FI89506C - Foerfarande foer att frigoera cellkulturer fraon mikrobaerare - Google Patents

Description

1 39506

Menetelmä soluviljelmien irrottamiseksi mikrokantoaineista

Esillä olevan keksinnön kohteena on patenttivaati-5 muksen 1 johdanto-osan mukainen menetelmä.

Tämän menetelmän tarkoituksena on soluviljelmien talteenotto niiden lisääntymisen avulla, mikrokantoaineis-sa. Soluviljelmien suurempien määrien ylläpitämiseksi on välttämätöntä irrottaa nämä viljelmät ajoittain mikrokan-10 toaineista ja siirtää ne vapaisiin mikrokantoaineisiin. Aikaisemmin tämä toimenpide on suoritettu useina erinä (panoksittain). Mikrokantoaineita sisältävään säiliöön johdetaan trypsiiniä, joka irrottaa solut. Soluja, so. soluja sisältävää solulietettä, poistettaessa säiliöstä 15 odotetaan, kunnes pääasiassa kaikki solut on irrotettu mikrokantoaineista. Suuri prosenttimäärä soluja irtoaa sangen nopeasti ja viipyy siten pitkän ajan trypsiini-liuoksessa. Tällöin esiintyy se haitta, että trypsiini vaikuttaa epäedullisesti näihin soluihin. Erityisesti nii-20 den kasvu ja siirtymisreaktio uusiin mikrokantoaineisiin huononevat. Tästä tulee erityisen kriittinen tekijä suurempien solumäärien yhteydessä, joiden muodostamat viljelmät ovat epäyhtenäisiä ja jotka on laskettava sangen erilaisten irrotusnopeuksien mukaisella tavalla.

25 Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on tarjota käyttöön kuvatunlainen menetelmä, jonka yhteydessä tryp-siinin vaikutusaika irrotettuihin soluihin tulee rajoitetuksi minimiinsä.

Tämä tehtävä ratkaistaan keksinnön mukaisesti pa-30 tenttivaatimuksen 1 tunnusmerkillisen osan mukaisen menetelmän avulla.

Irrotut solut poistetaan tällöin trypsiiniliuoksen läpivirtausnopeutta vastaavalla nopeudella säiliöstä, jolloin vahingoittavaa vaikutusta ei esiinny. Trypsiiniliuok-35 sen läpivirtausta voidaan jatkaa tarpeen mukaan viimeisten 2 49506 soluviljelmien erottamiseen asti mikrokantoaineista. Tryp-siinin vaikutusaika irrotettuihin soluihin on kussakin vaiheessa suunnilleen yhtä lyhyt.

Trypsiiniliuoksen patenttivaatimuksen 2 mukainen 5 läpivirtaus sisältää sen edun, että mitään irtautuneita soluja ei pääse kerrostumaan säiliön pohja-alueelle, ja ne tulevat johdetuiksi pois virtaussuunnassa myös mikrokanto-aineen alueelta.

Patenttivaatimuksen 3 tunnusmerkilliset ominaisuu-10 det vastaavat erästä edullista menetelmäsovellutusta, jonka yhteydessä mikrokantoaineet tulevat kaikilta puolilta läpivirtaavan liuoksen huuhtelemiksi ja solujen irtautuminen kiihtyy.

Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmäsovellutus 15 sisältää sen edun, että sen yhteydessä trypsiiniliuos jakautuu tasaisesti osuen yhtenäisellä nopeudella mikrokan-toaineisiin ja niiden soluviljelmiin.

Patenttivaatimuksen 5 mukaisesti irrotetut solut johdetaan edullisesti edelleen toiseen tyhjään mikrokan-20 toainetta sisältävään säiliöön, jossa solut voivat heti ruveta lisääntymään.

Keksintö tarjoaa myös käyttöön patenttivaatimuksen 7 mukaisen menetelmän toteuttamista varten tarkoitetun laitteen, jonka avulla trypsiiniluoksen läpivirtaus tulee 25 mahdolliseksi.

Patenttivaatimuksen 8 mukainen edullinen sovellu- tusmuoto mahdollistaa pesupuskurinesteen läpivirtauksen ylhäältä alaspäin säiliön läpi ennen trypsiinin sisään syöttöä .

