FI90254B - Dynaaminen jatkuvavirtauksinen entsyymireaktori - Google Patents
Dynaaminen jatkuvavirtauksinen entsyymireaktori Download PDFInfo
- Publication number
- FI90254B FI90254B FI894472A FI894472A FI90254B FI 90254 B FI90254 B FI 90254B FI 894472 A FI894472 A FI 894472A FI 894472 A FI894472 A FI 894472A FI 90254 B FI90254 B FI 90254B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- factor
- enzyme
- enzyme reactor
- phospholipid
- blood coagulation
- Prior art date
Links
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims description 67
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims description 67
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 66
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 claims description 48
- 229940012413 factor vii Drugs 0.000 claims description 48
- 102100023804 Coagulation factor VII Human genes 0.000 claims description 47
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 claims description 44
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 claims description 44
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 claims description 39
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 31
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 claims description 27
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 claims description 27
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 claims description 26
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 claims description 24
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 23
- 108010054265 Factor VIIa Proteins 0.000 claims description 21
- 229940012414 factor viia Drugs 0.000 claims description 21
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 18
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 claims description 16
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 claims description 16
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 claims description 15
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 claims description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 13
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 12
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 claims description 11
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 229940019700 blood coagulation factors Drugs 0.000 claims description 11
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 claims description 9
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 claims description 7
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 7
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 claims description 7
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 5
- 108010014172 Factor V Proteins 0.000 claims description 4
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 claims description 4
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 claims description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 4
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 claims description 4
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims description 2
- 238000005086 pumping Methods 0.000 claims description 2
- 241000257303 Hymenoptera Species 0.000 claims 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims 1
- UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N n-[(2s,3r,4r,5s,6r)-2-[(2r,3s,4r,5r,6s)-5-acetamido-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-(4-methyl-2-oxochromen-7-yl)oxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]acetamide Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](NC(C)=O)[C@H](OC=2C=C3OC(=O)C=C(C)C3=CC=2)O[C@@H]1CO UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N 0.000 claims 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 24
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 20
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 20
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 18
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 18
- 229940012426 factor x Drugs 0.000 description 18
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 17
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 108010048049 Factor IXa Proteins 0.000 description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 9
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 8
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 8
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 7
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 7
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 7
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 7
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 6
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 6
- MUCZHBLJLSDCSD-UHFFFAOYSA-N diisopropyl fluorophosphate Chemical compound CC(C)OP(F)(=O)OC(C)C MUCZHBLJLSDCSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229960005051 fluostigmine Drugs 0.000 description 6
- 108010071808 prepro-factor VII Proteins 0.000 description 6
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 5
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 5
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 4
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N Tritium Chemical compound [3H] YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 3
- 229930003448 Vitamin K Natural products 0.000 description 3
- 239000003012 bilayer membrane Substances 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 3
- 201000007386 factor VII deficiency Diseases 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N octyl beta-D-glucopyranoside Chemical compound CCCCCCCCO[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N 0.000 description 3
- SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N phylloquinone Natural products CC(C)CCCCC(C)CCC(C)CCCC(=CCC1=C(C)C(=O)c2ccccc2C1=O)C SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- -1 production Proteins 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- 229910052722 tritium Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019168 vitamin K Nutrition 0.000 description 3
- 239000011712 vitamin K Substances 0.000 description 3
- 150000003721 vitamin K derivatives Chemical class 0.000 description 3
- 229940046010 vitamin k Drugs 0.000 description 3
- KQJTXYQXRHCWKW-PJSBSAQXSA-N (4s)-4-[[(2s,3s)-2-benzamido-3-methylpentanoyl]amino]-5-[[2-[[(2s)-5-(diaminomethylideneamino)-1-(4-nitroanilino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-2-oxoethyl]amino]-5-oxopentanoic acid;hydrochloride Chemical compound Cl.N([C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NC=1C=CC(=CC=1)[N+]([O-])=O)C(=O)C1=CC=CC=C1 KQJTXYQXRHCWKW-PJSBSAQXSA-N 0.000 description 2
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 230000004089 microcirculation Effects 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- YDMBNDUHUNWWRP-VJBWXMMDSA-N (2s)-1-[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]-n-[(2s)-5-(diaminomethylideneamino)-1-(4-nitroanilino)-1-oxopentan-2-yl]piperidine-2-carboxamide Chemical compound C([C@@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCCC1)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NC=1C=CC(=CC=1)[N+]([O-])=O)C1=CC=CC=C1 YDMBNDUHUNWWRP-VJBWXMMDSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- QYLJIYOGHRGUIH-CIUDSAMLSA-N Arg-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N QYLJIYOGHRGUIH-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 206010008111 Cerebral haemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 102100037529 Coagulation factor V Human genes 0.000 description 1
- 102100029117 Coagulation factor X Human genes 0.000 description 1
- 208000037487 Endotoxemia Diseases 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000635804 Homo sapiens Tissue factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101710141452 Major surface glycoprotein G Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 208000002787 Pregnancy Complications Diseases 0.000 description 1
- 208000010378 Pulmonary Embolism Diseases 0.000 description 1
- 108010039286 S 2238 Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 108010031969 benzoyl-Ile-Glu-Gly-Arg-p-nitroanilide Proteins 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000005388 borosilicate glass Substances 0.000 description 1
- BULLHNJGPPOUOX-UHFFFAOYSA-N chloroacetone Chemical compound CC(=O)CCl BULLHNJGPPOUOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009852 coagulant defect Effects 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 229940125532 enzyme inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 1
- 229940099816 human factor vii Drugs 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000005567 liquid scintillation counting Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 230000020971 positive regulation of blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 230000031915 positive regulation of coagulation Effects 0.000 description 1
- 208000012113 pregnancy disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 238000003345 scintillation counting Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000012536 storage buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005166 vasculature Anatomy 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- 229960005080 warfarin Drugs 0.000 description 1
- PJVWKTKQMONHTI-UHFFFAOYSA-N warfarin Chemical compound OC=1C2=CC=CC=C2OC(=O)C=1C(CC(=O)C)C1=CC=CC=C1 PJVWKTKQMONHTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000008495 β-glucosides Chemical class 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
- C12M21/18—Apparatus specially designed for the use of free, immobilized or carrier-bound enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
- C12M23/02—Form or structure of the vessel
- C12M23/06—Tubular
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
- G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
- G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
- G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
- G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
- G01N2333/96433—Serine endopeptidases (3.4.21)
- G01N2333/96441—Serine endopeptidases (3.4.21) with definite EC number
- G01N2333/96444—Factor X (3.4.21.6)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
- G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
- G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
- G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
- G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
- G01N2333/96433—Serine endopeptidases (3.4.21)
- G01N2333/96441—Serine endopeptidases (3.4.21) with definite EC number
- G01N2333/96447—Factor VII (3.4.21.21)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
- G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
- G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
- G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
- G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
- G01N2333/96433—Serine endopeptidases (3.4.21)
- G01N2333/96441—Serine endopeptidases (3.4.21) with definite EC number
- G01N2333/96463—Blood coagulation factors not provided for in a preceding group or according to more than one of the proceeding groups
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- G01N2333/974—Thrombin
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2405/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving lipids
- G01N2405/04—Phospholipids, i.e. phosphoglycerides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Clinical Laboratory Science (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Description
1 90254 DYNAAMINEN JATKUVAVIRTAUKSINEN ENTSYYMIREAKTORI Keksinnön taustaa Tämä keksintö koskee dynaamista jatkuvavirtauksista entsyymi-reaktoria ja menetelmää, joka mahdollistaa veren koaguloitu-misreaktioiden ja muiden dynaamisten entsymaattisten reaktioiden nopeuksien in vitro-mittauksen, reaktioiden aktiivisuuden ollessa riippuvainen fosfolipideistä, ympäristössä, joka läheisesti muistuttaa kehossa vallitsevaa. Koaguloitutoisjärjestelmä (hyytyminen) ihmisessä ja eläimissä on pääasiallinen aputekijä verenvuodon tyrehdyttämisen ylläpidossa sekä trombien (verihyytymät) muodostumisessa. Koaguloituminen on olennaisesti sarja peräkkäisiä tapahtumia, jossa kukin hyytymistekijä, joka normaalisti on läsnä veressä ja muissa kudoksissa entsyymin inaktiivisena esiasteena, s.o. tsymogeenina, aktivoituu vuoronperään proteolyyttiseksi entsyymiksi, joka selektiivisesti hyökkää seuraavaksi vuorossa olevan tsymogeenin kimppuun aiheuttaen näin sen muuttumisen aktiiviseksi entsyymiksi. Vahvistuminen tapahtuu jokaisessa prosessin vaiheessa, niin että pieni alkuärsyke voi lopulta johtaa merkittävään määrään fibriinihyytyrniä.
