FI90628B - Kudossiirrännäisen käsittelymenetelmä - Google Patents

Description

1 90628

Kudossiirrännäisen käsittelymenetelmä

Keksinnön ala Tämä keksintö on lääketieteellisten kudossiirrännäisten 5 alalta. Erityisesti se koskee kiinteitä elinsiirrännäisiä, kuten haiman saarekkeita, jotka on päällystetty immunologisella esteellä niiden tekemiseksi siirtoon sopiviksi.

Tekniikan taso 10 Geneettisesti erilaisten yksilöiden väliset kudossiir- rännäiset (joita kutsutaan ksenotyyppisiksi siirrännäisiksi, kun luovuttaja ja vastaanottaja ovat eri lajia, ja al-lotyyppisiksi, kun luovuttaja ja vastaanottaja ovat samaa lajia) aiheuttavat yleensä vastaanottajayksilössä immuuni-15 vasteen. Immuunivaste johtaa usein siirrännäisen hylkäämiseen tai tuhoamiseen tai, jos siirrännäisessä on immunolo-gisesti kilpailukykyisiä soluja, graft-versus-host -sairauteen (GVHD).

Eräs tekniikka, jota on käytetty yritettäessä vähentää 20 tai eliminoida kudossiirrännäisten immunogeenisuutta, on kudossiirrännäisen kotelointi sellaiseen biologisesti sopivaan materiaaliin, joka ei vaikuta haitallisesti siirrännäisen elin- tai toimintakykyyn. Joukko yhdysvaltalaisia patenttijulkaisuja - 4352883, 4391909, 4407957 ja 4409331 -25 kuvaa sellaista kotelointia. Nämä julkaisut koskevat eri-tyisesti haiman saarekkeita, jotka on koteloitu pisaranmuo-, toisiin kapseleihin vangitsemalla saarekkeet ensin polysak- karidigeeliin (esim. alginaatti) ja sitten silloittamalla geelin pinta polykationisella polymeerillä (esim. polyly-*- · 30 siini). Tässä menetelmässä käytetyllä polysakkaridilla ei uskota olevan affiniteettia saarekkeiden pintaan, ja saarekkeiden pinta itse asiassa työntääkin sitä luotaan. Tämä .. : lisää todennäköisyyttä, että ympäröivässä geelissä on rei- kiä tai aukkoja ja että se ei kykene ympäröimään saarekkei-35 ta kokonaan. Lisäksi menetelmä, jossa saarekkeet vangitaan geelipisaroiden sisään, vaatii erikoislaitteita, ja se täytyy suorittaa huolellisesti säädetyissä olosuhteissa.

2 90628

Keksinnön kuvaus

Keksinnön kohteena on patenttivaatimuksen 1 mukainen kudossiirrännäisen käsittelymenetelmä. > 5 Menetelmässä j - siirrännäinen päällystetään ensimmäisellä materiaali- kerroksella, joka ei ole sytotoksista, joka muodostaa ke- : miallisen sidoksen siirrännäisen pinnan kanssa ja joka mu- 10 kautuu siirrännäisen pintaan; - ensimmäinen kerros haluttaessa päällystetään yhdellä tai useammalla haitattomalla välikerroksella; ja - siirrännäinen päällystetään polymeeristä materiaalia olevalla ulkokerroksella, joka muodostaa kemiallisen sidok- 15 sen ensimmäisen kerroksen materiaalin tai mahdollisesti mukana olevan liittävän välikerroksen kanssa ja joka ulkokerros on biologisesti sopeutuva ja puoliläpäisevä. j

Keksinnön mukaisesti aikaansaadaan päällystetty kudossiirrännäi- } nen, joka soveltuu siirrettäväksi geneettisesti erilaiseen 20 yksilöön ja jolle on tunnusomaista, että siirrännäinen on päällystetty sen pintaan mukautuvalla immunologisella este-kalvolla, jossa kalvossa on siirrännäisen pintaan kemialli-'.· sesti sitoutunut sytologisesti myrkytön sisäkerros, halut- taessa yksi tai useampia vaarattomia välikerroksia, ja ve-: 25 teen liukenematon puoliläpäisevä biologisesti sopeutuva ui- :··· kokerros, joka on kemiallisesti sitoutunut sisäkerroksen tai mahdollisesti mukana olevaan liittävään välikerrokseen.

