JPH07100661B2 - 被覆された移植片およびその製造方法 - Google Patents
被覆された移植片およびその製造方法Info
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- JPH07100661B2 JPH07100661B2 JP61054563A JP5456386A JPH07100661B2 JP H07100661 B2 JPH07100661 B2 JP H07100661B2 JP 61054563 A JP61054563 A JP 61054563A JP 5456386 A JP5456386 A JP 5456386A JP H07100661 B2 JPH07100661 B2 JP H07100661B2
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- A61L27/28—Materials for coating prostheses
- A61L27/34—Macromolecular materials
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は医用移植片の分野に属し，特に，移植片を免疫
学的な関門で被覆して移植に適するものとした，ランゲ
ルハンス島のような，固形器官移植片に関する。
学的な関門で被覆して移植に適するものとした，ランゲ
ルハンス島のような，固形器官移植片に関する。
（従来の技術） 遺伝的に異なる個体間の移植片（供与者と受容者が異種
の場合は異種移植片，または投与者と受容者が同種の場
合は同種移植片，と呼ばれる）は普通，受容側個体にお
いて免疫応答を誘起する。この免疫応答はしばしば移植
片の拒絶反応または破壊を導き，また移植片が免疫担当
細胞を含む場合はGVHD（graft−versus−host diseas
e）を引き起こす。
の場合は異種移植片，または投与者と受容者が同種の場
合は同種移植片，と呼ばれる）は普通，受容側個体にお
いて免疫応答を誘起する。この免疫応答はしばしば移植
片の拒絶反応または破壊を導き，また移植片が免疫担当
細胞を含む場合はGVHD（graft−versus−host diseas
e）を引き起こす。
移植片の免疫原性を低下または除去するために用いられ
てきた一技術として，移植片の生存能力または機能性に
逆の影響を及ぼさないような生物学的に適合性の物質で
移植片をカプセル包装することがある。一連の米国特許
・・・4,352,883,4,391,909,4,407,957,および4,409,33
1・・・にはこのようなカプセル包装が記載されてい
る。これら特許は特にランゲルハンス島に関するもの
で，これらランゲルハンス島は，まずランゲルハンス島
を多糖類（例えば，アルギン酸塩）ゲル内に捕獲し次い
で多カチオン性（例えば，ポリリジン）重合体でゲル表
面を架橋することによって小滴状カプセル内にカプセル
包装されている。この操作で使用される多糖類はランゲ
ルハンス島表面に対し親和性を持たず，実際，ランゲル
ハンス島表面ではねつけられると思われる。これにより
捕獲用ゲルに穴または裂け目が存在してランゲルハンス
島を完全にカプセル包装しそこなう可能性が高くなる。
また，ランゲルハンス島をゲル小滴内に捕獲するための
操作には特別な装置が必要であり，しかも注意深く制御
された条件下で行わなければならない。
てきた一技術として，移植片の生存能力または機能性に
逆の影響を及ぼさないような生物学的に適合性の物質で
移植片をカプセル包装することがある。一連の米国特許
・・・4,352,883,4,391,909,4,407,957,および4,409,33
1・・・にはこのようなカプセル包装が記載されてい
る。これら特許は特にランゲルハンス島に関するもの
で，これらランゲルハンス島は，まずランゲルハンス島
を多糖類（例えば，アルギン酸塩）ゲル内に捕獲し次い
で多カチオン性（例えば，ポリリジン）重合体でゲル表
面を架橋することによって小滴状カプセル内にカプセル
包装されている。この操作で使用される多糖類はランゲ
ルハンス島表面に対し親和性を持たず，実際，ランゲル
ハンス島表面ではねつけられると思われる。これにより
捕獲用ゲルに穴または裂け目が存在してランゲルハンス
島を完全にカプセル包装しそこなう可能性が高くなる。
また，ランゲルハンス島をゲル小滴内に捕獲するための
操作には特別な装置が必要であり，しかも注意深く制御
された条件下で行わなければならない。
（発明が解決しようとする問題点） 本発明は，上述したような従来のカプセル包装操作の欠
点に鑑みてなされたものであり，移植片を処理してその
免疫原性を低下させるためのより効果的かつ簡単な方法
を提供することを目的とする。
点に鑑みてなされたものであり，移植片を処理してその
免疫原性を低下させるためのより効果的かつ簡単な方法
を提供することを目的とする。
（問題点を解決するための手段） 本発明の方法は，移植片を処理して遺伝的に異なる個体
への移植に適するものとする方法であって，以下の工
程， （ａ）該移植片をまず，移植片表面と化学結合する非細
胞毒性物質の第１層で被覆する工程であり，該第１層が
移植片表面に適合すること， （ｂ）該第１層に無毒性物質の中間層を１層以上任意に
被覆する工程，および （ｃ）該移植片を次いで，場合により該第一層の物質ま
たはそれに接触する該中間層の物質と化学結合する重合
体物質の外層で被覆する工程であり，該外層が生物学的
に適合性でかつ半透性であること， を含有する。
への移植に適するものとする方法であって，以下の工
程， （ａ）該移植片をまず，移植片表面と化学結合する非細
胞毒性物質の第１層で被覆する工程であり，該第１層が
