kaavan XlVa mukaisek-15 si heterosykliseksi alkoholiksi käyttämällä vastaavaa menetelmää kuin se, joka on kuvattu yllä kaavan XI mukaisen suojatun aldehydin muuttamiseksi kaavan XIV mukaiseksi suojatuksi heterosykliseksi alkoholiksi. Muuttaminen voidaan suorittaa asteittain kaavan XHIa mukaisten analogisten vä-20 lituotteiden kautta tai suoraan käyttäen kaavan XVI mukaista heterosyklistä reagenssia. Kaavan XlVa mukaisesta alkoholista voidaan poistaa suojaus, jolloin saadaan kaavan XVa mukainen aminoalkoholi. Kytkemällä yhteen kaavan IX mukaisen hapon kanssa voidaan kaavan XVa mukainen aminoalkoholi muut-25 taa kaavan XIV mukaiseksi alkoholiksi, käytettäväksi kuten on kuvattu kaaviossa II. Vaihtoehtoisesti voidaan kaavan XVa mukainen amiini kytkeä yhteen kaavan IXa mukaisen hapon kanssa (joka on valmistettu käyttäen yleisiä menetelmiä tai menetelmiä, jotka vastaavat yllä kuvattuja), jolloin 30 saadaan kaavan III mukainen lähtöaine, esimerkiksi kuten on kuvattu esimerkissä 19. Lisäksi voidaan kaavan XVa mukainen amiini kytkeä yhteen kaavan IXb mukaisen hapon (valmistettu käyttäen yleisiä menetelmiä tai menetelmiä, jotka vastaavat yllä kuvattuja) kanssa, jolloin saadaan kaavan XVII mukainen 35 yhdiste, joka voidaan muuttaa kaavan IV mukaiseksi lähtöaineeksi .

16

Vielä erääseen tapaan saada kaavojen IV ja V mukaiset lähtöaineet, samoin kuin kaavan I mukaiset yhdisteet, kuuluu myös kaavan XVI mukaisten metalliorgaanisten rea-genssien, joissa Y on litium, käyttö, erityisesti, kun X 5 on rikki, kuten on kuvattu kaaviossa IV ja esimerkissä 13 ja esimerkissä 14. Siten voidaan esimerkiksi sopivaa ami-nosuojattua, Ν,Ν-disubstituoitua valiiniamidia, kuten esimerkiksi kaavan XX mukaista bentsyloksikarbonyylillä suojattua N-metoksi-N-metyylivaliiniamidia käsitellä litiumia 10 sisältävällä heterosyklisellä rengasyhdisteellä, kuten esimerkiksi 2-litiumtiatsolilla tai 2-litiumbentsotiatsolilla, jolloin saadaan vastaava kaavan XXI mukainen ketoni. Poistamalla kaavan XXI mukaisesta yhdisteestä aminoa suojaava ryhmä tavanomaista menetelmää käyttäen saadaan vastaava 15 kaavan XXII mukainen aminoketoni. Kytkemällä kaavan IX mukainen happo yhteen kaavan XXII mukaisen amiinin kanssa voidaan saada vastaava kaavan VI mukainen ketoni. Kuten yllä on kuvattu, voidaan kaavan VI mukainen ketoni muuttaa kaavan V mukaiseksi lähtöaineeksi, joka kaavan V mukainen lähtöaine 20 voidaan muuttaa edelleen kaavan IV mukaiseksi lähtöaineeksi. Kytkemällä kaavan IXa mukainen happo kaavan XXII mukaiseen aminoon, voidaan saada vastaava kaavan I mukainen tuote. Samalla tavoin voidaan kytkemällä kaavan IXb mukainen happo yhteen kaavan XII mukaisen amiinin kanssa saada suoraan 25 vastaava kaavan IV mukainen lähtöaine. Käyttämällä vastaavia menetelmiä kuin on kuvattu kaavan XX mukaisen amidin muuttamiseksi kaavan XXII mukaiseksi aminoketoniksi, voidaan myös saada muita välituoteyhdisteitä, kuten esimerkiksi kaavan XXIII, kaavan V ja kaavan IV, jossa on HNR^-, 30 mukaisia.

Kuten alan asiantuntijalle on selvää, voidaan keksinnön mukaisiin lähtöaineisiin johtavien reaktioteiden vaiheiden järjestystä muuttaa, jos otetaan huomioon asiaan kuuluvaa näkökohdat kytkemismenetelmien, rasemoinnin, 35 suojauksen poistamismenetelmien jne. kohdalla.

I! 91072 17

Inhibition määrityksiä:

Keksinnön mukaisten yhdisteiden kyky toimia elas-taasin inhibiittoreina määritetään aluksi arvioimalla keksinnön mukaisen yhdisteen kykyä inhiboida ihmisen leukosyy-5 tin elastaasin (HLE) vaikutusta pienen molekyylipainon omaavaan peptidisubstraattiin. Inhibiittorin tehokkuus arvioidaan määrittämällä kineettisestä sen kompleksin, joka muodostuu inhibiittorin ja HLE:n vaikuttaessa toisiinsa, dissosiaatiovakio K^. Käytetty substraatti oli anilidi 10 metoksisuksinyyli-alanyyli-alanyyli-prolyyli-valiini-p-nitroanilidi, jota ovat kuvanneet Nakajima, K. et ai. julkaisussa J. Biol. Chem., 245, 4027-4032 (1979) ja Teshima, T. et ai. julkaisussa J. Biol. Chem. 257, nro 9, 5085-5091 (1982). Näissä tutkimuksissa käytetty HLE-15 entsyymi voidaan saada toiminimeltä Elastin Products, St. Louis, Missouri, tai se voidaan puhdistaa kuten ovat kuvanneet Viscarello B.R. et ai. julkaisussa Preparative Biochemistry, osa 13, sivut 57-67, (1983), ja kuten myös on kuvattu EP-patenttihakemuksessa julkaisunumero 20 189 305 A2. Täten puhdistetulle HLE:lie määritettiin p- nitroaniliinin tuottamisen standardinopeus 25°C:ssa spektrofotometrisesti näkyvän spektrin aallonpituudella 410 nanometriä käyttäen automaattista tiedonkeruuta Cary 210 spektrofotometristä, joka oli hankittu toiminimeltä 25 Varian Associates. Reaktiot pantiin alulle ruiskuttamalla 10 mikrolitraa HLE-liuosta 3 millilitran kyvettiin, joka sisälsi 2,89 millilitraa puskuriliuosta (10 millimolaari-nen natriumfosfaatti, 500 millimolaarinen NaCl, pH 7,6), 50 mikrolitraa substraattiliuosta DMSOrssa ja 50 mikrolit-30 raa DMSO:a. p-nitroaniliinin tuottamisen alku-, vakioti-lannereaktionopeudet laskettiin sovittamalla koetulokset lineaariseen riippuvuuteen ajasta lineaarisen pienimmän neliösumman menetelmän avulla. Tätä nopeutta, joka oli määritetty ilman että läsnä oli inhibiittoria, käytettiin stan-35 dardina laskettaessa inhibiittorin K^-arvoja.

18

Yleensä tämän keksinnön mukaiset heterosykliset ketonit eivät ole HLE:n "hitaasti sitoutuvia" inhibiitto-reita; jos kuitenkin heterosyklisten ketonien todetaan olevan HLE:n "hitaasti sitoutuvia" inhibiittoreita, käytetään 5 erityisiä analyysimenetelmiä niiden aikaansaamaan HLE:n inhibition K^-arvojen tarkkaan määrittämiseen. (Katso julkaisusta Williams, J.W. ja Morrison, J.F., Meth. Enz. 63,

437 (1979) kuvaus näistä menetelmistä.) Tyypillisessä kokeessa lisätään 2,89 ml puskuriliuosta (10 millimolaarinen 10 natriumfosfaatti, 500 millimolaarinen natriumkloridi, pH

7,6), 50 mikrolitraa inhibiittorin DMSO-liuosta ja 50 mik-rolitraa substraatin DMSO-liuosta 3 millilitran kyvettiin. Kyvetti suljetaan, käännetään useita kertoja ylösalaisin sen sisällön sekoittamiseksi ja sitä pidetään (25°C:ssa) 15 spektrofotometrissä. Sen jälkeen, kun on annettu kulua viisi minuuttia, jotta reaktioliuos pääsisi lämpötasapai-noon, lisätään 10 mikrolitraa entsyymin varastoliuosta kyvettiin reaktion aloittamiseksi. Suoritetaan kaksi tai kolme rinnakkaismääritystä inhibiittorin nollakonsentraatiossa 20 ja vähintään kolme inhibiittorin ei-nolla-konsentraatioissa. K^-arvot lasketaan niiden menetelmien mukaan, jotka on esitetty pääpiirteittäin yllä mainitussa Williamsin ja Morri- sonin viitteessä. Valittujen yhdisteiden K.-arvot ovat -7 1 pienempiä kuin 10 M. Esimerkiksi esimerkin 1 yhdisteen 25 K^-arvo on 3,3 x 10 ^M.

Eläinmallit

Keuhkolaajentuman eläinmalleissa annetaan henki-torven sisään (i.t.) elastolyyttistä proteaasia aiheuttamaan keuhkon hitaasti etenevän tuhoisan vaurion. Näitä 30 vaurioita arvioidaan normaalisti kun on kulunut muutamista viikoista muutamiin kuukausiin alkuperäisestä häiriön alul-lepanemisesta. Nämä proteaasit aiheuttavat kuitenkin myös vaurion, joka ilmenee muutaman ensimmäisen tunnin aikana. Varhainen vaurio on ensin verenvuotoinen, etenee tulehduk-35 selliseksi vioittumaksi ensimmäisen 24 tunnin loppuun mennessä ja häviää ensimmäisellä viikolla häiriön alullepane-misen jälkeen. Tämän varhaisen vaurion hyväksikäyttämiseksi sovellettiin seuraavaa mallia.

Il 91072 19

Hamsterit nukutetaan ensin kevyesti Brevitalin avulla. Sitten annetaan suoraan henkitorveen fosfaatilla puskuroitua suolaliuosta (PBS), pH 7,4, joko yksin tai jo-^ ka sisältää 400 pg ihmisen leukosyytin elastaasia (HLE). Kaksikymmentäneljä tuntia myöhemmin tapetaan eläimet ja poistetaan keuhkot ja niistä poistetaan huolellisesti asiaankuulumaton kudos. Keuhkojen märkäpainon määrittämisen jälkeen keuhkoja huuhdellaan PBS:11a ja talteen saatu huuh-10 toutuvien puna- ja valkosolujen kokonaismäärä määritetään.

Keuhkojen märkäpainojen, huuhtoutuvien punasolujen kokonaismäärien ja huuhtoutuvien valkosolujen kokonaismäärien suuruudet ovat kohonneet annoksesta riippuvasti HLE:n antamisen jälkeen. Yhdisteet, jotka ovat tehokkaita elastaasin ^ inhibiittoreita, voivat ehkäistä tai vähentää entsyymin aiheuttaman vaurion vakavuutta, mistä on seurauksena alempi keuhkojen märkäpaino ja huuhtoutuvien solujen, sekä puna- että valkosolujen, pienentyneet kokonaismäärät, verrattaessa pelkän HLE:n antamiseen. Yhdisteitä voidaan ar- 20 vioida antamalla niitä joko yhdessä HLE:n kanssa tai eri aikoina ennen HLE:n antamista, jotta saataisiin määritettyä niiden hyödyllisyys HLE-vaurion estämisessä. Tämän keksinnön mukaiset yhdisteet aikaansaavat tilastollisesti merkitsevää keuhkojen märkäpainon ja huuhtoutuvien solujen ko-25 konaismäärien pienenemistä verrattuna pelkkään HLE:in.

Ne tämän keksinnön mukaiset yhdisteet, jotka tutkittiin, osoittivat aktiivisuutta vähintään yhdessä kokeista, jotka on kuvattu kohdissa "inhibition määrittäminen" tai "eläinmalli". Todettakoon, että aina ei esiintynyt suo-30 raa korrelaatiota inhibition määrityskokeessa K^-arvoina määritettyjen yhdisteiden aktiivisuuksien ja eläinmallikokeessa saatujen huuhtoutuvien solujen kokonaismäärien ja keuhkojen märkäpainojen pienentyneiden suuruuksien, verrattuna pelkän HLE:n antamisen tapauksiin, välillä. Yleensä ^ ei huomattu mitään ilmeisiä merkkejä akuutista myrkyllisyydestä eläinmallissa tutkittujen tämän keksinnön mukaisten yhteiden yhteydessä.

20 Tämän keksinnön mukaisia yhdisteitä voidaan antaa niitä tarvitsevalle lämminveriselle eläimelle kudosrappio-sairauden hoitamiseksi, erityisesti ihmiselle, etenkin keuhkolaajentuman hoitamiseksi. Parhaana pidetty antamis-5 tapa voi olla jauhe- tai nesteaerosolin avulla antaminen. Jauheaerosolissa keksinnön mukaiset yhdisteet voidaan antaa samalla tavoin kuin kromolynnatrium "Spinhaler" (tavaramerkki) turbohöyryhengityskojeen avulla, joka saadaan toimini-meltä Fisons Corp., Bedford, Massachusets, määränä noin 10 0,5-50 mg kapselia kohden, antaen tavalliselle ihmiselle 1-8 kapselia päivittäin. Kukin turbohöyryhengityskojeessa käytettävä kapseli sisältää vaaditun määrän keksinnön mukaista yhdistettä ja loput 20 mg:n kapselista on farmaseuttisesti hyväksyttävää kantaja-ainetta, kuten esimerkiksi 15 laktoosia. Nesteaerosolissa keksinnön mukaiset yhdisteet annetaan määränä noin 100-1000 mikrogrammaa "suihketta" eli vakiotilavuuden ponneainetta aktivoitua vapautumista kohden. Nestemäistä aerosolia annetaan määrinä 1-8 suihketta päivää kohden annostusten vaihdellessa hoidettavien ti-20 lojen vakavuuden, potilaan painon ja aerosolin hiukkaskoko-jakauman mukaan, koska pienemmät hiukkaset tunkeutuvat tehokkaammin keuhkoihin. Ponneaineita, esim. fluorattu hiilivety tai isobutaani, säiliöitä, venttiilejä ja käynnistimiä nesteaerosoleja varten ovat kuvanneet L. Lachman et ai.

25 julkaisussa "The Theory and Practice of Industrial Pharmacy", Lea and Febiger, Philadelphia (1976) .

Vaihtoehtoisesti voi antamistapana olla suun kautta tai ruoansulatuskanavan ulkopuolisesta antaminen, mukaan lukien ihonalainen säiliö käyttäen hyväksi osmoottista pump-30 pua. Keksinnön mukaiset yhdisteet voidaan sopivasti sekoittaa suun kautta tai ruoansulatuskanavan ulkopuolisesta annettavaksi annostusmuodoksi yhdistämällä noin 10-250 mg annostusyksikköä kohden tavanomaisen vehikkelin, täyteaineen, sideaineen, säilytysaineen, stabiloimisaineen, maus-35 teen tai vastaavan kanssa, kuten hyväksytty farmaseuttinen käytäntö vaatii, esim. kuten on kuvattu US-patentissa nro

II

91072 21 3 755 340. Antamisen tapahtuessa ruoansulatuskanavan ulko-puolisesti annetaan laskimoon, lihakseen tai ihon alle 1-10 ml:n ruiske, joka sisältää keksinnön mukaista yhdistettä noin 0,02-10 mg/kg ruumiinpainoa, 3 tai 4 kertaa 5 päivittäin. Ruiske sisältää tällöin keksinnön mukaista yhdistettä isotoonisessa steriilissä vesiliuoksessa tai -suspensiossa, mahdollisesti säilytysaineen, kuten esimerkiksi fenolin tai liuottavan aineen, kuten esimerkiksi etyleenidiamiinitetraetikkahapon (EDTA) kanssa.

10 Keksintöä valaisaan nyt seuraavien ei-rajoittavien esimerkkien avulla, joissa, ellei toisin ole ilmoitettu: (i) lämpötilat on annettu celsius (C) -asteina; työvaiheet suoritettiin huoneen tai ympäristön lämpötilassa, toisin sanoen lämpötilassa, joka oli välillä 18-25°C; 15 (ii) liuottimen haihduttaminen suoritettiin käyt täen kiertohaihdutinta, alennetussa paineessa (600-4000 pascalia; 4,5-30 mm Hg) ja käyttäen hauteen lämpötilana korkeintaan 60°C; (iii) "flash" -kromatografia suoritettiin käyttäen 20 Merckin Kieselgeeliä (tuote 9385) /hankittu toiminimeltä E. Merck, Darmstadt, Länsi-Saksa?; jos viitataan "happa-maan silikageeliin", käytettiin materiaalia, jonka oli erikoistilauksesta valmistanut toiminimi J.T. Baker Chemical Co., Phillipsburg, NJ, USA, ja jonka pH oli noin 25 6, kun se oli sekoitettu puuroksi veteen; ohutkerroskroma- tografia (TLC) suoritettiin käyttäen Analtechin 0,25 mm:n silikageeli-GHLF-levyjä (tuote 21521), joita on saatavissa toiminimeltä Analtech, Newark, DE, USA; (iv) yleensä seurattiin reaktioiden kulkua TLC:n 30 avulla ja reaktioajat on annettu ainoastaan kuvaavina esimerkkeinä; (v) sulamispisteet ovat korjaamattomia ja (d) tarkoittaa hajoamista; annetut sulamispisteet ovat kuvatulla tavalla valmistetuille materiaaleille saatuja; poly- 35 morfismista voi olla seurauksena materiaalien, joilla on erilaiset sulamispisteet, eristäminen joissakin valmistuksissa; 22 (vi) kaikki lopputuotteet olivat olennaisesti puhtaita TLV:n perusteella ja niillä oli tyydyttävät ydin-magneettinen resonanssi (NMR) -spektrit ja mikroanalyysin tulokset; 5 (vii) saannot on annettu ainoastaan kuvaavina esi merkkeinä eivätkä välttämättä ole sellaisia, joita voidaan saada tarkan menetelmän kehittämisen avulla; valmistukset toistettiin, jos tarvittiin enemmän materiaalia; (viii) kun on annettu NMR-tietoja, ovat ne tärkei-10 den diagnostisten protonien delta-arvojen muodossa, jotka on annettu miljoonasosina (ppm) suhteessa sisäisenä standardina olevaan tetrametyylisilaaniin (TMS), määritettynä käyttäen 80 MHz tai 250 MHz ja liuottimen ollessa CDCl^, DMSO-dg tai CD^OD; signaalin muodolle on käytetty tavanomai-15 siä lyhennyksiä, esimerkiksi: s, singletti; d, dubletti; m, multipletti; br, leveä; jne; lisäksi "Ar" tarkoittaa aromaattista ryhmää tai signaalia; (ix) alennetut paineet on annettu absoluuttisina paineina Pascaleina (Pa); muut paineet on annettu manomet- 20 ripaineina bareina; (x) kemiallisilla symboleilla on niiden tavalliset merkitykset; on myös käytetty seuraavia lyhennyksiä; min (minuutteja), hr (tunteja), V (tilavuus), w (paino); s.p. (sulamispiste), 1 £litr(oj)a7, ml (millilitroja), 25 g /_gramm (o j ) a7 , mg /^milligramm (o j ) a7 ; (xi) liuotinten suhteet on annettu tilavuus/tila-vuus (V/V) -suhteina; kiinteiden aineiden suhteet on annettu paino:paino (w/w) -suhteina; (xii) massaspektrit (MS) tuotettiin 70 elektroni-30 voltin elektronienergiaa käyttäen kemiallisella ionisaa- tiolla ja käyttäen suoraa näytteensyöttömenetelmää; kun on annettu piikkejä, on ilmoitettu ainoastaan kymmenen prosenttia peruspiikistä olevia ja sitä suurempia piikkejä; ja (xiii) kun on ilmoitettu korkeapainenestekromato-35 grafian (HPLC) tuloksia, on tR (retentioaika) annettu minuutteina. FR (virtausnopeus) on annettu ml/min, Koi A on ti 91072 23 "Zorbax" (tavaramerkki) ODS -analyyttinen pylväs (4,6 mm x 25 cm) ja Koi B on "Phenomenex" (tavaramerkki) "Zorbax" C-8 -analyyttinen pylväs (4,6 mm x 35 cm).

Nimistö: Yhdenmukaisuuden ja selvyyden vuoksi on käytetty 5 "aminohapposekvenssin" tyyppiä olevia nimiä milloin vain mahdollista. Yleensä tarkoittaa kiraalikeskuksen stereo-kemiallinen identifiointi (S):ksi, että tuotteen arvioidaan sisältävän vähintään 95 % tarkoitetun keskuksen (S)-isomeeriä; kiraalikeskuksen stereokemian identifioinnin puut-10 tuminen viittaa isomeerien seokseen, joka ei välttämättä ole tarkoitetun keskuksen suhteen 1:1.