Tapoja keksinnön toteuttamiseksi . 30 Termillä "kudossiirrännäinen" tarkoitetaan tässä yhtä nisäkässolua tai niiden joukkoa tai nisäkässolujoukkoa, joka muodostaa yhdestä tai useammasta luovuttajanisäkkäästä : : peräisin olevan organellin tai elimen ja joka solu tai so- ; lujoukko on aiotulle vastaanottajalle geneettisesti erilai-35 nen (ksenotyyppinen tai allotyyppinen). Termillä tarkoite-taan tyypillisesti umpieritteisiä (aivolisäke-, kilpirauhas-, lisämunuais-, lisäkilpirauhas-, haima-) soluja, organelleja .3 90628 tai rauhasia, mutta termiä voidaan käyttää myös muiden elinsiirrännäisten, kuten sydän-, maksa-, keuhko- ja mu-nuaissiirrännäisten yhteydessä.

Termillä "sytologisesti myrkytön" tarkoitetaan tässä 5 sitä, että materiaali ei olennaisesti vaikuta sen solun, organellin tai elimen elin- tai toimintakykyyn, johon materiaalia käytetään.

Ilmauksella "kemiallisesti sitoutunut" tarkoitetaan tässä sitä, että tämä on yksi tai useampi kovalentti-, io-10 ni- ja/tai vetysidos.

Ilmaus "biologisesti sopeutuva" tarkoittaa, että kerros on oleellisesti antigeenitön vastaanottajan immuunijärjestelmän suhteen eikä aiheuta foreign body (fibroosi) -reaktiota.

15 Termi "puoliläpäisevä" tarkoittaa, että mainittu kalvo sallii aina kyseisen solun, organellin tai elimen ravinteiden diffundoitua sisäänpäin ja metaboliatuotteiden ulospäin, mutta estää sellaisten tuotteiden diffundoitumisen sisään tai ulos, jotka voivat vaikuttaa vahingollisesti siirrän-^ 20 naiseen tai vastaanottajaan.

^ Tämä keksintö on sovellettavissa monenlaisiin siirrän- naisiin, eikä sen ole tarkoitettu rajoittuvan tietyntyyppi-'··’ seen soluun, organelliin tai elimeen tai tiettyyn nisäkäs lajiin. Niinpä kun keksintöä jäljempänä kuvataan ja ha-25 vainnollistetaan eri eläinten haiman saarekkeisiin liittyen, on korostettava, että nämä opetukset ovat yleistettävissä koskemaan myös muiden nisäkäslajien, ihminen mukaan luettuna, muita kudoksia.

Haimakudosta voidaan ottaa talteen ja viljellä käyttäen ; 30 tunnettuja menetelmiä, jotta se saadaan sopivaksi tämän keksinnön mukaisessa päällystysmenetelmässä käytettäväksi'. Kudos otetaan talteen tuoreena ja käsitellään jauhamalla, möyhentämällä, hienontamalla ja/tai liuottamalla varovasti ' : kollagenaasin avul-la, jotta saarekkeet saadaan helpommin ... 35 erotetuksi vieraista soluista ja aineksista. Saarekkeet .·. : voidaan eristää käsitellystä/liuotetusta haimskudoksosta pesemällä, suodattamalla, sentrifugoimall a tai poimintame- 4 90628 netelmillä. Eristettyä kudosta viljellään parhaiten nestemäisessä elatusväliaineessa sellaisissa olosuhteissa ja niin pitkän ajan, että viljelmän antigeeniset komponentit (esim. vaeltavat valkosolut) deaktivoituvat ja eliminoitu-5 vat. Sellaisia elatusväliaineita ja olosuhteita kuvataan julkaisussa Transplant Proc (1982) Ib(4):71^-23»