移植片表面に適合すること， （ｂ）該第１層に無毒性物質の中間層を１層以上任意に
被覆する工程，および （ｃ）該移植片を次いで，場合により該第一層の物質ま
たはそれに接触する該中間層の物質と化学結合する重合
体物質の外層で被覆する工程であり，該外層が生物学的
に適合性でかつ半透性であること， を含有する。
本発明の移植片は、遺伝的に異なる個体への移植に適す
る移植片であって、該移植片が移植片表面に適合する免
疫学的関門膜によって被覆され、該膜が、移植片表面に
化学的に結合する非細胞毒性の内層と、該内層と化学的
に結合する生物学的に適合性で水に不溶性かつ半透性の
外層、を有し、 前記内層が （ａ）水酸化アルミニウム （ｂ）二糖類 （ｃ）多官能性架橋剤 （ｄ）移植片の表面に対するイムノグロブリン、 （ｅ）レクチン、または （ｆ）移植片表面と反対のチャージを持つ多イオン性ポ
リアミノ酸 からなる群から選択される物質を含有し、 前記外層が、反応性のあるカルボキシル基，アミノ基、
またはイミノ基の側鎖を有するポリアミノ酸を含有する ことを特徴とする。
る移植片であって、該移植片が移植片表面に適合する免
疫学的関門膜によって被覆され、該膜が、移植片表面に
化学的に結合する非細胞毒性の内層と、該内層と化学的
に結合する生物学的に適合性で水に不溶性かつ半透性の
外層、を有し、 前記内層が （ａ）水酸化アルミニウム （ｂ）二糖類 （ｃ）多官能性架橋剤 （ｄ）移植片の表面に対するイムノグロブリン、 （ｅ）レクチン、または （ｆ）移植片表面と反対のチャージを持つ多イオン性ポ
リアミノ酸 からなる群から選択される物質を含有し、 前記外層が、反応性のあるカルボキシル基，アミノ基、
またはイミノ基の側鎖を有するポリアミノ酸を含有する ことを特徴とする。
以下に本発明を詳細に説明する。
「移植片」という用語は，目的の受容者と遺伝的に異な
る（異種または同種異系の）１匹または多数匹の供与側
哺乳動物に由来する細胞小器官または器官を特定すると
ころの,1つまたは多数の哺乳動物細胞もしくは多数の連
合した哺乳動物細胞を示すものとする。代表的には内分
泌（下垂体，甲状腺，副腎，上皮小体，膵臓）の細胞，
細胞小器官，あるいは腺を意味するために用いられる
が，心臓，肝臓，肺および腎臓の移植片のように他の器
官の移植片において用いてもよい。
る（異種または同種異系の）１匹または多数匹の供与側
哺乳動物に由来する細胞小器官または器官を特定すると
ころの,1つまたは多数の哺乳動物細胞もしくは多数の連
合した哺乳動物細胞を示すものとする。代表的には内分
泌（下垂体，甲状腺，副腎，上皮小体，膵臓）の細胞，
細胞小器官，あるいは腺を意味するために用いられる
が，心臓，肝臓，肺および腎臓の移植片のように他の器
官の移植片において用いてもよい。
「非細胞毒性」という用語は，ある物質がそれを適用し
た細胞，細胞小器官，または器官の生存能力および／も
しくは機能性に対し実質的な影響をおよぼさないことを
意味する。
た細胞，細胞小器官，または器官の生存能力および／も
しくは機能性に対し実質的な影響をおよぼさないことを
意味する。
「化学的に結合する」というフレーズは，共有結合，イ
オン結合，および／もしくは水素結合が１つ以上存在す
ることを示す。
オン結合，および／もしくは水素結合が１つ以上存在す
ることを示す。
「生物学的に適合性」というフレーズは，指摘された層
が受容者の免疫系に関して実質的に非抗原性であって異
質体（繊維形状）反応を誘起しないことを意味する。
が受容者の免疫系に関して実質的に非抗原性であって異
質体（繊維形状）反応を誘起しないことを意味する。
「半透性」という用語は，指摘された層が，場合により
低分子量の細胞栄養物，細胞小器官栄養物，あるいは器
官栄養物が内部に拡散すること，および代謝産物が外部
へ拡散することは許すが，移植片または受容者に対して
悪影響をおよぼす可能性のある組成物が内部あるいは外
部に拡散するのを妨げることを意味する。
低分子量の細胞栄養物，細胞小器官栄養物，あるいは器
官栄養物が内部に拡散すること，および代謝産物が外部
へ拡散することは許すが，移植片または受容者に対して
悪影響をおよぼす可能性のある組成物が内部あるいは外
部に拡散するのを妨げることを意味する。
本発明は様々な移植片に適用でき，特別なタイプの細
胞，細胞小器官，または器官に限定されず，また特別な
哺乳動物種に限定されない。従って，以下では本発明を
様々な動物における異種のランゲルハンス島および同種
異系のランゲルハンス島に関して説明および例証してい
るが，これら教示がヒトを含む他の哺乳動物種の他の組
織に拡張されることは認められよう。
胞，細胞小器官，または器官に限定されず，また特別な
哺乳動物種に限定されない。従って，以下では本発明を
様々な動物における異種のランゲルハンス島および同種
異系のランゲルハンス島に関して説明および例証してい
るが，これら教示がヒトを含む他の哺乳動物種の他の組
織に拡張されることは認められよう。
膵臓組織は公知技術により得て培養し，本発明による被
覆に適するものとする。組織は新鮮なものを得，これを
切り刻んだり，すいたり，細かく砕いたりして分割し，
および／もしくはコラゲナーゼで緩徐に分解して混在し
ている細胞や物質からランゲルハンス島を分離しやすく
する。分割され／分解された膵臓組織からランゲルハン
ス島を分離するには，洗浄，濾過，遠心分離もしくはつ
まみ取り（picking）の操作を行う。分離物は，液体培
養培地中で，その分離物中の抗原性成分（例えば，パッ
センジャー白血球）を不活化もしくは除外するような条
件下および期間で培養することが好ましい。このような
培地と条件はTransplant Proc（1982）14（４）:714−2
3に記載されている。
覆に適するものとする。組織は新鮮なものを得，これを