Esimerkki 1 (S) -/4-/.(4-kloorifenyyli) sulfonyyliaminokarbonyylijbentsoyy-li_/-L-valyyli-N-/l- (2-bentsoksatsolyyli) karbonyyli-2-metyy-15 lipropyyli7-L-proliiniamidi (kaava I, heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=2-bentsoksatsolyyli, A=CO, L=£-fenyleeni, R4=R5.S(CU).NH.CO-, R5=4-C1CCH4)_ a. N-bentsyylioksikarbonyyli-L-valinoli

Bentsyyliklooriformiaattia (91,0 g, 95 % puhtaus) 20 lisättiin tipoittain 1 tunnin aikana esijäähdytettyyn (0°) liuokseen, jossa oli L-valinolia (50,0 g) ja trietyy-liamiinia (60,0 g) kloroformissa (1500 ml). Reaktioseosta sekoitettiin 1 tunnin ajan 0°C:ssa ja sen annettiin sitten lämmetä huoneen lämpötilaan 2 tunnin aikana. Sen jälkeen, 25 kun oli haihdutettu reaktioseos, lisättiin jäännökseen etyyliasetaattia (1500 ml); ja orgaaninen liuos pestiin 1 N NaOH:lla ja suolavedellä, kuivattiin (MgSO^) ja haihdutettiin. Saatu jäännös puhdistettiin "flash" -kromatogra-fian avulla käyttäen portaittaista gradienttia, jonka muo-30 dosti eetteri:heksaani (1:5) ja sen jälkeinen eetteri, jolloin saatiin tuote (91,4 g) valkeana vahamaisena kiinteänä aineena; TLC: Rf=0,23, heksaani:eetteri (50:50).

b. N-bentsyylioksikarbonyyli-L-valinaali

Liuos, jossa oli dimetyylisulfoksidia (107,2 g) 35 metyleenikloridissa (150 ml), lisättiin tipoittain 0,5 tunnin aikana esijäähdytettyyn (-60°C), sekoitettuun liuokseen, jossa oli oksalyylikloridia (87,1 g) metyleeni- 24 kloridissa (800 ml) typpi-ilmakehän alla. Seoksen lämpötila nousi -45°C:seen. Reaktioseos lämmitettiin sitten -30°C:seen. Liuos, jossa oli esimerkin la tuotetta (81,5 g) metyleenikloridissa (300 ml), lisättiin tipoittain 5 45 minuutin aikana -30°C:ssa. Reaktioseosta sekoitettiin 50 minuutin ajan -25°C:ssa, se jäähdytettiin -40°C:seen ja lisättiin tipoittain 45 minuutin aikana -40°C:ssa liuos, jossa oli di-isopropyylietyyliamiinia (177,4 g) metyleenikloridissa (250 ml). Reaktioseosta sekoitettiin 1 tunnin 10 ajan ja se lämmitettiin huoneen lämpötilaan. Reaktioseos laimennettiin metyleenikloridilla (1500 ml) ja orgaaninen faasi pestiin 1 N HCl:lla ja haihdutettiin, jolloin saatiin tuote (98 g) vihreänä öljynä, joka käytettiin välittömästi ilman lisäpuhdistusta; TLC: Rf=0,48, heksaani:eetteri 15 (50:50).

c. N-bentsyylioksikarbonyyli-L-valinaalidietyyli- asetaali

Trietyyliortoformiaattia (508 g), absoluuttista etanolia (800 ml) ja £-tolueenisulfonihappomonohydraattia 20 (5,0 g) lisättiin osaan esimerkin Ib tuotetta (81 g). Seos ta sekoitettiin 10 minuutin ajan huoneen lämpötilassa ja sitten haihdutettiin. Saatu jäännös liuotettiin eetteriin, pestiin kyllästetyllä NaHCO^in vesiliuoksella, kuivattiin (Na2SO^) ja haihdutettiin, jolloin saatiin raaka tuote, 25 joka puhdistettiin "flash" -kromatografiän avulla käyttäen portaittaista gradienttia, jossa edettiin heksaanista me-tyleenikloridi:heksaaniseosten kautta etyyliasetaatti: metyleenikloridiin (30:70), jolloin saatiin tuote (84,7 %) vaalean keltaisena öljynä; TLC: R^=0,21, metyleenikloridi: 30 petrolieetteri (50:50).

d. L-valinaalin dietyyliasetaali (kaava VIII)

Seosta, jossa oli esimerkin le menetelmää käyttäen valmistettua tuotetta (147,8 g) ja 10 % palladioitua hiiltä (10 g) etyyliasetaatissa (1500 ml), sekoitettiin I^n alla 35 (1 bari), kunnes oli kulunut 2500 ml Hjiä. Reaktio keskey tettiin kahdesti tämän ajan kuluessa ja lisättiin 10 %

II

91072 25 palladioitua hiiltä (10 g). Reaktioseos suodatettiin sitten piimaakerroksen lävitse. Lisättiin 10 % palladioitua hiiltä (10 g) ja reaktioseosta sekoitettiin jälleen Ι^ίη alla, kunnes oli kulunut 10,92 litraa I^a. Reaktioseos suodatettiin 5 piimään lävitse ja suodos konsentroitiin tyhjössä, jolloin 25 saatiin tuote (78,8 g) vaalean keltaisena öljynä; = +7,8.

e. Bentsyylioksikarbonyyli-L-valyyli-L-proliinin metyyliesteri Jäähdytettyyn (0-5°C) liuokseen, jossa oli N-10 bentsyloksikarbonyyli-L-valiinia (450,0 g) kuivassa N,N-dimetyyliformamidissa (3,0 litraa), lisättiin 1-hydroksi-bentsotriatsolihydraattia (483,3 g) ja reaktioseosta sekoitettiin 20 minuutin ajan, minkä jälkeen lisättiin puuromainen seos, jossa oli L-proliinin metyyliesterihydrokloridia 15 (296,4 g) ja trietyyliamiinia (186,6 g) N,N-dimetyyliform- amidissa (1,5 litraa). Sen jälkeen kun saatu seos oli jäähdytetty 0°C:seen, lisättiin 1-(3-dimetyyliaminopropyy-li) -3-etyylikarbodi-imidihydrokloridia (377,6 g, 1,97 moolia) N,N-dimetyyliformamidissa (500 ml). Reaktioseosta 20 sekoitettiin 0-5°C:ssa 3 tunnin ajan ja sen annettiin sitten lämmetä vähitellen huoneen lämpötilaan. Sekoittamista jatkettiin 65 tunnin ajan ja seos suodatettiin ja haihdutettiin. Jäännöksen annettiin jakautua eetterin ja 1 N HCl:n kesken ja muodostunut saostuma poistettiin suodatta-25 maila. Sitten erotettiin eetterikerros; se pestiin vedellä, kyllästetyllä NaHCO^n vesiliuoksella ja suolavedellä; kuivattiin (MgSO^); ja haihdutettiin. Raaka esteri puhdistettiin "flash" -kromatografiän avulla käyttäen gradientti-eluutiota, johon kuului metyleenikloridi, sitten metanoli: 30 metyleenikloridi (1:99), (2,5:79,5) ja lopuksi (5:95). En simmäisestä pylväästä saatu epäpuhdas materiaali kromato-grafoitiin uudelleen käyttäen gradienttieluutiota, johon kuului metyleenikloridi:heksaanien seos (1:3), metyleenikloridi ja lopuksi metanoli:metyleenikloridi (2:98). Kroma-35 tografioiden yhdistelmästä saatiin esteri (596,9 g, 92 % värittömänä öljynä; TLC: Rf=0,45-0,60, metanolismetyleeni-kloridi (5:95); MS: m/e=363(M+l, peruspiikki), 319, 255, 130, 91.

26

Analyysi koostumukselle . 0,25 H^O:

Laskettu: C 62,19; H 7,28; N 7,68

Saatu: C 62,19; H 7,12; N 7,51 f. Bentsyylioksikarbonyyli-L-valyyli-L-proliini 5 (kaava IX)

Liuokseen, jossa oli esimerkin le tuotetta (595,0 g) metanolissa (4,8 litraa), lisättiin 1 N NaOH:a (1,80 litraa) ja liuosta sekoitettiin 18 tunnin ajan. Metanoli haihdutettiin ja vesikerros tehtiin happamaksi (pH 2) 1 N 10 HCl:lla ja uutettiin metyleenikloridilla. Orgaaniset uutteet pestiin suolavedellä, kuivattiin (Na2SC>4) ja haihdutettiin, jolloin saatiin happo (520,2 g, 90 %) analyysiin kel-paavan puhtaana, valkeana kiinteänä aineena; MS: m/e=349-(M+l, peruspiikki), 305, 241, 206, 116, 91.

15 Analyysi koostumukselle C^gH24N20,-. 0,3 H20:

Laskettu: C 61,11; H 7,01; N 7,92

Saatu: C 61,12; H 6,86; N 7,68 g. (S) -bentsyylioksikarbonyyli-L-valyyli-N-ZTl- (dietoksimetyyli)-2-metyylipropyyli7-L-proliiniamidi 20 (kaava X)

Isobutyyliklooriformiaattia (57,8 g) lisättiin yhtenä annoksena liuokseen, jossa oli esimerkin lf tuotetta (154,3 g) ja 4-metyylimorfoliinia (42,8 g) kuivassa tetrahydrofuraanissa (280 ml) -20°C:ssa. Sen jälkeen, kun 25 oli sekoitettu 10 minuutin ajan, seos jäähdytettiin -40°C:seen ja lisättiin aminoasetaalia, joka oli valmistettu kuten on kuvattu esimerkissä 1, osissa a-d (74,2 g), tetrahydrofuraanissa (700 ml). Seoksen annettiin lämmetä huoneen lämpötilaan ja sekoitettiin 16 tunnin ajan ennen 30 kuin se suodatettiin ja haihdutettiin. Jäännös liuotettiin etyyliasetaattiin; pestiin 1 N HCl:lla, kyllästetyllä NaHCOgin vesiliuoksella ja suolavedellä; kuivattiin (Na2S04); ja haihdutettiin. Raaka tuote puhdistettiin "flash" -kromatografian avulla käyttäen gradienttieluutio-35 ta, johon kuului metyleenikloridi, sitten etyyliasetaatti: metyleenikloridi (4:96), (8:92), (25:75), (50:50) ja

II

91072 27 lopuksi etyyliasetaatti, jolloin saatiin 156 g tuotetta. Epäpuhtaat fraktiot kromatografoitiin uudelleen korkea-painenestekromatografin avulla (Waters Prep 500 HPLC käyttäen 2 silikageelikolonnia), eluoiden etyyliasetaatti: 5 metyleenikloridilla, jolloin saatiin vielä 22 g tuotetta; TLC: Rj=0,47, etyyliasetaatti:metyleenikloridi (25:75).

h. (S)-bentsyylioksikarbonyyli-L-valyyli-N-(1-formyyli-2-metyylipropyyli)-L-proliiniamidi (kaava XI)

Liuos, jossa oli esimerkin lg tuotetta (16,97 g) 10 asetonissa (800 ml), lisättiin liuokseen, jossa oli väkevää HCl:a (45 ml) vedessä (2,6 litraa), ja liuosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 16 tunnin ajan. Lisättiin etyyliasetaattia ja vesikerrosta uutettiin etyyliasetaatilla. Orgaaniset uutteet kuivattiin (MgSO^) ja haihdutet-15 tiin, jolloin saatiin 12,8 g kellertävää öljyä; TLC:

Rf=0,61, etyyliasetaatti:heksaanien seos (4:1); MS: m/e=432(M+l, peruspiikki), 199.

h-1. Erityisen hyvänä pidetty menetelmä esimerkin lg asetaalituotteen muuttamiseksi esimerkin lh aldehydi-20 tuotteeksi on seuraavanlainen:

Sekoitettuun liuokseen, jossa oli esimerkin lg asetaalituotetta (18,80 g) asetonissa (800 ml) typpikaasun alla, lisättiin p-tolueenisulfonihappoa (360 mg).

Seosta sekoitettiin 23 tunnin ajan ja liuotin haihdutet-25 tiin. Jäännös laimennettiin etyyliasetaatilla ja pestiin (kyllästetty natriumbikarbonaatti, suolavesi), kuivattiin (Na2SO^) ja haihdutettiin, jolloin saatiin 15,68 g (97 %) esimerkin lh aldehydituotetta; TLC: R^=0,48, asetoni: heksaanien seos (45:55); MS: m/e=460(M+29), 433(M+2), 30 432(m+1), 331, 199.

i. Bentsyylioksikarbonyyli-L-valyyli-N-£l-(syaani-hydroksimetyyli)-2-metyylipropyylij-L-proliiniamidi (kaava XIII, W=CN)

Kiinteä KCN:a (7,74 g, 119 mmoolia) lisättiin liuok-35 seen, jossa oli esimerkin lh tuotetta (12,8 g) tetrahydro-furaanissa (150 ml) ja vedessä (128 ml). Saatua seosta 28 sekoitettiin 4,5 tunnin ajan ja sen annettiin sitten jakaantua etyyliasetaatin ja veden kesken. Vesikerrosta uutettiin etyyliasetaatilla; yhdistetyt orgaaniset kerrokset pestiin kyllästetyllä NaHCO^sn vesiliuoksella ja suolave-5 dellä, kuivattiin (10 % (paino/paino) K2C03/Na2S04) ja haihdutettiin, jolloin saatiin 14,0 g raakaa syaanihydrii-niä; TLC: Rj=0,17, asetoni:heksaanien seos (1:3).

i-1. Vaihtoehtoinen, erityisen hyvänä pidetty menetelmä esimerkin li tuotteen valmistamiseksi on kuvattu esi-10 merkissä 4a j. Bentsyylioksikarbonyyli-L-valyyli-N-/T·” (2-bentsoksatsolyyli)hydroksimetyyli-2-metyylipropyyli7-L-proliiniamidi (kaava XIV, heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=2-bentsoksatsolyyli) 15 Liuos, jossa oli asetyylikloridia (9,50 ml) eette rissä (15 ml), lisättiin liuokseen, jossa oli absoluuttista etanolia (10,8 ml) eetterissä (33 ml) 0°C:ssa 20 minuutin aikana. Sen jälkeen kun oli sekoitettu 0°C:ssa vielä 15 minuutin ajan, lisättiin esimerkin li tuotetta (käytet-20 tiin ilman lisäpuhdistusta) (7,70 g) kloroformissa (15 ml), ja liuosta sekoitettiin 0°C:ssa 16 tunnin ajan. Liuottimet haihdutettiin, jäännös liuotettiin absoluuttiseen etanoliin (80 ml) ja lisättiin 2-aminofenolia (1,83 g). Sen jälkeen kun oli kuumennettu 60°C:ssa 3 tunnin ajan, liuotettiin 25 seos etyyliasetaattiin, pestiin 1 N NaOHtlla ja suolavedellä, kuivattiin (10 % (paino/paino) K2C03/Na2S04) ja haihdutettiin. Raaka tuote "flash" -kromatografoitiin eluoiden asetoni:heksaanien seoksella (3:17), jolloin saatiin 3 fraktiota kellertävää vaahtoa: fraktio yksi, TLC: Rf=0,30, 30 asetoni:heksaani (3:17), MS: m/e=551(M+l), yksi isomeeri, 136 mg; fraktio kaksi, TLC: R^=0,25-0,17, asetoni:heksaani (3:17), kaikki neljä isomeeriä, 1,77 g; fraktio 3, TLC: R^=0,17-0,08, asetoni:heksaani (3:17), kolme isomeeriä, 2,45 g.

11 91072 29 k. L-valyy 1ί-Ν-/.ϊ- (2-bentsoksatsolyyli) hydroksi-metyyli-2-metyylipropyyli7-L-proliiniamidi (kaava XV, he-terosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=2-bentsoksat- 5 solyyli)

Seosta, jossa oli 10 % palladioitua hiiltä (300 mg, 50 % vettä kostukkeena) ja esimerkin lj tuotetta, fraktiota kolme (2,45 g) etanolissa (100 ml), hydrattiin raviste-lukoneessa käyttäen 3,4 barin painetta 6 tunnin ajan, min-10 kä jälkeen lisättiin lisämäärä palladioitua hiiltä (300 mg) ja seosta hydrattiin vielä 3 tunnin ajan. Seos suodatet-tii piimään lävitse ja liuotin haihdutettiin. Jäännös liuotettiin etyyliasetaattiin, uutettiin 1 N HCl:on ja happopi-toinen vesikerros pestiin etyyliasetaatilla, tehtiin emäk-15 siseksi 1 N NaOH:lla ja uutettiin etyyliasetaatilla. Orgaaninen liuotin haihdutettiin, jolloin saatiin 1,40 g (76 %) kiinteää ainetta. R^=0,0-0,15, metanoli:kloroformi (1:19); MS: m/e=471 (M+l),399.

l. Z4-/~(4-kloorifenyyli) sulfonyyliaminokarbonyyli7-20 bentsoyyli7-L-valyyli-N-/l-(2-bentsoksatsolyyli)hydroksi- metyyli-2-metyylipropyyli7-L-proliiniamidi (kaava III, heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=2-bentsoksat-solyyli, A=CO, L=p-fenyleeni, R^=R^.S(O2).NH.CO-, R^= 4-ClC,H.) 6 4 25 1-(3-dimetyyliaminopropyyli)-3-etyylikarbodi-imidiä (710 mg) lisättiin liuokseen, jossa oli esimerkin lk tuotetta (1,38 g), 1-hydroksibentsotriatsolia (983 mg) ja 4-/(4-kloorifenyyli)sulfonyyliaminokarbonyyli/bentsoehap-poa (katso jäljempänä olevia osia n ja o)(1,12 g) tetra-30 hydrofuraanissa (18 ml); ja liuosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 16 tunnin ajan. Seoksen annettiin jakaantua veden ja etyyliasetaatin kesken; orgaaninen faasi pestiin 1 N HCl:lla ja suolavedellä, kuivattiin (MgSO^) ja haihdutettiin. Raaka tuote puhdistettiin "flash" -kromatografiän 35 avulla eluoiden etyyliasetaatti:eetterisetikkahapolla 30 (60:40:2 tippa/ml), jolloin saatiin 1,2 g kiinteää ainetta; TLC: R^=0,42, metanoli:kloroformi:etikkahappo (5:95:1 tippa/ml); MS: m/e=738(M+l), 421, 318.

Analyysi koostumukselle C36H4oClN5°8S.1,4H20: 5 Laskettu: C 56,64; H 5,65; N 9,17

Saatu: C 56,97; H 5,39; N 8,67 m. (S) -/4-/.(4-kloorifenyyli) sulfonyyliamino-karbonyyli7bentsoyyli7-L-valyyli-N-/T-(2-bentsoksatsolyyli)-karbonyyli-2-metyylipropyyli7-L-proliiniamidi (kaava I, 10 heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=2-bentsoksat-solyyli, A=CO, L=£-fenyleeni, R4=R^.S(02).NH.CO-, R5= 4-ClC6H4)

Trifluorietikkahappoa (0,712 ml) lisättiin liuokseen, jossa oli esimerkin 1, osa 1 tuotetta (1,15 g) ja 15 Dess-Martinin perjodinania (2,65 g) metyleenikloridissa (15 ml); ja liuosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 16 tunnin ajan. Saadun suspension annettiin jakaantua etyyliasetaatin ja 1 N HCl:n kesken. Orgaaninen liuos pestiin kahdella annoksella 1:1 (paino/paino) kyllästettyä 20 Na2S203:NaHCOg-vesiliuosta, kyllästetyllä NaHCO^in vesi- liuoksella ja suolavedellä; kuivattiin (MgS04) ja haihdutettiin. Raaka tuote puhdistettiin "flash" -kromatografiän avulla eluoiden tetrahydrofuraani:metyleenikloridi:etikka-hapolla (2,5:97,5:1 tippa/ml), jolloin saatiin 889 mg kiin-25 teää ainetta. Toinen puhdistus suoritettiin "flash" -kromatograf iän avulla käyttäen hapanta silikageeliä ja eluoiden metanoli:kloroformilla (2,5:97,5), jolloin saatiin otsakkeen yhdiste (701 mg) kiinteänä aineena; TLC: R^=0,47, etyyliasetaatti:heksaanien seos:etikkahappo (65:35:1 30 tippa/ml); HPLC: t =9,27, Koi B, virtausnopeus=4, vesi: asetonitriili:tetrahydrofuraani:trifluorietikkahappo (55:35:15:0,1); MS: m/e=736(M+l), 718, 421, 298.

Analyysi koostumukselle C3gH3gClNgOgS.l,25 H20:

Laskettu: C 56,12; H 5,47; N 9,09 35 Saatu: C 56,24; H 5,07; N 8,74

II

91072 31

Bentsoehappovälituote, jota on käytetty kytkemiseen osassa 1, voidaan valmistaa seuraavasti: n. l,l-dimetyylietyyli-4-/l4-kloorifenyyli)-sulfonyyliaminokarbonyyli7bentsoaatti 5 5 litran pyöreäpohjainen kolmikaulakolvi varustet tiin koneellisella sekoituslaitteella ja typen sisäänjoh-toputkella. Reaktiokolviin pantiin metyleenikloridia (2 litraa) ja lisättiin peräkkäin tereftaalihapon mono-t-butyyliesteriä (127,5 g), 4-dimetyyliaminopyridiiniä 10 (70,06 g) ja 4-klooribentseenisulfonamidia (110,04 g) käyt täen metyleenikloridia (400 ml) kiinteiden aineiden huuhto-miseen alas. 1-(3-dimetyyliaminopropyyli)-3-etyylikarbodi-imidihydrokloridia lisättiin annoksittain 10 minuutin aikana käyttäen metyleenikloridia (100 ml) kiinteän aineen 15 huuhtomiseen alas. Sen jälkeen kun reaktioseosta oli sekoitettu yön ajan huoneen lämpötilassa, se haihdutettiin kuivaksi. Jäännöksen annettiin jakaantua etyyliasetaatin ja veden kesken. Orgaaninen liuos pestiin 20 % (paino/ti-lavuus) sitruunahapon vesiliuoksella, kyllästetyllä 20 NaHCO^sn vesiliuoksella ja suolavedellä; kuivattiin (Na2SO^); ja haihdutettiin valkeaksi kiinteäksi aineeksi.

Sen jälkeen kun oli kuivattu tyhjöuunissa 50°C:ssa, saatiin esteri (277 g, 100 %) riittävän puhtaassa tilassa käytettäväksi suoraan seuraavaan vaiheeseen; TLC: R^=0,43, 25 metanoli:kloroformi (15:85). (Lisäpuhdistaminen oli mahdollista uudelleenkiteyttämällä etanoli/vedestä; s.p. yli 300°C).

o. 4-2l4-kloorifenyyli)sulfonyyliaminokarbonyyli?-bentsoehappo 30 3 litran pyöreäpohjainen kolmikaulakolvi varustet tiin koneellisella sekoituslaitteella ja CaC^-kuivaus-putkella. Lisättiin trifluorietikkahappoa (1300 g) ja jäähdytettiin 0°C:seen ja lisättiin esimerkin In tuotetta (79,5 g). Aluksi kiinteä aine liukeni, jolloin muodostui 35 kirkas liuos. 10-15 minuutin kuluttua muodostui runsas saostuma tuotetta, ja reaktioseosta oli vaikea sekoittaa.

32

Voimakas sekoittaminen koneellisen sekoituslaitteen avulla oli oleellisen tärkeää reaktion saattamiseksi loppuun. Reaktioseosta sekoitettiin 0-5°C:ssa 1 tunnin ajan ennen kuin se kaadettiin 1500 ml:aan jää/vettä ja sitä sekoitet-5 tiin 2 tunnin ajan. Saatu kiinteä aine suodatettiin ja kuivattiin. Saatu valkea kiinteä aine (61,5 g, 91 %) uudel-leenkiteytettiin seoksesta 1600 ml absoluuttista etanolia/ 1600 ml vettä, jolloin saatiin bentsoehappo (54 g, 80 %) valkeina neulasina; s.p. 286-288°C; TLC: R^=0,7, metanoli: 10 kloroformi:etikkahappo (10:90:1).