Hyytymistapahtumasarja alkaa kahtena erillisenä reaktiotapah-tumana, jotka lopulta lähenevät toisiaan. Toinen reaktiota-pahtuma on "sisäsyntyinen" verelle ja toista nimitetään "ulkosyntyiseksi", koska sen laukaisevat hyytymistekijät, joita normaalisti ei ole läsnä veressä. Sisäsyntyisen reaktion kulku on tärkeämpi verenvuodon tyrehdyttämisessä vamman jälkeen. Ulkosyntyinen reaktion voi aktivoitua erilaisissa patologisissa tilanteissa, esim. diffuusissa endoteelivauriossa, edistyneessä syövässä, endotoksemiassa ja raskauskomplikaatioissa.
Nyt on löydetty merkittäviä todisteita siitä, että koaguloituminen alkaa kehossa, kun tekijä VII, K-vitamiinista riippuva plasman hyytymistekijäproteiini, ja kudostekijä, soluun sitoutunut proteiini, joka normaalisti ei liity verisoluihin, \ joutuvat vuorovaikutuksiin keskenään. (Katso esim. Nemerson, 2 90254
Blood 71:1-8, 1988, katsauksen saamiseksi aiheesta). Tämä vuorovaikutus johtaa aktivoituneeseen kompleksiin, jolla on entsymaattista aktiivisuutta ja joka aloittaa hyytymisen muuttamalla kaksi muuta proteiinia, s.o. tekijä X:n ja tekijä IX:n niiden aktiivisiksi entsyymimuodoiksi, tekijä Xa:ksi ja tekijä IXa:ksi, vastaavasti. (Tavallisen käytännön mukaan veren aktiivisten hyytymistekijöiden esiasteita s.o. tsymogeeneja merkitään roomalaisilla numeroilla, ja aktiiviset muodot osoitetaan alaindeksillä "a", esim. tekijä X tsymogeenille ja tekijä Xa aktivoituneelle tekijälle.)
Kudostekijä on esikoaguloiva proteiini, jota on mukana olennaisesti kaikkien solujen pinnalla, eivätkä ne normaalisti ole suorassa kosketuksessa veren kanssa. Kudostekijä on kuitenkin indusoitavissa endoteelisoluihin ja monosyytteihin stimuloimalla erilaisilla farmakologisilla välittäjillä, esim. kas-vainkuoliotekijällä, interleukiini-l:llä ja endotoksiinilla. Ulkosyntyisen koaguloitumisen laukaisee kudostekijä, joka kompleksoituu tekijä VII:n, K-vitamiinista riippuvan serii-niproteaasitsymogeenin, kanssa aktivoiden sen. Tekijän VII:n aktivointi kudostekijällä tapahtuu kalsiumionien läsnäollessa ja sen uskotaan johtuvan tekijän VII avaruusrakenteen muutoksesta. Katso esim. Nemerson et ai. (1982), Progress in Hemostasis and Thrombosis, Spaet, T.H. edi., Grune & Stratton, New York, voi. 6, pp. 237-261; Carson (1984) Prog. Clin. Pathol. 9:1-14. Tekijä VII-tsymogeenin muuttuminen aktiiviseksi entsyymiksi VIIa tapahtuu lohkaisemalla arg-ile-peptidisidos tsy-mogeenissa, jolloin saadaan tekijä VIIa, jolla on kevyt ketju, joka sisältää Gla-alueen ja raskas ketju, joka sisältää entsyymin aktiivisen kohdan.
Jos tekijä VII tsymogeenillä on esikoaguloiva aktiivisuus, voi koaguloituminen yksinkertaisesti alkaa sen fysikaalisen esteen rikkomisesta, joka normaalisti erottaa tekijän VII kudosteki-jästä. Niinpä veren hyytymiseksi vaurio itsessään voi olla riittävä aloittamaan koaguloitumisen. Määritelmä, jonka mukaan tsymogeenillä on pieni määrä aktiivisuutta johdannaisentsyy-miinsä verrattuna, voi johtaa vaikeuksiin, koska aktiivisella tsymogeenillä voi olla sama aktiviteetti kuin inerttillä 3 90254 tsymogeenillä, joka on kontaminoitunut mainitulla entsyymillä. Useimmissa tapauksissa tämä ongelma ratkaistaan yksinkertaisesti käsittelemällä tsymogeenia aktiiviseen kohtaan suunnatulla entsyymi-inhibiittorilla, kuten di-isopropyylifluori-fosfaatti (DFP) tai sopiva kloorimetyyliketoni, jolloin inhiboidaan kontaminoiva entsyymi. Koska tsymogeenit tavallisesti ovat lähes inerttejä, tämä johtaa koko mitattavan aktiivisuuden häviämiseen. Tekijä VII-tsymogeeni kuitenkin itse helposti inhiboituu DFP:n vaikutuksesta estäen näin tämän suoraviivaisen lähestymistavan. Tekijän VII:n reaktiivisuus DFP:n kanssa on todellakin niin suuri, että jo tämä viittaa tekijä'VII tsymogeenin äärimmäisen suureen aktiivisuuteen.
DFP:n inhibitiotutkimukset, jotka suoritettiin käyttäen naudan tekijöitä VII ja VII., osoittivat, että tekijällä VII on kvalitatiivisesti sama entsymaattinen aktiivisuus kuin tekijällä VII., vaikka tekijä VII-tsymogeeni omaa hiukan alle 1 % tekijän Vila aktiivisuudesta. DFP:n on myös osoitettu inhiboivan ihmisen tekijää VII, nopeuden ollessa yksi kolmasosa tekijän VII. inhibointinopeudesta, joka on suunnilleen sama suhde kuin havaittiin käytettäessä naudan proteiineja. Katso esim. Ne-merson, Blood 71:1-8, 1988 ja Zur et ai., J. Biol. Chem. 257:5623-5631, 1982.
Kokeet tukevat havaintoa, että koaguloituminen voi alkaa yksinkertaisesti kudostekijän ja tekijän VII kompleksoituessa fysikaalisesti. Lisätodiste tälle käsitykselle saadaan havainnosta, että naudan tekijät VII ja VII, sitoutuvat kudosteki-jään oleellisesti samoilla dissosioitumisvakioilla. Kun ihmisen kudostekijän lähteenä käytettiin monosyyttejä, sama ilmiö havaittiin ihmisen tekijöille VII ja VII,. Sen mukaisesti ei tarvitse pitää selviönä koaguloitumisen proteolyyttistä aloitusta, jolloin vältetään proteolyyttisten tapahtumien äärettömän regression ongelma. Tämä tsymogeenin aktiivisuuden määrä on yleensä epätavallinen ja osoittautuu olevan ainutlaatuinen hyytymisjärjestelmässä. Tekijän VII ja, vielä enemmän tekijän VII,, aktiivisuus on yhteensopiva levossa olevan hyytymisjärjestelmän kanssa, koska kudostekijän poissaollessa se ei voi laukaista koaguloitumista.
