NO166836B

NO166836B - Fremgangsmaate for behandling av et organtransplantat.

Info

Publication number: NO166836B
Application number: NO860858A
Authority: NO
Inventors: Kent C Cochrum
Original assignee: Univ California
Priority date: 1985-03-14
Filing date: 1986-03-07
Publication date: 1991-06-03
Also published as: DK119286A; NO166836C; US4696286A; EP0195577A3; EP0195577A2; DK119286D0; CA1267851A; FI90628B; EP0195577B1; FI861083A0; DE3685046D1; ATE75409T1; IL78110A; FI90628C; JPS61222443A; DK165221B; JPH07100661B2; IL78110A0; DK165221C; NO860858L

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for behandling av et organtransplantat for å gjøre det egnet for transplantasjon inn i et genetisk ulikt individ. Derved tilveiebringes det faste organtransplantater, så som biter av bukspyttkjertel, som er belagt med en immunologisk barriære som gjør dem egent for transplantasjon.

Transplantasjon mellom genetisk forskjellige individer (kalt xenopodninger når donoren og verten er av forskjellig spesies og allopodninger når donoren og verten er av samme spesies) induserer normalt en immunrespons hos vertsindividet. Immunresponsen fører ofte til avvisning eller ødeleggelse av transplantatet, eller dersom transplantatet inneholder immunokompentente celler, til pode-mot-vertsykdom (GVHD graft-versus-host disease).

En teknikk som har vært benyttet for å forsøke å redusere eller eliminere antigenisiteten for transplantater er innkapsling av transplantatet i et biokompatibelt materiale som ikke i negativ retning påvirker levedyktigheten eller funksjonaliteten av transplantatet. En serie US patenter 4,352,883, 4,391,909, 4,407,957 og 4,409,331 beskriver slik innkapsling. Disse patentene vedrører spesifikt biter av bukspyttkjertel som innkapsles i dråpeformede kapsler ved at bitene innledningsvis innkapsles i et polysakkarid (f.eks. alginat) gel, og deretter kryssbindes overflaten av gelen med en polykationisk (f.eks. polylysin) polymer. Det antas at polysakkaridet som benyttes i denne fremgangsmåten ikke har noen affinitet for overflaten av bitene og avstøtes av overflaten av bitene. Dette øker sannsynligheten for at det finnes hull eller åpninger i inneslutningsgelen og at bitene ikke er fullstendig innkapslet. Videre krever fremgangsmåten som benyttes for å innkapsle bitene i geldråpene spesialut-styr og må utføres under strengt kontrollerte betingelser.

Foreliggende oppfinnelse er rettet mot å overvinne ulempene ved tidligere kjente innkapslingsfremgangsmåtene og søker å tilveiebringe en mer effektiv og enklere måte å behandle transplantater på, slik at de gjøres mindre antigeniske.

Ved foreliggende oppfinnelse tilveiebringes en fremgangsmåte for behandling av et organtransplantat for å gjøre det egnet for transplantasjon inn i et genetisk ulikt individ. Fremgangsmåten er kjennetegnet ved at: transplantatet først belegges med et første eller indre lag av et ikke-cytotoksisk materiale som danner en kjemisk binding med overflaten av transplantatet, hvor det første laget former seg etter overflaten av transplantatet, det første laget omfatter et materiale valgt fra gruppen bestående av: (a) aluminiumhydroksyd; (b) et dlsakkarid; (c) et polyfunksjonelt kryssbindingsmiddel; (d) et immunoglobulin til en overflatekomponent av

transplantatet;

(e) et lektin; og

(f) en polyionisk polyaminosyre som har en motsatt ladning av transplantatoverflaten; og

transplantatet belegges med et andre eller ytre lag av et polymert materiale, bestående av en polyaminosyre som har reaktive karboksyl-, amino- eller iminosidegrupper, som danner en kjemisk binding med materialet i det første laget, hvor det andre laget er biologisk kompatibelt og semipermeabelt.