Puhdistetut eristetyt saarekkeet päällystetään sitten syto-logisesti myrkyttömällä polyfunktionaalisella materiaalilla, jolla on hyvä affiniteetti yhteen tai useampaan solun 10 pinnan komponenttiin. Termi "polyfunktionaalinen" tarkoittaa, että materiaalilla on ainakin kaksi mahdollista kohtaa, joiden avulla se voi helposti liittyä solun pintakom-ponentteihin, ja materiaalilla on toisaalta myös ulompaan kerrokseen tarttuvia funktionaalisia ryhmiä. Polyfunktio-15 naalinen materiaali toimii sitovana siltana solun pinnan ja ulomman polymeerikerroksen välillä. Se muodostaa pysyviä (tarkoittaen hajoamisen kestävyyttä päällystyksen, sitä seuraavan mahdollisen säilytyksen aikana sekä siirron jälkeen) kemiallisia sidoksia yhden tai useamman solun pinnan 20 komponentin kanssa (riippuen esim. materiaalin, proteiinien reaktiivisten ryhmien, hiilihydraattien tai lipidien luonteesta) sekä ulomman, puoliläpäisevän kalvon muodostavan materiaalin funktionaalisten ryhmien kanssa. Materiaali voi olla synteettistä tai luonnollista, epäorgaanista tai ! 25 orgaanista. Esimerkkeinä materiaaleista, joita voidaan käyttää muodostamaan sisäpäällystettä, mainittakoon: alu-miinihydroksi; disakkaridit (maltoosi, sakkaroosi, laktoosi ja trehaloosi tai niiden sulfatoidut johdannaiset); mole- ; kyylipainoltaan pienet, ei-polymeeriset proteiinien liittä- ; 30 mis- tai ristisitomisagenssit, kuten bifunktionaaliset di-sulfidit, esim. 3,3’-dimetyyliditiobispropionaatti (DTBP) ja N-sukkinimidyyli-3-(2-pyridyyliditio)propionaatti (SPDP), 6-maleimidokapronihapon N-hydroksisukkinimidoesterit, 2- bromietikkahappo ja 2-jodietikkahappo, näiden tapaisten 35 happojen aktiiviset esterit, imidoesterit, kuten dimetyyli-adipimaatti ja disukkinimidyylisuberaatti, aldehydit, kuten glutaarialdehydi, bisatsidoyhdisteet, kuten bis(p-etsido- i i ! 5 90628 bentsoyyli)heksaanidiamiini, bisdiatsonium-j ohdannaiset, di-isosyanaatit, kuten bistolyleeni-2,6-di-isosyanaatti, ja karbodi-imidit; siirrännäisen jonkun pintakomponentin immu-noglobuliini, kuten luokan I tai II MHC-antigeenien vasta-5 aineet; lektiinit (s.o. kasviproteiinit, jotka sitoutuvat sokeriin tai sokeritähteisiin) kuten konkavaliini A, DBA, soijapapuagglutiniini, vehnänituagglutiniini ja fyto-hemagglutiniini; ja polyioniset polyaminohapot, joilla on vastakkainen varaus kuin siirrännäisen pinnalla, esim. hai-10 man saarekkeilla on negatiivinen pintavaraus ja saarekkeen pintaan voidaan sitoa polykationista polyaminohappoa, kuten polylysiiniä.