4 90254
Sisäsyntyisestä reaktiivisuudestaan johtuen tekijä VII eroaa kaikista muista tunnetuista hyytymistsymogeeneistä. Niinpä, koska tekijä VII tsymogeenillä on entsymaattista aktiivisuutta, kun viitataan sekä tsymogeeniin että aktiiviseen entsyymiin tekemättä eroa näiden kahden lajin välillä, käytetään tekijän VII(a) määritelmää.
Kudostekijä on samoin ainutlaatuinen lisätekijöiden joukossa, koska, päinvastoin kuin hyytymistekijät V ja VIII sekä muut lisätekijät hyytymistapahtumasarjassa, kypsä kudostekijäprote-iini ilmeisesti ei vaadi enempää käsittelyä ollakseen'aktiivinen. Nämä havainnot yhdessä antavat aiheen ehdottaa, että ainoa vaatimus kudostekijän aikaansaaman koaguloitumisen alkamiselle on sen fysikaalinen kompleksoituminen tekijän VII kanssa.
Kudostekijä, joka on membraaniin sitoutunut glykoproteiini, joka liittyy fosfolipideihin, ei normaalisti ole läsnä verenkierrossa. Kuitenkin kun verisuonet rikkoutuvat, tekijä VII, joka on plasman koaguloitumistekijä, voi kompleksoitua kudos-tekijän kanssa muodostaen näin katalyyttisesti aktiivisen tekijän, joka aktivoi sekä tekijän IX (plasman tromboplastiini-komponentti), joka on komponentti, joka sisäsyntyisesti muodostaa tekijän IXa, että tekijän X (Stuartin tekijä), joka liittyy sekä ulkosyntyisiin e.ttä sisäsyntyisiin koaguloitumi-siin, jolloin syntyy tekijä Xa. Kudostekijällä on myös tärkeä kliininen käyttö diagnostisena reagenssina hyytymisen seurannassa ja tutkimisessa.
Tekijää VII on mukana hyvin pienissä määrin plasmassa (n. 10 nM). Vaikea verenvuoto, joka voidaan nähdä yksilöissä, joilla on merkittävä tekijän VII puute, osoittaa tämän proteiinin fysiologisen tärkeyden. Tekijän VII puutokset ovat harvinaisia, mutta viimeaikaiset todisteet antavat aiheen olettaa, että noin 16 %:lla potilaista, joilla se on, on aivoverenvuoto, joka tavallisesti johtaa kuolemaan. Ragni et ai., Factor VII Deficiency, Amer. J. Hematol., 10:79-88 (198.1). Toisaalta potilaat, joilla on niinkin vähän kuin 5 % normaalimää- * rästä tekijää VII, on joskus hyvin vähän tai ei lainkaan 5 90254 verenvuototaipumusta. Mikä tahansa annettu tekijän VII määrä onkaan, esiintyy huomattavasti kliinisiä vaihteluita.
Erilaisiin sairauksiin, esim. syöpä ja sydänverisuonitauti, liittyy lisääntynyt verihyytymien muodostuminen verisuonissa. Pääasiallisiin hoitoihin sydänverisuonitaudeille kuuluu anti-koagulanttien käyttö, esim. warfariinin ja sen sukuisten lääkkeiden käyttö, jotka häiritsevät K-vitamiinista riippuvien hyytymistekijöiden synteesiä (esim. tekijöiden II, VII, IX ja X). On tehty monia tutkimuksia, jotka osoittavat, että tämä hoito laskee verisuonten trombitulppaumien, keuhkotulppien ja sydänlihasinfarktien (sydänkohtausten) ilmenemistä. Warfa-riinihoitoon kuitenkin liittyy verenvuodon suhteellisen runsas esiintyminen, joka joskus on kuolemaan johtavaa.
Standarditapa, jossa warfariinin tyyppisten antikoagulanttien annostusta seurataan, on käyttää Quickin yksivaiheista pro-trombiiniaikaa. Tässä kokeessa, joka suoritetaan staattisissa olosuhteissa, potilaan veriplasmanäyte lämmitetään 37C°:seen. Kudoksen tromboplastiinin suspensio (epäpuhdas kudostekijä) lisätään sitten plasmanäytteeseen yhdessä kalsiumionien kanssa ja hyytymisaika määritetään. Normaali hyytymisaika on 12 + /-0,5 sekuntia. Antikoagulantin terapeuttinen alue on lääkkeen konsentraatio veressä, joka antaa hyytymisajan, joka on välillä 1,2 ja 1,5 kertaa normaaliarvo. Tämä pieni pelivara pakottaa kliiniset laboratotiot työskentelemään tarkkuuksilla, joita usein ei voida saavuttaa. Näiden epätarkkuuksien uskotaan olevan syynä joihinkin antikoagulanttien verenvuotosivu-vaikutuksiin.
Tekijä VII voidaan mitata samantapaisella menetelmällä. Laimennukset potilaan plasmasta lisätään normaaliin plasmaan ja suoritetaan yksivaiheinen protrombiiniaika-koe. Koenäytteessä olevan tekijän VII:n määrä arvioidaan vertaamalla koenäyttei-den hyytymisaikaa niihin, jotka saatiin normaalin plasman laimennuksista. Kaikki nykyään käytössä olevat koaguloitumisjärjestelmän kokeet ovat perustuneet erilaisten plasmojen hyyty-misaikojen määrittämiseen, mutta aina koeputkessa staattisissa olosuhteissa. Koska veren hyytyminen in vivo tapahtuu aina 6 90254 kuitenkin liikkuvassa virrassa, virtauksen vaikutuksia entsy-maattisiin reaktioihin ei voida sopivasti arvioida staattisessa järjestelmässä.
Nyt on havaittu, että spesifiset veren hyytymisen entsymaatti-set reaktiot voidaan tarkemmin suorittaa dynaamisesti kuljettamalla erilaisia veren hyytymisen tsymogeeneja yhdessä kal-siumionien kanssa määrätyllä virtausnopeudella putkimaisen kotelo-osan läpi, jonka sisäpinta on päällystetty tasomaisella fosfolipidin kaksoiskerrosmembraanilla. Valinnaisesti ja edullisesti tasomaiseen membraaniin sisältyy puhdistettu ku-dostekijä. Kotelon läpi kuljetetut reagenssit sisältävät joko tekijän VII tai Vila, joka kompleksoituu kuodostekijän kanssa ja muodostaa entsymaattisesti aktiivisia lajeja, yhdessä tekijän IX tai tekijän X kanssa, jotka ovat substraatteja kudoste-kijä - tekijä VII kompleksille. Tekijän IXa tai tekijän Xa valmistumisnopeudet voidaan helposti analysoida millä tahansa näille tekijöille sopivalla analyysillä. Dynaaminen reaktio mahdollistaa aktivoitujen tekijöiden tuotannon tarkemman analyysin kuin mitä nykyisillä staattisilla menetelmillä voidaan saada aikaan.
Lisäksi esim. potilaasta otetun plasmanäytteen, kuljettaminen tällaisen fosfolipidimembraanilla päällystetyn laitteen läpi keksinnön mukaisilla virtausnopeuksilla ja määrätyissä muissa olosuhteissa mahdollistaa tiettyjen entsyymituotteiden mittaamisen, jotka ovat syntyneet plasmanäytteen vuorovaikutuksesta kudostekijää sisältävän fosfolipidimembraanin kanssa ja voivat antaa arvokasta tietoa määrättyjen hyytymistekijöiden puutteista tai voi mahdollistaa entistä herkemmän analysoinnin sopivien antikoaguloitumisparametrien löytämiseksi potilaille, kuin mitä voitiin saada aikaan tekniikan tason menetelmillä.
Keksinnön entsyymireaktoria voidaan myös käyttää suoritettaessa ja analysoitaessa muita fosfolipidiriippuvaisia entsymaat-tisia reaktioita kuin veren hyytymisreaktiot. Tällaisiin reaktioihin kuuluu erilaisten inaktiivisten entsyymireaktiokompo-nenttien virtaaminen reagenssiliuoksessa läpi fosfolipidikak- s soiskerrosmembraanilla päällystetyn putkimaisen kotelon.