Betegnelsen "transplantat" skal betegne en eller et større antall pattedyrceller, eller et større antall assosierte pattedyrceller, som definerer en organell eller et organ fra et donorpattedyr eller flere donorpattedyr som er genetisk ulike (xenogene eller allogene) resipienten. Betegnelsen benyttes typisk for å beskrive endokrine (hypofyse, skjold-brusk, binyre, biskjoldbrusk, bukspytt) celler, organeller, eller kjertler, men kan også benyttes ved andre organtransplantater så som hjerte-, lever-, lunge- og nyretrans-plantater.

Betegnelsen "lkke-cytotokslsk" skal bety at materialet Ikke 1 betydelig grad påvirker levedyktigheten og/eller funksjonaliteten av cellen, organellen eller organet hvorpå materialet påføres.

Betegnelsen "bundet kjemisk" skal indikere tilstedeværelsen av én eller flere kovalente, ioniske og/eller hydrogen-bindinger.

Uttrykket "biologisk kompatibelt" betyr at det angitte laget er i det vesentlige ikke antigenisk relativt til immun-systemet for resipienten og ikke induserer en fremmedlegeme (fibrose) reaksjon.

Betegnelsen "semipermeabel" betyr at det angitte laget tillater diffusjon innover av celler med lav molekylvekt, organeller, eller organnæringsmidler, avhengig av det enkelte tilfellet, og utoverrettet diffusjon av metabolismeprodukter, men forhindrer innoverrettet eller utoverrettet diffusjon av preparater som kan forårsake nedbrytende effekter på transplantatet eller resipienten.

Foreliggende oppfinnelse kan anvendes på en rekke transplantater og skal ikke være begrenset til en spesiell type celle, organell eller organ, eller til et spesielt pattedyrspesies. Bukspyttkjertelvev kan oppnås og kultiveres ved å benytte kjente teknikker for å gjøre det egnet for behandling ifølge foreliggende oppfinnelse. Vevet oppnås friskt og oppdeles ved finhakklng, skraping, knusing og/eller mild nedbrytning med kollagenase for å lette separering av bitene fra forurensende celler og materialer. Bitene kan isoleres fra det oppdelte/nedbrutte bukspyttkjertelvevet ved vasking, filtrering, sentrifugering eller utplukkingsfremgangsmåter. Fortrinnsvis kultiveres isolatet i et flytende kulturmedium under betingelser og i et tidsrom som forårsaker at de antigeniske komponentene (f.eks. vedhengende leukocyter) i isolatet deaktiveres eller elimineres. Slike medier og betingelser er beskrevet i Transplant. Proe. (1982) 14(4):714-23.

De rensede, isolerte bitene belegges så med et lag av et ikke-cytotoksisk polyfunksjonelt materiale som har en høy affinitet for én eller flere overflatekomponenter i bitcel-lene. Betegnelsen "polyfunksjonell" betyr at materialet på den ene siden har to eller flere tilgjengelige posisjoner for lett vekselvirkning med overflatekomponentene for cellen og på den annen side funksjonelle grupper for det ytre lag-materialet. Det polyfunksjonelle materialet virker som en bindende bro mellom celleoverflaten og det ytre polymere laget det dannes stabile (når det gjelder "susceptibilitet for brudd under beleggingsprosessen, etterfølgende lagring og ettertransplantasjon) kjemiske bindinger med én eller flere celleoverflatekomponenter (f.eks. avhengig av materialets natur, reaktive grupper av proteiner, karbohydrater, eller lipider) og med funksjonelle grupper i polymermateri-alet som danner det ytre, semipermeable laget. Materialet kan være syntetisk eller naturlig, uorganisk eller organisk. Eksempler på materialer som kan benyttes for å danne det indre belegget er: aluminhydroksyd; disakkarlder (maltose, sukkrose, laktose og trehalose eller sulfaterte derivater derav); ikke-polymere proteinkoblings-eller kryssbindings-midler med lav molekylvekt som bifunksjonelle disulfider så som 3,3'-dimetylditiobispropionat (DTBP) og N-suksinimidyl-3-(2-pyridyltio)propionat (SPDT), N-hydroksysuksinimidoestere av 6-malimidokapronsyre, 2-bromeddiksyre, og 2-Jodeddiksyre, andre aktive estere av slike syrer, imidoestere så som dimetyladipimidat og dissuksinimidylsuberat, aldehyder så som glutaraldehyd, bis-azidoforbindelser så som bis(p-azidoben-zoyl)heksandlamln, bis-diazoniumderivater, diisocyanater så som bis-tolylen-2,6-diisocyanat, og karbodiimider; immuo-globulin til en overflatekomponent av transplantatet, så som antistoffer til klasse I eller klasse II MHC-antigener (det viktigste histokompatibilitetskomplekset); lektiner (dvs. planteproteiner som bindes til sukker eller sukkerrester) så som concanavalin A, DBA, soyabønne-agglutinin, hvetekim-agglutinin, og fytohemagglutinin; og polyioniske polyaminosyrer som har en ladning motsatt overflateladningen av transplantatoverflaten, f.eks. har bukspyttkjertelbiter en negativ overflateladning og en polykationisk polyaminosyre så som polylysin kan bindes til bitoverflaten.