切り刻んだり，すいたり，細かく砕いたりして分割し，
および／もしくはコラゲナーゼで緩徐に分解して混在し
ている細胞や物質からランゲルハンス島を分離しやすく
する。分割され／分解された膵臓組織からランゲルハン
ス島を分離するには，洗浄，濾過，遠心分離もしくはつ
まみ取り（picking）の操作を行う。分離物は，液体培
養培地中で，その分離物中の抗原性成分（例えば，パッ
センジャー白血球）を不活化もしくは除外するような条
件下および期間で培養することが好ましい。このような
培地と条件はTransplant Proc（1982）14（４）:714−2
3に記載されている。
分離精製したランゲルハンス島は次いで,1つ以上のラン
ゲルハンス島細胞表面成分に高い親和性を有する非細胞
毒性の多官能性物質から成る層で被覆する。「多官能
性」という用語は，その物質が，一方では細胞の表面成
分と，他方では外層の物質の官能基と，容易に相互作用
するのに利用可能な２つ以上の部位を有することを意味
する。多官能性物質は細胞表面と重合体の外層とを結合
する橋となる。すなわち,1つ以上の細胞表面成分と（例
えばこれは，物質の性質，すなわちタンパク質，炭水化
物または脂質の反応基により異なるが），また半透性外
層を形成する重合物質の官能基と，安定な（被覆工程
時，それに続く保存中における破損，またあるとすれば
移植後の破損に対する感受性に関して）化学結合を形成
する。物質は合成物が天然物，また無機物か有機物，の
いずれでもよい。内側の被膜形成に用いられる物質とし
ては例えば，水酸化アルミニウム；二糖類（マルトー
ス，スクロース，ラクトースおよびトレハロース，もし
くはそれらの硫酸塩誘導体）；低分子量の非重合性タン
パク質カップリング剤あるいは非重合性タンパク質架橋
剤，例えば,3,3′−ジメチルジチオビスプロピオネート
（DTBP）やＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジル
ジチオ）プロピオネート（SPDP）のような二官能性ジス
ルフィド,6−マレイミドカプロン酸や２−ブロモ酢酸や
２−ヨード酢酸のＮ−ハイドロキシスクシンイミドエス
テル，上記酸の他の活性エステル，ジメチルアジピミデ
ートやジスクシンイミジルスベレートのようなイミドエ
ステル，グルタルアルデヒドのようなアルデヒド，ビス
（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンのようなビ
ス−アジド化合物，ビス−ジアゾニウム誘導体，ビス−
トリレン−2,6−ジイソシアネートのようなジイソシア
ネート，およびカルボジイミド；移植片の表面成分に対
するイムノグロブリン，例えばクラスＩまたはクラスII
のMHC抗原に対する抗体；例えばコンカナバリンA,DBA,
ダイズ アグルチニン，麦芽 アグルチニン，およびフ
ィトへマグルチニンのようなレクチン（すなわち，糖ま
たは糖残基に結合した植物タンパク質）；および移植片
表面のチャージと反対のチャージを持つ多イオン性ポリ
アミノ酸，例えばランゲルハンス島の表面は負のチャー
ジを持つのでポリリジンのような多カチオンのポリアミ
ノ酸をランゲルハンス島表面に結合すればよい；があ
る。
ゲルハンス島細胞表面成分に高い親和性を有する非細胞
毒性の多官能性物質から成る層で被覆する。「多官能
性」という用語は，その物質が，一方では細胞の表面成
分と，他方では外層の物質の官能基と，容易に相互作用
するのに利用可能な２つ以上の部位を有することを意味
する。多官能性物質は細胞表面と重合体の外層とを結合
する橋となる。すなわち,1つ以上の細胞表面成分と（例
えばこれは，物質の性質，すなわちタンパク質，炭水化
物または脂質の反応基により異なるが），また半透性外
層を形成する重合物質の官能基と，安定な（被覆工程
時，それに続く保存中における破損，またあるとすれば
移植後の破損に対する感受性に関して）化学結合を形成
する。物質は合成物が天然物，また無機物か有機物，の
いずれでもよい。内側の被膜形成に用いられる物質とし
ては例えば，水酸化アルミニウム；二糖類（マルトー
ス，スクロース，ラクトースおよびトレハロース，もし
くはそれらの硫酸塩誘導体）；低分子量の非重合性タン
パク質カップリング剤あるいは非重合性タンパク質架橋
剤，例えば,3,3′−ジメチルジチオビスプロピオネート
（DTBP）やＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジル
ジチオ）プロピオネート（SPDP）のような二官能性ジス
ルフィド,6−マレイミドカプロン酸や２−ブロモ酢酸や
２−ヨード酢酸のＮ−ハイドロキシスクシンイミドエス
テル，上記酸の他の活性エステル，ジメチルアジピミデ
ートやジスクシンイミジルスベレートのようなイミドエ
ステル，グルタルアルデヒドのようなアルデヒド，ビス
（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンのようなビ
ス−アジド化合物，ビス−ジアゾニウム誘導体，ビス−
トリレン−2,6−ジイソシアネートのようなジイソシア
ネート，およびカルボジイミド；移植片の表面成分に対
するイムノグロブリン，例えばクラスＩまたはクラスII
のMHC抗原に対する抗体；例えばコンカナバリンA,DBA,
ダイズ アグルチニン，麦芽 アグルチニン，およびフ
ィトへマグルチニンのようなレクチン（すなわち，糖ま
たは糖残基に結合した植物タンパク質）；および移植片
表面のチャージと反対のチャージを持つ多イオン性ポリ
アミノ酸，例えばランゲルハンス島の表面は負のチャー
ジを持つのでポリリジンのような多カチオンのポリアミ
ノ酸をランゲルハンス島表面に結合すればよい；があ
る。
移植片の表面に結合橋物質を適用する方法はその物質の