Esimerkki 2 /4-(metyylisulfonyyliaminokarbonyyli)bentsoyyli/-L-valyyli-N-/.1- (2-bentsoksatsolyyli) karbonyyli-2-metyylipropyyli7~L-proliiniamidi (kaava I, heterosykliseen renkaaseen sisältyy 15 X, N ja Q=2-bentsoksatsolyyli, A=CO, L=£-fenyleeni, r4=r5.s(o2).nh.co-, r5=ch3)_ a. (IS)-/.4-(1,1-dimetyylietoksi)karbonyyli- bentsoyyli7-L-valyyli-N-/.l- (2-bentsoksatsolyyli) hydroksi-metyyli-2-metyylipropyyli7’-L-proliiniamidi (kaava XVII, 20 heterosykliseen rengaskaasuun sisältyy X, N ja Q=2-bents-oksatsolyyli, R .L.A=4-£7cH3)3COCO/C6H4CO)

Lisättiin 1-(3-dimetyyliaminopropyyli)-3-etyyli-karbodi-imidihydrokloridia (510 mg) liuokseen, jossa oli esimerkin lk menetelmän mukaan valmistettua tuotetta /jiia-25 teriaalia, joka oli valmistettu esimerkin lj menetelmän mukaan ja saatu (IS)-muodossa, käsiteltiin esimerkin lk menetelmän mukaan ja se saatiin (IS)-muodossa/ (1,00 g), 1-hydroksibentsotriatsolia (720 mg) ja tereftaalihapon mo-no-t-butyyliesteriä (560 mg) tetrahydrofuraanissa (5 ml) 30 0°C:ssa; ja liuoksen annettiin lämmetä huoneen lämpötilaan ja sitä sekoitettiin 16 tunnin ajan. Seoksen annettiin jakaantua veden ja etyyliasetaatin kesken, orgaaninen faasi pestiin 1 N HCl:lla (kaksi kertaa), kyllästetyllä natriumbikarbonaatilla (kaksi kertaa) ja suolavedellä, kuivattiin 35 (MgS04) ja haihdutettiin. Raaka tuote puhdistettiin

II

91072 33 "flash" -kromatografiän avulla eluoiden asetoni:heksaanilla (4:6), jolloin saatiin tuote (1,08 g, 73 %) kiinteänä aineena; TLC: R^=0,7, asetoni:heksaani (45:55); MS: m/e=621 (M+l), 649, 622, 565, 318.

5 Analyysi koostumukselle .0,4 1^0:

Laskettu: C 65,03; H 7,19; N 8,92

Saatu: C 65,06; H 7,05; N 8,72 b. (S)-ΪΛ- (1, l-dimetyylietoksi)karbonyylibentso-yyli7~L-valyyli-N-Zl-(2-bentsoksatsolyyli)karbonyyli-2- 10 metyylipropyyli7-L-proliiniamidi (kaava IV, heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=2-bentsoksatsolyyli, r7.l.a=4-/1ch3)3cocq7c6h4co)

Lisättiin t-butyylialkoholia (0,030 ml) liuokseen, jossa oli esimerkin 3a tuotetta (200 mg) ja Dess-Martinin 15 perjodinania (410 mg) metyleenikloridissa (5 ml), ja liuosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 16 tunnin ajan. Saadun liuoksen annettiin jakaantua etyyliasetaatin ja 1:1 kyllästetyn Na3S203 :NaHCC>3 -liuoksen kesken. Orgaaninen faasi erotettiin ja pestiin 1:1 kyllästetyllä Na2S2C>3 :NaHCC>3 20 -liuoksella (kaksi kertaa) ja suolavedellä, kuivattiin /^CC^:^280^ (1:2, paino:paino)y ja haihdutettiin. Raaka tuote puhdistettiin "flash" -kromatografiän avulla eluoiden asetoni:heksaanien seoksella (1:3), jolloin saatiin tuote (161 mg, 80 %) kiinteänä aineena; TLC: R^=0,35, 25 asetoni:heksaanien seos (1:3); HPLC: tR=7,86, Koi A, vir-tausnopeus=2, vesi:asetonitriili (40:60); MS: m/e=619 (M+l), 563, 316, 304, 204, 120, 115.

Analyysi koostumukselle C34H42N4°7 · 0 # 4 HjO:

Laskettu: C 65,24; H 6,89; N 8,95 30 Saatu: C 65,26; H 6,74; N 8,84 c. (4-karboksibentsoyyli)-L-valyyli-N-/l-(2-bentsoksatsolyyli)karbonyyli-2-metyylipropyyli7-L-proliini-amidi (kaava IV, heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=2-bentoksatsolyyli, R7.L.A=4-(HOOC)CgH^CO) 35 Liuosta, jossa oli esimerkin 3b tuotetta (770 mg) trifluorietikkahapossa (5 ml), sekoitettiin huoneen lämpötilassa 2 tunnin ajan. Sitten haihdutettiin liuotin. Jäi- 34 jelle jäänyt öljy laimennettiin eetterillä ja saatu liuos haihdutettiin. Tämä menettely toistettiin 6 kertaa. Ruskea öljy pantiin sitten suurtyhjöön 48 tunnin ajaksi. Raaka happo (nyt vaahto) puhdistettiin "flash" -kromatografiän 5 avulla eluoiden asetoni:heksaani:etikkahapolla (40:60:1), jolloin saatiin tuote (680 mg, 96 %) keltaisena kiinteänä aineena; TLC: R^=0,23, asetoni:heksaanien seos:etikkahappo (4:6:1 tippa/ml); MS: m/e=563 (M+l), 545, 316, 298, 248, 245, 220, 204, 149, 148, 120.

10 Analyysi koostumukselle .0,2 NaOH.0,55 I^O:

Laskettu: C 62,07; H 6,13; N 9,65

Saatu: C 61,70; H 5,95; N 9,92 d. Z.4- (metyylisulfonyyliaminokarbonyyli)bentsoyy-li/ -L-valyy li-N-Z.1- (2-bentsoksatsolyyli) karbonyyli-2-metyy-15 lipropyyli7-L-proliiniamidi (kaava I, heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=2-bentsoksatsolyyli, A=CO, L=£-fenyleeni, R4=R5 . S (C>2 ) .NH.CO-, R5=CH3) 1-(3-dimetyyliaminopropyyli)-3-etyylikarbodi-imidi-hydrokloridia (78 mg) lisättiin liuokseen, jossa oli esi-20 merkin 3c tuotetta (200 mg), 4-dimetyyliaminopyridiiniä (58 mg) ja metaanisulfonamidia (37 mg) metyleenikloridissa (2 ml) ja liuosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 16 tunnin ajan. Sen jälkeen kun oli haihdutettu liuottimet, annettiin jäännöksen jakaantua etyyliasetaatin ja 1 N HCl:n 25 kesken. Orgaaninen kerros erotettiin, pestiin 1 N HCl:lla, kuivattiin (MgS04) ja haihdutettiin. Raaka tuote puhdistettiin "flash" -kromatografiän avulla eluoiden etyyli-asetaatti:eetteri:etikkahapolla (20:80:1), jolloin saatiin tuote (74,2 mg, 32 %) kiinteänä aineena; TLC: R^=0,10, 30 eetteri:etikkahappo (100:1); HPLC: t^=6,03, Koi B, vir-tausnopeus=2, vesi:asetonitriili:tetrahydrofuraani:tri-fluorietikkahappo (55:35:13:0,1); MS: m/e=640 (M+l), 622, 326, 325, 316, 298, 247, 201.

Analyysi koostumukselle C^H^NgOgS. 0,8 CH3C02H: 35 Laskettu: C 56,93; H 5,89; N 10,18

Saatu: C 57,22; H 5,97; N 9,79

II

91072 35

Esimerkki 3 (S) -/.4- ( fenyylisulfonyyliaminokarbonyyli) bentsoyyli/-L-valyyli-N-/l-(2-bentsoksatsolyyli)karbonyyli-2-metyyli-propyyli7-L-proliiniamidi (kaava I, heterosykliseen ren-5 kaaseen sisältyy X, N ja Q=2-bentsoksatsolyyli, A=CO, L=£-fenyleeni, R4=R5.S(O.J .NH.CO-, R5=CCH,-)_ a. 4-(fenyylisulfonyyliaminokarbonyyli)bentsoe- happo Käyttäen samankaltaisia menetelmiä kuin ne, jotka 10 on kuvattu esimerkissä 1 osissa n ja o, paitsi että käytettiin bentseenisulfonamidia 4-klooribentseenisulfon-amidin asemesta, saatiin bentsoehappo kiinteänä aineena; s.p. 259-261°C.

b. (IS)-/4-(fenyylisulfonyyliaminokarbonyyli)-15 bentsoyyl£7-L-valyyli-N-/l-(2-bentsoksatsolyyli)hydroksi- metyyli-2-metyylipropyyli/-L-proliiniamidi (kaava III, heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=2-bents- 4 5 oksatsolyyli, A=C0, L=£-fenyleeni, R =R .S(C^).NH.CO-, R5=C6H5> 20 Lisättiin 1-(3-dimetyyliaminopropyyli)-3-etyyli- karbodi-imidihydrokloridia (140 mg) liuokseen, jossa oli esimerkin lk tuotetta (290 mg) 1-hydroksibentsotriatsolia (200 mg) ja 4-(fenyylisulfonyyliaminokarbonyyli)bentsoe-happoa (179 mg) tetrahydrofuraanissa (4 ml); ja liuosta 25 sekoitettiin huoneen lämpötilassa 16 tunnin ajan. Seoksen annettiin jakaantua veden ja etyyliasetaatin kesken. Orgaaninen faasi pestiin kyllästetyllä NaHCO^-liuoksella (3 kertaa) ja suolavedellä, kuivattiin (MgSO^) ja haihdutettiin. Vesikerrokset yhdistettiin, tehtiin happamaksi 30 pH l:een väkevällä HClilla ja uutettiin kloroformilla.

Kloroformifaasi kuivattiin /K2C03:Na2S04 paino:pai no)^ ja haihdutettiin. Etyyliasetaatti ja kloroformiliuok-sista saadut raakatuotteet yhdistettiin ja puhdistettiin "flash" -kromatografiän avulla eluoiden asetonisheksaanien 35 seos:etikkahapolla (45:55:1), jolloin saatiin tuote 36 (270 mg, 60 %) kiinteänä aineena; R^=0,15, asetoni:heksaa-ni:etikkahappo (30:70:1 tippa/ml); MS: m/e=704 (M+l), 686, 387, 346, 318, 316, 300, 158, 120.

Analyysi koostumukselle C^gH^N^OgS. 0,8 CH^CC^H: 5 Laskettu: C 58,79; H 6,03; N 9,07

Saatu: C 59,11; H 6,02; N 8,68 c. (S)-Λ4-(fenyylisulfonyyliaminokarbonyyli)- bentsoyyli/-L-valyyli-N-/_l- (2-bentsoksatsolyyli) karbonyyli-2-metyylipropyyli/-L-proliiniamidi (kaava I, heterosykli-10 seen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=2-bentsoksatsolyyli, A=CO, L=£-fenyleeni, R4=R5.S(02).NH.CO-, R5=CgH5)

Lisättiin trifluorietikkahappoa (0,09 ml) liuokseen, jossa oli esimerkin 4b tuotetta (270 mg) ja Dess-Martinin perjodinania (490 mg) metyleenikloridissa (5 ml) 15 ja liuosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 16 tunnin ajan. Saatu liuos laimennettiin etyyliasetaatilla ja pestiin (4 kertaa 4:1 suolavesi:kyllästetty ^2820^:NaHCOg (1:1) -liuoksella, kerran suolavedellä), kuivattiin (MgSO^) ja haihdutettiin. Raaka tuote puhdistettiin "flash" 20 -kromatografiän avulla eluoiden asetoni:heksaanien seos: etikkahapolla (40:60:1). Tästä pylväästä saatu kiinteä aine puhdistettiin lisäksi "flash" -kromatografiän avulla käyttäen hapanta silikageeliä ja eluoiden kloroformilla, jolloin saatiin otsakkeen yhdiste (152 mg, 57 %) kiinteänä 25 aineena; TLC: R^=0,23, asetoni:heksaanien seos:etikkahappo (40:60:1); HPLC: tR=10,09, Koi B, virtausnopeus=2, vesi:asetonitriili:tetrahydrofuraani:trifluorietikkahappo (55:35:15:0,1); MS: m/e=702 (M+l), 326, 299, 298, 297, 201, 136.

30 Analyysi koostumkselle C^gH^gN^OgS.0,75 NaOH.0,25 I^O: Laskettu: C 58,72; H 5,51; N 9,51

Saatu: C 58,38; H 5,34; N 9,28 11 91072 37

Esimerkki 4 (S) -Z."4~ZT(4-kloorifenyyli) sulfonyyliaminokarbonyyli/-bentsoyyli/-L-valyyli-N-/.l~· (5-metoksibentsoksatsol-2-yyli)karbonyyli-2-metyylipropyyli7-L-proliiniamidi (kaava 5 I, heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=5-metoksi- 4 5 bentsoksatsol-2-yyli, A=C0, L=p-fenyleeni, R =R .S(02).-NH.CO-, R5=4-C1CcH4)_ a. (IS)-bentsyylioksikarbonyyli-L-valyyli-N-£l-(syaanihydroksimetyyli)-2-metyylipropyyli/-L-proliiniamidi 10 (kaava XIII, W=CN)

Vaihtoehtoinen, erityisen hyvänä pidetty menetelmä esimerkin li tuotteen valmistamiseksi on seuraavanlainen: 250 ml:n pyöreäpohjäinen kolvi, jossa oli sekoitin, kuivattiin tyhjössä ja huuhdeltiin typellä. Pulloon pantiin di-15 kloorimetaania (120 ml), minkä jälkeen lisättiin aldehydiä, joka oli valmistettu kuten on kuvattu esimerkissä lh, (17,7 g) ja trietyyliamiinia (3,4 ml). Lisättiin asetoni-syaanihydriiniä (11,0 ml) yhtenä annoksena. Reaktioseosta sekoitettiin 21 tunnin ajan. Raaka reaktioseos laimennet-20 tiin dikloorimetaanilla. Tämä liuos pestiin huolellisesti (kaksi kertaa kyllästetyllä ammoniumkloridilla, kerran suolavedellä) , kuivattiin (MgS04) ja liuotin haihdutettiin.

Raaka tuote liuotettiin etyyliasetaattiin, pestiin (kerran kyllästetyllä ammoniumkloridilla, kerran suolavedellä, kui-25 vattiin (MgSC>4) ja haihdutettiin. Saatua vaahtoa kuumennettiin 50°C:seen tyhjössä neljän päivän ajan, jolloin saatiin 18,90 g (100 %) tuotetta; TLC: R^=0,31, asetonirheksaanien seos (40:60).

b. (IS)-bentsyylioksikarbonyyli-L-valyyli-N-£3- 30 etoksi-2-hydroksi-3-imino-l-(1-metyylietyyli)propyyli/-L- proliiniamidihydrokloridi (kaava XIII, W=C(NH)OR, R=C2H^)

Sekoitettuun liuokseen, jossa oli etanolia (79,4 ml) kloroformissa (80 ml) 0°C:ssa typen alla, lisättiin tipoittain asetyylikloridia (87,7 ml) 25 minuutin ai-35 kana. Lisättiin esimerkin 4a tuotetta (18,81 g) kloroformissa (80 ml) ja reaktioseosta sekoitettiin 0°C:ssa 38 4 tunnin ajan. Liuottimet haihdutettiin, jolloin saatiin tuote (20,89 g); TLC, sen jälkeen kun näytteen oli annettu jakaantua etyyliasetaatin ja 1 N NaOHrn kesken vapaan iminoeetterin muodostamiseksi: R^=0,45, metanoli:kloroformi 5 (7,5:92,5).

c. 2-amino-4-metoksifenoli

Seosta, jossa oli 10 % (paino/paino) palladioitua hiiltä (200 mg) ja 4-metoksi-2-nitrofenolia (3,0 g) etanolissa (100 ml), hydrattiin ravistelukoneessa käyttäen 3,4 10 baarin painetta 24 tunnin ajan. Seos suodatettiin piimään lävitse ja haihdutettiin, jolloin saatiin tuote (2,3 g); TLC: R^=0,61, metanoli:kloroformi (1:9); MS: m/e=170 (M+l), 164, 152 (peruspiikki), 124.

d. (IS)-bentsyylioksikarbonyyli-L-valyyli-N- 1-15 (hydroksi)-(5-metoksibentsoksatsol-2-yyli)metyyli-2-metyy- lipropyyli/-L-proliiniamidi (kaava XIV, heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=5-metoksibentsoksatsol-2-yyli)

Sekoitettua liuosta, jossa oli esimerkin 4b imid-20 aattia (6,35 g) ja 2-amino-4-metoksifenolia (1,525 g) kuivassa etanolissa (40 ml), kuumennettiin 8 tunnin ajan 60°C:ssa typpikaasun alla. Seos liuotettiin etyyliasetaattiin, pestiin (1 N HC1, kyllästetty natriumbikarbonaatti, suolavesi) , kuivattiin (10 % (paino/paino) 25 ja haihdutettiin. Raaka tuote "flash" -kromatografoitiin eluoiden asetoni:heksaanien seoksella (30:70), jolloin saatiin tuote (983 mg). Sekafraktiot yhdistettiin, haihdutettiin ja "flash" -kromatografoitiin eluoiden asetoni: heksaanien seoksella (35:65), jolloin saatiin lisää tuotet-30 ta (588 mg); TLC: R^=0,28, asetoni:heksaanien seos (40:60); MS: m/e=582 (M+2), 581 (M+l), 563, 473, 331, 261, 195, 107, 91, 79, 70.

e. (IS)-L-valyyli-N-/l-(hydroksi)(5-metoksi-bentsoksatsol-2-yyli)-metyyli-2-metyylipropyyli7-L-pro- 35 liiniamidi (kaava XV, heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=5-metoksibentsoksatsol-2-yyli)

Seosta, jossa oli 10 % (paino/paino) palladioitua 11 91072 39 hiiltä (300 mg) ja esimerkin 4d tuotetta (1,54 g) etanolissa (100 ml), hydrattiin ravistelukoneessa käyttäen 3,4 barin painetta 4 tunnin ajan, minkä jälkeen seos suodatettiin piimään lävitse ja liuotin haihdutettiin. Jäännös uu-5 delleenliuotettiin etanoliin (100 ml), lisättiin 10 % palladioitua hiiltä (0,69 g) ja seosta hydrattiin ravistelukoneessa käyttäen 3,4 baarin painetta 4 tunnin ajan. Seos suodatettiin sitten piimään lävitse ja liuotin haihdutettiin, jolloin saatiin 990 mg (83 %) kiinteää ainetta; 10 R^=0,0, metanoli:kloroformi (1:19); MS: m/e=475 (M+29), 447 (M+l), 429, 348, 234, 233, 197, 180, 179, 178, 155, 150, 100, 72, 70.

f. (IS) -,/4-£(4-kloorifenyyli) sulfonyyliamino-karbonyyli7bentsoyyli.7-L-valyyli-N-.Zl- (hydroksi) (5-metoksi-15 bentsoksatsol-2-yyli)metyyli-2-metyylipropyyli/-L“prolii-niamidi (kaava III, heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=5-metoksibentsoksatsol-2-yyli, A=CO, L=£-fenyleeni, R4=R5.S(02).NH.CO-, R5=4-C1C6H4)

Lisättiin 1-(3-dimetyyliaminopropyyli)-3-etyyli-20 karbodi-imidihydrokloridia (470 mg) liuokseen, jossa oli esimerkin 4e tuotetta (990 mg), 1-hydroksibentsotriatsolia (330 mg) ja esimerkin 1 osan o tuotetta (830 mg) tetrahyd-rofuraanissa (7 ml); ja liuosta sekoitettiin ympäristön lämpötilassa 16 tunnin ajan. Reaktioseosta säilytettiin 25 sitten -78°C:ssa 36 tunnin ajan. Reaktioseos laimennettiin etyyliasetaatilla, pestiin (kyllästetty natriumbikarbonaatit, 1 N HC1, suolavesi), kuivattiin (^SO^) ja haihdutettiin. Saatu kiinteä aine uudelleenliuotettiin etyyliasetaattiin, pestiin (kyllästetty natriumbikarbonaatti, 1 N 30 HC1, suolavesi), kuivattiin (Na2SC>4) ja haihdutettiin.

Raaka tuote puhdistettiin "flash" -kromatografiän avulla eluoiden asetoni:kloroformiretikkahapolla (20:80:1), jolloin saatiin tuote (976 mg) kiinteänä aineena; TLC:

Rj=0,25, asetoni:kloroformi:etikkahappo (35:65:1), MS: 35 m/e=768 (M+l), 752, 751, 750, 423, 422, 421, 402, 377, 348, 330.

40

Analyysi koostumukselle C^H^CIN^O^S.1,8 CH3C02H:

Laskettu: C 55,97; H 5,63; N 8,16

Saatu: C 56,14; H 5,76; N 7,95 g. (S) -Z4-/T(4-kloorifenyyli) sulfonyyliamino-5 karbonyyli7bentsoyyli/-L-valyyli-N-/l-(5-metoksibents-oksatsol-2-yyli)karbonyyli-2-metyylipropyyli7-L-proliini-amidi (kaava I, heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=5-metoksibentsoksatsol-2-yyli, A=CO, L=£-fenyleeni, R4=R5.S(02).NH.CO-, R5=4-ClCgH4) 10 Lisättiin t-butanolia (0,116 ml) liuokseen, jossa oli esimerkin 4f tuotetta (947,6 mg) ja Dess-Martinin per-jodinania (1,57 g) dikloorimetaanissa (6 ml), ja liuosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 21 tunnin ajan. Saatu suspensio laimennettiin etyyliasetaatilla ja pestiin 15 (kaksi kertaa 1:1 kyllästetty Na2S2C>3: kyllästetty NaHCC>3 -liuoksella, kerran 1 N HClilla, suolavedellä), kuivattiin (MsSO^) ja haihdutettiin. Raaka tuote puhdistettiin "flash" -kromatografiän avulla eluoiden asetoni:heksaani:etikkaha-polla (50:50:1), jolloin saatiin tuote (703 mg) kiinteänä 20 aineena; TLC: R^=0,47, etyyliasetaatti:heksaanien seos: etikkahappo (65:35:1); MS: m/e-766 (M+l), 750, 749, 748, 422, 421, 329, 328, 327, 326, 249, 231.