Den måten hvorpå det bindende bromaterialet påføres på overflaten av transplantatet vil avhenge av materialets natur. Det vil typisk påføres som en vandig suspensjon eller oppløsning under betingelser (fysiologisk pH, dvs. 7-7,5, temperatur, ca. 37'C, og ionestyrke) som fremmer og tillater uniform belegging av overflaten og dannelsen av stabile, kjemiske bindinger mellom materialet og de gitte celleover-flatekomponentene. Påføringen vil normalt bevirkes ved å bringe transplantatet i kontakt med suspensjonen eller oppløsningen under mild risting i 4 til 20 minutter. Belegget påføres fortrinnsvis som et tynt lag som former seg etter overflaten og er ett eller få molekyler i tykkelse.

Det ytre laget fremstilles av en polymer som vil tilveiebringe den påkrevde semipermeabiliteten og immunologiske kompatibiliteten. Polyaminosyrer som har reaktive karboksyl-, amino- eller iminogrupper, så som polyaspartinsyre, polyglutaminsyre, polylysin og polyarginin er foretrukket, den spesielle polyaminosyren avhenger av naturen og ladningen av de tilgjengelige bindingsposisjonene på det indre belegget. Dersom f.eks. de tilgjengelige posisjonene er negativt ladet anvendes en polykationisk polyaminosyre så som polylysin. Dersom omvendt de tilgjengelige posisjonene er positivt ladet kan en polyanionisk polyaminosyre så som polyaspartinsyre benyttes. Permeabiliteten av laget er primært en funksjon av molekylvekten av materialet og tykkelsen av laget. Permeabiliteten øker med økende molekylvekt og avtar med økende tykkelse. Molekylvekten av polymeren vil typisk være i området fra 5000 til 300.000 dalton, og tykkelsen vil vanligvis variere mellom 0,1-10 mikron, mer vanligvis 0,1-3 mikron. Disse polymerene kan påføres på transplantatene i fortynnede, vandige oppløsninger (0,1 til 1 vekt-56) ved fysiologisk pH, ionestyrke og temperatur. Kontakten mellom polymeroppløsningen og transplantatet utføres typisk under mild risting (for å sikre fullstendig belegging) i 4 til 10 minutter pr. lag. Om ønsket kan det ytre laget dannes som et stort antall lag av den samme polymeren eller forskjellige polymerer. Ett eller flere mellomlag av det samme eller forskjellige uskadelige materialer, så som polysakkarider, kan benyttes, forutsatt at de (1) ikke bryter den kjemiske bindingen mellom det indre laget og transplantatoverflaten, (2) ikke påvirker levedyktigheten eller funksjonaliteten av transplantatet, og (3) tilveiebringer et egnet substrat hvortil det ytre, semipermeable laget kan bindes kjemisk.

De følgende eksemplene illustrerer ytterligere transplantatene og materialene og fremgangsmåtene som benyttes for å danne de indre og ytre beleggene på transplantatet.