性質による。代表的には，水に懸濁してあるいは水溶液
として，表面が均一に被覆され所定の細胞表面成分とそ
の物質間に安定な化学結合が形成されるのを促進し可能
にするような条件（pH7〜7.5の生理学的pH,約37℃の生
理学的温度，かつ生理学的イオン強度）下で適用する。
この適用は通常，約４〜20分間の温和な撹拌によって移
植片が懸濁液または溶液と接触することにより行なわれ
る。被覆物は,1分子もしくは２〜３分子の厚さの，表面
に適合する薄層として形成されるのが好ましい。
性質による。代表的には，水に懸濁してあるいは水溶液
として，表面が均一に被覆され所定の細胞表面成分とそ
の物質間に安定な化学結合が形成されるのを促進し可能
にするような条件（pH7〜7.5の生理学的pH,約37℃の生
理学的温度，かつ生理学的イオン強度）下で適用する。
この適用は通常，約４〜20分間の温和な撹拌によって移
植片が懸濁液または溶液と接触することにより行なわれ
る。被覆物は,1分子もしくは２〜３分子の厚さの，表面
に適合する薄層として形成されるのが好ましい。
外層は，必要な半透性と免疫学的適合性とを提供するで
あろう重合体で作る。反応性のあるカルボキシル基，ア
ミノ基，あるいはイミノ基を有するポリアミノ酸，例え
ばポリアスパラギン酸，ポリグルタミン酸，ポリリジ
ン，およびポリアルギニンが好ましい。このとき，内側
の被覆物の利用可能な結合部位の性質とチャージに従っ
て，特別なポリアミノ酸を用いる。例えば，利用可能部
位が負にチャージしている場合はポリリジンのようなポ
リカチオンのポリアミノ酸を用いる。逆に，利用可能部
位が正にチャージしている場合はポリアスパラギン酸の
ようなポリアニオンのポリアミノ酸を用いる。この層の
浸透性は主として物質の分子量と層の厚さの関数であ
る。浸透性は分子量の増加に伴って増加し，また厚さの
増加に伴って減少する。重合体の分子量は代表的には5,
000〜300,000ダルトンの範囲にし，また厚さは通常0.1
〜10ミクロン，より一般的には0.1〜３ミクロンの範囲
にする。これら重合体は，生理学的なpH,イオン強度お
よび温度の，稀薄水溶液（0.1〜１重量％）として移植
片に適用する。重合体溶液と移植片との接触は，代表的
には，層当り約４〜10分間温和に撹拌する（被覆を完全
なものとするために）ことにより行われる。必要に応じ
て，外層は同じまたは異なる重合体から成る複数の被膜
として形成してもよい。同じまたは異なる無毒性物質，
例えば多糖類のような物質，から成る１層以上の中間層
を作ってもよい。但しこれは，（１）内層が移植片表面
に化学係合するのを妨げず，（２）移植片の生存能力も
しくは機能性に影響を及ぼさず，かつ（３）半透性外層
が化学結合できる適当な基質を提供するものとする。
あろう重合体で作る。反応性のあるカルボキシル基，ア
ミノ基，あるいはイミノ基を有するポリアミノ酸，例え
ばポリアスパラギン酸，ポリグルタミン酸，ポリリジ
ン，およびポリアルギニンが好ましい。このとき，内側
の被覆物の利用可能な結合部位の性質とチャージに従っ
て，特別なポリアミノ酸を用いる。例えば，利用可能部
位が負にチャージしている場合はポリリジンのようなポ
リカチオンのポリアミノ酸を用いる。逆に，利用可能部
位が正にチャージしている場合はポリアスパラギン酸の
ようなポリアニオンのポリアミノ酸を用いる。この層の
浸透性は主として物質の分子量と層の厚さの関数であ
る。浸透性は分子量の増加に伴って増加し，また厚さの
増加に伴って減少する。重合体の分子量は代表的には5,
000〜300,000ダルトンの範囲にし，また厚さは通常0.1
〜10ミクロン，より一般的には0.1〜３ミクロンの範囲
にする。これら重合体は，生理学的なpH,イオン強度お
よび温度の，稀薄水溶液（0.1〜１重量％）として移植
片に適用する。重合体溶液と移植片との接触は，代表的
には，層当り約４〜10分間温和に撹拌する（被覆を完全
なものとするために）ことにより行われる。必要に応じ
て，外層は同じまたは異なる重合体から成る複数の被膜
として形成してもよい。同じまたは異なる無毒性物質，
例えば多糖類のような物質，から成る１層以上の中間層
を作ってもよい。但しこれは，（１）内層が移植片表面
に化学係合するのを妨げず，（２）移植片の生存能力も
しくは機能性に影響を及ぼさず，かつ（３）半透性外層
が化学結合できる適当な基質を提供するものとする。
（実施例） 移植片，および移植片の内側被覆物や外側被覆物を形成
するために用いられる物質とその方法を下記実施例でさ
らに説明する。これら実施例はあらゆる意味で本発明を
限定するものではない。
するために用いられる物質とその方法を下記実施例でさ
らに説明する。これら実施例はあらゆる意味で本発明を
限定するものではない。
ランゲルハンス島の単離 新鮮な膵臓組織を破砕して，コラゲナーゼを含むハンク
ス溶液中に入れ結合組織を分解した。得た分解物をFico
ll−Hypaque勾配遠心にかけてランゲルハンス島を単離
した。単離したランゲルハンス島を,10％ウシ胎児血清
を添加したRPMI 1640培地で,5％CO2の湿った雰囲気下
で,37℃,7日間培養した。
ス溶液中に入れ結合組織を分解した。得た分解物をFico
ll−Hypaque勾配遠心にかけてランゲルハンス島を単離
した。単離したランゲルハンス島を,10％ウシ胎児血清
を添加したRPMI 1640培地で,5％CO2の湿った雰囲気下
で,37℃,7日間培養した。
ランゲルハンス島の被覆 A.水酸化アルミニウム 単離したランゲルハンス島を3mlのRPMI1640中に103のラ
ンゲルハンス島/mlの濃度で浮遊ささせる。水酸化アル
ミニウムを乳ばち中で粉砕し，ゲル粒子の大きさが１〜
３ミクロンになるまで乳棒ですりつぶす。これを生理食