Tapa, jolla sitova silloittava aine viedään siirrännäisen pintaan, riippuu materiaalin luonteesta. Tyypillisessä 15 tapauksessa se viedään vesisuspensiona tai -liuoksena sellaisissa olosuhteissa (fysiologinen pH, eli 7...7,5, lämpötila, eli noin 37°C, ja ioni-vahvuus) jotka edistävät ja edesauttavat pinnan yhtenäistä päällystymistä ja kemiallisten sidosten muodostumista materiaalin ja kysymyksessä ole-20 van pinnan komponentin välillä. Aplikointi suoritetaan tavallisesti siten, että siirrännäisen pinta saatetaan kosketukseen suspension tai liuoksen kanssa samalla sekoittaen noin 4...20 min. Päällyste tehdään parhaiten ohueksi pinnan myötäiseksi kerrokseksi, jossa on yksi tai muutamia mo-25 lekyylikerroksia.

Ulkokerros tehdään polymeeristä, joka antaa tarvittavan puoliläpäisevyyden ja immunologisen sopeutumiskyvyn. Polyaminohapot, joilla on reaktiivisia karboksyyli-, amino- tai iminoryhmiä, kuten polyasparagiinihappo, polyglutaamihappo, 30 polylysiini ja polyarginiinihappo, soveltuvat parhaiten.

Kulloinkin kysymykseen tuleva aminohappo riippuu sisäpääl-lysteen käytettävissä olevien sitovien kohtien luonteesta ja varauksesta. Esimerkiksi jos käytettävissä olevat kohdat ovat negatiivisesti varautuneita, käytetään polykatio- 35 nista polyaminohappoa, kuten polylysiiniä. Jos taas käy tettävissä olevat kohdat ovat positiivisesti varautuneita, voidaan käyttää polyanionista polyaminohappoa, kuten poly- 6 90628 asparagiinihappoa. Kerroksen läpäisevyys riippuu ennen kaikkea materiaalin molekyylipainosta ja kerroksen paksuudesta. Läpäisevyys kasvaa rnolekyylipainon kasvaessa ja pienenee paksuuden kasvaessa. Polymeerin molekyylipaino on 5 tyypillisesti alueella 5000...300 000 daltonia ja paksuus vaihtelee tavallisesti välillä 0,1 ... 10 mikronia, tavallisimmin 0,1 ... 3 mikronia. Nämä polymeerit voidaan apli-koida siirrännäisiin laimeina vesiliuoksina (0,1 ... 1 p-%) fysiologisessa pH:ssa, ionivahvuudessa ja lämpötilassa. Polo lymeeriliuos pidetään kosketuksissa siirrännäiseen tavallisesti lievästi sekoittaen (täydellise päällystyksen varmistamiseksi) noin 4—10 min kerrosta kohti. Haluttaessa ulkokerros voidaan muodostaa yhden tai useamman poiymeerin useista kerroksista. Voidaan myös käyttää yhtä tai useam-15 paa yhdestä tai useammasta haitattomasta materiaalista, kuten polysakkaridista, tehtyä välikerrosta, edellyttäen että ne eivät häiritse sisäkerroksen kemiallista sitoutumista siirrännäisen pintaan, eivät vaikuta siirrännäisen elin-tai toimintakykyyn, ja että ne muodostavat sopivan alustan, 20 ' johon ulompi, puoliläpäisevä kalvo voi sitoutua kemialli sesti .

Seuraavat esimerkit edelleen havainnollistavat kudos-siirrännäisiä sekä materiaaleja ja menetelmiä, joita käytetään siirrännäisten sisä- ja ulkopäällysteiden muodostami-25 seen. Näitä esimerkkejä ei ole tarkoitettu mitenkään rajoittamaan keksintöä.

Haiman saarekkeen eristys

Vasta saatu haimakudos hienonnettiin ja sijoitettiin 30 Hankin liuokseen, jossa oli kollagenaasia sidekudoksen liuottamiseksi. Saatu seos käsiteltiin saarekkeiden eristämiseksi Ficoll-Hypaque -gradienttisentrifugimenetelmällä. Eristettyjä saarekkeita viljeltiin 7 päivää 37 °C:ssa RPMI 1640 -elatusaineessa, johon oli lisätty 10 % vasikan sikiön 35 seerumia, kosteassa, 5 % CC^ta sisältävässä atmosfäärissä.