Isolering av bukspyttklertelbiter

Friskt bukspyttkjertelvev ble findelt og plassert i Hank's oppløsning inneholdende kollagenase for å nedbryte sammen-bindende vev. Det resulterende nedbrytningsproduktet ble underkastet Ficoll-Hypaque gradientsentrifugering for å isolere bitene. De isolerte bitene ble kultivert i 7 dager ved 37°C i "RPMI 1640"-medium supplert med 10* fosterkalve-serum under en fuktig 5* C02~atmosfære.

Belegglng av biter

A. Aluminiumhvdroks<y>d

Isolerte biter ble suspendert i 3 ml "RPMI 1640" ved en konsentrajson på 10<3->biter pr. ml. Aluminiumhydroksyd ble malt med morter og pistill inntil gelpartikkelstørrelsen var 1-3 pm. Det ble dannet en 1* Al(OH^-oppløsning i fysiologisk saltvann. RPMI-mediet fjernes fra bitene og erstattes med 3 ml av 1* Al(0H)3-saltvannsoppløsningen. Bit-A1(0H)3~ oppløsningen blandes ved rotasjon i 2,5 minutter. De Al(011)3-belagte bitene sedimenteres ut og overskuddet av Al(011)3-oppløsning fjernes. De belagte bitene vaskes deretter tre ganger i 6 ml fysiologisk saltvannsoppløsning, pH 7.

De belagte bitene overføres deretter til 3 ml av en 0,5* fysiologisk saltvannsoppløsning med pH 7 av poly-L-aspartinsyre, molekylvekt 50.000, og blandes i 4 minutter. Poly-L-aspartinsyren fjernes og de belagte bitene vaskes tre ganger med 6 ml fysiologisk saltvannsoppløsning, pH 7.

De belagte bitene suspenderes deretter i 3 ml 0,5* oppløsning av poly-L-lysIn, molekylvekt 50.000, og blandes i 5 minutter. Poly-L-lysinen fjernes og bitene vaskes 3 ganger i fysiologisk saltvann, pH 7.

Poly-L-aspartinsyre og poly-L-lysinbeleggingen og vaskingene kan gjentas dersom det ønskes et tykkere ytre lag.

Etter den endelige vaskingen i fysiologisk saltvannsoppløs-ning suspenderes de belagte bitene i 10 ml av en l*-oppløs-ning av deferoksamin i fysiologisk saltvann, pH 7,2 i 10 minutter. Deferoksamin-behandlingen gjentas i ytterligere 10 minutter og det fjernes deretter. De belagte bitene vaskes 2 ganger i fysiologisk saltvannsoppløsning og "RPMI 1640"-medium. Bitene kan transplanteres ved dette punktet eller føres tilbake til vevskulturen. De belagte bitene kan bevares 1 vevskultur 1 "RMPI 1640", 10* kalvefosterserum, 5* C02, 85* luft.

B. DTBP

Et tusen isolerte biter suspenderes i 0,5* DTBP i 3 ml fysiologisk saltvann, pH 7,2. Bitene blandes 1 30 sekunder og deretter tilsettes 30 ml saltvann til suspensjonen og de DTBP-belagte bitene får sedimentere ut. DTBP-oppløsningen fjernes og bitene vaskes 3 ganger med 20 ml saltvann, pH 7. Den endelige saltvannsvasken fjernes og 3 ml av en 0,5* poly-L-aspartinsyre-oppløsning, molekylvekt 50.000, tilsettes og blandes 1 4 minutter.

Poly-L-aspartinsyren fjernes og de polymerbelagte bitene vaskes 3 ganger med 6 ml saltvannsoppløsning. De belagte bitene suspenderes deretter i 3 ml 0,5* poly-L-lysin, molekylvekt 50.000, og blandes i 5 minutter. Poly-L-lysinet fjernes og bitene vaskes 3 ganger i fysiologisk saltvanns-oppløsning.