塩水に溶かしてAl（OH）３の１％溶液を作る。ランゲル
ハンス島からRPMI培地を除去し,3mlの１％Al（OH）３食
塩水溶液で置き換える。ランゲルハンス島−Al（OH）３
溶液を2.5分間の回転により混合する。Al（OH）３で被
覆されたランゲルハンス島を沈降させ，過剰のAl（OH）
３溶液を除去する。被覆されたランゲルハンス島を次い
で6mlの生理食塩水（pH7）で３回洗う。
ンゲルハンス島/mlの濃度で浮遊ささせる。水酸化アル
ミニウムを乳ばち中で粉砕し，ゲル粒子の大きさが１〜
３ミクロンになるまで乳棒ですりつぶす。これを生理食
塩水に溶かしてAl（OH）３の１％溶液を作る。ランゲル
ハンス島からRPMI培地を除去し,3mlの１％Al（OH）３食
塩水溶液で置き換える。ランゲルハンス島−Al（OH）３
溶液を2.5分間の回転により混合する。Al（OH）３で被
覆されたランゲルハンス島を沈降させ，過剰のAl（OH）
３溶液を除去する。被覆されたランゲルハンス島を次い
で6mlの生理食塩水（pH7）で３回洗う。
被覆されたランゲルハンス島を次に，ポリ−Ｌ−アスパ
ラギン酸（mw50,000）の0.5％生理食塩水溶液（pH7）3m
l中に移し,4分間混合する。ポリ−Ｌ−アスパラギン酸
を除去し，被覆されたランゲルハンス島を6mlの生理食
塩水（pH7）で３回洗う。
ラギン酸（mw50,000）の0.5％生理食塩水溶液（pH7）3m
l中に移し,4分間混合する。ポリ−Ｌ−アスパラギン酸
を除去し，被覆されたランゲルハンス島を6mlの生理食
塩水（pH7）で３回洗う。
被覆されたランゲルハンス島を次に，ポリ−Ｌ−リジン
（mw50,000）の0.5％溶液3ml中に浮遊させ,5分間混合す
る。ポリ−Ｌ−リジンを除去し，ランゲルハンス島を生
理食塩水（pH7）で３回洗う。
（mw50,000）の0.5％溶液3ml中に浮遊させ,5分間混合す
る。ポリ−Ｌ−リジンを除去し，ランゲルハンス島を生
理食塩水（pH7）で３回洗う。
外層をよく厚くしたい場合は，ポリ−Ｌ−アスパラギン
酸とポリ−Ｌ−リジンによる被覆および洗浄を繰り返し
行えばよい。
酸とポリ−Ｌ−リジンによる被覆および洗浄を繰り返し
行えばよい。
最後に生理食塩水で洗った後，被覆されたランゲルハン
ス島を１％デフェロキサミンの生理食塩水溶液（pH7.
2）10mlに10分間浮遊させる。デフェロキサミン処理を
さらに10分間繰り返してからこれを除去する。被覆され
たランゲルハンス島を生理食塩水とRPMI1640培地とで２
回洗う。ランゲルハンス島はこの時点で移植可能であ
り，また組織培養に戻すこともできる。被覆されたラン
ゲルハンス島は,10％ウシ胎児血清を含むRPMI1640中,5
％CO2,85％空気，の組織培養で維持され得る。
ス島を１％デフェロキサミンの生理食塩水溶液（pH7.
2）10mlに10分間浮遊させる。デフェロキサミン処理を
さらに10分間繰り返してからこれを除去する。被覆され
たランゲルハンス島を生理食塩水とRPMI1640培地とで２
回洗う。ランゲルハンス島はこの時点で移植可能であ
り，また組織培養に戻すこともできる。被覆されたラン
ゲルハンス島は,10％ウシ胎児血清を含むRPMI1640中,5
％CO2,85％空気，の組織培養で維持され得る。
B.DTBP 単離したランゲルハンス島1000個を0.5％DTBPの生理食
塩水溶液（pH7.2）3ml中に浮遊させる。ランゲルハンス
島を30秒間混合し，次いで浮遊液に食塩水を30ml加え,D
TBPで被覆されたランゲルハンス島を沈降させる。DTBP
溶液を除去後，ランゲルハンス島を食塩水（pH7）20ml
で３回洗う。最後の食塩水洗浄液を除去し,0.5％ポリ−
Ｌ−アスパラギン酸溶液（mw50,000）3mlを加えて４分
間混合する。
塩水溶液（pH7.2）3ml中に浮遊させる。ランゲルハンス
島を30秒間混合し，次いで浮遊液に食塩水を30ml加え,D
TBPで被覆されたランゲルハンス島を沈降させる。DTBP
溶液を除去後，ランゲルハンス島を食塩水（pH7）20ml
で３回洗う。最後の食塩水洗浄液を除去し,0.5％ポリ−
Ｌ−アスパラギン酸溶液（mw50,000）3mlを加えて４分
間混合する。
ポリ−Ｌ−アスパラギン酸を除去後，重合体で被覆され
たランゲルハンス島を食塩水6mlで３回洗う。次に被覆
されたランゲルハンス島を0.5％ポリ−Ｌ−リジン（mw5
0,000）3ml中に浮遊させ,5分間混合する。ポリ−Ｌ−リ
ジンを除去し，ランゲルハンス島を生理食塩水で３回洗
う。
たランゲルハンス島を食塩水6mlで３回洗う。次に被覆
されたランゲルハンス島を0.5％ポリ−Ｌ−リジン（mw5
0,000）3ml中に浮遊させ,5分間混合する。ポリ−Ｌ−リ
ジンを除去し，ランゲルハンス島を生理食塩水で３回洗
う。
C.MHC抗血清 ラットから単離したランゲルハンス島1000個を，クラス
Ｉの組織適合性抗血清（M.A.Bioproducts製）を生理食
塩水で1/2に稀釈したもの（pH7.5）0.25ml中に浮遊させ
る。ランゲルハンス島と抗体を４℃,45分間インキュベ
ートする。抗体で被覆された組織を次に生理食塩水（pH
7）5mlで２回洗う。最後の食塩水洗浄液を除去し,0.5％
ポリ−Ｌ−リジン（mw50,000）3mlを加えて５分間混合
する。ポリ−Ｌ−リジンを除去後，ランゲルハンス島を
生理食塩水（pH7）で洗う。被覆されたランゲルハンス
島を次いで0.5％ポリ−Ｌ−アスパラギン酸溶液（mw50,
000）3ml中に浮遊させ,4分間混合する。ポリ−Ｌ−アス
パラギン酸を除去し，ランゲルハンス島を生理食塩水
（pH7）で洗う。必要に応じて，ランゲルハンス島を２
回目，ポリ−Ｌ−リジンで被覆して洗ってもよい。他の
被覆法として，橋となる抗体と重合体をビオチニル化し