Laskettu: C 55,26; H 5,51, N 8,22

Saatu: C 55,16; H 5,20, N 8,08 25 Esimerkki 5 (S) -£4-Z~(4-kloorifenyyli) sulfonyyliaminokarbonyyli7bentso- yyli/-L-valyyli-N-/.l- (5-hydroksibentsoksatsol-2-yyli) - karbonyyli-2-metyylipropyyli7~L-proliiniamidi (kaava I, heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=5-hydroksi- 4 5 30 bentsoksatsol-2-yyli, A=CO, L=£-fenyleeni, R =R .S(02).- NH.CO-, R5 = 4-C1CcH4)_

Booritribromidia (3,55 ml, 1,0 M dikloorimetaanissa) lisättiin liuokseen, jossa oli esimerkin 4g tuotetta (680 mg) dikloorimetaanissa (5 ml) 0°C:ssa, ja 35 annettiin lämmetä huoneen lämpötilaan. 3 tunnin kuluttua annettiin reaktioseoksen jakaantua etyyliasetaatin ja il 91072 Η ί 1 N HCl:n kesken. Etyyliasetaattikerros pestiin (suolavesi), kuivattiin (MgSO^) ja haihdutettiin. Raaka tuote puhdistettiin "flash" -kromatografiän avulla eluoiden metanoli:kloroformi : etikkahapolla (1:98:1), jolloin saatiin tuote (236 mg, 5 35 %) keltaisena kiinteänä aineena; TLC: R^=0,28, metanoli: kloroformi:etikkahappo (5:94:1); HPLC: tR=6,75 Koi A, vir-tausnopeus=3, vesi:asetonitriili:tetrahydrofuraani:trifluo-rietikkahappo (55:35:15:0,1); MS: m/e=752 (M+l), 734, 421, 377, 342, 314 (peruspiikki).

10 Analyysi koostumukselle C^gH^gClN^OgS.0,2 CHCl.j.0,3 CH^COOH.- 1,5 H20:

Laskettu: C 53,83; H 5,20; N 8,53

Saatu: C 53,65; H 4,96; N 8,37

Esimerkki 6 15 L^~L(4-kloorifenyyli)sulfonyyliaminokarbonyyli/bentsoyyli/-L-valyyli-N-£l-/5-(aminokarbonyyli)bentsoksatsol-2-yyli)-karbonyyli-2-metyylipropyyli?-L-proliiniamidi (kaava I, heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=5-(aminokarbonyyli) bentsoksatsol-2-yyli , A=CO, L=£-fenyleeni, 20 R4=R5.S(Q2) .NH.CO-, R5=4-C1C(.H1)_ a. 3-amino-4-hydroksibentsamidi

Liuosta, jossa oli 3-amino-4-hydroksibentsoehappoa (7,73 g) tionyylikloridissa (96 ml), sekoitettiin voimakkaasti typpikaasun alla 40°C:ssa yhden tunnin ajan. Tionyyli-25 kloridi poistettiin tislaamalla alennetussa paineessa ja saatu kiinteä aine suspendoitiin tolueeniin (350 ml). Vedetöntä NH^a kuplitettiin reaktioseokseen 45 minuutin ajan.

Seos suodatettiin piimään lävitse ja suodatuskakkua pestiin runsaalla määrällä asetonia, kunnes juuri tullut suodos oli 30 kirkasta. Asetoniliuos haihdutettiin ja raaka tuote "flash" -kromatografoitiin eluoiden asetoni:kloroformilla (1:1), jolloin saatiin tuote (1,2 g) kiinteänä aineena; TLC: R^=0,17, asetoni:kloroformi (60:40); MS: m/e=193 (M+41), 181 (M+29), 153 (M+l), 136, 110.

42 b. (IS)-bentsyylioksikarbonyyli-L-valyyli-Ν-^Ί-/7>-aminokarbonyyli)-bentsoksatsol-2-yyli7hydroksimetyyli-2-metyylipropyyli7-L-proliiniamidi (kaava XIV, heterosyk-liseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=5-(aminokarbonyyli)-5 bentsoksatsol-2-yyli)

Sekoitettua liuosta, jossa oli esimerkin 4b imid-aattia (3,81 g) ja 3-amino-4-hydroksibentsamidia (1,00 g) kuivassa etanolissa (28 ml), kuumennettiin 2 tunnin ajan 60°C:ssa typpikaasun alla. Seos liuotettiin etyyliase-10 taattiin, pestiin (kaksi kertaa vedellä, kerran kyllästetyllä natriumbikarbonaattiliuoksella, suolavedellä), kuivattiin (MgSO^) ja haihdutettiin. Raaka tuote "flash" -kro-matografoitiin eluoiden asetoni:kloroformilla (60:40), jolloin saatiin tuote (936 mg); TLC: Rf=0,42, tetrahydrofuraa-15 ni:kloroformi (75:25); MS: m/e=622 (M+29), 595 (M+2), 594 (M+l), 505, 478, 477.

Analyysi koostumukselle c31H39N507.2,0 H20:

Laskettu: C 59,13; H 6,88; N 11,12

Saatu: C 59,18; H 6,35; N 11,04 20 c. (lS)-L-valyyli-N-^l-/5-(aminokarbonyyli)- bentsoksatsol-2-yyli7hydroksimetyyli-2-metyylipropyylf7-L- proliiniamidi (kaava XV, heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=5-(aminokarbonyyli)bentsoksatsol-2-yyli)

Seosta, jossa oli 10 % (paino/paino) palladioitua 25 hiiltä (750 mg) ja esimerkin 6b tuotetta (0,920 g) etanolissa (150 ml), hydrattiin ravistelukoneessa käyttäen 3,4 barin painetta 4 tunnin ajan, minkä jälkeen seos suodatettiin piimään lävitse ja liuotin haihdutettiin. Jäännös uudel-leenliuotettiin sitten metanoliin ja haihdutettiin, jolloin 30 saatiin tuote (680 mg, 100 %) kiinteänä aineena; TLC: R^=0,0, metanoli;kloroformi (5:95); MS: m/e=460 (M+l), 247, 225, 198, 197, 196, 154, 125, 91.

Il 4 3 91072 d. (IS) -/.4-/. (4-kloorifenyyli) sulfonyyliamino-karbonyyli/bentsoyyli7-L-valyyli-N-^l-/.5- (aminokarbonyyli) -bentsoksatsol-2-yylf7hydroksimetyyli-2-metyylipropyyli7-L-proliiniamidi (kaava III, heterosykliseen renkaaseen sisäl- 5 tyy X, N ja Q=5-(aminokarbonyyli)bentsoksatsol-2-yyli, A=CO, L=£-fenyleeni, R4=R5.S(02).NH.CO-, R5=4-C1C6H4) 1-(3-dimetyyliaminopropyyli)-3-etyylikarbodi-imidihydrokloridia (292 mg) lisättiin liuokseen, jossa oli esimerkin 6c tuotetta (670 mg), 1-hydroksibentsotriatsolia 10 (206 mg) ja esimerkin 1 osan o tuotetta (507 mg) tetrahydro- furaanissa (5 ml); ja liuosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 16 tunnin ajan. Reaktioseos laimennettiin etyyliasetaatilla ja pestiin kolme kertaa tislatulla vedellä, kerran 1 N HClrlla, kerran kyllästetyllä natriumbikarbonaattiliuok-15 sella ja kerran suolavedellä. Bikarbonaattipesuliuos tehtiin happamaksi pH l:een ja uutettiin kolme kertaa etyyliasetaatilla. Yhdistetyt orgaaniset faasit pestiin suolavedellä, kuivattiin (Na2S04) ja haihdutettiin. Raaka tuote "flash" -kromatografoitiin eluoiden tetrahydrofuraani:kloroformi: 20 etikkahapolla (70:30:1). Saatu materiaali suodatettiin sili-kageelin lävitse eluoiden tetrahydrofuraani:kloroformi: etikkahapolla (30:70:0 - 30:70:1 - 100:0:1), jolloin saatiin tuote (350 mg) kiinteänä aineena; TLC: Rf=0,55, tetrahydrofuraani: kloroformi:etikkahappo (80:20:1); MS: m/e=247, 197, 25 163.

e. Z4-/”(4-kloorifenyyli) sulfonyyliaminokarbonyyli./.-bentsoyyli?“L-valyyli-N-/i-(5-(aminokarbonyyli)bentsoksatsol-2-yyli)karbonyyli-2-metyylipropyyli7-L-proliiniamidi (kaava I, heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=5-(amino- 30 karbonyyli)bentsoksatsol-2-yyli, A=CO, L=p-fenyleeni, R4=R5.S(02).NH.CO-, R5=4-C1C6H4)

Lisättiin pyridiiniä (0,422 ml) suspensioon, jossa oli kromitrioksidia (261 mg) kuivassa dikloorimetaanissa (27 ml), ja seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 30 mi-35 nuutin ajan. Lisättiin piimaata (0,5 g) seokseen, jota sekoitettiin vielä 5 minuutin ajan. Lisättiin esimerkin 6d 44 tuotetta (340 mg) kuivassa dimetyyliformamidissa (1,5 ml) ja seosta sekoitettiin 3,5 tunnin ajan. Saatu suspensio suodatettiin piimään lävitse ja haihdutettiin. Jäännöstä uutettiin kloroformilla ja suodatettiin piimään lävitse.

5 (Pidetään parempana käyttää uuttamiseen metanolia). Tämä menettely toistettiin kuusi kertaa. Suodokset yhdistettiin ja haihdutettiin. Saatu kiinteä aine "flash" -kromatografoitiin eluoiden tetrahydrofuraani:kloroformi:etikkahapolla (55:45:1). Saatu kiinteä aine suodatettiin silikageelin lä-10 vitse eluoiden ensin kloroformilla, sitten tetrahydrofuraani : etikkahapolla (99:1). Saatu kiinteä aine "flash" -kromatografoitiin jälleen eluoiden tetrahydrofuraani:heksaanien seos:etikkahapolla (60:40:1), jolloin saatiin tuote (37,5 mg); TLC: R^=0,50, metanoli:kloroformi:etikkahappo 15 (10:90:1); HPLC: tR=7,23, Koi A, virtausnopeus=l, vesi: asetonitriili:tetrahydrofuraani:trifluorietikkahappo (55:35:15:0,1); MS: m/e=777 (M+l), 761, 421, 342, 341, 340, 339, 192.

Analyysi koostumukselle C^^H^gClNgOgS.0,90 Ι^Ο.Ι,Ο CH^CC^H: 20 Laskettu: C 54,75; H 5,28; N 9,82

Saatu: C 55,07; H 5,41; N 9,57

Esimerkki 7 £$-L( 4-kloorifenyyli)sulfonyyliaminokarbonyyli/bentsoyyli7” L-valyyli-N-ZJ-ZB-(hydroksimetyyli)bentsoksatsol-2-yyli/- 25 karbonyyli-2-metyylipropyyl£7-L-proliiniamidi (kaava I, heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=5-(hydroksi- 4 5 metyyli)bentsoksatsol-2-yyli, A=CO, L=£-fenyleeni, R =R .- S (02) .NH.CO-, R5 = 4-C1C(.H1)_ a. 3-amino-4-hydroksibentsyylialkoholi 30 Seosta, jossa oli 10 % (paino/paino) palladioitua hiiltä (5,25 g) ja 4-hydroksi-3-nitrobentsyylialkoholia (25,0 g) etanolissa (1,3 litraa) hydrattiin ravistelukonees-sa käyttäen 3,4 barin painetta 23 tunnin ajan, minkä jälkeen seos suodatettiin piimään lävitse ja haihdutettiin. Jäännös 35 "flash" -kromatografoitiin eluoiden metanoli:kloroformilla (0:100 - 10:90), jolloin saatiin tuote (11,92 g, 60 %)

II

91072 45 punaisena kiinteänä aineena; TLC: R^=0,14, metanoli:kloroformi (5:95); MS: m/e=140 (M+l), 139, 138, 122, 110.

b. (IS) -bentsyylioksikarbonyyli-L-valyyli-N-Z^l-(hydroksi) £5-(hydroksimetyyli)bentsoksatsol-2-yylf7metyyli-5 2-metyylipropyyli7”L-proliiniamidi (kaava XIV, heterosykli-seen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=5-(hydroksimetyyli)-bentsoksatsol-2-yyli)

Esimerkin 4b tuotetta (3,0 g) ja esimerkin 7a mukaan valmistettua alkoholia (0,771 g) , jotka olivat abso-2o luuttisessa etanolissa (20 ml), kuumennettiin 65°C:ssa 20 tunnin ajan; seos liuotettiin etyyliasetaatiin, pestiin (1 N NaOH, suolavesi), kuivattiin (MgSO^) ja haihdutettiin. Raaka tuote "flash" -kromatografoitiin eluoiden asetoni: heksaanien seoksella (55:45), jolloin saatiin tuote (858 mg) 25 valkeana kiinteänä aineena; TLC: R^=0,26, asetoni:heksaanien seos (3:2); MS: m/e=581 (M+l), 563, 501, 473, 455.

Analyysi koostumukselle C32H40N4°7* *'25 I^O:

Laskettu: C 61,73; H 7,10; N 9,29

Saatu: C 61,81; H 6,86; N 9,09 20 c. (lS)-bentsyylioksikarbonyyli-L-valyyli-N-£l- £5-£(t-butyylidimetyylisilyloksi)metyyl£7bentsoksatsol-2-yyli7hydroksimetyyli-2-metyylipropyyli/-L-proliiniamidi (kaava XIV, heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=5-£( t-butyylidimetyylisilyloksi)metyyli/bentsoksatsol-2-25 yyii)

Liuosta, jossa oli esimerkin 7b tuotetta (736 mg), t-butyylidimetyylisilyylikloridia (380 mg), 4-dimetyyli-aminopyridiiniä (7,8 mg) ja trietyyliamiinia (0,37 ml) dikloorimetaanissa (10 ml), sekoitettiin huoneen lämpöti-30 lassa 16 tunnin ajan. Liuos liuotettiin sitten etyyliasetaattiin, pestiin (1 N HC1, kyllästetty natriumbikarbonaat-tiliuos, suolavesi), kuivattiin (MgSC>4) ja haihdutettiin. Raaka tuote puhdistettiin "flash" -kromatografiän avulla eluoiden asetoni:heksaanien seoksella (1:3), jolloin saa-35 tiin tuote (715 mg, 82 %) vaalean keltaisena kiinteänä aineena; TLC: R^=0,46, asetoni:heksaanien seos (2:3); MS: m/e=695 (M+l), 679, 587, 563, 455.

46

Analyysi koostumukselle C^H^N^O^Si .0, 25 H^O:

Laskettu: C 63,54; H 7,85? N 8,01

Saatu: C 63,44; H 7,75; N 7,54 d. (S)-bentsyylioksikarbonyyli-L-valyyli-N-il-^5- 5 /”(t-butyylidimetyylisilyloksi)metyyli7bentsoksatsol-2-yyli7“ karbonyyli-2-metyylipropyyli7-L-proliiniamidi (kaava VI, heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=5-/_(t-butyyli-dimetyylisilyloksi)metyyli/bentsoksatsol-2-yyli)

Tert-butyylialkoholia (0,068 ml) lisättiin liuok-10 seen, jossa oli esimerkin 7c tuotetta (500 mg) ja Dess-Martinin perjodinania (1,22 g) dikloorimetaanissa (5 ml) ja liuosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 16 tunnin ajan. Saadun suspension annettiin jakaantua etyyliasetaatin ja 1:1 kyllästetty ^2820^:kyllästetty NaHCO^ -liuoksen kesken; 15 kerrokset erotettiin ja etyyliasetaattikerros pestiin (kerran 1:1 kyllästetty Na2S202:kyllästetty NaHCO^ -liuoksella, kaksi kertaa kyllästetyllä NaHCO -liuoksella, kerran suolavedellä) , kuivattiin (MgSO^) ja haihdutettiin. Raaka tuote puhdistettiin "flash" -kromatografiän avulla eluoiden 20 asetoni:heksaanien seoksella (1:3), jolloin saatiin tuote (448 mg, 90 %) valkeana kiinteänä aineena; TLC: R^=0,54, asetoni:heksaanien seos (2:3); HPLC: t =6,18, Koi A, vir-tausnopeus=2, vesi:asetonitriili (1:9); MS: m/e=603 (M+l, peruspiikki), 677, 635, 585, 460.

25 Analyysi koostumukselle C37H52N4°7^i. 0,25 I^O:

Laskettu: C 63,72; H 7,59; N 8,03

Saatu: C 63,84; H 7,45; N 7,70 e. Bentsyylioksikarbonyyli-L-valyyli-N-Z7l~Zj5- (hyd-roksimetyyli)bentsoksatsol-2-yyli/karbonyyli-2-metyylipro- 30 pyyliy-L-proliiniamidi (kaava VI, heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=5-(hydroksimetyyli)bentsoksatsol-2-yyli)

Tetrabutyyliammoniumfluoridia (1,2 ml 1 M liuosta tetrahydrofuraanissa) lisättiin liuokseen, jossa oli esi-35 merkin 7d tuotetta (418 mg) tetrahydrofuraanissa (5 ml).

11 91072 47

Saatua punaista liuosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 10 minuutin ajan ja seisotettiin 5°C:ssa 16 tunnin ajan. Punaisen liuoksen annettiin jakaantua etyyliasetaatin ja 1 N HCl:n kesken ja etyyliasetaattikerros pestiin (kylläs-5 tetty natriumbikarbonaattiliuos, suolavesi), kuivattiin (MgSC>4) ja haihdutettiin. Raaka tuote puhdistettiin "flash" -kromatografiän avulla eluoiden asetoni:heksaanien seoksella (35:65), mitä seurasi toinen puhdistus "flash" -kromatogra-fian avulla eluoiden metanoli:kloroformilla (2,5:97,5), jol-10 loin saatiin tuote (183 mg, 53 %) valkeana kiinteänä aineena? TLC: R^=0,52, asetoni:heksaanien seos (3:2); HPLC: tR=6,27, Koi A, virtausnopeus=l, vesi:asetonitriili (40:60); MS: m/e=579 (M+l), 561, 331, 225, 197, 91 (peruspiikki). Analyysi koostumukselle .1,0 H20: 15 Laskettu: C 62,40? H 6,76? N 9,39

Saatu: C 62,23; H 6,40; N 9,14 f. Z3-Z"(4-kloorifenyyli) sulfonyyliaminokarbonyy-li/bentsoyyli/-L-valyyli-L-£J-/5-(hydroksimetyyli)bentsoks-atsol-2-yylf7karbonyyli-2-metyylipropyyli7-L-proliiniamidi 20 (kaava I, heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=5-(hydroksimetyyli)bentsoksatsol-2-yyli, A=CO, L=£-fenyleeni, r4=r5.s(o2).nh.co-, r5=4-cic6h4)

Trifluorimetaanisulfonihappoa (0,140 ml) lisättiin liuokseen, jossa oli esimerkin 7e menetelmän mukaan valmis-25 tettua materiaalia (182 mg) dikloorimetaanissa (8 ml), sekoitettiin 15 minuutin ajan ja haihdutettiin. Jäännös liuotettiin tetrahydrofuraaniin (10 ml) ja lisättiin 4-dimetyy-liaminopyridiiniä (293 mg), esimerkin 1 osan o tuotetta (113 mg) ja 1-(3-dimetyyliaminopropyyli)-3-etyylikarbodi-30 imidihydrokloridia (66,5 mg9 ja sekoitettiin huoneen lämpötilassa 16 tunnin ajan. Seoksen annettiin jakaantua 1 N HCl:n ja etyyliasetaatin kesken; etyyliasetaattifaasi pestiin (1 N HC1, suolavesi), kuivattiin (MgS04) ja haihdutettiin. Raaka tuote puhdistettiin "flash" -kromatografiän 35 avulla eluoiden metanoli:kloroformi:etikkahapolla (1,5:97,5:1,0), jolloin saatiin tuote (77 mg, 32 %) vaalean 48 keltaisena kiinteänä aineena; TLC: R^=0,28, metanoli:kloroformi :etikkahappo (5:94:1); MS: m/e=766 (M+l), 758, 592, 562, 421, 346, 328.

Analyysi koostumukselle C^H^qCIN^O^S . 1,0 Ι^Ο.Ι,Ο CH^COOH: 5 Laskettu: C 55,48; H 5,49; N 8,29

Saatu: C 55,42; H 5,33; N 8,77

Esimerkki 8 (S) -Z4-/”(4-kloorifenyyli) sulfonyyliaminokarbonyyli7bentsoyy-li/-L-valyyli-N-/l-/5-(metoksikarbonyyli)bentsoksatsol-2-yyli7karbonyyli-2-metyylipropyyli7-L-proliiniamidi (kaava I, heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=5-(metoksi- 4 karbonyyli)bentsoksatsol-2-yyli, A=CO, L=£-fenyleeni, R = R5.S(02) .NH.CO-, R5=4-C1CcH4)_ a. (IS)-bentsyylioksikarbonyyli-L-valyyli-N-£l-(hydroksi)-/5-(metoksikarbonyyli)bentsoksatsol-2-yyli7-metyylipropyyli7-L-proliiniamidi (kaava XIV, heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=5-(metoksikarbonyyli)-bentsoksatsol-2-yyli)

Sekoitettua liuosta, jossa oli esimerkin 4b imidaat- 20 υ tia (5,47 g) ja 4-karbometoksi-2-aminofenolia (5,10 g) kuivassa etanolissa (50 ml), kuumennettiin 3 tunnin ajan 60°C:ssa typpikaasun alla. Seos liuotettiin etyyliasetaattiin, pestiin (1 N HC1, 1 N NaOH kolme kertaa, suolavesi), kuivattiin (MgSC>4) ja haihdutettiin. Raaka tuote "flash" 25 -kromatografoitiin eluoiden asetoni:heksaanien seoksella (30:70), jolloin saatiin 2,210 g tuotetta; TLC: R^=0,18, asetoni:heksaanien seos (35:65); MS: (M+41), 637 (M+29), 611 (M+3), 610 (M+2), 609 (M+l), 591, 501.

Analyysi koostumukselle C32H40N4°8 · 0,35 ¢^¢:0202^:

Laskettu: C 62,73; H 6,74; N 8,76

Saatu: C 62,71; H 6,73; N 8,67 b. (S) -bentsyylioksikarbonyyli-L-valyyli-N-Z*l-ZT5-metoksikarbonyyli)bentsoksatsol-2-yyli?karbonyyli-2-metyyli-propyyli7-L-proliiniamidi (kaava VI, heterosykliseen renkaa- 35 seen sisältyy X, N ja Q=5-(metoksikarbonyyli)bentsoksatsol-2-yyli)

Lisättiin t-butanolia (0,340 ml) liuokseen, jossa

II

91072 49 oli esimerkin 8a tuotetta (2,70 g) ja Dess-Martinin per-jodinania (4,62 g) dikloorimetaanissa (20 ml), ja liuosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 22 tunnin ajan. Saatu suspensio laimennettiin etyyliasetaatilla ja pestiin (kol-5 me annosta 1:1 kyllästetty Na^^^: kyllästetty NaHCO^ -liuosta, suolavesi), kuivattiin (MgSO^) ja haihdutettiin. Raaka tuote puhdistettiin "flash" -kromatografian avulla eluoiden asetoni:heksaanilla (25:75), jolloin saatiin 2,20 g kiinteää ainetta; TLC: R^=0,21, asetoni:heksaanien seos 10 (30:70); MS: m/e=635 (M+29), 608 (M+2), 607 (M+l), 374, 331, 91.