C. MHC antiserum

Et tusen isolerte biter fra rotte suspenderes i 0,25 ml "klasse I histokompatibilitetsantiserum" (M. A. Bioproducts) fortynnet 1/2 gang med fysiologisk saltvann, pH 7,5. Bitene og antistoff inkuberes ved 4°C i 45 minutter. Det antistoff-belagte vevet vaskes deretter 2 ganger med 5 ml fysiologisk saltvann, pH 7. Den endelige saltvannsvasken fjernes og 3 ml 0,5* poly-L-lysin, molekylvekt 50.000, tilsettes og blandes i 5 minutter. Poly-L-lysinet fjernes og bitene vaskes i fysiologisk saltvann, pH 7. De belagte bitene suspenderes deretter i 3 ml av en 0,5* poly-L-aspartinsyre-oppløsning, molekylvekt 50.000, og blandes i 4 minutter. Poly-L-aspartinsyren fjernes og bitene vaskes i fysiologisk saltvann, pH 7. Om ønsket kan bitene belegges en andre gang med poly-L-lysin og vaskes. En alternativ beleggingsfremgangsmåte er å biotinylere det brodannende antistoffet og polymeren og benytte standardbiotin-avidinsystemet.

Biter fra mennesker kan belegges på en tilsvarende måte ved å benytte tilgjengelige antistoffer til humane klasse I/II MHC-anigener.

D. Lektin

Et tusen isolerte biter ble suspendert i 10 jjg/ml "Con A" i 3 ml fysiologisk saltvann, pH 7 (Sigma Chemical Company). Bitene ble bladnet i 15 minutter ved 4°C og vasket med 10 ml fysiologisk saltvann, pH 7. Saltvannet ble fjernet og erstattet med 3 ml 0,5* poly-L-lysin, molekylvekt 50.000, saltvannsoppløsning, pH 7, og blandet i 5 minutter. Poly-L-lysinet ble fjernet og bitene ble vasket i fysiologisk saltvann, pH 7. De belagte bitene ble deretter suspendert i 3 ml av en 0,5* poly-L-aspartinsyre-oppløsning, molekylvekt 50.000, og blandet i 4 minutter. Bitene ble deretter vasket i fysiologisk saltvann, pH 7. Et andre belegg av poly-L-lysin kan, om ønsket, i tillegg påføres.

En alternativ beleggingsfremgangsmåte er å biotinylere lektin-broen og polymeren og benytte standard biotin-avidinsystemet.

E. Polykationisk polyaminosyre

Isolerte biter ble suspendert i 3 ml av en 0,5* fysiologisk saltvannsoppløsning, pH 7, av poly-L-lysin, molekylvekt 50.000, og blandet i ca. 10 minutter. Poly-L-lysinoppløs-nlngen ble deretter fjernet og de belagte bitene ble vasket 3 ganger med 6 ml fysiologisk saltvann.

De belagte bitene ble deretter overført til 3 ml av en 0,5* fysiologisk saltvannsoppløsning av poly-L-aspartinsyre, molekylvekt 50.000, og blandet i ca. 10 minutter. Poly-L-aspartinsyren ble fjernet og de belagte bitene ble igjen vasket 3 ganger med saltvann.

Til slutt ble de belagte bitene igjen suspendert i 3 ml av 0,5* saltvannsoppløsning av poly-L-lysin, og blandet i ca. 10 minutter, etterfulgt av vasking i saltvann.

In vitro- undersøkelse av biter

Funksjonell levedyktighet og regulering ved glukose ble bestemt for de belagte bitene. De ble belagt ved å anvende fremgangsmåten angitt I eksemplene A-E. Den immunoreaktive insulin(IRI)konsentrasjonen for vevskulturmediet ble bestemt ved radioinnunoanalyse. Insullnsekresjon ble bestemt som respons på en én times sekvensvis stimulering med 2 mM-glukose og 25 mM-glukose. Insullnsekresjon fra 60 belagte biter i 5 ml RPMI-medium ble bestemt. Lite insulin ble utskilt som respons på 2 mM-glukose (ikke-stimulerende konsentrasjon). Som respons på 25 mM-glukose utskilte de behandlede bitene Insulin I en mengde på 1,5-2,2 mg/bit/time. Dette er sammenlignbart med responsen i form av insulin utskilt av friske, ubehandlede biter.