て標準的なビオチン−アビジン系を利用することがあ
る。
Ｉの組織適合性抗血清（M.A.Bioproducts製）を生理食
塩水で1/2に稀釈したもの（pH7.5）0.25ml中に浮遊させ
る。ランゲルハンス島と抗体を４℃,45分間インキュベ
ートする。抗体で被覆された組織を次に生理食塩水（pH
7）5mlで２回洗う。最後の食塩水洗浄液を除去し,0.5％
ポリ−Ｌ−リジン（mw50,000）3mlを加えて５分間混合
する。ポリ−Ｌ−リジンを除去後，ランゲルハンス島を
生理食塩水（pH7）で洗う。被覆されたランゲルハンス
島を次いで0.5％ポリ−Ｌ−アスパラギン酸溶液（mw50,
000）3ml中に浮遊させ,4分間混合する。ポリ−Ｌ−アス
パラギン酸を除去し，ランゲルハンス島を生理食塩水
（pH7）で洗う。必要に応じて，ランゲルハンス島を２
回目，ポリ−Ｌ−リジンで被覆して洗ってもよい。他の
被覆法として，橋となる抗体と重合体をビオチニル化し
て標準的なビオチン−アビジン系を利用することがあ
る。
ヒトのランゲルハンス島を，ヒトのクラスI/II MHC抗原
に対する利用可能な抗体を用いて同様に被覆してもよ
い。
に対する利用可能な抗体を用いて同様に被覆してもよ
い。
D.レクチン 単離したランゲルハンス島1000個を,10μg/ml Con Aの
生理食塩水溶液（pH7）（Sigma Chemical Company製）3
ml中に浮遊させる。ランゲルハンス島を４℃,15分間混
合し，生理食塩水（pH7）10mlで洗う。食塩水を除去し,
0.5％ポリ−Ｌ−リジン（mw50,000）食塩水溶液（pH7）
3mlで置き換えて５分間混合する。ポリ−Ｌ−リジンを
除去後，ランゲルハンス島を生理食塩水（pH7）で洗
う。被覆されたランゲルハンス島を次いで0.5％ポリ−
Ｌ−アスパラギン酸（mw50,000）溶液3ml中に浮遊させ,
4分間混合する。次にランゲルハンス島を生理食塩水（p
H7）で洗う。必要に応じて２回目のポリ−Ｌ−リジンに
よる被覆を行なってもよい。
生理食塩水溶液（pH7）（Sigma Chemical Company製）3
ml中に浮遊させる。ランゲルハンス島を４℃,15分間混
合し，生理食塩水（pH7）10mlで洗う。食塩水を除去し,
0.5％ポリ−Ｌ−リジン（mw50,000）食塩水溶液（pH7）
3mlで置き換えて５分間混合する。ポリ−Ｌ−リジンを
除去後，ランゲルハンス島を生理食塩水（pH7）で洗
う。被覆されたランゲルハンス島を次いで0.5％ポリ−
Ｌ−アスパラギン酸（mw50,000）溶液3ml中に浮遊させ,
4分間混合する。次にランゲルハンス島を生理食塩水（p
H7）で洗う。必要に応じて２回目のポリ−Ｌ−リジンに
よる被覆を行なってもよい。
他の被覆法として，レクチン橋と重合体をビオチニル化
して標準的なビオチン−アビジン系を利用してもよい。
して標準的なビオチン−アビジン系を利用してもよい。
E.ポリカチオン性ポリアミノ酸 単離したランゲルハンス島を0.5％のポリ−Ｌ−リジン
（mw50,000）の生理食塩水溶液（pH7）3mlに浮遊させ
て，約10分間混合する。ポリ−Ｌ−リジン溶液を除去
後，被覆されたランゲルハンス島を生理食塩水6mlで３
回洗う。
（mw50,000）の生理食塩水溶液（pH7）3mlに浮遊させ
て，約10分間混合する。ポリ−Ｌ−リジン溶液を除去
後，被覆されたランゲルハンス島を生理食塩水6mlで３
回洗う。
被覆されたランゲルハンス島を次いで0.5％のポリ−Ｌ
−アスパラギン酸（mw50,000）生理食塩水溶液3ml中に
移し，約10分間混合する。ポリ−Ｌ−アスパラギン酸を
除去後，被覆されたランゲルハンス島を再度食塩水で３
回洗う。
−アスパラギン酸（mw50,000）生理食塩水溶液3ml中に
移し，約10分間混合する。ポリ−Ｌ−アスパラギン酸を
除去後，被覆されたランゲルハンス島を再度食塩水で３
回洗う。
最後に，被覆されたランゲルハンス島を再度0.5％のポ
リ−Ｌ−リジン食塩水溶液3mlに浮遊させ，約10分間混
合した後，食塩水で洗う。
リ−Ｌ−リジン食塩水溶液3mlに浮遊させ，約10分間混
合した後，食塩水で洗う。
ランゲルハンス島のin vitro試験 被覆されたランゲルハンス島について機能的な生存能力
およびグルコースによる調節を調べた。これらランゲル
ハンス島は実施例Ａ〜Ｅに示された方法で被覆した。組
織培養用培地の免疫反応性インシュリン（IRI）濃度は
ラジオイムノアッセイで測定した。インシュリンの分泌
は,2mMグルコースおよび25mMグルコースによる１時間連
続刺激に対する反応で測定した。RPMI培地5ml中の被覆
されたランゲルハンス島60個から分泌されたインシュリ
ンを測定した。2mMグルコース（非刺激性濃度）に対す
る反応ではインシュリンはほとんど分泌されなかった。
25mMグルコースに対する反応では，処理されたランゲル
ハンス島は1.5〜2.2mg/ランゲルハンス島/hrのインシュ
リンを分泌した。この値は新鮮な未処理ランゲルハンス
島で分泌される反応インシュリンに匹敵する。
およびグルコースによる調節を調べた。これらランゲル
ハンス島は実施例Ａ〜Ｅに示された方法で被覆した。組
織培養用培地の免疫反応性インシュリン（IRI）濃度は
ラジオイムノアッセイで測定した。インシュリンの分泌
は,2mMグルコースおよび25mMグルコースによる１時間連
続刺激に対する反応で測定した。RPMI培地5ml中の被覆
されたランゲルハンス島60個から分泌されたインシュリ
ンを測定した。2mMグルコース（非刺激性濃度）に対す
る反応ではインシュリンはほとんど分泌されなかった。
25mMグルコースに対する反応では，処理されたランゲル
ハンス島は1.5〜2.2mg/ランゲルハンス島/hrのインシュ
リンを分泌した。この値は新鮮な未処理ランゲルハンス