Analyysi koostumukselle C32H38N4°8. 0,50 H20:

Laskettu: C 62,43; H 6,38; N 9,10

Saatu: C 62,43; H 6,24; N 8,91 15 c. (S)-L-valyyli-N-£l-£5-(metoksikarbonyyli)bents- oksatsol-2-yyli7karbonyyli-2-metyylipropyyli7-L-proliini-amidi (kaava V, heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=5-(metoksikarbonyyli)bentsoksatsol-2-yyli)

Sekoitettuun liuokseen, jossa oli esimerkin 8b tuo-20 tetta (500 mg) dikloorimetaanissa (4 ml) typpikaasun alla, lisättiin tipoittain trifluorimetaanisulfonihappoa (0,365 ml). 5 minuutin kuluttua reaktioseos kaadettiin tislattuun veteen (100 ml) ja uutettiin kolme kertaa dikloo-rimetaanilla. Vesikerroksen pH säädetiin NaHCO^lla 8:ksi 25 ja kerros pestiin kolme kertaa dikloorimetaanilla. Vesifaa-sia käsiteltiin 1 N NaOH:lla (50 ml) ja se pestiin vielä kerran dikloorimetaanilla. Orgaaniset pesuliuokset yhdistettiin, kuivattiin (Na2SO^) ja haihdutettiin, jolloin saatiin 185 mg (48 %) valkeaa vaahtoa; TLC: R^=0,22, metanoli: 30 kloroformi (5:95).

d. (S) -/4-/_(4-kloorifenyyli) sulfonyyliamino-karbonyyli7bentsoyyli7-L-valyyli-N-A-/5-(metoksikarbonyyli) bentsoksatsol-2-yylf7karbonyyli-2-metyylipropyyli7-L-proliiniamidi (kaava I, heterosykliseen renkaaseen sisältyy 35 X, N ja Q=5-(metoksikarbonyyli)bentsoksatsol-2-yyli, A=C0, L=£-fenyleeni, R4=R5.S(02).NH.CO-, R5=4-ClCgH4) 1-(3-dimetyyliaminopropyyli)-3-etyylikarbodi-imidi-hydrokloridia (160 mg) lisättiin liuokseen, jossa oli 50 esimerkin 8c tuotetta (185 mg), 1-hydroksibentsotriatsolia (110 mg) ja esimerkin 1 osan o tuotetta (280 mg) tetrahyd-rofuraanissa (3 ml), ja liuosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 16 tunnin ajan. Reaktioseos laimennettiin etyyli-5 asetaatilla, pestiin (kolme kertaa 1 N HClrlla, suolavedellä), kuivattiin (MgSO^) ja haihdutettiin. Raaka tuote puhdistettiin "flash" -kromatografiän avulla eluoiden asetoni: dikloorimetaani:etikkahapolla (20:80:1 tippa/ml), jolloin saatiin 160 mg kiinteää ainetta; Rf=0,36, metanoli:kloro-10 formi:etikkahappo (5:95:1 tippa/ml); HPLC: tR=15,84, Koi A, vesi:asetonitriili:tetrahydrofuraani:trifluorietikkahappo (55:35:15:0,1), virtausnopeus=2; MS: m/e=684 (M+29), 656 (M+l), 375, 374, 356, 355, 354, 352, 302, 283, 260, 259, 178, 168.

15 Analyysi koostumukselle CggH^QClN^O^gS.1,0 1^0.1,0 CH^CC^H: Laskettu: C 55,07; H 5,31; N 8,03

Saatu: C 55,05; H 5,13; N 8,06

Esimerkki 9 (S) -/4-/.(4-kloorifenyyli) sulfonyyliaminokarbonyyli/bentsoyy-20 li7-L-valyyli-N-/l-/]S- (metoksikarbonyyli)bentsoksatsol-2-yyli7karbonyyli-2-metyylipropyyli7-l‘-proliiniamidi (kaava I, heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=6-(metok-sikarbonyyli)bentsoksatsol-2-yyli, A=CO, L=£-fenyleeni, R4=R5.S(CU) .NH.CO-, R5=4-C1C4H4)_ 25 a. (IS)-bentsyylioksikarbonyyli-L-valyyli-N-£l- (hydroksi)-/6-(metoksikarbonyyli)bentsoksatsol-2-yylί7“ metyyli“2-metyylipropyyli7-L-proliiniamidi (kaava XIV, heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=6-(metoksikarbonyyli) bent soksatsol-2-yyli) 30 Sekoitettua liuosta, jossa oli esimerkissä 4b kuva tulla tavalla valmistettua imidaattia (1,00 g) ja 5-karbo-metoksi-2-aminofenolia (930 mg) kuivassa etanolissa (9 ml), kuumennettiin 4 tunnin ajan 60°C:ssa typpikaasun alla. Seos liuotettiin etyyliasetaattiin, pestiin (kaksi kertaa 1 N 35 NaOHslla, suolavedellä), kuivattiin (MgSO^) ja haihdutettiin. Raaka tuote "flash" -kromatografoitiin eluoiden

II

91072 51 asetoni:heksaanien seoksella (35:65), jolloin saatiin 300 mg tuotetta; TLC: R^=0,50, asetoni:heksaanien seos (45:55); MS: m/e=610 (M+2), 609 (M+l).

5 b. (S)-bentsyylioksikarbonyyli-L-valyyli-N-ri-jT6- (metoksikarbonyyli)bentsoksatsol-2-yyli7karbonyyli-2-metyylipropyyliy-L-proliiniamidi (kaava VI, heterosykli-seen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=6-(metoksikarbonyyli)-bentsoksatsol-2-yyli) 10 Lisättiin t-butanolia (0,050 ml) liuokseen, jossa oli esimerkin 9a tuotetta (300 mg) ja Dess-Martinin per-jodinania (630 mg) dikloorimetaanissa (3 ml), ja liuosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 17 tunnin ajan. Saatu suspensio laimennettiin etyyliasetaatilla ja pestiin (kol-15 mella annoksella 1:1 kyllästettyä ^2820^^aHCO^ -liuosta, suolavedellä, kuivattiin (MgSO^) ja haihdutettiin. Raaka tuote puhdistettiin "flash" -kromatografian avulla eluoi-den asetoni:heksaanilla (30:70), jolloin saatiin kiinteä aine, joka liuotettiin asetonitriiliin (30 ml) ja käsitel-20 tiin 300 mg:11a aktiivihiiltä. Seosta sekoitettiin 10 minuutin ajan, se suodatettiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin 257 mg tuotetta; TLC: R^=0,49, asetoni:heksaanien seos (40:60); MS: m/e=635 (M+29), 608 (M+2), 607 (M+l).

Analyysi koostumukselle · 0 > 5 1^0 25 Laskettu: C 62,43; H 6,38; N 9,10

Saatu: C 62,62; H 6,28; N 8,94 c . (S) -L-valyyli-N-/i-/.6- (metoksikarbonyyli) - bentsoksatsol-2-yyli7karbonyyli-2-metyylipropyyl£7-L-proliiniamidin trifluorimetaanisulfonihapposuola (kaava V, 30 heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=6-(metoksikarbonyyli) bent soksatsol-2-yy li)

Sekoitettuun liuokseen, jossa oli esimerkin 9b tuotetta (210 mg) dikloorimetaanissa (1,5 ml) typpikaasun alla, lisättiin tipoittain trifluorimetaanisulfonihappoa 35 (0,15 ml). 40 minuutin kuluttua reaktioseos haihdutettiin.

Saatu kiinteä aine pantiin tyhjöön tunnin ajaksi ja käy- 52 tettiin suoraan alla olevaan esimerkkiin 9d; TLC: R^=0,00, asetoni:heksaanien seos (25:75); MS: m/e=244, 242, 235, 195, 189, 186, 181, 178, 121, 105, 93, 92, 91, 79.

d. (S) -Z4-/”(4-kloorifenyyli) sulfonyyliaminokar-5 bonyyli.7bentsoyyli7-L-valyyli-N-.Zl-/6- (metoksikarbonyyli) -bentsoksatsol-2-yyli7karbonyyli-2-metyylipropyyli7-L-pro-liiniamidi (kaava I, heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=6-(metoksikarbonyyli)bentsoksatsol-2-yyli, A=C0, L=p-fenyleeni, R4=R5.S(02).NH.CO-, R5=4-C1C6H4) 10 1-(3-dimetyyliaminopropyyli)-3-etyylikarbodi-imidi- hydrokloridia (75 mg) lisättiin liuokseen, jossa oli yllä olevan esimerkin 9c tuote, 1-hydroksibentsotriatsolia (50 mg) ja 4-Z"(4-kloorifenyyli) sulfonyyliaminokarbonyyli7-bentsoehappoa (130 mg) metyleenikloridissa (2 ml) ja tetra-15 hydrofuraanissa (2 ml), minkä jälkeen lisättiin 4-metyyli-morfoliinia (0,041 ml) ja liuosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 16 tunnin ajan. Reaktioseokseen lisättiin vielä 4-metyylimorfoliinia (0,041 ml) ja reaktioseosta sekoitettiin vielä 7 tunnin ajan. Reaktioseos laimennettiin etyyli-20 asetaatilla, pestiin (1 N HCl (kolme kertaa), suolavesi), kuivattiin (MgSO^) ja haihdutettiin. Raaka tuote puhdistettiin "flash" -kromatografiän avulla eluoiden asetoni:me-tyleenikloridi:etikkahapolla (30:70:1), jolloin saatiin kiinteä aine (160 mg), jota puhdistettiin edelleen "flash" 25 -kromatografiän avulla käyttäen asetoni:metyleenikloridi: etikkahappo-gradienttieluutiota (500 ml 0:100:1; 900 ml 10:90:1; sitten 50:50:1), jolloin saatiin otsakkeen yhdiste (71,6 mg); TLC: R^=0,17, asetoni:kloroformi:etikkahappo (10:90:1); HPLC: t =15,84, Koi A, virtausnopeus=2, vesi: I\ 30 asetonitriili:tetrahydrofuraani:trifluorietikkahappo (55:35:15:0,1); MS: m/e=794 (M+l), 778, 777, 776, 423, 421, 384, 374, 357, 356, 355, 354, 259.

Analyysi koostumukselle C^qH^qCINjO^qS.1,0 1^0.1,5 CH^CC^H: Laskettu: C 54,57; H 5,36; N 7,76 35 Saatu: C 54,34? H 5,19; N 7,81

II

91072 53

Esimerkki 10 (S) -Z3-/T(4-kloorifenyyli) sulfonyyliaminokarbonyyli?-bentsoyyli/-L-valyyli-N-Zl“ (5-karboksibentsoksatsol-2-yyli) -karbonyyli-2-metyylipropyyli7-L-proliiniamidi (kaava I, 5 heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=5-karboksi- 4 5 bentsoksatsol-2-yyli, A=CO, L=£-fenyleeni, R =R .S(02).NH.-CO-, R5=4-C1C(-H1)_ a. (IS) -bentsyylioksikarbonyyli-L-valyyli-N-ZTl- (5-karboksibentsoksatsol-2-yyli)hydroksimetyyli-2-metyyli- 10 propyylx7~L-proliiniamidi (kaava XIV, heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=5-karboksibentsoksatsol-2-yyli)

Sekoitettua liuosta, jossa oli esimerkin 4b mukaan valmistettua imidaattia (3,00 g) ja 3-amino-4-hydroksi-bentsoehappoa (2,55 g) kuivassa etanolissa (25 ml), kuumen-15 nettiin 1,5 tunnin ajan 60°C:ssa typpikaasun alla, minkä jälkeen lisättiin uusi määrä imidaattia (2,00 g) ja amino-fenolia (1,85 g). Seosta kuumennettiin vielä 8,25 tunnin ajan. Seos liuotettiin etyyliasetaattiin, pestiin (1 N HC1 (kaksi kertaa), suolavesi), kuivattiin (MgSO^) ja haihdutet-20 tiin. Raaka tuote "flash" -kromatografoitiin eluoiden asetonirheksaanien seos:etikkahapolla (50:50:1), jolloin saatiin tuote (330 mg); TLC: R^=0,19, asetoni:heksaanien seos:etikkahappo (50:50:1); MS: m/e=595 (M+l), 577.

b. (IS)-L-valyyli-N-Zl-(5-karboksibentsoksatsol-2-25 yyli)hydroksimetyyli-2-metyylipropyyli7-L-proliiniamidi (kaava XV, heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q= 5-karboksibentsoksatsol-2-yyli)

Seosta, jossa oli 10 % palladioitua hiiltä (1,50 g) ja esimerkin 10a tuotetta (2,90 g) etanolissa (100 ml), 30 hydrattiin ravistelukoneessa käyttäen 3,4 barin painetta 3 tunnin ajan, minkä jälkeen seos suodatettiin piimään lävitse ja liuotin haihdutettiin, jolloin saatiin tuote (1,95 g); TLC: R^=0,0, metanoli:kloroformi:etikkahappo (5:95:1); MS: m/e=461 (M+l), 443, 331, 319, 290, 265, 248, 35 232, 225, 198, 197, 196, 154.

54 c. (IS) -/4-/(4-kloorifenyyli) sulfonyyliamino-karbonyyli/bentsoyyli/-L-valyyli-N-i.l- (5-karboksibentsoks-atsol-2-yyli)hydroksimetyyli-2-metyylipropyyl.i/“L-proliini-amidi (kaava III, heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, 5 N ja Q=5-karboksibentsoksatsol-2-yyli, A=CO, L=£-fenyleeni, R4=R5.S(02).NH.CO-, R5=4-C1C6H4)

Isobutyyliklooriformiaattia (0,34 ml) lisättiin tipoittaan kolmen minuutin aikana sekoitettuun, -40°C:ssa olevaan liuokseen, jossa oli 4-/ (4-kloorifenyyli) -sulfonyy-10 liaminokarbonyyli/bentsoehappoa (850 mg) ja 4-metyyli- morfoliinia (0,58 ml) kuivassa tetrahydrofuraanissa (12 ml). Seosta sekoitettiin 30 minuutin ajan, minkä jälkeen reak-tioseokseen lisättiin tipoittain esimerkin 10b tuotetta (800 mg) dimetyyliformamidissa (9 ml). Reaktioseoksen 15 annettiin lämmetä hitaasti huoneen lämpötilaan yön aikana. Saatu seos laimennettiin etyyliasetaatilla, pestiin (kaksi kertaa 1 N HCl:lla, kerran suolavedellä), kuivattiin (MgSO^) ja haihdutettiin. Raaka materiaali "flash" -kroma-tografoitiin eluoiden asetoni:metyleenikloridi:etikkaha-20 polla (30:70:1), jolloin saatiin tuote (570 mg); TLC: R^=0,28, asetoni:metyleenikloridi:etikkahappo (42:60:1); MS: m/e=782 (M+l), 764, 423, 421, 377, 193, 191.

d. (S) -/4-/.4 (kloorifenyyli) sulfonyyliamino-karbonyyli/bentsoyyli?-L-valyyli-N-/l-(5-karboksibentsoks- 25 atsol-2-yyli)karbonyyli-2-metyylipropyyli7-L-proliiniamidi (kaava I, heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=5-karboksibentsoksatsol-2-yyli, A=CO, L=£-fenyleeni, R4=R5.S(02).NH.CO-, R5=4-C1C6H4)

Lisättiin t-butanolia (0,070 ml) liuokseen, jossa 30 oli esimerkin 10c tuotetta (560 mg) ja Dess-Martinin per-jodinania (910 mg) kuivassa dikloorimetaanissa (3 ml), ja liuosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 21 tunnin ajan. Saatu suspensio laimennettiin etyyliasetaatilla, pestiin (puoleksi kyllästetty Na^^^ -liuos (kolme kertaa) , kui-35 vattiin (MgSC>4) ja haihdutettiin. Raaka tuote puhdistettiin "flash" -kromatografiän avulla eluoiden asetoni:di-kloorimetaani:etikkahapolla (30:70:1), jolloin saatiin

II

91072 55 otsakkeen yhdiste (100 mg); TLC: R^=0,28, metanoli:kloroformi :etikkahappo (5:95:1); MS: m/e=781 (M+l), 764, 763, 762, 423, 421, 342, 341; HPLC: t =10,43, Koi A, virtausno- Γν peus=2, vesi:asetonitriili:tetrahydrofuraani:trifluorietik-5 kahappo (55:35:15:0,1).

Analyysi koostumukselle C^H^ClN^OgS.0,50 H2O.l,50 CH3C02H: Laskettu: C 54,64; H 5,16; N 7,96

Saatu: C 54,64; H 5,30; N 7,73

Esimerkki 11 10 Z4-(isopropyylisulfonyyliaminokarbonyyli)bentsoyyli7~L-valyyli-N-/.l- (2-bentsoksatsolyyli) karbonyyli-2-metyyli-propyyli7-L-proliiniamidi (kaava I, heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=2-bentsoksatsolyyli, A=CO, L=p- fenyleeni, R4=R5.S(CU).NH.CO-, R5=CH(CHj)2_ 15 a. t-butyyli-4-(isopropyylisulfonyyliaminokarbonyy- li) bentsoaatti 1-(3-dimetyyliaminopropyyli)-3-etyylikarbodi-imidi-hydrokloridia (198 mg) lisättiin sekoitettuun seokseen, jossa oli 4-(t-butoksikarbonyyli)bentsoehappoa (195 mg), 20 2-propaanisulfonamidia (98 mg) ja 4-dimetyyliaminopyridii-niä (126 mg) dikloorimetaanissa (3,7 ml). Seosta sekoitettiin yön ajan, laimennettiin etyyliasetaatilla, pestiin (1 N HCl, suolavesi), kuivattiin (MgSO^) ja haihdutettiin. Raaka tuote puhdistettiin "flash" -kromatografiän avulla 25 eluoiden asetoni:heksaanien seoksella (75:25), jolloin saatiin tuote (193 mg); TLC: R^=0,64, asetoni:heksaanien seos (75:25); MS: m/e=356 (M+29), 330 (M+3), 329 (M+2), 328 (M+l), 272, 223, 222, 205, 204, 166.

b. 4-(isopropyylisulfonyyliaminokarbonyyli)-bentsoehappo

Lisättiin trifluorietikkahappoa (5 ml) esimerkin 11a tuotteen (193 mg) joukkoon. Saatua liuosta sekoitettiin 6,5 tunnin ajan ja se haihdutettiin sitten. Raaka tuotemateriaali uudelleenliuotettiin eetteriin ja haihdu-35 tettiin (neljä kertaa). Raaka tuote lisättiin sitten tilavuuteen heksaanien seosta ja haihdutettiin (kaksi kertaa), 56 jolloin saatiin tuote (214 mg); TLC: R^=0,29, asetoni; heksaanien seos:etikkahappo (50:50:1); MS: m/e=272 (M+l), 166, 148, 115, 109, 95.

c. LA-(isopropyylisulfonyyliaminokarbonyyli)- 5 bentsoyyli7-L-valyyli-N-Zl-(2-bentsoksatsolyyli)hydroksi-metyyli-2-metyylipropyyli7_L-proliiniainidi (kaava III, heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=2-bentsoks-atsolyyli, R4=R5.S(02).NH.CO-, R5=CH(CH3)2) 1-(3-dimetyyliaminopropyyli)-3-etyylikarbodi-10 imidihydrokloridia (166 mg) lisättiin sekoitettuun liuokseen, jossa oli esimerkin lk tuotetta (362 mg), esimerkin 11b tuotetta (214 mg) ja 1-hydroksibentsotriatsolia (117 mg) dikloorimetaanissa (3 ml), ja seosta sekoitettiin yön ajan. Reaktioseos laimennettiin etyyliasetaatilla, pestiin (1 N 15 HC1 (kolme kertaa)), kuivattiin (MgSO^) ja haihdutettiin. Raaka tuote puhdistettiin "flash" -kromatografiän avulla eluoiden tetrahydrofuraani:heksaanien seos:etikkahapolla (65:35:1), jolloin saatiin tuote (215 mg); TLC: R^=0,44, asetoni:heksaanien seos:etikkahappo (75:25:1); MS: 20 m/e=671 (M+2), 670 (M+l), 653, 652, 353, 319, 318, 300, 249, 231, 204, 124, 120.

d. LA-(isopropyylisulfonyyliaminokarbonyyli)-bentsoyyli/-L-valyyli-N-VT- (2-bentsoksatsolyyli)karbonyyli-2-metyylipropyyli7-L-proliiniamidi (kaava I, heterosykli- 25 seen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=2-bentsoksatsolyyli, L=£-fenyleeni, R4=R5.S(02).NH.CO-, R5=CH(CH3)2)

Dess-Martinin perjodinania (408 mg) lisättiin sekoitettuun liuokseen, jossa oli esimerkin 11c tuotetta (215 mg) ja t-butanolia (0,09 ml) dikloorimetaanissa (3 ml). 30 Saatua suspensiota sekoitettiin yön ajan. Reaktioseos suodatettiin ja liuotin haihdutettiin. Saatu öljy suodatettiin silikageelin lävitse asetoni:heksaanien seoksen (65:35) avulla, jolloin saatiin 404 mg raakaa tuotetta.

Tämä raaka tuote puhdistettiin "flash" -kromatografiän 35 avulla eluoiden tetrahydrofuraani:heksaanien seos etikka-hapolla (55:45:1) ja saatu kiinteä aine liuotettiin dill 91072 57 kloorimetaaniin (5 ml) ja sitä käsiteltiin valkaisuhiilel-lä (15 mg). Suspensio suodatettiin ja liuotin haihdutettiin, jolloin saatiin tuote (130 mg); TLC: R^=0,67, metanoli:kloroformi:etikkahappo (5:95:1); HPLC: tR=9,50, 5 Koi B, virtausnopeus=2, vesi:asetonitriili:tetrahydrofu-raani:trifluorietikkahappo (55:35:15:0,1); MS: m/e=696 (M+29), 669 (M+2), 668 (M+l), 651, 650, 353, 317, 316, 309, 299, 298, 297, 296, 201.