7 90254
Inaktiivisten entsyymien komponentit reagenssiliuoksessa tulevat entsymaattisesti aktiivisiksi vuorovaikutuksella kotelon sisäpinnalla olevan fosfolipidimembraanin kanssa ja reaktion tuotteet voidaan analysoida ulos virtaavasta liuoksesta.
Keksinnön yhteenveto Tämän keksinnön mukaisesti tarjotaan käyttöön dynaaminen jat-kuvavirtauksinen entsyymireaktori, joka mahdollistaa veren hyytymisreaktioiden ja muiden fosfolipideistä riippuvien ent-symaattisten reaktioiden nopeuksien mittaamisen in vitro ympäristössä, joka läheisesti muistuttaa elimistön ympäristöä. Tämän keksinnön mukaisesti tarjotaan käyttöön myös menetelmä erilaisten hyytymistekijöiden aktivoitumisnopeuksien mittaamiseksi, erityisesti tekijän X aktivoitumisessa tekijäksi Xa ja tekijän IX tekijäksi IXa, molemmat tekijän VII tai tekijän VIIa avulla, sekä menetelmän trombiinituotannon nopeuden niittämiseksi.
Lyhyt kuvaus piirroksista
Kuva 1 esittää tekijän X aktivoimista tekijän VIIa ja kudoste-kijän avulla tämän keksinnön erään toteutusmuodon mukaan.
Kuva 2 on kaavakuva tämän keksinnön jatkuvavirtauksisesta ent-syymireaktorista.
Kuva 3 on pituussuuntainen kuva tämän keksinnön jatkuvavirtauksisesta entsyymireaktorista.
Kuva 4 on kaaviokuva tämän keksinnön jatkuvavirtauksisesta entsyymireaktorista yhdistettynä laitteisiin, joilla reagens-sit pumpataan reaktoriin ja laitteisiin, joilla analysoidaan reaktiosta ulos virtaavasta liuoksesta sekä trombiini että tekijä Xa.
Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus Tämä keksintö koskee dynaamista jatkuvavirtauksista entsyymi-reaktoria, joka käsittää putkimaisen kotelon, joka on päällystetty sisäpinnaltaan lipidimembraanilla, joka koostuu tasomai- * sesta fosfolrpidikaksoiskerroksesta, joka valinnaisesti ja 8 90254 edullisesti sisältää entsyymin tai entsyymin lisätekijän. Putkimaisella kotelolla on toinen pää, joka on yhdistettävissä laitteeseen, jolla syötetään spesifisiä nestemäisiä reagens-seja siihen ja toisesta päästä yhdistettävissä laitteeseen, jolla kerätään ja analysoidaan siitä ulos tuleva neste. Edullisesti putkimainen kotelo on kapillaariputki, joka on avoin tai avattavissa molemmista päistä.
Erilaisia puhdistettuja hyytymistekijöitä tai tsymogeeneja tai, vaihtoehtoisesti plasmaa voidaan pumpata entsyymireakto-rin läpi kalsiumionien kanssa ja antaa reagoida entsyymin tai lisätekijän kanssa fosfolipidimembraanissa. Säätämällä näiden tekijöiden virtausnopeuksia niiden tullessa reaktoriin ja mittaamalla tuotteiden pitoisuudet reaktorista pois virtaavassa nesteessä voidaan arvioida veren hyytymistapahtumasarjän eri tsymogeenien aktivoitumisnopeuksia aktiivisiksi tuotteiksi ja määrittää virtauksen vaikutus tuotteiden muodostumiseen. Lisäksi voidaan myös laskea aika, joka tarvitaan minkä tahansa aktivoituneen lajin tuotannon steady-state tason saavuttamiseksi.
Keksinnön edullisen toteutusmuodon mukaan fosfolipidikaksois-kerros sisältää puhdistettua kudostekijää, joka on entsyymin lisätekijä, joka aloittaa veren hyytymistekijöiden aktivoitumisen. Hyytymistekijät, jotka^pumpataan reaktorin läpi, ovat tekijä VII tai tekijä VIIa sekä tekijä IX tai tekijä X. Hyytymistekijät pumpataan fosfolipidimembraanilla päällystetyn kapillaariputken läpi kalsiumionien kanssa ja annetaan virrata kudostekijää sisältävän fosfolipidikaksoiskerrosmembraanin ohi, joka on putken sisäpinnalla. Kun merobraanissa oleva ku-dostekijä kohtaa tekijän VII tai tekijän VIIa virtaavassa aineessa, muodostuu kapillaariputken sisällä entsymaattisesti aktiivinen kompleksi. Tämä entsymaattisesti aktiivinen kompleksi puolestaan aktivoi tekijän IX tekijäksi IXa tai tekijän X tekijäksi Xa virtaavassa aineessa. Säätämällä virtausnopeuksia ja tekijän IX tai tekijän X ja tekijän VII tai tekijän Vlla pitoisuuksia reaktorin sisääntulossa sekä seuraamalla tekijän IXa tai tekijän Xa pitoisuuksia reaktorista ulos tulevas- % .
sa nesteessä voidaan laskea aktivoitumisnopeudet.tekxjän IX
9 90254 aktivoituessa tekijäksi IXa tai tekijän X aktivoituessa tekijäksi Xa ja määrittää virtauksen vaikutukset siihen. Lisäksi voidaan myös laskea aika, jona saavutetaan tekijän IXa tai tekijän Xa steady-state tuotanto erilaisilla tekijän VII tai VIIa pitoisuuksilla.
Tekijä VII voidaan korvata tekijällä VIIa ja päin vastoin, koska, kuten edellä todettiin, tsymogeenitekijällä VII on kvalitatiivisesti sama esikoaguloiva aktiivisuus kuin aktiivisella entsyymijohdannaisellaan tekijällä VIIa, vaikkakin tsymogeenin aktiviisuus on vain noin 1 % aktiivisesta entsyymistä. Zur et ai., J. Biol. Chem. 257:5623-5631 (1982); Ne-merson, Blood 71:1-8 (1988). Tekijää VII voidaan siis käyttää lähtöaineena tämän keksinnön entsyymireaktorissa ilman esi-prosessointia tekijäksi VII,.
Tämän keksinnön toisen toteutusmuodon mukaan puhdistetun tekijän VII tai tekijän VII, seos puhdistettujen hyytymistekijöiden, tekijän V, tekijän VIII, tekijän IX ja tekijän X kanssa voidaan viedä membraanilla päällystettyyn kapillaariputkeen yhdessä protrombiinin kanssa. Trombiinin tuotannon, tekijän IX, tuotannon tai tekijän X, tuotannon nopeus voidaan sitten mitata ja seurata kunkin hyytymistekijän erilaisten pitoisuuksien vaikutusta trombiinin, tekijän IX, tai tekijän X, tuotantoon.
Tämän keksinnön vielä erään toteutusmuodon mukaan plasmaa voidaan viedä fosfolipidimembraanilla päällystettyyn entsyymi-reaktoriin vakiovirtausnopeudella, tarkoituksena aloittaa hyytymistekijöiden aktivointi vuorovaikutuksella fosfolipidimem-braanissa olevan kudostekijän kanssa. Valittujen tekijöiden, kuten IX,:n, X,:n tai trombiinin tuotanto voidaan sitten mitata. Tämä toteutusmuoto mahdollistaa spesifisemmän arvioinnin hyytymien muodostumiselle kuin mikä voidaan saada protrombi-iniaikojen staattisella mittauksella ja sitä voidaan käyttää potilaiden tutkimiseen, joilla on hyytymispuutoksia tai syitä antikoagulanttihoitoon.