7 90628

Saarekkeen päällystys A. Alumiinihydroksidi

Eristettyjä saarekkeita suspentoidaan 3 ml:aan RPMI 5 1640 -liuosta siten, että konsentraatioksi tulee 10^ saare ketta per ml. Alumiinihydroksidia hienonnetaan hiertimellä huhmaressa, kunnes geelin hiukkaskoko on 1...3 mikronia. Fysiologiseen suolaliuokseen tehdään yksiprosenttinen AI(OH)j-liuos. RPMI-elatusaine poistetaan, ja se korvataan 10 3 ml:11a saatua 1 % Al(0H)^:a sisältävää suolaliuosta.

Saareke-Al(OH)^ -liuosta sekoitet-an pyörittämällä 2,5 min. Al(0H)^:lla päällystetyt saarekkeet sedimentoidaan, ja ylimääräinen AI(OH)j-liuos poistetaan. Päällystetyt saarekkeet pestään sen jälkeen 3 kertaa 6 ml:ssa fysiologista 15 suolaliuosta (pH 7).

Päällystetyt saarekkeet siirretään sitten 3 ml:aan fysiologista suolaliuosta (pH 7), jossa on 0,5 % poly-L-aspa-ragiinihappoa (molek.p. 50 000), ja sekoitetaan 4 min. Poly-L-asparagiinihappo poistetaan, ja päällystetyt saarek-.. . 20 keet pestään 3 kertaa 6 ml:ssa fysiologista suolaliuosta (pH 7).

Päällystetyt saarekkeet suspentoidaan sen jälkeen 3 ml:aan liuosta, jossa on 0,5 % poly-L-lysiiniä (molek.p.

* *’ 50 000), ja sekoitetaan 5 min. Poly-L-lysiini poistetaan, 25 ja saarekkeet pestään 3 kertaa fysiologisessa suolaliuok-•V/ sessa (pH 7).

Poly-L-asparagiinihappo- ja poly-L-lysiinipäällystyk-set ja -pesut voidaan toistaa, jos halutaan paksumpi ulkokerros .

. 30 Viimeisen fysiologisella suolaliuoksella suoritetun pe- * ·*·, sun jälkeen saarekkeet suspentoidaan 10 ml:aan liuosta, jossa on 1 % deferoksamiinia fysiologisessa suolaliuoksessa (pH 7,2), 10 min ajaksi. Deferoksamiinikäsittely uusitaan '“ · toisen 10 min ajan, ja deferoksamiini poistetaan. Päällys- 35 tetyt saarekkeet pestään 2 kertaa fysiologisessa suolaliuok-sessa ja RPMI 1640 -elatusaineessa. Saarekkeet voidaan tässä vaiheessa siirtää, tai ne voidaan palauttaa kudosvil- 8 90628 jelmään. Päällystettyjä saarekkeita voidaan säilyttää ku-dosviljelmässä RPMI 1640:ssä (10 % vasikan sikiön seerumia, 5 % CO^ia, 85 % ilmaa).

5 B. DTBP

Tuhat eristettyä saareketta suspentoidaan fysiologiseen suolaliuokseen (pH 7,2), jossa on 0,5 % DTBP:tä. Saarekkeita sekoitetaan 50 sek, suspensioon lisätään 30 ml suolaliuosta, ja DTBPrllä päällystettyjen saarekkeiden annetaan 10 laskeutua liuoksesta. DTBP-liuos poistetaan, ja saarekkeet pestään 3 kertaa 20 ml:11a suolaliuosta (pH 7). Viimeinen suolaliuos poistetaan, lisätään 3 ml 0,3-prosenttista poly-L-asparagiinihapon (molek.paino 50 000) liuosta, ja sekoitetaan 4 min.