30 Käytetyn säiliön ja käytettyjen mikrokantoaineiden valmistamista uutta käyttökertaa varten helpottaa edullisesti patenttivaatimuksen 9 tunnusmerkillisen osan mukainen järjestely.

Keksinnön mukaista menetelmää selostetaan seuraa-35 vassa erään kaavamaisesti esitetyn laitesovellutuksen avulla (yksi kuvio).

3 4 9 506

Suljettuun säiliöön 1 on etäisyyden päähän sen pohjasta la asetettu läpäisevä sovite 2, esimerkiksi seula tai huokoinen levy. Tämän sovitteen 2 alapuolella säiliöön avautuu trypsiiniliuoksen syöttämistä varten tarkoitettu 5 syöttöjohto 3. Samoin säiliön seinäalueelle pohjan la ja sovitteen 2 väliin on muodostettu suljettava ulosvirtaus-aukko 4 pesupuskurinesteen poisjohtamista varten. Läpäisevän sovitteen 2 yläpuolella säiliöön 1 avautuu pesupuskurinesteen syöttöjohto 5 ja soluviljelmien lisääntymistä 10 varten tarkoitetun väliaineen syöttöjohto 6. Säiliössä kulkee edelleen ylhäältä irtautuneita soluja sisältävää suspensiota varten tarkoitettu poistojohto 7 sekä poisto-johto 8, viimeksimainitun johdon syöttöaukon ollessa suoraan sovitteen 2 päällä. Poistojohtoon 7 liittyy säiliön 15 ulkopuolella syöttöjohto 9. Poistojohtoon 7 on lisäksi liitetty kuviossa näkymätön imupumppu.

Säiliössä ulottuu edelleen ylhäältä sekoituselin 10, joka on kuviossa näkymättömällä tavalla laakeroitu säiliön ulkopuolelle käyttöä varten.

20 Läpäisevän sovitteen 2 päälle on asetettu pisteillä merkitty korkeudeltaan mielivaltainen mikrokantoaineiden 11 muodostama kerros. Tähän kerrokseen on ennen seuraavas-sa selostetun menetelmän aloittamista siirretty soluviljelmiä ja annettu niiden lisääntyä, kunnes mikrokantoker-25 ros 11 tulee täyteen niitä. Tämä vaihe voidaan todentaa ottamalla näyte haarakohdasta 12. Tämän jälkeen johdetaan läpivirtausmenetelmän yhteydessä ensin pesupuskuriliuos kulkemaan säiliön kautta, jolloin tämä liuos syötetään syöttöjohdon 5 välityksellä ja poistetaan samanaikaisesti 30 avatun poistoaukon 4 kautta. Aukon 4 sulkemisen jälkeen pumpataan säiliöön trypsiiniliuosta syöttöjohdon 3 välityksellä. Tämä liuos jaetaan kulkemaan läpäisevän sovitteen 2 läpi ja suunnataan kevyen ja tasaisen virtauspai-neen vallitessa mikrokantokerrokseen 11, joka kelluu täl-35 löin vapaasti. Trypsiinin vaikutuksesta soluviljelmät ir- 4 '39506 tautuvat mikrokantoaineista. Trypsiiniliuos johdetaan kulkemaan tämän läpivirtausmenetelmän yhteydessä ulos säiliöstä poistojohdon 7 kautta imupumpun välityksellä. Irronneet solut seuraavat välittömästi tätä virtausta ja 5 tulevat poistetuiksi säiliöstä. Syöttöjohdon 9 kautta syötetään samanaikaisesti väliainetta poistojohtoon 8, tämän väliaineen inaktivoidessa ja/tai erottaessa trypsiinin. Siten poisliotetut solut vapautuvat trypsiinin lisävaikutuksesta. Ne voidaan tällöin johtaa suoraan toiseen säili-10 öön, joka sisältää vapaita mikrokantoaineita.

Trypsiiniliuoksen läpivirtausta pidetään yllä niin kauan, että pääasiassa kaikki soluviljelmät tulevat irrotetuiksi ja siirretyiksi pois säiliöstä.