島で分泌される反応インシュリンに匹敵する。
ランゲルハンス島のin vivo試験 Bal b/Cマウスにトレプトゾトシン（180mg/kg体重）を
腹腔内注射して糖尿病にした。非絶食時の血漿グルコー
スレベルは400〜600mg/dLの範囲であった。血漿グルコ
ース濃度が２週間にわたり400mg/dL以上であったマウス
のみが移植片を受けつけた。ラット（Sprague−Dawle
y）から単離したランゲルハンス島を実施例Ａ〜Ｄに示
した方法で被覆した。各糖尿病マウスに2000個の被覆さ
れたランゲルハンス島を腹腔内移植して，非絶食時の血
漿グルコースレベルを週に３回測定した。移植マウスの
血漿グルコースレベルは100〜175mg/dLに低下した。こ
れら被覆されたランゲルハンス島により移植マウスは３
週間から１年半にわたり正常血糖性を維持した。３カ月
後，正常血糖性マウスを殺して移植したランゲルハンス
島を回収した。被覆されたランゲルハンス島には全体的
なまたは組織学的な組織の反応は認められず，また回収
したランゲルハンス島は生存可能でかつグルコースによ
りin vitro調節が可能であった。
腹腔内注射して糖尿病にした。非絶食時の血漿グルコー
スレベルは400〜600mg/dLの範囲であった。血漿グルコ
ース濃度が２週間にわたり400mg/dL以上であったマウス
のみが移植片を受けつけた。ラット（Sprague−Dawle
y）から単離したランゲルハンス島を実施例Ａ〜Ｄに示
した方法で被覆した。各糖尿病マウスに2000個の被覆さ
れたランゲルハンス島を腹腔内移植して，非絶食時の血
漿グルコースレベルを週に３回測定した。移植マウスの
血漿グルコースレベルは100〜175mg/dLに低下した。こ
れら被覆されたランゲルハンス島により移植マウスは３
週間から１年半にわたり正常血糖性を維持した。３カ月
後，正常血糖性マウスを殺して移植したランゲルハンス
島を回収した。被覆されたランゲルハンス島には全体的
なまたは組織学的な組織の反応は認められず，また回収
したランゲルハンス島は生存可能でかつグルコースによ
りin vitro調節が可能であった。
イヌを全膵摘により糖尿病にした。術後の初期血中グル
コースレベルは430mg/dLであり、従ってそれを300mg/dL
以下に保つために15UのNPHインシュリンを必要とした。
血縁のないイヌの膵臓から5000個のランゲルハンス島を
得,MHC抗血清法（上記実施例C,抗イヌMHC抗血清はMicro
biologica Associatesから入手できる）により処理し
て，糖尿病イヌの膜腔に移植した。移植後24時間以内
に，血中グルコースレベルとインシュリン必要量は減少
した。移植したランゲルハンス島は２年半にわたり機能
し続けた。イヌは免疫抑制剤を必要とせず，また血中グ
ルコースレベルはインシュリンがなくても170〜250mg/d
Lであった。この値は移植前のレベルより低いが，正常
な非糖尿病イヌに比べると高い。ランゲルハンス島を50
00個しか移植しなかったので，このように正常レベルよ
りわずかに高いことは予測された。（正常な膵臓な約30
0,000のランゲルハンス島を含有しており，このイヌを
正常血糖性に回復させるには約20,000個が必要であろ
う。）イヌを6UのNPHインシュリンで維持する（ランゲ
ルハンス島の発育と増殖を促進するため）と血中グルコ
ースは93mg/dLである。イヌは何ら糖尿病の臨床症状は
示さなかった。
コースレベルは430mg/dLであり、従ってそれを300mg/dL
以下に保つために15UのNPHインシュリンを必要とした。
血縁のないイヌの膵臓から5000個のランゲルハンス島を
得,MHC抗血清法（上記実施例C,抗イヌMHC抗血清はMicro
biologica Associatesから入手できる）により処理し
て，糖尿病イヌの膜腔に移植した。移植後24時間以内
に，血中グルコースレベルとインシュリン必要量は減少
した。移植したランゲルハンス島は２年半にわたり機能
し続けた。イヌは免疫抑制剤を必要とせず，また血中グ
ルコースレベルはインシュリンがなくても170〜250mg/d
Lであった。この値は移植前のレベルより低いが，正常
な非糖尿病イヌに比べると高い。ランゲルハンス島を50
00個しか移植しなかったので，このように正常レベルよ
りわずかに高いことは予測された。（正常な膵臓な約30
0,000のランゲルハンス島を含有しており，このイヌを
正常血糖性に回復させるには約20,000個が必要であろ
う。）イヌを6UのNPHインシュリンで維持する（ランゲ
ルハンス島の発育と増殖を促進するため）と血中グルコ
ースは93mg/dLである。イヌは何ら糖尿病の臨床症状は
示さなかった。
（発明の概要） ランゲルハンス島のような移植片を，移植片の表面成分
に化学結合する多官能性物質の表面適合性結合橋層で被
覆し，次いでこの結合橋層に化学結合する重合体の半透
性で生物学的に適合性の層で被覆することにより，この
移植片を遺伝学的に異なる個体へ移植するのに適するよ
うにする。
に化学結合する多官能性物質の表面適合性結合橋層で被
覆し，次いでこの結合橋層に化学結合する重合体の半透
性で生物学的に適合性の層で被覆することにより，この
移植片を遺伝学的に異なる個体へ移植するのに適するよ
うにする。
Claims (9)
- 【請求項１】遺伝的に異なる個体への移植に適する移植
片であって、該移植片が移植片表面に適合する免疫学的
関門膜によって被覆され、該膜が、移植片表面に化学的
に結合する非細胞毒性の内層と、該内層と化学的に結合
する生物学的に適合性で水に不溶性かつ半透性の外層、
を有し、 前記内層が （ａ）水酸化アルミニウム （ｂ）二糖類 （ｃ）多官能性架橋剤 （ｄ）移植片の表面に対するイムノグロブリン、 （ｅ）レクチン、または （ｆ）移植片表面と反対のチャージを持つ多イオン性ポ