15 Poly-L-asparagiinihappo poistetaan, ja polymeerillä päällystettyjä saarekkeita pestään 3 kertaa 6 ml :11a suolaliuosta. Päällystetyt saarekkeet suspentoidaan sen jälkeen 3 ml:aan liuosta, jossa on 0,5 % poly-L-lysiiniä (molek.p. 50 000), ja sekoitetaan 5 min. Poly-L-lysiini poistetaan, 20 ja saarekkeita pestään 3 kertaa fysiologisessa suolaliuoksessa.

C. MHC-antiseerumi

Tuhat eristettyä rotan saareketta suspentoidaan 0,25 25 ml:aan kudosopilliselta yhteensopivuudeltaan luokkaa I olevaan vasta-aineseerumiin (M.A. Bioproducts) , joka on laimennettu puoleen fysiologisella suolaliuoksella (pH 7,5). Saarekkeita ja vasta-ainetta inkuboidaan 4 °C:ssa 45 min. Vasta-aineella päällystettyjä saarekkeita pestään sen jäl-30 keen 2 kertaa 5 ml:lla fysiologista suolaliuosta (pH 7).

Viimeinen pesusuolaliuos poistetaan, lisätään 3 ml 0,5-pro-senttista poly-L-lysiiniä (molek.paino 50 000), ja sekoitetaan 5 min. Poly-L-lysiini poistetaan, ja saarekkeet pestään fysiologisessa suolaliuoksessa (pH 7)· Päällystetyt 35 saarekkeet suspentoidaan sen jälkeen 3 ml:aan poly-L-aspa-ragiinihapon (molek.paino 50 000) 0,5-prosenttista liuosta, ja sekoitetaan 4 min. Poly-L-asparagiinihappo poistetaan, 9 90628 ja saarekkeet pestään fysiologisessa suolaliuoksessa (pH 7). Jos halutaan, saarekkeet voidaan toistamiseen päällystää poly-L-lysiinillä ja pestä. Vaihtoehtoisesti voidaan käsitellä sitova vasta-aine ja polymeeri biotiinilla ja käyttää 5 standardin mukaista biotiini-avidiinisysteemiä.

Ihmisestä peräisin olevia saarekkeita voidaan päällystää samalla tavalla käyttäen saatavilla olevia luokan I tai II MHC-vasta-aineita.

10 D. Lektiini

Tuhat eristettyä saareketta suspentoidaan 3 ml:aan fysiologista suolaliuosta (pH 7), jossa on 10 yg/ml Con A:ta (Sigma Chemical Company). Saarekkeita sekoitetaan 15 min ^ °C:ssa, ja pestään 10 ml:lla fysiologista suolaliuosta 15 (pH 7)· Suolaliuos poistetaan ja korvataan 3 ml:11a suolaliuosta (pH 7), jossa on 0,5 % poly-L-lysiiniä (molek.paino 50 000), ja sekoitetaan 5 min. Poly-L-lysiini poistetaan, ja saarekkeet pestään fysiologisella suolaliuoksella (pH 7). Päällystetyt saarekkeet suspentoidaan 3 ml:aan 0,5-prcsent-20 tista poly-L-asparagiinihapon (molek.paino 50 000) liuosta, ja sekoitetaan 4 min. Saarekkeet pestään sen jälkeen fy-: siologisessa suolaliuoksessa (pH 7)· Toinen poly-L-lysii- nikerros voidaan haluttaessa lisätä.

Vaihtoehtoisessa päällystysmenetelmässä voidaan lektii-25 nisiltä ja polymeeri käsitellä biotiinilla ja käyttää stan- : : : dardin mukaista biotiini-avidiinisysteemiä.

E. Polykationinen polyaminohappo

Eristettyjä saarekkeita suspentoidaan 3 ml:aan fysiolo-30 gista suolaliuosta (pH 7), jossa on 0,5 % poly-L-lysiiniä (molek.paino 50 000), ja sekoitetaan noin 10 min. Sen jäl-keen poistetaan poly-L-lysiini liuos, ja päällystettyjä saarekkeita pestään 3 kertaa 6 ml :11a fysiologista suolaliuos-ta.