Trypsiiniliuoksen läpivirtausnopeus mitoitetaan si-15 ten, että mikrokantoaineet 11 tulevat kelluvaan tilaan, jolloin trypsiinliuos pääsee tunkeutumaan niihin kaikilta puolilta ja irrotetut solut voidaan siirtää nopeasti pois.

Soluviljelmien poistamisen jälkeen otetaan nyt pääasiassa tyhjät mikrokantoaineet pois säiliöstä poistojoh-20 don 8 välityksellä ja ne esikäsitellään sitten uutta käyttökertaa varten samoin kuin myös säiliö 6.

Sekoituselintä 10 voidaan tarvittaessa käyttää mik-rokantoaineiden nopeampaan sekoittamiseen pesupuskuri-liuoksen kanssa.

Claims (10)

1. Menetelmä soluviljelmien irrottamiseksi mikro-kantoaineista, jonka menetelmän yhteydessä soluja sisältä- 5 viä mikrokantoaineita sisältävään säiliöön syötetään tryp-siiniliuosta ja irrotetut solut johdetaan pois säiliöstä, tunnettu siitä, että trypsiiniliuos johdetaan lä-pivirtausmenetelmän avulla kulkemaan säiliön ja siten myös sen sisältämien mikrokantoaineiden kautta, jolloin irron- 10 neet solut voidaan siten samalla huuhtoa pois säiliöstä ja jolloin trypsiiniliuos inaktivoidaan ja/tai erotetaan lähdettyään säiliöstä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että trypsiiniliuos pumpataan al- 15 haalta ylöspäin säiliön läpi.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että trypsiiniliuoksen läpivir-tausnopeus mitoitetaan sellaiseksi, että mikrokantoaineet pysyvät kelluvassa tilassa.

4. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että trypsiiniliuos syötetään mikrokantoaineita sisältävälle säiliöalueelle alhaaltapäin läpäisevän sovitteen läpi.

5. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-4 mukainen 25 menetelmä, tunnettu siitä, että irrotetut soluviljelmät syötetään edelleen tyhjiä mikrokantoaineita sisältävään säiliöön.

5 'J 9 506

6 It 9506 jossa säiliössä on sen pohjasta (la) välimatkan päässä läpäisevä sovite (2) ja jossa trypsiiniliuoksen syöttöjoh-to (3) tulee säiliöön sovitteen (2) alapuolelta ja irtautuneita soluja sisältävän suspension poistojohto (7) läh-5 tee säiliöstä sovitteen (2) yläpuolelta, jolloin säiliön (1) ulkopuolella poistojohtoon (7) yhtyy syöttöjohto (9) trypsiiniliuosta inaktivoivaa väliainetta varten ja/tai trypsiinin erottamiseksi.

6. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että soluja sisältäviä 30 mikrokantoaineita sisältävän säiliön kautta johdetaan lä-pivirtausmenetelmän avulla kulkemaan pesupuskurinestettä ennen trypsiiniliuoksen syöttämistä.

7. Laite jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukaisen menetelmän suorittamiseksi, tunnettu siitä, että • 35 siihen kuuluu säiliö (1) mikrokantoaineita (11) varten,

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen laite, t u n -10 n e t t u siitä, että pesupuskurinestettä varten tarkoitettu syöttöjohto (5) avautuu ylemmälle säiliöalueelle ja että säiliön pohja-alueelle läpäisevän sovitteen (2) alapuolelle on muodostettu suljettava poistoaukko (4).

9. Patenttivaatimuksen 7 tai 8 mukainen laite, 15 tunnettu siitä, että mikrokantoaineiden (11) säiliöstä (1) poistamista varten tarkoitettu poistojohto (8) ulottuu tiiviisti sovitteen (2) päältä ylöspäin ja säiliöstä (1) ulos.

10. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 7-9 mukai-20 nen laite, tunnettu siitä, että säiliö (1) on varustettu läpäisevän sovitteen (2) yläpuolella olevalla haarakohdalla (12) näytteenottoa varten mikrokantoaineis-ta. 7 <9506