Analyysi koostumukselle . 0,85 H20: 10 Laskettu: C 58,02; H 6,30; N 10,25

Saatu: C 58,29; H 6,17; N 9,67

Esimerkki 12 CK-CX 4-kloorifenyyli) sulfonyyliaminokarbonyyli7bentsoyyli7-L-valyyli-N-Z.1- (2-oksatsolyyli) karbonyyli-2-metyylipropyy-15 li/-L-proliiniamidi (kaava I, heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=2-oksatsolyyli, A=CO, L=jo-fenyleeni, R4=R5.S(02) .NH.CO-, R5=4-ClCcHfl)_ a. 2-trimetyylisilyylioksatsoli

Lisättiin n-butyylilitiumia (28,5 ml 2,54 M liuos-20 ta heksaanissa) -78°C:ssa olevaan liuokseen, jossa oli oksatsolia (5,0 g) eetterissä (150 ml). Saatua liuosta sekoitettiin -78°C:ssa 30 minuutin ajan, minkä jälkeen lisättiin trimetyylisilyylikloridia (7,86 g) ja seoksen annettiin lämmetä huoneen lämpötilaan. Reaktioseos tislat-25 tiin ja otettiin talteen fraktio, jonka kiehumispiste oli noin 130°C, jolloin saatiin 2-trimetyylisilyylioksatsoli (5,12 g); MS: m/e=142 (M+l), 91, 73.

b. (IS) -bentsyylioksikarbonyyli-L-valyyli-N-£"l- (2-oksatsolyyli)hydroksimetyyli-2-metyylipropyyli7-L-proliini- 30 amidi (kaava XIV, heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=2-oksatsolyyli)

Liuosta, jossa oli esimerkissä lh kuvatun kaltaisella tavalla valmistettua aldehydiä (kaavan XI mukaista) (7,4 g) ja esimerkin 12a tuotetta (4,84 g) tolueenissa 35 (10 ml), kuumennettiin 80°C:ssa 24 tunnin ajan ja lisäksi 60°C:ssa 14 tunnin ajan. Liuottimet haihdutettiin ja ui.

58 jäännös liuotettiin tetrahydrofuraaniin (50 ml) ja käsiteltiin 1 N HCl:lla (5 ml) ja sekoitettiin 30 minuutin ajan. Seos liuotettiin etyyliasetaattiin, pestiin (1 N HCl, kyllästetty natriumbikarbonaattiliuos, suolavesi), 5 kuivattiin (MgSO^) ja haihdutettiin. Raaka materiaali puhdistettiin "flash" -kromatografian avulla eluoiden asetoni : heksaanien seoksella (30:70), jolloin saatiin tuote (4,57 g); TLC: R^=0,31, metanoli:kloroformi (5:95); MS: m/e=501 (M+l), 483, 393.

10 Analyysi koostumukselle C26H36N06:

Laskettu: C 62,38; H 7,25; N 11,19

Saatu: C 62,52; H 7,22; N 10,87 c. (S) -bentsyylioksikarbonyyli-L-valyyli-N-<T2- metyyli-l-/_(2-oksatsolyyli) karbonyylij'propyyli7”L“Pr°li.i.“ 15 niamidi (kaava VI, heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=2-oksatsolyyli)

Lisättiin t-butanolia (0,83 ml) liuokseen, jossa oli esimerkin 12b tuotetta (4,4 g) ja Dess-Martinin per-jodinania (15 g) dikloorimetaanissa (150 ml) ja sekoitet-20 tiin 16 tunnin ajan. Saadun suspension annettiin jakaantua kyllästetty Na2S303:kyllästetty NaHCO^ (1:1) -liuoksen ja etyyliasetaatin kesken. Etyyliasetaattiliuos pestiin (kyllästetty ^2820^:kyllästetty NaHCO^ (1:1), kyllästetty NaHCO^, suolavesi), kuivattiin (MgSO^) ja haihdutettiin.

25 Jäännös puhdistettiin "flash" -kromatografian avulla eluoiden asetoni:heksaanien seoksella (35:65), jolloin saatiin 4,8 g kiinteää ainetta. Tämä kiinteä aine liuotettiin etyyliasetaattiin, pestiin (kyllästetty ^2820^:kyllästetty NaHC03 (1:1), kyllästetty NaHCO^, suolavesi), kui-30 vattiin (MgSO^) ja haihdutettiin, jolloin saatiin tuote valkeana vaahtona (3,74 g); TLC: R^=0,32, asetoni:heksaanien seos (40:60); MS: m/e=499 (M+l), 266.

Analyysi koostumukselle C26H34N4°<5:

Laskettu: C 62,64; H 6,87; N 11,24 35 Saatu: C 62,30; H 6,74; N 11,01 tl 91072 59 d. /.4-/14-kloorifenyyli) sulfonyyliaminokarbonyyli/-bentsoyyli/-L-valyyli-N-/1- (2-oksatsolyyli) karbonyyli-2-metyylipropyyli7“L-proliiniamidi (kaava I, heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=2-oksatsolyyli, L=£-fenylee-5 ni, R4=R5.S(02).NH.CO-, R5=4-ClCgH4)

Lisättiin trifluorimetaanisulfonihappoa (0,89 ml) liuokseen, jossa oli esimerkin 12c tuotetta (1,0 g) di-kloorimetaanissa (15 ml) ja sekoitettiin 10 minuutin ajan, liuottimet haihdutettiin ja jäännös pantiin suurtyhjöön 10 20 minuutin ajaksi. Jäännös liuotettiin tetrahydrofuraa- niin (40 ml) ja lisättiin 1-(3-dimetyyliaminopropyyli)- 3-etyylikarbodi-imidihydrokloridia (429 mg), 4-/14-kloo-rifenyyli)sulfonyyliaminokarbonyyli7bentsoehappoa (800 mg) ja 4-dimetyyliaminopyridiiniä (1,97 g). Seosta sekoitet-15 tiin huoneen lämpötilassa 16 tunnin ajan, se liuotettiin etyyliasetaattiin, pestiin (1 N HC1, kyllästetty NaHCO^, suolavesi), kuivattiin (MgS04) ja haihdutettiin. Raaka materiaali puhdistettiin "flash" -kromatografian avulla eluoiden asetoni:heksaanien seos:etikkahapolla (10:90:1 -20 20:80:1), jolloin saatiin tuote (930 mg); TLC: R^=0,40, metanoli:kloroformi:etikkahappo (5:95:1); HPLC: t =7,35,

Koi A, virtausnopeus=2, vesi:asetonitriili:tetrahydro-furaani:trifluorietikkahappo (55:35:15:0,1); MS: m/e=686 (M+l), 668, 393, 377, 266, 248.

25 Analyysi koostumukselle C32H36ClN5°gs·0>5 H2O.l,0 CH3COOH: Laskettu: C 54,07; H 5,47; N 9,27

Saatu: C 53,78; H 5,33; N 9,25

Esimerkki 13 /4-/14-kloorifenyyli)sulfonyyliaminokarbonyyli7bentsoyyli7-30 L-valyyli-N-/l-(2-bentsotiatsolyyli)karbonyyli-2-metyyli-propyyli7-L-proliiniamidi (kaava I, heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=2-bentsotiatsolyyli, A=CO, L=£- fenyleeni, R4=R5.S(CU) .NH.CO-, R5=4-ClCcH4)_ a. Nof-bentsyylioksikarbonyyli-N-metoksi-N-metyyli-35 valiiniamidi

Liuos, jossa oli 1-(3-dimetyyliaminopropyyli)-3-etyylikarbodi-imidihydrokloridia (19,07 g) dikloorimetaa- 60 nissa (500 ml), jäähdytettiin -10°C:seen. Tähän liuokseen lisättiin 1-hydroksibentsotriatsolia (13,44 g) ja 4-metyy-limorfoliinia (11,5 ml). Reaktioseokseen lisättiin tipoittaan liuos, jossa oli N-(bentsyylioksikarbonyyli)-L-valiinia 5 (25,0 g) dikloorimetaanissa (200 ml). Sen jälkeen kun lisääminen oli suoritettu loppuun, seos lämmitettiin ympäristön lämpötilaan ja sekoitettiin 0,5 tunnin ajan ennen kuin se jäähdytettiin 10°C:seen. Seos, jossa oli N-metyy-li-O-metyylihydroksyyliamiinihydrokloridia (9,7 g) ja 4-10 metyylimorfoliinia (11,5 ml) dikloorimetaanissa (150 ml), lisättiin tipoittain sekoitettuun reaktioseokseen. Reaktio-seos lämmitettiin ympäristön lämpötilaan sekoittaen yön ajan. Seos haihdutettiin ja jäännöksen annettiin jakaantua veden ja etyyliasetaatin kesken. Orgaaninen kerros pestiin 15 (10 % HC1, kyllästetty NaHCO^, suolavesi), kuivattiin (MgSO^), haihdutettiin ja kuivattiin yön ajan suurtyhjössä, jolloin saatiin tuote kumina (26,25 g), joka jähmettyi jäädyttimessä; TLC: R^=0,57, kloroformismetanoli (40:1); MS: m/e=295 (M+l), 234, 187, 162, 152, 119.

20 b. (S)-1-(2-bentsotiatsolyyli)-2-(bentsyylioksikar bonyyli )amino-3-metyyli-1-butanoni

Kuivaa eetteriä (5 ml) jäähdytettiin -78°C:seen ja lisättiin n-butyylilitiumia (6,0 ml 2,54 M liuosta heksaa-nissa). Lisättiin nopeasti tipoittain bentsotiatsolin 25 (1,83 g) kuiva eetteri (15 ml) -liuos. Jatkettiin sekoit tamista -78°C:ssa 10 minuutin ajan. Amidin, joka oli valmistettu esimerkin 13a menetelmän mukaan ja käytettiin ilman lisäpuhdistusta, (2,00 g) eetteri (10 ml) -liuos lisättiin johtoputken kautta ja reaktioseoksen annettiin 30 lämmetä 30°C:seen sekoittaen 1 tunnin ajan. Reaktioseos sammutettiin kaatamalla kyllästettyyn NH^Cl -liuokseen ja uutetiin etyyliasetaatilla. Uutteet kuivattiin (Na2SO^) ja haihdutettiin, jolloin saatiin keltainen öljy. Puhdistamalla "flash" -kromatografian avulla eluoiden heksaani: 35 etyyliasetaatilla (10:1) saatiin tuote keltaisena lasina (0,98 g); TLC: R^=0,67, heksaani:etyyliasetaatti (2:1); MS: m/e=368 (M+l), 206, 191, 162, 135, 91 (peruspiikki).

Il 91072 61 c. 2-amino-1-(2-bentsotiatsolyyli)-3-metyyli-l-butanoni

Esimerkin 13b menetelmän mukaan valmistettua materiaalia (0,94 g) liuotettiin dikloorimetaanin (20 ml) ja 5 anisolin (1 ml) seokseen typpikaasun alla. Lisättiin tri-fluorimetaanisulfonihappoa (1 ml) ja reaktioseosta sekoitettiin 10 minuutin ajan. Reaktioseos laimennettiin di-kloorimetaanilla ja uutettiin vedellä. Vesiuutteet pestiin dikloorimetaanilla, pH saatettiin 8:ksi kyllästetyn 10 NaHC03 -liuoksen avulla ja uutettiin dikloorimetaanilla.

Orgaaninen liuos kuivattiin (Na2SO^) ja haihdtettiin, jolloin saatiin keltainen öljy (0,50 g); TLC: R£=0,36, heksaani:etyyliasetaatti (2:1).

d. Bentsyylioksikarbonyyli-L-valyyli-N-^"l- (2-bentso-15 tiatsolyyli)karbonyyli-2-metyylipropyyli7“L-proliiniamidi (kaava VI, heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=2-bentsotiatsolyyli)

Dikloorimetaaniliusota, jossa oli esimerkin 13c menetelmän mukaan valmistettua ja ilman lisäpuhdistusta käy-20 tettyä materiaalia (0,5 g), 1-hydroksibentsotriatsolia (0,58 g) ja esimerkin lf menetelmän mukaan valmistettua tuotetta (0,74 g), käsiteltiin 1-(3-dimetyyliaminopropyy-li) -3-etyylikarbodi-imidihydrokloridilla (0,47 g) ja reaktioseosta sekoitettiin typpikaasun alla 15 tunnin ajan.

25 Reaktioseos laimennettiin dikloorimetaanilla, pestiin (kyllästetty NaHCO^, 10 % HC1), kuivattiin (Na2SO^) ja haihdutettiin, jolloin saatiin keltainen öljy (1,48 g); TLC: R^=0,39, kloroformi:metanoli (50:1); MS: m/e=565 (M+l, peruspiikki), 332, 331.

30 e. L-valyyli-N-Z.1-(2-bentsotiatsolyyli) karbonyyli- 2-metyylipropyyli7-L-proliiniamidi (kaava V, heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=2-bentsotiatsolyyli)

Esimerkin 13d menetelmän mukaan valmistetusta ja ilman lisäpuhdistusta käytetystä amidista (1,20 g) pois-35 tettiin suojaus käyttäen esimerkin 13c menetelmän kaltaista menetelmää, jolloin saatiin tuote öljynä (0,34 g, 37 %); TLC: R^=0,34, kloroformi:metanoli (10:1).

62 f. /4-/.(4-kloorifenyyli) sulfonyyliaminokarbonyy-li/bentsoyyli/-L-valyyli-N-/.l- (2-bentsotiatsolyyli) karbon-yyli-2-metyylipropyyli7-L-proliiniamidi (kaava I, hetero-sykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=2-bentsotiatsolyy-5 li, A=CO, L=£-fenyleeni, R4=R5.S(02).NH.CO-, R5=4-C1C6H4) Esimerkin 13e menetelmän mukaan valmistettua ja ilman lisäpuhdistusta käytettyä amiinia (0,34 g),1-hydroksi-bentsotriatsolia (0,21 g) ja 4-/(4-kloorifenyyli)sulfonyy-liaminokarbonyyli7bentsoehappoa (0,27 g) yhdistettiin di-10 kloorimetaanissa (12 ml) ja suspensiota käsiteltiin l-(3- dimetyyliaminopropyyli)-3-etyylikarbodi-imidihydrokloridil-la (0,17 g). Sekoittamista jatkettiin 7,5 tunnin ajan. Reaktioseos laimennettiin etyyliasetaatilla ja pestiin (kyllästetty NaHCO^, 10 % HC1), kuivattiin (Na2S04) ja 15 haihdutettiin, jolloin saatiin öljyinen vaahto. Puhdistamalla "flash" -kromatografiän avulla eluoiden heksaanien seos:etyyliasetaatti:etikkahapolla (50:50:1,5) saatiin tuote valkeana kiinteänä aineena (0,32 g); TLC: R^=0,29, heksaanien seos:etyyliasetaatti:etikkahappo (50:50:1,5); 20 HPLC: tR=26, Koi A, virtausnopeus=2, vesi:asetonitriili: tetrahydrofuraani:trifluorietikkahappo (55:35:15:0,1); MS: m/e=752 (M+l), 423, 421, 393, 377, 342, 332, 315, 314 (peruspiikki), 313, 312, 136.

Analyysi koostumukselle C36H3gclN5°7S2·0,3 CH^COOH: 25 Laskettu: C 57,07; H 5,13; N 9,09

Saatu: C 57,32; H 5,45; N 8,76

Esimerkki 14 (S) -/.4-/.(4-kloorifenyyli) sulfonyyliaminokarbonyyli/bentso-yyli/-L-valyyli-N-/2-metyyli-l-(2-tiatsolyyli)karbonyyli-30 propyyliJ-L-proliinicimidi (kaava I, heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=2-tiatsolyyli, A=CO, L=£-fenyleeni, R4=R5.S(Q2).NH.CO-, R5=4-C1CcH1)_ a. (S) -2-(bentsyylioksikarbonyyli)amino-3-metyyli-l-(2-tiatsolyyli)-1-butanoni 35 Jäähdytettyyn (-35°C) liuokseen, jossa oli tiatso- lia (1,23 ml) kuivassa tetrahydrofuraanissa (40 ml), lisättiin n-butyylilitiumia (6,6 ml 2,18 M liuosta heksaanissa)

II

91072 63 3 minuutin aikana. Tumman ruskeata reaktioseosta sekoitettiin lämpötila-alueella -30°C - -25°C 10 minuutin ajan. Liuos, jossa oli esimerkin 13a menetelmän mukaan valmistettua ja ilman lisäpuhdistusta käytettyä materiaalia (1,7 g) 5 kuivassa tetrahydrofuraanissa (15 ml), lisättiin nopeasti 1 minuutin aikana. Jatkettiin sekoittamista -30°C:ssa 15 minuutin ajan. Seos sammutettiin kaatamalla se kyllästettyyn NH^Cl -liuokseen (100 ml) ja orgaaniset aineet uutettiin etyyliasetaattiin. Uutteet pestiin (kyllästetty 10 NaHCO^), kuivattiin (Na2S0^) ja haihdutettiin, jolloin saatiin ruskea öljy. Puhdistamalla "flash" pylväskromatogra-fian avulla eluoiden heksaani:etyyliasetaatilla (2:1) saatiin tuote keltaisena öljynä (1,81 g, 98 %); TLC: R^=0,45, heksaani:etyyliasetaatti (2:1); MS: m/e=319 (M+l, perus-15 piikki), 275.

b. (S)-2-amino-3-metyyli-l-(2-tiatsolyyli)-1-butanoni

Esimerkin 14a menetelmän mukaan valmistettua ketonia (1,8 g) liuotettiin dikloorimetaaniin (30 ml) ja käsitel-20 tiin trifluorimetaanisulfonihapolla (2,5 ml) lisäten se yhtenä annoksena ja reaktioseosta sekoitettiin ympäristön lämpötilassa 5 minuutin ajan. Seos laimennettiin dikloori-metaanilla ja uutettiin vedellä. Vesifaasin pH saatettiin emäksiseksi kyllästetyn NaHCO^ -liuoksen avulla ja sitä 25 uutettiin sitten dikloorimetaanilla. Uutteet kuivattiin (NagSO^) ja haihdutettiin, jolloin saatiin tuote tumman keltaisena öljynä (0,78 g, 75 %); TLC: Rj=0,7, kloroformi: metanoli (10:1); MS: m/e=185 (M+l, peruspiikki), 167, 140.

c. (S)-bentsyylioksikarbonyyli-L-valyyli-N-Z^-metyy- 30 li-1-(2-tiatsolyyli)karbonyylipropyyliT-L-proliiniamidi (kaava VI, heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=2-tiatsolyyli)

Esimerkin 14b menetelmän mukaan valmistettua amino-ketonia (0,73 g) liuotettiin dikloorimetaaniin (25 ml).

35 Liuokseen lisättiin peräkkäin bentsyylioksikarbonyyli-L-valyyli-L-proliinia (1,38 g), 1-hydroksibentsotriatsolia 64 (1,07 g) ja 1-(3-dimetyyliaminopropyyli)-3-etyylikarbodi-imidihydrokloridia (0,76 g). Seosta sekoitettiin yön ajan ympäristön lämpötilassa typpikaasun alla. Reaktioseos laimennettiin dikloorimetaanilla, pestiin (kyllästetty 5 NaHCO^/ 10 % HC1), kuivattiin (Na2SO^) ja haihdutettiin, jolloin saatiin keltainen öljy (2,5 g). Puhdistamalla "flash" -kromatografiän avulla eluoiden heksaani:etyyliasetaatilla (1:1) saatiin tuote jähmeänä vaahtona (1,61 g); TLC: R^=0,3, heksaani:etyyliasetaatti (1:1); MS: m/e=515 10 (M+l, peruspiikki), 407, 331, 282, 91.

Analyysi koostumukselle C26H34N4°5S.0,5 I^O:

Laskettu: C 59,64; H 6,74; N 10,70

Saatu: C 59,56; H 6,54; N 10,42 d. (S)-L-valyyli-N-£2-metyyli-l-(2-tiatsolyyli)-15 karbonyylipropyyli7-L-proliiniamidin trifluorimetaanisul- fonihapposuola (kaava V, heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=2-tiatsolyyli)

Esimerkin 14c mukaan valmistettua ketonia (0,51 g) liuotettiin dikloorimetaaniin (15 ml) ja käsiteltiin tri-20 fluorimetaanisulfonihapolla (0,44 ml) lisäten se yhtenä annoksena. Reaktioseosta sekoitettiin ympäristön lämpötilassa 15 minuutin ajan. Haihduttamalla ja kuivaamalla suur-tyhjössä saatiin valkea kumi (1,17 g, yli 100 %). Raa'an tuotteen 100 %:n saannon ylittävän painon otaksuttiin ole-25 van trifluorimetaanisulfonihappoa.

e. (S) 4-kloorifenyyli) sulfonyyliamino- karbonyyli7bentsoyyl£7-L-valyyli-N-/^-metyyil-l-(2-tiatsolyyli)karbonyylipropyyli/-L-proliiniamidi (kaava I, heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=2-tiatsolyy- 30 li, A=CO, L=£-fenyleeni, R4=R5.(SC^).NH.CO-, R5=4-C1C6H4) Esimerkin 14d menetelmän mukaan valmistettua ja ilman lisäpuhdistusta käytettyä raakaa aminoketonia (1,14 g), 1-hydroksibentsotriatsolia (0,13 g), 4-£T4-kloo-rifenyyli)sulfonyyliaminokarbonyyli7bentsoehappoa (0,34 g) 35 ja 4-metyylimorfoliinia (0,59 ml) liuotettiin tetrahydro-furaaniin ja seosta käsiteltiin 1-(3-dimetyyliaminopropyyli) -3-etyylikarbodi-imidihydrokloridilla. Seosta sekoitet-

II

91072 65 tiin yön ajan typpikaasun alla. Haihduttamalla saatiin jäännös,jonka annettiin jakaantua veden ja etyyliasetaatin kesken. Orgaaninen faasi pestiin (10 % HC1, vesi, suolavesi) , kuivattiin (MgSO^) ja haihdutettiin. "Flash" 5 -kromatografian avulla, eluoiden kloroformiimetanoli:etik-kahapolla (100:2,5:0,5), saatiin tuote valkeana vaahtona (0,50 g). Suorittamalla toinen puhdistus (sama liuotin-systeemi kuin yllä) saatiin otsakkeen tuote valkeana vaahtona (0,43 g); TLC: Rf=0,35, kloroformi:metanoli:etikka-10 happo (100:2,5:0,5)? MS: m/e=702 (35C1-M+1), 283, 282 (peruspiikki), 120; HPLC: tR=8,54, Koi A, virtausnopeus=2, vesi:asetonitriili:tetrahydrofuraani:trifluorietikkahappo (55:35:15:0,1).