': · 35 Päällystetyt saarekkeet siirretään sen jälkeen 3 ml: aan fysiologista suolaliuosta, jossa on 0,5 % poly-L-asparagi i-• nihappoa (molek.paino 50 000), ja sekoitetaan noin 10 min.

.10 90628

Poly-L-asparagiinihappo poistetaan, ja päällystettyjä saarekkeita pestään taas 3 kertaa suolaliuoksella.

Lopuksi päällystetyt saarekkeet suspentoidaan taas 3 ml:aan 0,5-prosenttista poly-L-lysiinin suolaliuosta, ja 5 sekoitetaan noin 10 min, minkä jälkeen pestään suolaliuoksella.

Saarekkeiden in vitro -testaus

Eristettyjen saarekkeiden toiminnallinen elinkykyisyys 10 ja säädeltävyys glukoosin suhteen määritettiin. Ne päällystettiin käyttäen esimerkeissä A...E annettuja menetelmiä. Kudosviljelmän immunoreaktiivisen insuliinin (IRI) pitoisuus määritettiin radioimmunologisesti. Insuliinin eritys määritettiin vasteena, joka saatiin stimuloimalla 15 yhden tunnin aikana jaksottaisesti 2 mM:lla ja 25 mM:lla glukoosia. Määritettiin 60 päällystetyn saarekkeen insuliinin eritys 5 ml:ssa RPMI-elatusainetta. Vasteena 2 mM:iin glukoosia (ei-stimuloiva konsentraatio) erittyi vähän insuliinia. Vasteena 25 mM:iin glukoosia käsitellyt 20 solut erittivät insuliinia 1,5 ··· 2,2 mg/saareke/h. Tämä on verrattavissa vasta saatujen käsittelemättömien saarekkeiden erittämään vasteinsuliiniin.

Saarekkeiden in vivo -testaus 25 Balb/C-hiiriä tehtiin diabeettisiksi injektoimalla vat saontelon sisäisesti streptotsosiinia (180 mg/ruumiin painon kg). Plasmaan glukoosipitoisuudet olivat ilman paastoa tasolla 400.600 mg/dL. Vain hiirille, joiden plasman glu-koosipitoisuus oli yli 400 mg/dL kahden viikon ajan, annet-30 tiin siirrännäisiä. Eristettyjä rotan (Spraque-Dawley) siirrännäisiä päällystettiin käyttäen esimerkeissä A...D annettuja menetelmiä. Kaksi tuhatta päällystettyä saareketta siirrettiin vatsaontelon sisäisesti kuhunkin diabeet-tiseen hiireen, ja plasman glukoosipitoisuus ilman paastoa 35 määritettiin kolmasti viikossa. Hiirillä, joille oli siirretty saarekkeita, plasman glukoosipitoisuudet putosivat 100...175 mg/dL:aan. Nämä päällystetyt saarekkeet ovat yl- il 90628 läpitäneet käsitellyillä hiirillä normaalin verensokerin pitoisuuden kolmesta viikosta puoleentoista vuoteen. Verensokeriltaan normaaleja hiiriä lopetettiin kolmen kuukauden kuluttua, jotta saataisiin takaisin siirretyt saarek-5 keet. Päällystetyt saarekkeet eivät osoittaneet silmin nähtävää tai histologista kudosreaktiota, ja takaisin saadut saarekkeet olivat elinkykyisiä ja pystyivät glukoosin in vitro -säätelyyn.