Jatkuvavirtauksisen entsyymireaktorin kapillaariputki voi olla 10 90254 mitoiltaan vaihteleva, ja sen sisähalkaisija voi olla välillä noin 0,10-1,10 mm ja pituus noin 1-15 cm. Alhaisilla seinämän leikkausnopeuksilla (n. 20 s'1) tuotteen muodostuminen on verrannollinen kapillaariputken kokoon yhtälön (L/Q)2/3 mukaan, jossa L on putken pituus ja Q on virtausnopeus reaktorin läpi, mikä osoittaa diffuusiokonrolloitua reaktiota. Suurilla leikkausnopeuksilla (yli 100 s-1) uskotaan, että diffuusio tulee vähemmän tärkeäksi ja entsyymikinetiikka hallitsevaksi.
Kapillaariputki valmistetaan upottamalla se ensin kiehuvaan detergenttiliuokseen, esim. Sparkleen* ja huuhtomalla' se sitten tislatussa deionisoidussa vedessä ultraäänihauteessa. Sitten se kuivataan 120 C°:ssa ja täytetään kudostekijää sisältävien lipidirakkuloiden suspensiolla. Kapillaariputki huuhdotaan sitten puskuriliuoksella, jossa on 0,01 M N-2-hydroksi-etyylipiperatsiini-N'-2-etaanisulfonihappoa (HEPES) sekä 0,14 M NaCl ja 1 mg/ml naudan seerumin albumiinia (BSA) , ja jossa pH on säädetty arvoon 7,5 HCl:llä. Täytetty kapillaariputki säilytetään lopuksi huoneenlämmössä puskuriliuoksessa membraa-nin ilmalle altistumisen estämiseksi.
Lipidirakkulasuspensio, joka sisältää puhdistettua kudostekijää, on edullisesti valmistettu menetelmän mukaan, joka on kuvattu julkaisussa Bach et ai., "Factor VII Binding to Tissue Factor in Reconstituted Phospholipid Vesicles: Induction of Cooperativity by Phosphatidylserine", Biochemistry 25:4007 (1986), johon liittyy kudostekijän liittäminen fosfolipidirak-kuloihin dialysoituvan ionittoman detergentin oktyyligluko-sidin läsnäollessa suuressa ylimäärässä, esim. 15-kertaisesti. Detergentin poistaminen dialyysillä johtaa puhdistetun kudos-tekijän spontaaniin liittymiseen suuriin fosfolipidirakkuloi-hin. Rakkulat valmistetaan fosfatidyyliseriinin tai muiden happamien fosfolipidien ja fosfatidyylikoliinin seoksesta. Edullisesti seos, jossa on 0-40 % fosfatidyyliseriiniä (PS) ja 60-100 % fosfatidyylikoliinia (PC), kompleksoidaan kudostekijän kanssa suhteessa noin 1-10 moolia kudostekijää 100 000 moolia fosfolipidiä kohti.
%
Puhdistettua kudostekijää voidaan valmistaa tunnetuilla 11 90254 menetelmillä naudan aivoista tai ihmisen aivoista tai istukasta (katso esim. Spicer et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. 84: 5148-5152, 1987) tai valmistaa yhdistelmä-DNA-kloonausmene-telmällä, kuten US-patenttihakemuksessa sarjanumero 062 166 (Nemerson et ai., jätetty 12.6.1987) on esitetty.
Kuvien 2 ja 4 mukaan, kun entsyymireaktoria käytetään, kapil-laariputki (1) poistetaan säilytyspuskurista ja liitetään ruiskuun (3), joka sisältää kalsiumionien liuosta ja joko tekijää VII tai tekijää VIIa sekä yhtä tai useampaa puhdistettua hyytymistekijää, joita ovat tekijä V, tekijä VIII> tekijä IX, tekijä X ja protrombiini. Nämä puhdistetut tekijät voidaan saada tunnetuilla proteiinin eristysmenetelmillä tai tuottaa yhdistelmä-DNA-kloonausmenetelmillä. Käyttäen pumppua (4) liuos kuljetetaan kapillaariputken (1) läpi vakionopeudella ja erilaisten hyytymistekijöiden annetaan reagoida kudostekijän kanssa tasomaisessa fosfolipidi membraanissa. Aktivoituneet entsyymituotteet sisältävä poisvirtaava neste kerätään sitten keräilylaitteeseen (2) kapillaariputken (1) ulostulopäässä ja analysoidaan.
Valittujen entsyymien valmistumisnopeudet mitataan sitten.
Eräs menetelmä mitata tekijän IXa tai tekijän Xa valmistumisnopeuksia on käyttää tritiumilla leimattua tekijää IX tai tekijää X lähtöaineena ja mitata sitten happoon liukoisen tritiumin määrä, joka syntyy kapillaariputkesta poisvirtaa-vassa nesteessä. Lisäksi voidaan käyttää standardi sätei-lyanalyysejä tai fluoresenssi-(fluorogeenisia) analyysimenetelmiä analysoimaan tämän keksinnön reaktorissa tapahtuvien entsyymireaktioiden tuotteita. Kun käytetään fluoresenssi-analyysiä, erilaisten kemiallisten komponenttien vuorovaikutuksen jälkeen mitataan kapillaariputkesta ulostulevan nesteen fluoresenssi ajan funktiona.
Toinen menetelmä mitata annetun entsyymin tuotantonopeutta on lisätä entsyymituotteelle spesifinen kromogeeninen substraatti entsyymireaktorista ulosvirtaavaan nesteeseen, ja suunnata virta jatkuvajuoksuisen fotometrin läpi. Kuten esim. kuvassa 4 on esitetty, kun tekijän Xa tuotantonopeutta mitataan, i2 90254 kromogeeninen substraatti S2222 (6) (Lottenberg et ai., Meth.
Enzymol. 80:341-361, 1981) lisätään ulostulevaan nesteeseen ennen fotometrin läpi kulkemista. Sitten entsyymireaktorissa muodostuneen tekijän Xa pitoisuus voidaan mitata optisen ab-sorbanssin 405 nm:ssä, muutoksina. Tai esimerkiksi, kun on tarkoitus mitata trombiinin tuotantonopeutta, kromogeeninen substraatti S2238®(7) (Lottenberg et ai., Meth. Enzymol. 80:-341-361, 1981) lisätään entsyymireaktorista ulosvirtaavaan nesteeseen ennen kuin se viedään fotometriin. Jos on tarkoituksena mitata useamman kuin yhden entsyymin tuotantoa samanaikaisesti, entsyymireaktorista ulostuleva virta voidaan jakaa ja eri kromogeeniset substraatit lisätä kuhunkin virtaan ja mitata erillisesti optinen absorbanssi. Suhdepumppua (8) käytetään lähettämään virta sekoitusvaiheeseen (9), jonka jälkeen erilliset virrat lähetetään spektrofotometreihin (10) ja (11).
Yhdelle tai useammalle entsyymituotteelle mitattuja pitoisuustasoja käyttäen voidaan laskea aika steady-state tuotannon saavuttamiselle jokaiselle näistä tuotteista. Analyysitarkoi-tuksissa voidaan myös mitata aika annetun tuotteen steady-state tuotannon puolivälin (T 1/2 ) saavuttamiseksi, jolloin tietoja voidaan helpommin verrata. Tämä uusi parametri, t.s. aika, jona saavutetaan steady-state tuotanto, joka nyt voidaan saada käyttäen tämän keksinnön jatkuvavirtauksista entsyymi-reaktoria, mahdollistaa veren .hyytymismekanismin paremman analyysin. Sitävastoin tavallisilla staattisilla hyytymiskokeilla ei voida saada tietoa steady-state olosuhteista, eikä niitä voida käyttää arvioitaessa virtausnopeuden vaikutusta steady-state tilan saavuttamiseksi.
Tämän keksinnön entsyymireaktori kestää seinämän leikkausnopeuksia, jotka ovat suuruudeltaan ainakin 3000 s"1, joka on verrattavissa keskimääräisiin maksimaalisiin seinämäleikkaus-nopeuksiin ihmisen verisuonistossa, s.o. noin 2000 - 5000 s"1.
Seuraavat ei-rajoittavat esimerkit on tarkoitettu edelleen valaisemaan tätä keksintöä.