Esimerkki 15 15 (S) - /4-/TJ' - (fenyylisulfonyyli)ureido/bentsoyyli/-L-valyyli- N-/J-(2-bentsoksatsoyyli)karbonyyli-2-metyylipropyyli7-L-proliiniamidi (kaava I, heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=2-bentsoksatsoyyli, A=CO, L=£-fenyleeni, R4=R5.S (02) .NH.CO.NR6-, R5=C(.H;·, R6=H)_ 20 a. 4-/N'-(fenyylisulfonyyli)ureido/bentsoehappo

Sekoitettuun liuokseen, jossa oli p-aminobentsoe-happoa (3,48 g) ja 4-metyylimorfoliinia (2,75 ml) tislatussa tetrahydrofuraanissa (110 ml), lisättiin fenyyli-sulfonyyli-isosyanaattia (4,65 g). Reaktioseosta, joka 25 lämpeni hiukan lisäyksen johdosta, sekoitettiin 18 tunnin ajan, laimennettiin 1 N HCl:lla ja uutettiin metyleeni-kloridilla. Orgaaniset uutteet pestiin (1 N HC1 (kaksi kertaa) , suolavesi), kuivattiin (Na2S04), suodatettiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin kellertävä kiinteä aine.

30 Tätä kiinteää ainetta hierrettiin eetterin kanssa ja suodatettiin, jolloin saatiin tuote valkeana kiinteänä aineena (5,26 g, 65 %); TLC: R^=0,25, metanoli:kloroformi:etik-kahappo (5:95:1); MS: 321 (M+l), 303, 277, 257, 184, 164, 160, 159, 158, 141, 140, 139, 138, 137, 120, 94.

66 b. (IS) -bentsyylioksikarbonyyli-L-valyyli-N-£'l- (2-bentsoksatsoyyli)hydroksimetyyli-2-metyylipropyyli/-L-proliiniamidi (kaava XIV, heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=2-bentsoksatsoyyli) 5 Sekoitettuun liuokseen, jossa oli etanolia (42,3 ml) kloroformissa (44 ml) 0°C:ssa, lisättiin tipoittain asetyy-likloridia (46,5 ml) 25 minuutin aikana. Seosta sekoitettiin vielä 10 minuutin ajan. Seokseen lisättiin syaanihyd-riiniä, joka oli valmistettu kuten on kuvattu esimerkissä 10 4a (10,0 g), minkä jälkeen lisättiin vielä annos kloroformia (44 ml). Reaktioseosta sekoitettiin 0°C:ssa 3 tunnin ajan ja liuottimet haihdutettiin, jolloin saatiin valkea vaahto, joka liuotettiin etanoliin (100 ml). Tähän etanoli-liuokseen lisättiin 2-aminofenolia (7,14 g) ja saatua rus-15 keaa seosta kuumennettiin 60°C:seen sekoittaen typpikaasun alla 45 minuutin ajan. Reaktioseos jäähdytettiin, laimennettiin eetterillä, pestiin (1 N NaOH (5 kertaa), suolavesi) , kuivattiin (Na2SO-j/K2CC>2 (2:1 V/V)) ja haihdutettiin, jolloin saatiin ruskea vaahto (10,3 g). Raaka ma-20 teriaali puhdistettiin "flash" -kromatografian avulla eluoiden asetoni:heksaanien seoksella (35:65), jolloin saatiin tuote (4,92 g); TLC: R^=0,24, metanoli: kloroformi (5:95); MS: m/e=551 (M+l), 331, 148, 108, 91.

Analyysi koostumukselle C3QH3gN4°g.0,50 1^0: 25 Laskettu: C 64,39; H 7,02; N 10,01

Saatu: C 64,29; H 6,87; N 9,86 c. (IS)-L-valyyli-Ν-ΖΪ-(2-bentsoksatsolyyli)-hydroksimetyyli-2-metyylipropyyli/-L-proliiniamidi (kaava XV, heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=2- 30 bentsoksatsolyyli)

Seosta, jossa oli 10 % (paino/paino) palladioitua hiiltä (800 mg, 50 % (paino/paino) vettä kostukkeena) ja esimerkin 15b tuotetta (4,90 g) etanolissa (250 ml), hyd-rattiin ravistelukoneessa käyttäen 3,4 barin painetta 2 35 tunnin ajan, minkä jälkeen lisättiin vielä annos katalysaattoria (0,500 g). Seosta hydrattiin ravistelukoneessa 11 91072 67 käyttäen 3,4 barin painetta vielä 2 tunnin ajan, se suodatettiin piimään lävitse ja haihdutettiin, jolloin saatiin tuote kiinteänä aineena (3,67 g, 99 %) ; TLC: R^=0,42, metanoli:kloroformi (5:95); MS: m/e=445 (M+29), 418 (M+2), 5 417 (M+l).

d. (IS)-/4-/N'-fenyylisulfonyyli)ureido7bentsoyy-li7-L-valyyli-N-/l-(2-bentsoksatsolyyli)hydroksimetyyli-2-metyylipropyyli7-L-proliiniamidi (kaava III, heterosykli-seen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=2-bentsoksatsolyyli, 10 A=C0, L=£-fenyleeni, R4=R5.S(02).NH.CO.NR6-, R5=C6H5, r6=h ) 1-(3-dimetyyliaminopropyyli)-3-etyylikarbodi-imidi-hydrokloridia (190 mg) lisättiin liuokseen, jossa oli esimerkin 15c tuotetta (380 mg), 1-hydroksibentsotriatsolia 15 (140 mg) ja 4-/N'-(fenyylisulfonyyli)ureido/bentsoehappoa (320 mg) dimetyyliformamidissa (5 ml), ja liuosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 16 tunnin ajan. Reaktioseos laimennettiin etyyliasetaatilla, pestiin (1 N HC1 (kolme kertaa) , suolavesi), kuivattiin (MgSO^) ja haihdutettiin. Raa-20 ka tuote "flash" -kromatografoitiin eluoiden etyyliasetaatti: kloroformi:etikkahapolla (50:50:1), jolloin saatiin tuote kiinteänä aineena (460 mg); TLC: R^=0,14, metanoli:klo-roformi:etikkahappo (5:95:1).

Analyysi koostumukselle C3gH44Ng°gs. 1,0 I^O. 1,0 CHgCC^H: 25 Laskettu: C 57,13; H 6,31; N 10,51

Saatu: C 58,39; H 6,33; N 9,95 e. (S) -/4-Z.N' - (fenyylisulfonyyli) ureido7bentsoyyliJ-L-valyyli-N-ZI-(2-bentsoksatsolyyli)karbonyyli-2-metyyli-propyyli/-L-proliiniamidi (kaava I, heterosykliseen renkaa- 30 seen sisältyy X, N ja Q=2-bentsoksatsolyyli, A=CO, L=£-fenyleeni, R4=R5.S(02).NH.CO.NR6-, R5=CgH5, R6=H)

Lisättiin Dess-Martinin perjodinania (440 mg) liuokseen, jossa oli t-butanolia (0,048 ml) ja esimerkin 15d tuotetta (370 mg) kuivassa metyleenikloridissä (2,5 ml).

35 Seos tummeni heti, ja sitä sekoitettiin 22 tunnin ajan.

68

Saatu suspensio laimennettiin metyleenikloridilla, pestiin (1:1 (V/V) kyllästetty natriumtiosulfaatti/natriumbikar-bonaatti (3 kertaa), suolavesi), kuivattiin (MgSO^) ja haihdutettiin, jolloin saatiin 450 mg raakaa öljyä. Tämä 5 "flash" -kromatografoitiin eluoiden etyyliasetaattisdi-kloorimetaaniietikkahapolla (50:50:1), kromatografoitiin sitten uudelleen käyttäen samaa systeemiä, jolloin saatiin otsakkeen yhdiste (91 mg); TLC: Rf=0,22, etyyliasetaatti: dikloorimetaani:etikkahappo (50:50:1); HPLC: t =8,46, Koi B,

K

10 virtausnopeus=2, vesi:asetonitriili:tetrahydrofuraani:tri-fluorietikkahappo (55:35:15:0,1); MS: m/e=640, 317, 316, 298, 245, 219, 197, 120.

Analyysi koostumukselle C^gH^NgOgS . 1,0 H2O.2,0 CH^COjH: Laskettu: C 56,20; H 5,89; N 9,83 15 Saatu: C 56,08; H 5,93; N 9,33

Esimerkki 16 (S)~/l4-kloorifenyyli)sulfonyyli/ureido/bentsoyylij-L-valyyli-N-/.l- (2-bentsoksatsolyyli) karbonyyli-2-metyyli-propyyliJ-L-proliiniamidi (kaava I, heterosykliseen ren-20 kaaseen sisältyy X, N ja Q=2-bentsoksatsolyyli, A=CO, L=£- fenyleeni, R4=R5.S(CM .NH.CO.NR6-, R5=4-C1CCH4, R6=H)_ a. 4-/N' -/T(4-kloorifenyyli) sulfonyyli7ureidq7-bentsoehappo

Sekoitettuun liuokseen, jossa oli p-aminobentsoe-25 happoa (2,68 g) ja 4-metyylimorfoliinia (2,15 ml) tislatussa tetrahydrofuraanissa (90 ml), lisättiin kloorifenyy-lisulfonyyli-isosyanaattia (4,25 g). Reaktioseosta, joka lämpeni hiukan lisäyksen johdosta, sekoitettiin 18 tunnin ajan. Reaktioseos tehtiin happamaksi 1 N HCl:lla ja muo-30 dostui höytyinen saostuma. Seosta uutettiin metyleeniklo-ridilla, jättäen jäljelle paljon saostumaa. Haihduttamalla metyleenikloridiliuos ja hiertämällä saatua kiinteää ainetta eetterin kanssa saatiin 1,25 g valkeaa kiinteää ainetta. Alkuperäistä kiinteää saostumaa uutettiin metano-35 lilla ja saatu liuos haihdutettiin, jolloin saatiin valkea kiinteä aine, jota hierrettiin eetterin kanssa saaden vielä 11 91072 69 4,90 g (kokonaissaanto 5,15 g, 89 %) valkeaa kiinteää ainetta; TLC: R^=0,21, metanoli:kloroformi:etikkahappo (5:95:1); MS: m/e=355 (M+l), 220, 219, 218, 192, 177, 175, 164, 139, 138, 120, 94.

5 b. (IS)-Z.4-Z.N'-£(4-kloorifenyyli) sulfonyyliJ/ureidq/- bentsoyyli7-L”valyyli“N-/I- (2-bentsoksatsolyyli)hydroksi-metyyli-2-metyylipropyyli/-L-proliiniamidi (kaava III, heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=2-bentsoks-atsolyyli, A=CO, L=jo-fenyleeni, R4=R5.S(02).NH.CO.NR^-, 10 R5=4-C1C6H4, R6=H) 1-(3-dimetyyliaminopropyyli)-3-etyylikarbodi-imidi-hydrokloridia (210 mg) lisättiin liuokseen, jossa oli esimerkin 15c tuotetta (360 mg), 4-dimetyyliaminopyridiiniä (130 mg) ja 4-/N'-/T(4-kloorifenyyli) sulfonyyli7\ireido7-15 bentsoehappoa (507 mg) tetrahydrofuraanissa (5 ml); ja saatua seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 16 tunnin ajan. Reaktioseos laimennettiin etyyliasetaatilla, pestiin (tislattu vesi (3 kertaa), 1 N HC1, kyllästetty natriumbikarbonaatti, suolavesi). Bikarbonaattipesuliuos tehtiin 20 happamaksi pH l:een ja pestiin kolme kertaa etyyliasetaatilla. Yhdistetyt orgaaniset faasit pestiin (suolavesi), kuivattiin (Na2SC>4) ja haihdutettiin. Raaka tuote "flash" -kromatografoitiin eluoiden tetrahydrofuraani:kloroformi: etikkahapolla (70:30:1). Saatu materiaali suodatettiin 25 silikageelin lävitse käyttäen tetrahydrofuraani:kloroformi: etikkahappoa (30:70:1 - 100:0:1), jolloin saatiin tuote (350 mg) kiinteänä aineena; TLC: R^=0,55, tetrahydrofuraani : kloroformi : etikkahappo (80:20:1); MS: m/e=247, 197, 163. Analyysi koostumukselle C^^H^^ClNgOgS.4,0 H2O.5,0 CH^CC^H: 30 Laskettu: C 48,94; H 6,03; N 7,29

Saatu: C 48,64; H 5,16; N 7,53 c. (S) -/4-/N' -/~(4-kloorifenyyli) sulfonyylx7ureido7-bentsoyyli7-L-valyyli-N-/l-(2-bentsoksatsolyyli)karbonyyli-2-metyylipropyyli7-L-proliiniamidi (kaava I, heterosykli-35 seen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=2-bentsoksatsolyyli, A=CO, L=£-fenyleeni, R4=R5.S(02).NH.CO.NR6-, R5=4-C1C6H4, R6=H)

Lisättiin Dess-Martinin perjodinania (500 mg) 70 liuokseen, jossa oli t-butanolia (0,055 ml) ja esimerkin 16b tuotetta (440 mg) kuivassa metyleenikloridissa (3 ml). Seos tummeni heti, ja sitä sekoitettiin 22 tunnin ajan. Saatu suspensio laimennettiin etyyliasetaatilla, pestiin 5 (1:1 (V/V) kyllästetty natriumtiosulfaatti:natriumbikar bonaatti (3 kertaa)), kuivattiin (MgSO^) ja haihdutettiin, jolloin saatiin 570 mg öljyä. Tämä "flash" -kromatografoi-tiin eluoiden asetonirmetyleenikloridi:etikkahapolla (60:40:1), jolloin saatiin otsakkeen yhdiste (95 mg); TLC: 10 R^=0,50, metanoli:kloroformi:etikkahappo (10:90:1); HPLC: tR=14,68, Koi B, virtausnopeus=2, vesi:asetonitriili:tet-rahydrofuraani:trifluorietikkahappo (55:35:15:0,1); MS: m/e=317, 316, 219, 192, 120.

Analyysi koostumukselle C^gH-^gClNgOgS. 1,0 CH3C02H: 15 Laskettu: C 56,26; H 5,34; N 10,36

Saatu: C 56,23; H 5,50; N 10,59

Esimerkki 17 (S) -/4-/N' -£"( 4-kloorifenyyli) sulfonyyli/ureido/bentsoyyli/-L-valyyli-N-/.l-/_5- (metoksikarbonyyli) bentsoksatsol-2-yyli7-20 karbonyyli-2-metyylipropyyli^-L-proliiniamidi (kaava I, heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=5-(metoksi- 4 karbonyyli)bentsoksatsol-2-yyli, A=CO, L=£-fenyleeni, R = R5.S(02) .NH.CO.NR6, R5=4-C1CCH4, R6=H)_ a. (S)-L-valyyli-N-£I-/3-(metoksikarbonyyli)-25 bentsoksatso1-2-yyli/karbonyyli-2-metyylipropyyl47-L- proliiniamidi (kaava V, heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=5-(metoksikarbonyyli)bentsoksatsol-2-yyli)

Sekoitettuun liuokseen, jossa oli esimerkin 8b tuotetta (1,00 mg) metyleenikloridissa (8 ml) typpikaasun al-30 la, lisättiin tipoittain trifluorimetaanisulfonihappoa (0,73 ml). 10 minuutin kuluttua reaktioseos laimennettiin dikloorimetaanilla ja pestiin kolme kertaa tislatulla ve-vedllä. Saadun liuoksen pH säädetiin pH 8:ksi lisäämällä kyllästettyä natriumbikarbonaattiliuosta (25 ml). Emäksis-35 tä liuosta uutettiin tehokkaasti dikloorimetaanilla kuusi kertaa. Jäljelle jääneeseen vesikerrokseen lisättiin nat-riumkloridia (10 g) ja sitä uutettiin kaksi kertaa dikloo-

II

91072 71 rimetaanilla. Kaikki orgaaniset uutteet yhdistettiin, kuivattiin (Na2S04) ja haihdutettiin, jolloin saatiin tuote (620 mg); TLC: R^=0,20, metanoli:kloroformi (5:95).

b. (S) -Z.4-/N' -/"(4-kloorifenyyli) sulfonyyli/ureido/-bentsoyyliy-L-valyyli-N-/i-/5-(metoksikarbonyyli)bentsoks-atsol-2-yyli7karbonyyli-2-metyylipropyyli7-L-proliiniamidi (kaava I, heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q= 5-(metoksikarbonyyli)bentsoksatsol-2-yyli, A=C0, L=£-feny-leeni, R4=R5.S(02).NH.CO.NR6, R5=4-C1C6H4, R6=H) 1-(3-dimetyyliaminopropyyli)-3-etyylikarbodi-imidi-hydrokloridia (100 mg) lisättiin liuokseen, jossa oli esimerkin 17a tuotetta (225 mg), 1-hydroksibentsotriatsolia (70 mg) ja 4-/N'-/Π4-kloorifenyyli)sulfonyyli/ureidoZ-bentsoehappoa (190 mg) dikloorimetaanissa (3 ml), ja liuos-^ ta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 16 tunnin ajan. Reak-tioseos laimennettiin etyyliasetaatilla, pestiin (1 N HC1 (3 kertaa), suolavesi), kuivattiin (MgS04) ja haihdutettiin. Raaka tuote puhdistettiin "flash" -kromatografian avulla eluoiden asetoni:metyleenikloridiretikkahapolla (10:90:1), jolloin saatiin otsakkeen yhdiste (271 mg) kiinteänä aineena; TLC: R^=0,14, asetoni:dikloorimetaani:etik-kahappo (20:80:1); HPLC: t =13,47, Koi A, virtausnopeus=2, vesi:asetonitriili:tetrahydrofuraani:trifluorietikkahappo (55:35:15:0,1); MS: m/e=699, 374, 245, 219, 197, 179, 120.

Analyysi koostumukselle CotJH..C1N,0.nS.3,7 H_0.0,70 CH,CO_H: 25 38 44 6 10 2 32

Laskettu: C 51,55; H 5,62; N 9,15

Saatu: C 51,40; H 4,97; N 9,48

Esimerkki 18 /4-/1trifluorimetyylisulfonyyli)aminö7bentsoyyli7-L-valyyli-30 Ν-/Ί-/5-(metoksikarbonyyli)bentsoksatsol-2-yyliJkarbonyyli- 2-metyylipropyyliT-L-proliiniamidi (kaava I, heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=5-(metoksikarbonyyli)bentsoks- 4 atsol-2-yyli, A=CO, L=p-fenyleeni, R =CFj.S (C?2).NH-)_ a. Etyyli-4-/f( trifluorimetyylisulfonyyli) amino/-bentsoaatti

Lisättiin trifluorimetaanisulfonihappoanhydridiä (4,1 ml) tipoittain esijäähdytettyyn (0°C) liuokseen, 72 jossa oli etyyli-p-aminobentsoaattia (3,3 g) dikloori-metaanissa (50 ml) typpikaasun alla. Reaktioseosta sekoitettiin 1 tunnin ajan 0°C:ssa, sen annettiin sitten lämmetä huoneen lämpötilaan ja sitä sekoitettiin 1 tunnin ajan. Sen 5 jälkeen kun reaktioseos oli haihdutettu, lisättiin jäännökseen etyyliasetaattia (125 ml); ja saatu orgaaninen liuos pestiin (1 N HC1, sitten suolavesi), kuivattiin (MgSO^) ja haihdutettiin. Jäännös puhdistettiin "flash" -kromato-grafian avulla eluoiden kloroformiimetanolilla (95:5), 10 jolloin saatiin tuote valkeana jauheena (1,27 g); TLC: R^=0,37, kloroformi:metanoli (90:10).

b. 4-/7trifluorimetyylisulfonyyli) amincj7bentsoe- happo 1 N NaOH-liuos (8,4 ml) lisättiin sekoitettuun 15 liuokseen, jossa oli esimerkin 18a tuotetta (1,25 mg) me-tanolissa (25 ml). Lisättiin vettä (2 ml) ja reaktioseosta sekoitettiin yön ajan. Sen jälkeen kun metanoli oli tislattu pois vesi-imutyhjössä, saatu vesipitoinen jäännös laimennettiin vedellä (20 ml). Vesiliuos pestiin etyyliasetaa-20 tiliä, tehtiin happamaksi (pH 2) 1 N HCl:lla ja uutettiin etyyliasetaatilla (kokonaismäärä=40 ml). Orgaaninen faasi kuivattiin (MgS04) ja haihdutettiin, jolloin saatiin tuote valkeana jauheena (1,05 g); TLC: R^=0,4, kloroformi^etanoli : etikkahappo (96:4:0,2) .

25 c. (S)-L-valyyli-N-/l-/5-(metoksikarbonyyli)- bentsoksatsol-2-yyli7karbonyyli-2-metyylipropyyli7-L-proliiniamidi (kaava V, heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=5-(metoksikarbonyyli)bentsoksatsol-2-yyli) Sekoitetutun liuokseen, jossa oli esimerkin 8b 30 tuotetta (750 mg) metyleenikloridissa (5 ml) typpikaasun alla, lisättiin tipoittain trifluorimetaanisulfonihappoa (0,53 ml). 20 minuutin kuluttua reaktioseos laimennettiin dikloorimetaanilla ja pestiin kolme kertaa tislatulla vedellä. Yhdistettyihin vesikerroksiin lisättiin natriumklo-35 ridia (5 g) ja saadun liuoksen pH säädetiin 8:ksi lisäämällä kyllästettyä natriumbikarbonaattiliuosta (20 ml).

ti 91072 73

Emäksistä liuosta uutettiin tehokkaasti dikloorimetaanilla kahdeksan kertaa. Orgaaniset kerrokset yhdisteett, kuivattiin (Na2S04) ja haihdutettiin, jolloin saatiin tuote (420 mg); TLC: Rj=0,28, metanoli:kloroformi (5:95).

5 d. £?-/Titrifluorimetyylisulfonyyli) aminc>7bentsoyy- li7-L-valyyli-N-/l-Z5-(metoksikarbonyyli)bentsoksatsol-2-yyli7karbonyyli-2-metyylipropyyli7-L-proliiniamidi (kaava I, heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=5-(metok-sikarbonyyli)bentsoksatsol-2-yyli, A=CO, L=£-fenyleeni, 10 R4=CF3S(02).NH-) 1-(3-dimetyyliaminopropyyli)-3-etyylikarbodi-imidi-hydrokloridia (240 mg) lisättiin liuokseen, jossa oli esimerkin 18c tuotetta (420 mg), 4-dimetyyliaminopyridiiniä (110 mg) ja 4-/.( trifluorimetyylisulfonyyli) aminq7-bentsoe-15 happoa (340 mg) tetrahydrofuraanissa (3 ml); ja liuosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 16 tunnin ajan. Reaktio-seos laimennettiin etyyliasetaatilla, pestiin (1 N HCl (3 kertaa), suolavesi), kuivattiin (MgSO^) ja haihdutettiin. Raaka tuote puhdistettiin "flash" -kromatografian avulla 20 eluoiden metanoli:kloroformi:etikkahapolla (20:80:1), jolloin saatiin otsakkeen yhdiste (330 mg) kiinteänä aineena; TLC: R^=0,50, metanoli:kloroformi:etikkahappo (5:95:1); HPLC: tR=15,61, Koi A, vesi:asetonitriili:tetrahydrofuraani: etikkahappo (55:35:15:0,1), virtausnopeus=2; MS: m/e=752 25 (M+29), 724 (M+l), 706, 374, 356, 351, 323.