Koira tehtiin diabeettiseksi poistamalla sen haima kolo konaan. Leikkauksen jälkeen sen veren glukoositaso oli alussa ^30 mg/dL, ja pitoisuuden pitämiseksi pienempänä kuin 300 mg/dL koira tarvitsi 15 U NPH-insuliinia. Ei sukua olevan koiran haimasta otettiin viisituhatta saareketta, ne käsiteltiin käyttäen MHC-vasta-aineseerumimenetelmää (edel-15 lä oleva esimerkki C, anti-koira-MHC-vasta-aineseerumia voidaan saada Microbiological Associatesilta) ja siirrettiin diabeettisen koiran vatsaonteloon. Siirron jälkeen sen verensokeritaso ja insuliinin tarve putosivat 2k tunnissa. Siirretyt saarekkeet ovat toimineet jatkuvasti yli 20 21/2 vuotta. Koira ei tarvinnut immuunivastetta vähentä viä lääkeaineita, ja sen verensokerin taso on ilman insu-; ·’ liinia 170...250, joka on korkeampi kuin ennen siirtoa mut- ta enemmän kuin normaaleilla, ei-diabeettisilla koirilla. Tämä hieman normaalia korkeampi taso oli odotettu, koskapa 25 siirrettiin vain 5000 solua. (Normaali haima sisältää noin : : : 300 000 saareketta ja noin 20 000 saareketta palauttaisi :V; käsitellyn koiran verensokeritason normaaliksi.) Koiralle annostellaan jatkuvasti 6 U NPH-insuliinia (saarekkeiden kehittymisen ja lisääntymisen edistämiseksi), ja sen veren-30 sokeri on 93 mg/dL. Koiralla ei ole ollut diabeteksen kliinisiä oireita.

Claims (8)

12 90628

1. Kudossiirrännäisen käsittelymenetelmä sen tekemiseksi sopivaksi siirrettäväksi geneettisesti erilaiseen yksilöön, jossa menetelmässä siirrännäinen päällystetään sisäkerroksel- 5 la ja ulkokerroksella, tunnettu siitä, että - siirrännäinen päällystetään ensin kerroksella sytolo-gisesti myrkytöntä materiaalia, joka muodostaa kemiallisen sidoksen siirrännäisen pinnan kanssa ja mukautuu siirrännäisen pintaan, ja jossa on alumiinihydroksidia, disakkaridia, 10 polyfunktionaalista ristisilloitusagenssia, siirrännäisen pinnan jotain komponenttia vastaavaa immunoglobuliinia, lek-tiiniä tai polyionista aminohappoa, jolla on päinvastainen varaus kuin siirrännäisen pinnalla, ensimmäinen kerros päällystetään haluttaessa yhdellä 15 tai useammalla haitatonta materiaalia olevalla välikerroksel la, siirrännäinen päällystetään sen jälkeen polymeeristä materiaalia olevalla ulkokerroksella, joka muodostaa kemiallisen sidoksen ensimmäisen kerroksen tai mahdollisesti mukana 20 olevan liittävän välikerroksen kanssa ja on biologisesti sopeutuva ja puoliläpäisevä ja jossa on polyaminohappoa, jossa on reaktiivisia karboksyyli-, amino- tai iminosivuryh-miä.

2. Vaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa siirrännäinen 25 on umpirauhassiirrännäinen.

3. Vaatimuksen 2 mukainen menetelmä, jossa siirrännäinen on haimasiirrännäinen.

4. Jonkin vaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sisäkerroksessa on bifunktionaalista disulfidia, 30 siirrännäisen MHC-antigeeniin sitoutuvaa immunoglobuliinia, konkanavaliini A:ta tai polylysiiniä.

5. Jonkin vaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ulkokerroksen polyaminohappo on polylysiini, po-lyarginiini, polyasparagiinihappo tai polyglutaanihappo.

6. Jonkin vaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ulkokerroksen polyaminohapon molekyylipaino on 5000 - 300000 daltonia ja että ulkokerroksen paksuus on 0,1 -10 μιη. 13 90628

7. Vaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sisäkerroksessa on alumiinihydroksidia ja ulkokerroksessa on kemiallisesti alumiinihydroksidiin sitoutunutta polyas-paragiinihappoa sekä polyasparagiinihappoon kemiallisesti 5 sitoutunutta polylysiiniä.

8. Jonkin vaatimuksen 1-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että siinä on ainakin yksi haitatonta materiaalia oleva välikerros ja että ulkokerros on kemiallisesti sitoutunut välikerrokseen. 10