* i3 90254
Esimerkki 1
Seuraavalla tavalla valmistettiin fosfolipidirakkulat, jotka sisälsivät puhdistettua kudostekijää, joka oli saatu yhdistel-mä-DNA-kloonaustekniikalla, kuten on kuvattu US-patenttihake-muksessa sarjanumero 062 166 tai tunnetuilla proteiinien eris-tysmenetelmillä naudan aivoista tai ihmisen aivoista tai istukka jauheesta, kuten Spicer et ai. ovat kuvanneet julkaisussa Proc. Natl. Acad. Sei. 84:5148-5152, 1987. PS ja PC CHCl3:ssa yhdistettiin moolisuhteissa, jotka vaihtelivat välillä 0:100 -40:60 (PS:PC) ja kuivattiin ohueksi filmiksi boorisilikaatti-lasiputken seinämään N2-virrassa ja sitten vakuumissa 2 tuntia. Lisättiin 15-kertainen molaarinen ylimäärä oktyyliglu-kosidia (200 mM) 0,1 M NaCl:ssä ja 0,05 M Tris:ssä, pH 7,5 (TBS), ja seosta inkuboitiin huoneenlämmössä satunnaisesti pyörryttämällä kunnes se oli täysin kirkasta.
Puhdistettu kudostekijä TBSrssä, joka sisälsi 0,1 % Triton X-100:a, lisättiin fosfolipidi-oktyyliglukosidivalmisteeseen, jolloin saatiin lopullinen liuos, jossa Triton-' X-100:n pitoisuus oli < 0,02 % ja moolisuhde kudostekijä:fosfolipidi:oktyy-liglukosidi oli 1-10:100 000:1 500 000.
Lisättiin hyvin pieni määrä [14C] PC:tä ja 3H-kudostekijää proteiinin ja fosfolipidin tarkaksi annostelemiseksi lopullisessa materiaalissa. 3H-lukeman suhde 14C:n lukemaan oli suunnilleen 10-100:1 (riippuen kudostekijän pitoisuudesta). Näytteistä otettiin alikvoottinen määrä nestetuikelaskentaa varten ja jäljellä oleva osa dialysoitiin vasten 3x1 litraa TBS:ää huoneenlämmössä 72-96 tuntia, jonka jälkeen materiaali gee-lisuodatettiin huoneenlämmössä TBS:ssä Sepharose CL-2B-kolon-nissa (1,5 x 55 cm). 3H-kudostekijän ja [14C]-fosfolipidin saanti määritettiin tuikelaskennalla. Saatu suspensio sisälsi 2 mM PS/PC-lipidirakkuloita ja 20-200 nM kudostekijää.
Standardikäytössä olevat kapillaarilasit preparoitiin upottamalla ne ensin kiehuvaan detergenttiliuokseen, jossa oli 1 g
Sparkleen TM /500ml tislattua/deionisoitua vettä, 30 minuu- \ tiksi ja huuhtelemalla ne kolme kertaa 5 minuutin ajan 14 90254 tislatulla/deionisoidulla vedellä ultraäänihauteessa, kaikkiaan 15 minuuttia. Kapillaariputket kuivattiin sitten 120C°:ssa 30 minuuttia ja täytettiin sitten valmistetulla PS/PC-lipidi-rakkulasuspensiolla, joka sisälsi kudostekijää. 10 minuutin ku-luttua putket huuhdottiin HEPES/albumiinipuskurilla (0,01 M HEPES, 0,14 NaCl, 1 mg/ml BSA, pH säädettynä arvoon 7,5 käyttäen HC1) ja säilytettiin puskuriin upotettuna, jottei lipi-dimembraani joutunut kosketuksiin ilman kanssa.
Esimerkki 2
Kapillaariputket (sisähalk. = 0,56 mm, L = 75 mm) preparoituna ja käsiteltynä esimerkissä 1 kuvatun menetelmän mukaan liitettiin ruiskuun, joka sisälsi erilaisia tekijän VIIa liuoksia, 100 nM tritiummerkittyä tekijää X ja 5 mM CaCl2. Käyttäen tarkkuuspumppua liuokset kuljetettiin putkien läpi vakiovir-tausnopeudella 27,1 μΐ/min. Putkista ulos tulevat virrat analysoitiin sitten tekijän Xa, tuotannon ja pitoisuuden suhteen mittaamalla syntyneen happoliukoisen tritiumin määrä. Tulokset steady-state tilassa on esitetty taulukossa 1.
Taulukko 1
Kapillaari- Virt,nop. Kapillaariputkeen Steady- putki entsyymi- saapuvat pitoisuud. state-pit.
reaktoriin
Tekijä VIIa Tekijä X Tekijä Xa sisähalk. L ul/min nM nM nM
mm mm 0,56 75 27,1 1 100 8,4 0,56 75 27,1 0,5 100 9,8 0,56 75 27,1 0,1 100 8,8 0. 56 75 27,1 0,075 100 8,4
Kuten voidaan nähdä, muodostuneen tekijän pitoisuus on riippumaton tekijän VIIa pitoisuudesta steady-state vaiheessa. Kuva 1. esittää kuitenkin tekijän Xa määrää, joka syntyi ajan funktiona neljällä ylläolevalla tekijän VIIa pitoisuudella.
is 90254
Havaittiin, että steady-state tilan saavuttamiseksi tarvittava aika tekijän X, tuotannossa vaihteli kääntäen verrannollisesti tekijän VIIa pitoisuuksiin. Lisäksi tekijää VII käytettiin samoissa olosuhteissa ja se antoi samat tulokset, s.o. kun tekijän VII konsentraatio laski , aika steady-state tilan saavuttamiseksi nousi. Tekijän VII pitoisuudelle 0,1 nM oli tekijän X, steady-state tilan pitoisuus 10,6 nM.
Koska tekijän Xa tuotanto saavutti steady-state tilan asteittain laskettiin Xa:n T1/2. Kuvassa 1 on esitetty, että T1/2 on sama tekijän VIIa pitoisuuksilla 0,5-10 nM, nimttäin noin 4 minuuttia. Nämä tekijän VIIa määrät vastaavat 5-100% normaaleista tekijän VII määristä ihmisellä, ja vaikeat verenvuodot ilmenevät yleensä kun tekijän VIIa määrä kehossa on alle 5 %. Kuten kuvassa 1 on esitetty, kun tekijän VII, määrät putoavat 0,1 nM:iin (1 % normaalista), T1/2 nousee merkittävästi. Tässä esimerkissä kehittynyt seinämän leikkausnopeus oli suunnilleen sama kuin ihmisen verisuonijärjestelmissä, esim. noin 20 -40 s-1.
Esimerkki 3 Käytettiin samoja koeolosuhteita kuin esimerkissä 2 paitsi että kapillaariputken dimensiot ja virtausnopeus muutettiin. Tulokset, jotka saatiin kapillaariputken sisähalkaisijalla 0,33 mm ja pituudella 125 mm, annetaan taulukossa 2.
Taulukko 2
Kapillaari- Virt.nop. Kapillaariputkeen Steady- putki entsyymi- saapuvat pitoisuud. state-pit.
reaktoriin
Tekijä VII, Tekijä X Tekijä X, sisähalk. L μΐ/min nM nM nM
mm mm 0,33 125 200 1 200 3,20 0,33 125 400 1 200 2,40 % i6 90254
Alemmalla virtausnopeudella (200 ul/min) laskettu seinämän leikkausnopeus oli 856 s"1, joka on keskimääräisten seinämän leikkausnopeuksien välillä, jotka on saatu pienissä valtimoissa ja mikroverenkierrossa; nopeudella 400 ul/min saatu seinämän leikkausnopeus oli 1712 s'1, sama kuin mikroverenkierron nopeudet. Niinpä entsyymireaktori selvästi kesti leikkausnopeudet, jotka olivat verrattavissa fysiologisiin arvoihin. Täten erilaisten koaguloitumisjärjestelmien poikkeavuuksien vaikutukset voidaan arvioida virtausolosuhteissa, joiden alue ulottuu verisuonijärjestelmästä mikroverenkierrossa vallitseviin olosuhteisiin. Havaittiin, että kapillaariputkef, joiden sisäiset halkaisijat olivat alueella noin 0,10-1,10 mm ja putkenpituudet alueella noin 1,0-15 cm, olivat hyväksyttäviä. Putken halkaisijoiden muutosten havaittiin muuttavan syntyvien tuotteiden pitoisuuksia, muttei keksinnön perusmekanismia.