In vivo- undersøkelse av biter

Balb/C-mus ble gjort diabetiske ved intraperitoneal Injeksjon av streptozotocin (180 mg/kg kroppsvekt). Ikke-fastende plasmaglukosenivåer varierte i området 400-600 mg/dl. Bare mus med plasmaglukosekonsentrasjoner større enn 400 mg/dl 1 2 uker mottok transplantater. Isolerte rotte(Sprague-Dawley).-biter ble belagt, ved å anvende fremgangsmåtene angitt i eksemplene A-D. To tusen belagte biter ble transplantert intraperitonealt i hver diabetisk mus, og ikke-fastende plasmaglukosenivåer ble bestemt 3 ganger ukentlig. Plasma-glukosenivåene falt til 100-170 mg/dl 1 musene med transplantatene. Disse belagte bitene har opprettholdt normoglykemi i de transplanterte musene i fra 3 uker til 1 1/2 år. Normo-glykemiske mus ble avlivet etter 3 måneder for å gjenutvinne de transplanterte bitene. De belagte bitene viste ingen store endringer eller hlstologlske vevsreaksjoner, og de utvundne bitene var levedyktige og istand til in vitro-regulering av glukose.

En hund ble gjort diabetisk ved total pankreatektomi. Etter operasjonen var det innledende blodglukosenivået 430 mg/dl, og det var påkrevet med 15 U NPH-insulin for å holde det under 300 mg/dl. Fem tusen biter ble utvunnet fra en ubeslektet hunds bukspyttkjertel, behandlet ved å anvende MHC-antiserumfremgangsmåten (eksempel C ovenfor, antihund-MCH-antiserum kan fås fra Microbiological Associates) og transplantert inn i bukhulen hos den diabetiske hunden. Etter transplantasjonen sank blodglukosenivået og insulinbehovet i løpet av 24 timer. De transplanterte bitene har fortsatt å fungere i over 2 1/2 år. Hunden krevde ingen immunoundertryk-kende legemidler, og har et blodglukosenivå på 170-250 uten insulin, dette er lavere enn nivået før transplantasjonen, men over nivået for en normal, ikke-diabetisk hund. Dette noe høyere enn normale nivået var ventet siden bare 5.000 biter ble transplantert. (En normal bukspyttkjertel inneholder ca. 300.000 biter og ca. 20.000 ville gjøre denne hunden normoglykemisk). Hunden holdes på 6 U NPH-insulin (for å fremme utvikling og formering av bitene) og har et blodglukosenivå på 93 mg/dl. Den har ikke vis noen kliniske tegn på diabetes.

Claims

1. Fremgangsmåte for behandling av et organtransplantat for å gjøre det egnet for transplantasjon inn i et genetisk ulikt individ, karakterisert ved at: transplantatet først belegges med et første eller indre lag av et ikke-cytotoksisk materiale som danner en kjemisk binding med overflaten av transplantatet, hvor det første laget former seg etter overflaten av transplantatet, det første laget omfatter et materiale valgt fra gruppen bestående av: (a) aluminiumhydroksyd; (b) et disakkarid; (c) et polyfunksjonelt kryssbindingsmiddel; (d) et immunoglobulin til en overflatekomponent av transplantatet; (e) et lektin; og (f) en polyionisk polyaminosyre som har en motsatt ladning av transplantatoverflaten; og transplantatet belegges med et andre eller ytre lag av et polymert materiale, bestående av en polyaminosyre som har reaktive karboksyl-, amino- eller iminosidegrupper, som danner en kjemisk binding med materialet i det første laget, hvor det andre laget er biologisk kompatibelt og semipermeabelt.

2. Fremgangsmåte Ifølge krav 1, karakterisert ved at det, til det Indre laget, som et polyfunksjonelt kryssbindingsmiddel anvendes et bifunksjonelt disulfid.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det, til det indre laget, som et immunoglobulin til en overflatekomponent av transplantatet anvendes et immunoglobulin som bindes til et MHC-antigen av transplantatet.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det, til det indre laget, som lektin anvendes concanavalin A.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det, til det indre laget, som en polyionisk polyaminosyre som har en motsatt ladning av transplantatoverflaten anvendes polylysin.