リアミノ酸 からなる群から選択される物質を含有し、 前記外層が、反応性のあるカルボキシル基，アミノ基、
またはイミノ基の側鎖を有するポリアミノ酸を含有する ことを特徴とする被覆された移植片。 - 【請求項２】前記内層が、水酸化アルミニウム、二官能
性ジスルフィド、移植片のMHC抗原と結合するイムノグ
ロブリン、コンカナバリンＡ、またはポリリジンを含有
する特許請求の範囲第１項に記載の被覆された移植片。 - 【請求項３】前記外層のポリアミノ酸が、ポリリジン、
ポリアルギン酸、ポリアスパラギン酸、またはポリグル
タミン酸である特許請求の範囲第１項に記載の被覆され
た移植片。 - 【請求項４】前記移植片が、ランゲルハンス島である特
許請求の範囲第１項に記載の被覆された移植片。 - 【請求項５】遺伝的に異なる個体への移植に適する移植
片の製造方法であって、 以下の工程、 （ａ）該移植片をまず、移植片表面と化学結合する非細
胞毒性物質の第１層で被覆する工程であり、該第１層が
移植片表面に適合すること、 （ｂ）該第１層に無毒性物質の中間層を１層以上任意に
被覆する工程、および （ｃ）該移植片を次いで，場合により該第１層の物質ま
たはそれに接触する該中間層の物質と化学結合する外層
で被覆する工程であり、該外層が生物学的に適合性でか
つ半透性であること、 を含有する方法。 - 【請求項６】前記内層が、 （ａ）水酸化アルミニウム （ｂ）二糖類 （ｃ）多官能性架橋剤 （ｄ）移植片の表面成分に対するイムノグロブリン （ｅ）レクチン、または （ｆ）移植片表面と反対のチャージを持つ多イオン性ポ
リアミノ酸 を含有する特許請求の範囲第５項の記載の方法。 - 【請求項７】前記内層が、水酸化アルミニウム、二官能
性ジスルフィド、移植片のMHC抗原と結合するイムノグ
ロブリン、コンカナバリンＡ、またはポリリジン、を含
有する特許請求の範囲第５項に記載の方法。 - 【請求項８】前記外層が、反応性のあるカルボキシル
基、アミノ基またはイミノ基の側鎖を有するポリアミノ
酸を含有する特許請求の範囲第５項、第６項または第７
項に記載のいずれかの方法。 - 【請求項９】前記外層のポリアミノ酸がポリ−Ｌ−リジ
ン、ポリアルギニン、ポリアスパラギン酸、またはポリ
グルタミン酸である特許請求の範囲第８項に記載の方
法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US71166485A | 1985-03-14 | 1985-03-14 | |
| US711664 | 1985-03-14 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61222443A JPS61222443A (ja) | 1986-10-02 |
| JPH07100661B2 true JPH07100661B2 (ja) | 1995-11-01 |
Family
ID=24859010
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61054563A Expired - Lifetime JPH07100661B2 (ja) | 1985-03-14 | 1986-03-12 | 被覆された移植片およびその製造方法 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4696286A (ja) |
| EP (1) | EP0195577B1 (ja) |
| JP (1) | JPH07100661B2 (ja) |
| AT (1) | ATE75409T1 (ja) |
| CA (1) | CA1267851A (ja) |
| DE (1) | DE3685046D1 (ja) |
| DK (1) | DK165221C (ja) |
| FI (1) | FI90628C (ja) |
| IL (1) | IL78110A (ja) |
| NO (1) | NO166836C (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010517621A (ja) * | 2007-02-02 | 2010-05-27 | ユニバーシティ オブ マイアミ | 治療用ハイブリッド移植型デバイス |
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|---|---|---|---|---|
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| EP0491860B1 (en) * | 1989-09-15 | 1997-01-15 | Chiron Vision Corporation | Synthetic material for supporting the attachment, growth and migration of epithelial cells, prosthetic device for subepithelial implantation and lens treated |
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| US6231881B1 (en) * | 1992-02-24 | 2001-05-15 | Anton-Lewis Usala | Medium and matrix for long-term proliferation of cells |
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