Edellä olevat esimerkit antavat kuvan siitä minkälaisia tietoja, voidaan saada käyttäen tämän keksinnön jatkuvavirtauksista entsyymireaktoria, ja joita ei voida saada käyttäen tunnettuja staattisia menetelmiä. Edelläolevan ei ole tarkoitettu rajoittavan keksinnön piiriä, koska tässä vaatimusten avulla esitettyä reaktoria voidaan käyttää mittaamaan trombiinin tuotan-tonopeuksia, hyytymistekijöiden tuotantoa kokoplasmassa ja erilaisia fosfolipideistä riippuvaisia entsyymireaktioita.
t *
Claims (23)
1. Dynaaminen jatkuvavirtauksinen entsyymireaktori fosfolipi-deistä riippuvaisten entsymaattisten reaktioiden suorittami-seksi ja analysoimiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää putkimaisen osan, jonka sisäpinta on päällystetty tasomaisella fosfolipidikaksoiskerrosmembraanilla, kotelon ollessa liitettävissä toisesta sen aukosta laitteeseen, jolla syötetään nestemäiset virtausreagenssit siihen ja yhdistettävissä toisesta sen aukosta laitteeseen, jolla kerätään ja analysoidaan siitä pois virtaava neste.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen entsyymireaktori, tunnettu siitä, että kotelo on kapillaariputki.
3. Patenttivaatimusten 1-2 mukainen entsyymireaktori, tunnettu siitä, että kotelo on kapillaariputki, jonka sisähalkaisija on noin 0,1 - 1,1 mm ja pituus noin 1,0 -15 cm.
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen entsyymireaktori, tunnettu siitä, että fosfolipidimembraani käsittää ainakin yhden lisäkomponentin, joka on valittu ryhmästä, johon kuuluvat entsyymit ja entsyymien lisätekijät.
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen entsyymireaktori, tunnettu siitä, että lisätekijä on kudostekijä.
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen entsyymireaktori, tunnettu siitä, että fosfolipidimembraani sisältää neutraaleja ja happamia fosfolipidejä.
7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen entsyymireaktori, tunnettu siitä, että fosfolipidimembraani sisältää fosfa-tidyylikoliinia ja fosfatidyyliseriiniä. 1 Patenttivaatimuksen 1 mukainen entsyymireaktori, tunnettu siitä, että fosfolipidimembraani koostuu seoksesta, jossa on 60-100 % fosfatidyylikoliinia ja 0-40 %» fosfatidyy- 18 90254 liseriiniä.
9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen entsyymireaktori, tunnettu siitä, että fosfolipidimembraani koostuu seoksesta, jossa on 70 % fosfatidyylikoliinia ja 30 % fosfatidyyliserii-niä.
10. Patenttivaatimuksen 5 mukainen entsyymireaktori, t u n -n e t u siitä, että fosfolipidimembraani sisältää kudoste-kijää suhteessa noin 1-10 moolia kudostekijää kohti 100 000 moolia fosfolipidiä.
11. Menetelmä dynaamisten entsyymireaktioiden jatkuvaksi suorittamiseksi ja mittaamiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää seuraavat vaiheet: (a) syötetään reagensseja entsymaattisen reaktion suorittamiseksi määrätyllä virtausnopeudella dynaamisen jatkuvavirtauk-sisen entsyymireaktoriin sisäänmenoaukkoon, reaktorin koostuessa putkimaisesta osasta, joka on sisäpinnaltaan päällystetty tasomaisella fosfolipidikaksoiskerrosmembraanilla, jolloin reagenssit ja membraanikomponentit ovat erillisinä inaktiivisia entsymaattisen reaktion suorittamiseksi, mutta yhdessä antavat entsymaattisesti aktiivisen järjestelmän; (b) pumpataan reagenssit entsyymireaktorin läpi määrätyllä vakiovirtausnopeudella niin, että entsyymireaktorissa tapahtuu entsyymireaktio reagenssien joutuessa kosketuksiin fosfolipi-dimembraanin kanssa; (c) kerätään entsyymireaktion tuote entsyymireaktorin ulostu-loaukosta ulos virtaavasta nesteestä; ja (d) mitataan entsyymireaktion aikana muodostuneen tuotteen pitoisuus sopivilla koemenetelmillä.
12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että fosfolipidimembraani edelleen käsittää aina-kin yhden lisäkomponentin, joka on valittu ryhmästä, johon i9 90254 kuuluvat entsyymit ja entsyymien lisätekijät.
13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että lisätekijä on kudostekijä.
14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että reagenssit kostuvat veren hyytymistekijöistä ja kalsiumioneista.
15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että veren hyytymistekijät käsittävät veren hyytymistekijän, joka on valittu ryhmästä, johon kuuluvat tekijä VII ja tekijä VIIa, yhdessä ainakin yhden tekijän kanssa, joka on valittu ryhmästä, johon kuuluvat tekijä IX, tekijä X, tekijä V, tekijä VIII, protrombiini ja kokoplasma.
16. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että veren hyytymistekijät ovat tekijä VII ja tekijä IX.
17. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että veren hyytymistekijät ovat tekijä VIIa ja tekijä IX.
18. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että veren hyytymistekijät ovat tekijä VII ja X.
19. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että veren hyytymistekijät ovat tekijä VIIa ja .. . tekijä X.
20. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että veren hyytymistekijät ovat tekijä VII, tekijä X, tekijä V ja protrombiini.
21. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että veren hyytymistekijä on tekijä VIIa/ tekijä X, tekijä V ja protrombiini. * 20 90254
22. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että koemenetelmä tuotteen pitoisuuden mittaamiseksi valitaan ryhmästä, johon kuuluvat säteilymittaukset, kromogeeniset mittaukset ja fluorogeeniset mittaukset.
23. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että se edelleen käsittää sen, että lisätään kro-mogeenista tai fluorogeenista substraattia, joka on selektiivinen reaktion tuotteelle, ulos virtaavaan nesteeseen ennen muodostuneen tuotteen pitoisuuden mittaamista.
24. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että se edelleen käsittää entsyymireaktorista poisvirtaavan tuotevirran jakamisen siten, että useamman kuin yhden entsyymireaktorissa muodostuneen tuotteen pitoisuus voidaan mitata. 2i 90254
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/154,083 US4865984A (en) | 1988-02-08 | 1988-02-08 | Dynamic continuous flow enzyme reactor |
| US15408388 | 1988-02-08 | ||
| PCT/US1989/000397 WO1989007133A2 (en) | 1988-02-08 | 1989-02-01 | Dynamic continuous flow enzyme reactor |
| US8900397 | 1989-02-01 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI894472A0 FI894472A0 (fi) | 1989-09-21 |
| FI894472A FI894472A (fi) | 1989-09-21 |
| FI90254B true FI90254B (fi) | 1993-09-30 |
| FI90254C FI90254C (fi) | 1994-01-10 |
Family
ID=22549933
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI894472A FI90254C (fi) | 1988-02-08 | 1989-09-21 | Dynaaminen jatkuvavirtauksinen entsyymireaktori |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4865984A (fi) |
| EP (1) | EP0353291B1 (fi) |
| JP (1) | JP2756606B2 (fi) |
| AU (1) | AU607661B2 (fi) |
| CA (1) | CA1282361C (fi) |
| DK (1) | DK494989A (fi) |
| FI (1) | FI90254C (fi) |
| WO (1) | WO1989007133A2 (fi) |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5045479A (en) * | 1988-07-05 | 1991-09-03 | The Johns Hopkins University | Continuous flow competitive assay with reference system |
| GB9022938D0 (en) * | 1990-10-22 | 1990-12-05 | Biocompatibles Ltd | Non-thrombogenic surfaces |
| US5314695A (en) † | 1990-11-13 | 1994-05-24 | Corvas International, Inc. | Tissue factor based prothrombin time reagent |
| US6203816B1 (en) * | 1990-11-13 | 2001-03-20 | Corvas International, Inc. | Tissue factor based prothrombin time reagent |
| AU663343B2 (en) * | 1991-10-04 | 1995-10-05 | Dade Behring Inc. | Preparation of prothrombin time reagents from recombinant human tissue factor and purified natural and synthetic phospholipids |
| US5366869A (en) * | 1991-11-08 | 1994-11-22 | Sheldon Goldstein | Multiple coagulation test device and method |
| US6114135A (en) * | 1991-11-08 | 2000-09-05 | Goldstein; Sheldon | Multiple coagulation test system and method of using a multiple coagulation test system |
| AU696924B2 (en) * | 1994-04-28 | 1998-09-24 | Dade Behring Inc. | Calibrator for prothrombin time (PT) assays |
| US5731212A (en) * | 1994-12-20 | 1998-03-24 | International Technidyne Corporation | Test apparatus and method for testing cuvette accommodated samples |
| US20030232075A1 (en) * | 2002-05-06 | 2003-12-18 | University Of Minnesota, A Minnesota Corporation | Compositions for producing factor Xa |
| CN101151533A (zh) * | 2005-02-16 | 2008-03-26 | 伊利诺斯大学理事会 | 基于金属螯合脂质的促凝血剂 |
| ATE505488T1 (de) * | 2005-03-04 | 2011-04-15 | Univ Illinois | Modulator von coagulationskaskaden und fibrinolytischen kaskaden |
| WO2009046194A2 (en) * | 2007-10-05 | 2009-04-09 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Fibrin sealant |
| WO2009061697A1 (en) * | 2007-11-09 | 2009-05-14 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Anticoagulant antagonist and hemophilia procoagulant |
| US8372343B2 (en) * | 2007-12-07 | 2013-02-12 | Sheldon Goldstein | Multiple coagulation test cartridge and method of using same |
| BRPI0821158A2 (pt) | 2007-12-20 | 2015-06-16 | Novartis Ag | Método para fazer lentes de contato |
| EP3291208B1 (en) | 2016-08-31 | 2020-09-30 | Ricoh Company, Ltd. | Hydrogel structure, blood vessel, internal organ model, practice tool for medical procedure, and method of manufacturing the hydrogel structure |
| US10429377B1 (en) | 2019-03-15 | 2019-10-01 | Coagulation Sciences Llc | Coagulation test device, system, and method of use |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3785772A (en) * | 1971-12-08 | 1974-01-15 | Blowitz M | Blood analyzer |
| DE2967545D1 (en) * | 1979-06-11 | 1985-12-19 | Gambro Lundia Ab | A device for removal of substances from a liquid |
| US4452682A (en) * | 1980-10-24 | 1984-06-05 | Hitachi, Ltd. | Apparatus for measuring clinical emergency check items of blood |
| DE3311287A1 (de) * | 1983-03-28 | 1984-10-04 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Verfahren zur fotometrischen bestimmung der aktivierten partiellen thromboplastinzeit und reagenz dazu |
| US4604182A (en) * | 1983-08-15 | 1986-08-05 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Perfluorosulfonic acid polymer-coated indicator electrodes |
-
1988
- 1988-02-08 US US07/154,083 patent/US4865984A/en not_active Expired - Fee Related
-
1989
- 1989-02-01 JP JP1502293A patent/JP2756606B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-02-01 AU AU30604/89A patent/AU607661B2/en not_active Ceased
- 1989-02-01 EP EP89902462A patent/EP0353291B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-02-01 WO PCT/US1989/000397 patent/WO1989007133A2/en active IP Right Grant
- 1989-02-07 CA CA000590377A patent/CA1282361C/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-09-21 FI FI894472A patent/FI90254C/fi not_active IP Right Cessation
- 1989-10-06 DK DK494989A patent/DK494989A/da not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU607661B2 (en) | 1991-03-07 |
| WO1989007133A2 (en) | 1989-08-10 |
| AU3060489A (en) | 1989-08-25 |
| US4865984A (en) | 1989-09-12 |
| DK494989D0 (da) | 1989-10-06 |
| FI90254C (fi) | 1994-01-10 |
| EP0353291B1 (en) | 1993-01-27 |
| JPH02503057A (ja) | 1990-09-27 |
| DK494989A (da) | 1989-12-07 |
| EP0353291A1 (en) | 1990-02-07 |
| FI894472A0 (fi) | 1989-09-21 |
| JP2756606B2 (ja) | 1998-05-25 |
| WO1989007133A3 (en) | 1989-09-08 |
| CA1282361C (en) | 1991-04-02 |
| FI894472A (fi) | 1989-09-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI90254B (fi) | Dynaaminen jatkuvavirtauksinen entsyymireaktori | |
| Funk et al. | Reptilase®‐R—A New Reagent in Blood Coagulation | |
| US8551405B2 (en) | Electrophoretic interactive spectral methods and devices for the detection and/or characterization of biological particles | |
| JP4718833B2 (ja) | 複合生物媒体における、一時的なタンパク質分解活性の濃度を決定するための診断試験 | |
| JP2023017978A (ja) | 凝固分析を使用した抗凝固剤の検出および分類 | |
| JPH10500008A (ja) | 乾燥プロトロンビン時間アッセイ | |
| Duchemin et al. | A new assay based on thrombin generation inhibition to detect both protein C and protein S deficiencies in plasma | |
| Ząbczyk et al. | Assays of fibrin network properties altered by VKAs in atrial fibrillation–importance of using an appropriate coagulation trigger | |
| Zeibi Shirejini et al. | Current and future strategies to monitor and manage coagulation in ECMO patients | |
| WO1989008150A1 (en) | Method for measuring biological activity of antithrombin iii and reagents for the measurement | |
| JP5212821B2 (ja) | スペーサーを介して高分子へ結合する基質を含む修飾基質を用いた酵素測定アッセイ | |
| CA2039173C (en) | Factor ix chromogenic assay | |
| JP2009198506A (ja) | 血液凝固反応抑制血漿タンパク質の活性測定方法及び活性測定試薬 | |
| JP5176085B2 (ja) | プロテインｓ及びプロテインｃの活性測定方法並びに活性測定試薬 | |
| Owens et al. | Ethanol inhibition of thrombus formation on collagen-coated glass | |
| NO176574B (no) | Dynamisk kontinuerlig strömmende enzymreaktor | |
| Quien et al. | Plasma tissue factor antigen levels in capillary whole blood and venous blood: effect of tissue factor on prothrombin time | |
| US5114845A (en) | Assays for plasminogen activator inhibitor and soluble fibrin | |
| Novacek et al. | No evidence of activated blood coagulation in Crohn's disease | |
| WO2012124798A1 (ja) | 試料中の総プロテインｓの活性測定試薬及び活性測定方法 | |
| Tang et al. | Preliminary study of simultaneous multi-anticoagulant deficiency diagnosis by fiber optic multi-analyte biosensor | |
| EP0040601B1 (en) | Method for detecting proteolytic enzymes in blood | |
| RU2222019C2 (ru) | Способ контроля лечения непрямыми антикоагулянтами | |
| KOTLAREK | Optical biosensing of biomarkers in blood and plasma enabled by biocompatible polymer architectures | |
| Norén et al. | Value of blood coagulation tests in ischemic cerebral disease |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BB | Publication of examined application | ||
| MM | Patent lapsed | ||
| MM | Patent lapsed |
Owner name: MOUNT SINAI SCHOOL OF MEDICINE OF THE |