Analyysi koostumukselle C32H3gF3N,-0<jS. 0,60 H2O.0,80 CH3CC>2H: Laskettu: C 51,57; H 5,20; N 8,95

Saatu: C 51,29; H 5,07; N 8,97

Esimerkki 19 30 sZ4-/T(4-kloorifenyyli) sulfonyyliaminokarbonyyli7bentsoyyli7-L-valyyli-N-£I-/5-(aminokarbonyyli)bentsoksatsol-2-yyli)- karbonyyli-2-metyylipropyyli7“Ii“Proliiniamicli (kaava I, heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=5-(aminokarbon- 4 5 yyli)bentsoksatsol-2-yyli, A=CO, L=£-fenyleeni, R =R .- 35 S(02) .NH.CO-, R5=4-C1CcH1)__

Menetelmä A

Materiaalia, joka oli valmistettu esimerkissä 6 74 kuvatulla tavalla ja jonka arvioitiin sisältävän vähintään 95 % (S)-diastereomeeria (200 mg) liuotettiin kuumaan kloroformiin (15 ml), suodatettiin ja laimennettiin kokonaistilavuudeksi 25 ml kuumalla kloroformilla. Lisättiin toluee-5 nia (5 ml), kunnes liuos juuri muuttui sameaksi ja lisättiin muutamia pisaroita kloroformia, jolloin saatiin kirkas liuos. Liuoksen annettiin jäähtyä hitaasti. 4 päivän kuluttua poistettiin sakan yläpuolella oleva neste suodattamalla ja kiteytynyt kiinteä aine kuivattiin typpikaasun alla, 10 jolloin saatiin 101 mg valkeaa kiinteää ainetta; s.p. 165-180°C; ^/^=-73,2° (c=2,5, CH3OH) .

Menetelmä B

a. Bentsyylioksikarbonyyli-L-valyyli-L-proliini-t-butyyliesteri 15 N-bentsyylioksikarbonyyli-L-valiinia (121,3 g), 1- hydroksibentsotriatsolia (130,5 g) ja kuivaa dimetyyli-formamidia (DMF) (800 ml) pantiin 5 litran kolmikaulakol-viin, joka oli varustettu koneellisella sekoituslaitteel-la, lämpömittarilla ja kalsiumsulfaattikuivausputkella, 20 typpi-ilmakehän alle. Seos jäähdytettiin 0°C:seen 15 minuutin ajaksi ja lisättiin tipoittain nopeaa vauhtia 2 tunnin aikana proliinin t-butyyliesteriä (82,6 g) kuivassa DMFrssa (800 ml) pitäen reaktioseoksen lämpötila 0°C:ssa. Sitten lisättiin disykloheksyylikarbodi-imidiä (109,4 g) 25 kuivassa DMF;ssa (400 ml) reaktioseokseen yhtenä annoksena. Reaktioseosta sekoitettiin 0°C:ssa 3 tunnin ajan, sen annettiin lämmetä huoneen lämpötilaan vähitellen 1 tunnin aikana ja sitä sekoitettiin 48 tunnin ajan, jonka ajan kuluttua TLC osoitti reaktion tapahtuneen loppuun ZRj=0,55, 30 kloroformi: etyyliasetaatti (85:15).7. Reaktioseos jäähdytettiin jää/vedessä ja suodatettiin kylmänä saostuneen disyk-loheksyyliurean poistamiseksi. DMF haihdutettiin käyttäen koneellista tyhjöpumppua ja korkeintaan 40°C:n hauteen lämpötilaa. Jäljelle jäänyt öljy laimennettiin etyyliase-35 taatilla (2 litraa), jäähdytettiin ja suodatettiin uudelleen lisämäärän disykloheksyyliurean poistamiseksi. Etyyli-asetaattiliuos pestiin (20 % (paino/tilavuus) sitruunahap-

II

91072 75 poliuos (kaksi kertaa), kyllästetty natriumkloridiliuos, kyllästetty natriumbikarbonaattiliuos (kaksi kertaa) ja kyllästetty natriumkloridiliuos), kuivattiin (MgSO^) ja haihdutettiin, jolloin saatiin raaka bentsyloksikarbonyy-5 li-L-valyyli-L-proliinin t-butyyliesteri kullanruskeana öljynä (208,3 g, 100 %) .

b. L-valyyliproliinin t-butyyliesteri

Liuos, jossa oli bentsyylioksikarbonyyli-L-valyyli-L-proliinin t-butyyliesteriä (51,8 g) liuotettuna absoluut-10 tiseen etanoliin (1 litra), pantiin 2 litran hydrauspulloon. Reaktioseoksesta poistettiin ilma typpikaasun avulla ja lisättiin 10 % (paino/paino) palladioitu hiili -katalysaattoria (10 g, 50 % (paino/paino) vettä kostukkeena). Reak-tioseos sijoitettiin suureen ravistelukoneeseen ja ravis-15 teltiin huoneen lämpötilassa vetyilmakehän alla (3,4 baria). 1 tunnin kuluttua vedyn otto lakkasi. Reaktioseos tutkittiin TLC:n avulla /kloroformi:etyyliasetaatti (85:15)/ ja ilmeni, että se sisälsi huomattavasti lähtöainetta (Rf=0,55). Lisättiin uutta katalysaattoria (10 g) ja reak-20 tioseos sijoitettiin takaisin ravistelukoneeseen vielä 4 tunnin ajaksi, minkä ajan kuluttua vedyn otto lakkasi. Reaktioseoksen TLC osoitti lähtöaineen puuttuvan täydellisesti. Reaktioseos suodatettiin piimaakerroksen lävitse ja suodatuskakku pestiin etanolilla. Haihdutettaessa etano-25 li kondensoituneesta liuoksesta jäi jäljelle samea keltainen öljy. Tämä öljy liuotettiin eetteriin (1 litra), suodatettiin pienen määrän saostumaa (disykloheksyyliureaa) poistamiseksi ja haihdutettiin, jolloin saatiin raakaa L-valyyli-L-proliinin t-butyyliesteriä keltaisena öljynä 30 (32,1 g, 93 %).

c. /4-£l4-kloorifenyyli)sulfonyyliaminokarbonyyl£7-bentsoyyli7-L-valyyli-L-proliinin t-butyyliesteri

Lisättiin 4-dimetyyliaminopyridiiniä (16,4 g) liuokseen, jossa oli 4-Zl4-kloorifenyyli)sulfonyyliaminokarbonyy-35 li7bentsoehappoa (45,6 g) metyleenikloridissa (250 ml).

76

Seosta sekoitettiin 15 minuutin ajan ennen kuin lisättiin peräkkäin esimerkin 19b amiinia (39,9 g) dikloorimetaanissa (250 ml) ja 1-(3-dimetyyliaminopropyyli)-3-etyylikarbodi-imidiä (28,3 g). Reaktioseosta sekoitettiin 16 tunnin ajan 5 ja lisää amiinia (1,1 g) ja karbodi-imidiä (1,5 g) lisättiin reaktioseokseen. Kun oli kulunut vielä 3 tuntia, reak-tioseos haihdutettiin, jolloin saatiin paksu harmaa siirappi. Tämä liuotettiin etyyliasetaattiin, pestiin (20 % (paino/paino) sitruunahappo (3 kertaa), suolavesi (4 kertaa), 10 kuivattiin (MgSO^) ja haihdutettiin. Raaka materiaali "flash" -kromatografoitiin eluoiden metanoli:metyleeniklo-ridilla (gradientti: 0:1 (1,5 litraa), 2:98 (1,5 litraa), 5:95 (4 litraa)), jolloin saatiin Z4-/.(4-kloorifenyyli)-sulfonyyliaminokarbonyyliT'bentsoyyli/-L-valyyli-L-proliinin 15 t-butyyliesteri (65,5 g, 73 %) valkeana vaahtona; TLC: R^=0,50, metanoli:dikloorimetaani:etikkahappo (2:98:1).

d. /-4-/"(4-kloorifenyyli) sulfonyyliaminokarbonyyli7-bentsoyyliJ-L-valyyli-L-proliini (kaava IXa, A=CO, L=£-fenyleeni, R4=R5.S(02).NH.CO-, R5=4-C1C6H4) 20 Esimerkin 19c tuotetta (65,5 g) liuotettiin tri- fluorietikkahappoon (200 ml) sekoittaen typpi-ilmakehän alla 0°C:ssa. Yhden tunnin kuluttua reaktioseos jäähdytettiin -15°C:seen 16 tunnin ajaksi, minkä ajan jälkeen reaktioseos kaadettiin jääveteen (2 litraa) sekoittaen voimak-25 kaasti. Saostuma suodatettiin, pestiin kolmella annoksella kylmää vettä ja kuivattiin alennetussa paineessa. Raaka tuote uudelleenliuotettiin trifluorietikkahappoon (200 ml) ja sekoitettiin huoneen lämpötilassa 18 tunnin ajan. Reaktioseos kaadettiin jääveteen (1,5 litraa) sekoittaen voi-30 makkaasti. Saostuma suodatettiin ja kuivattiin suurtyhjös-sä, jolloin saatiin happo (59,7 g); TLC: R^=0,05, metanoli: kloroformi:etikkahappo (5:95:1). Lisäpuhdistusta varten liuotettiin yllä oleva happo (59,7 g) ja kalsiumoksidia (6,25 g) veteen (500 ml) ja tetrahydrofuraaniin (500 ml) 35 ja kuumennettiin 55-60°C:ssa 0,5 tunnin ajan. Sen jälkeen, kun oli jäähdytetty huoneen lämpötilaan, konsentroitiin

II

91072 77 seos alennetussa paineessa. Vesifaasi dekantoitiin kumi-maisen jäännöksen päältä ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin kellanvalkea jauhe (47,3 g). Tämä materiaali kiteytettiin metanoli:vedestä ja muutettiin takaisin vapaaksi 5 hapoksi liuottamalla se veteen ja käsittelemällä liuosta 1 N HClslla (pH 2) ja suodattamalla saostunut kiinteä aine.

e. N-bentsyylioksikarbonyyli-L-valinaali

Liuokseen, jossa oli esimerkin le tuotetta (27,5 g) asetonissa (1,7 litraa), lisättiin p-tolueeni-10 sulfonihappomonohydraattia (1,0 g) ja saatua liuosta sekoitettiin 28 tunnin ajan. Liuottimet haihdutettiin ja jäännös liuotettiin eetteriin, pestiin (kyllästetty NaHCO^ -liuos (3 kertaa), suolavesi), kuivattiin (MgSO^) ja haihdutettiin, jolloin saatiin aldehydi (20,6 g); TLC: 15 R^=0,48, metanoli:kloroformi (5:95); MS: m/e=236 (M+l), 192, 91.

f. (3S)-3-(bentsyylioksikarbonyyli)amino-2-hydroksi- 4-metyylipentaaninitriili (kaava XHIa, W=CN) 500 ml:n pyöreäpohjäinen kolvi, jossa oli sekoitta-20 ja, kuivattiin tyhjössä ja huuhdeltiin typellä. Kolviin pantiin metyleenikloridia (265 ml), minkä jälkeen lisättiin esimerkin 19e aldehydituote (20,6 g) ja trietyyli-amiinia (7,40 ml). Lisättiin asetonisyaanihydriiniä (24,0 ml) yhtenä annoksena. Reaktioseosta sekoitettiin 6 25 tunnin ajan ja liuotin haihdutettiin. Raaka tuote liuotettiin eetteriin, pestiin (vesi (3 kertaa), suolavesi), kuivattiin (MgSO^) ja haihdutettiin. Saatu raaka öljy "flash" -kromatografoitiin eluoiden metyleenikloridi:metanoli: NH^OH:lla (99:1:0,1), jolloin saatiin syaanihydriini 30 (18,0 g, 78 %) keltaisena kiinteänä aineena, TLC: R^=0,53, asetoni:heksaanien seos (50:50).

g. (2S)-2£7bentsyylioksikarbonyyli)amino-1-hydroksi-3-metyylibutyyli7bentsoksatsoli-5-karboksamidi (kaava XlVa, heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=5-(amino- 35 karbonyyli)bentsoksatsol-2-yyli) 1 litran kolvi, jossa oli sekoittaja, kuivattiin tyhjössä ja huuhdeltiin typellä. Kolviin pantiin juuri 78 tislattua asetyylikloridia (98,0 ml) ja kloroformia (100 ml) ja jäähdytettiin jäähauteessa. Lisättiin etanolia (89,0 ml) tipoittain 45 minuutin aikana pitäen lämpötila 15°C:n alapuolella. Sen jälkeen kun oli jäähdytetty 5 5°C:seen lisättiin tipoittain 10 minuutin aikana liuos, jossa oli esimerkin 19f tuotetta (12,0 g) kloroformissa (100 ml). Reaktioseosta sekoitettiin 2 tunnin ajan jäähauteessa ja liuotin haihdutettiin 0°C:ssa, jolloin saatiin kullanruskea vaahto (14,1 g, 100 %); TLC, sen jälkeen, kun 10 näytteen oli annettu jakaantua etyyliasetaatin ja kyllästetyn NaHCO^ -liuoksen kesken vapaan iminoeetterin muodostamiseksi: Rf=0,40, asetoniiheksaanien seos (50:50); MS: m/e=309 (M+l). Tämä vaahto liuotettiin absoluuttiseen etanoliin (230 ml) ja lisättiin 3-amino-4-hydroksibents-15 amidia (7,30 g). Seosta kuumennettiin palautusjäähdyttäen 1,5 tunnin ajan ja liuotin haihdutettiin, jolloin saatiin ruskea kiinteä aine. Kiinteä jäännös liuotettiin 500 ml:an etyyliasetaattia, pestiin (1 N HC1, joka oli kyllästetty NaCl:lla, kyllästetty NaHCO^/NaCl, suolavesi), kuivattiin 20 (MgSO^) ja haihdutettiin. Tämä jäännös liuotettiin metano-liin, annettiin adsorboitua piimäähän ja "flash" -kromato-grafoitiin eluoiden asetoni:heksaanien seoksella (50:50), jolloin saatiin alkoholi (7,15 g, 39 %) kullanruskeana kiinteänä aineena; TLC: Rf=0,ll, asetoni:heksaanien seos 25 (50:50); MS: m/e=290, 246.

h. (2 S)-(2-amino-l-hydroksi-3-metyylibutyyli)- bentsoksatsoli-5-karboksamidi (kaava XVa, heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=5-(aminokarbonyyli)bentsoks-atsol-2-yyli) 30 Seosta, jossa oli 10 % (paino/paino) palladioitua hiiltä (1,26 g, 50 % (paino/paino) vettä kostukkeena) ja esimerkin 19g tuotetta (5,00 g) etanolissa (63 ml), hydrat-tiin ravistelukoneessa käyttäen 3,4 barin painetta 18 tunnin ajan. Seos suodatettiin piimään lävitse ja liuotin 35 haihdutettiin, jolloin saatiin amiini (3,13 g, 95 %) kullanruskeana kiinteänä aineena; TLC: R^=0,20, metyleeni-kloridi:metanoli:NH^OH (95:5:0,5); MS: m/e=264 (M+l).

Il 91072 79 i. (IS) -/M-/TT4-kloorifenyyli) sulfonyyliami.no-karbonyyli/bentsoyylf7-L-valyyli-N-/I-Z5-(aminokarbonyy-li) bentsoksatsol-2-yyli7hydroksimetyyli-2-metyylipropyyli7-L-proliiniamidi (kaava III, heterosykliseen renkaaseen si-5 sältyy X, N ja Q=5-(aminokarbonyyli)bentsoksatsol-2-yyli, A=CO, L=£-fenyleeni, R4=R5.S(02).NH.CO-, R5=4-ClCgH4) 1-(3-dimetyyliaminopropyyli)-3-etyylikarbodi-imidi-hydrokloridia (1,57 g) lisättiin liuokseen, jossa oli esimerkin 19h tuotetta (1,57 g), 1-hydroksibentstriatsolia 10 (1,01 g) ja esimerkin 19d happotuotetta (4,00 g) dimetyyli- formamidissa (75 ml), ja liuosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 60 tunnin ajan. Liuotin haihdutettiin ja ruskea öljy pestiin 1 N HCl:lla, joka oli kyllästetty NaCl:lla, jolloin muodostui kullanruskea saostuma. Sen jälkeen, kun 15 saostuma oli suodatettu ja osa kiinteästä aineesta (750 mg) poistettu, raaka saostuma liuotettiin metanoliin , annettiin adsorboitua piimäähän ja puhdistettiin "flash" -kro-matografian avulla eluoiden metyleenikloridi:metanoli: NH^OHslla (gradientti 85:15:1 - 70:30:1), jolloin saatiin 20 alkoholi (3,58 g, 59 %) kullanruskeana kiinteänä aineena; TLC: R^=0,22, metyleenikloridi:metanoli:etikkahappo (90:10:0,2)? MS: m/e=421.

j . (S) -/4-/_(4-kloorifenyyli) sulfonyyliaminokar- bonyyli/bentsoyyli7-L-valyyli-N-_/l-/5- (aminokarbonyyli) -25 bentsoksatsol-2-yyli7 karbonyyli-2-metyylipropyyl.f7-L- proliiniamidi (kaava I, heterosykliseen renkaaseen sisältyy X, N ja Q=5-(aminokarbonyyli)bentsoksatsol-2-yyli, A=CO, L=p-fenyleeni , R4=R5 .S (C>2) .NH.CO-, R5=4-C1C6H4) Liuokseen, jossa oli yllä olevassa esimerkissä 30 19i kuvatun kaltaisella tavalla valmistettua alkoholia (50 mg) ja 1-(3-dimetyyliaminopropyyli)-3-etyylikarbodi-imidihydrokloridia (183 mg) dimetyylisulfoksidissa (1,0 ml) ja tolueenissa (1,0 ml), lisättiin dikloorietikkahappoa (8,2 mg, 0,0052 ml). Seosta sekoitettiin 16 tunnin ajan, 35 sitten lisättiin vielä dikloorietikkahappoa (0,011 ml) ja sekoittamista jatkettiin vielä 24 tunnin ajan. Reaktio- 80 seos liuotettiin kloroformiin, pestiin (1 N HC1, suolavesi), kuivattiin (MgSO^) ja liuottimet haihdutettiin, jolloin saatiin otsakkeen yhdiste (42 mg).

Il 91072 81 yj

O

' Z—X

o S

y3^y>gi O* 'V 'i >r ' 5 \ Γ o \ 5 vl· ^ £.

a .t , , >t >} Id >L * f >ί·Β1^ _ { · Kr,5 I >-£*-Ά m

X

Kaavio II

82 „, I---MV 1 XV ;

X.JLX/> — IV

*' ! “O I ™ *

xvn I

^¥

VI

II

Kaavio III

83 91072

CBZ-N^O0-^ CBZ-N^Y'W

H H H OH

| Xllla

H OH %' Hi V

XIVa XVa oh + χν3 m IXa

R-l-A-N-^i-^OH + XVa -*> XVII DCb IV

Kaavio IV

84 CBZ~ i»^0CH’ xx H 0 ^CH.

CBZ-N-^V^^ XXI

A 0 x H~iVCQ xxn

H

H—N—XXIII

O i rv

II

Claims (4)

91072 85

1. Menetelmä terapeuttisesti aktiivisen heterosyk-lisen peptidin valmistamiseksi, jolla on kaava (I) 5 R4— L—A—N

10 H °0 li ° jossa R4 on ryhmä, jolla on kaava Rs*S02-NH-C0-, R5· S02 · NH · CO · NH- tai CF3S02-NH-, joissa R5 on (l-6C)alkyy-15 li, fenyyli tai halogeenifenyyli; L on para-fenyleeni; A on karbonyyli; X on happi tai rikki; ja Q on orto-feny-leeni, jossa voi olla substituenttina hydroksi, halogeeni, trifluorimetyyli, (1-4C)alkoksi, hydroksi(1-3C)alkyy-li, karboksi, syaani, karbamoyyli tai [(1-4C)alkoksi]kar-20 bonyyli, tai Q on cis-vinyleeni, ja sen farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että (A) hapetetaan vastaava alkoholi, jolla on kaava (III) 25 R—L—A—N ίΓ,Ν—\| "l~C V H h Hi X7 m (B) kaavan I mukaisen yhdisteen saamiseksi, jossa R4 on R5·S02·NH·CO-, vastaava yhdiste, jolla on kaava (IV) 86

5 R- L-a - ν'ιγ/ν -χ' f ^Sr( V 1 o / \ I Ä χ/ IV H H ° * jossa R7 on karboksi (jota yhdistettä seuraavassa nimite-10 tään kaavan IV mukaiseksi hapoksi), saatetaan regoimaan kaavan R5,S02-NH2 mukaisen sulfonamidijohdannaisen kanssa dehydratointiaineen läsnä ollessa tai kaavan IV mukaisen hapon reaktiivinen johdannainen saatetaan reagoimaan kaavan R5 · S02 ·NH2 mukaisen sulfonamidijohdannaisen tai sen 15 suolan kanssa tai (C) kytketään happo, jolla on kaava R4-L-COOH, tai sen reaktiivinen johdannainen aminoketonin kanssa, jolla on kaava (V) 20 H °0 It O 25 minkä jälkeen haluttaessa kaavan I mukainen yhdiste, jossa Q on hydroksiryhmällä substituoitu orto-fenyleeni, 30 dealkyloidaaan vastaava kaavan I mukainen yhdiste, jossa Q on (1-4C)alkoksiryhmällä substituoitu orto-fenyleeni, ja/tai haluttaessa farmaseuttisesti hyväksyttävä suola saatetaan kaavan I mukaisen yhdisteen happomuoto reagoimaan emäksen kanssa, joka antaa fysiologisesti hyväksyt-35 tävän kationin. Il 91072 87

2. Yhdiste, jolla on kaava (III) R —L—A—Ν^ΙΓί*-/3 TTT Λ »(J A Hi V 10 jossa R4, L, A, Q ja X ovat patenttivaatimuksessa 1 määritellyt, tai sen suola.

3. Yhdiste, jolla on kaava (IV) R-L-Ä-N f.N — i o/ \ I ΙΓΛ r iv H |!| o x/ 20 jossa R7 on karboksi, H2N*S02-, NH2- tai -NCO ja L, A, Q ja X ovat patenttivaatimuksessa 1 määritellyt, tai sen suola.

4. Yhdiste, jolla on kaava (V) 25 H — w'lP.H V A A ° χ/ jossa Q ja X ovat patenttivaatimuksessa 1 määritellyt, tai sen suola. 88