CN105238689A - 一种吹打细胞的装置及基于其的细胞传代培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种吹打细胞的装置及基于其的细胞传代培养方法。本发明的吹打细胞的装置包括2个细胞培养瓶、与细胞瓶契合的2个瓶塞和与瓶塞连接的2个打气泵，所述2个瓶塞均纵向贯穿插入3根管，分别为打气泵管、喷出管、回流管；其中打气泵管上端与打气泵相连，喷出管下端连接一个细针头，回流管下端连接有一个硅胶软管；一个瓶塞的喷出管上端、回流管的上端分别与同组的另一个瓶塞的回流管的上端、喷出管的上端相连。本发明装置的细胞传代培养中可通过交替开启2个瓶塞连接的打气泵，反复多次吹打细胞，减少细胞团块状，使细胞分布均匀，不易老化脱落，有利于细胞的传代培养，适用于工厂化规模化细胞培养。

Description

一种吹打细胞的装置及基于其的细胞传代培养方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，具体地，涉及一种吹打细胞的装置及基于该装置的细胞传代培养方法。
背景技术
细胞传代培养过程中，影响培养效果的因素除了消化液的选择、消化液的浓度、消化时间、温度外，还与细胞的来源、细胞的质量优劣以及传代过程中消化后的细胞是否团块状分布有关。尤其对于癌变细胞，基于其自身的特性，传代培养过程中非常容易呈团块状贴壁生长。例如PK-15细胞系来源于E.stlce于1955年11月从一个成年母猪肾培养物建立起来的PK2a细胞系，M.Harris和H.F.Ruddle1960年从PK2a的单细胞克隆中分离得到3个细胞系，其中一个定名为PK15，当时的染色体组型与正常的猪肾细胞差异不明显。但随着不断的传代，其染色体已经发生改变，不再保持原来细胞的二倍体组型，故又称异倍体细胞，这种癌变细胞具有很高的生长和增殖能力，可以无限地传代。但PK-15细胞在传代培养过程中细胞呈团块状贴壁生长，分布不均匀，且容易老化，圆缩脱落，不能连续传代。例如有报道在培养PK-15细胞时，使用0.05％的胰蛋白酶消化培养了48小时的PK-15细胞后，倒掉胰酶溶液，加入营养液后使用吸耳球吹打，并用力使劲旋转细胞瓶数次使细胞脱落得到细胞悬液，再将细胞悬液吸入新的细胞培养瓶中，适度摇晃后再上转瓶机或置于温箱中进行培养。这种方法培养的细胞由于细胞悬液中的细胞多数呈团块状，分布不均匀，在传代培养的过程中容易老化脱落，不仅导致细胞损耗较多，还不利于PK-15细胞的连续传代培养。
消除消化后细胞的团块状聚集，使细胞尽量呈现离散的均匀分布，使细胞与培养基质之间的附着消失是细胞传代培养技术普遍追求的目标。中国专利CN202440493U公开了一种新型细胞传代装置，采用吸耳球对瓶底细胞反复加压吹打，使成为单细胞悬液；中国专利CN202047058U公开了一种传代细胞分散、分装装置，通过反复挤压吸耳球实现对细胞分散分装的目的。可见现有技术消除细胞团块聚集的方式是主要是通过手工方式挤压吸耳球压缩空气吹打细胞，这些装置及其应用方式仅限于实验室规模的细胞传代培养，不利于节省人力物力。因此迫切需要一种新的适于规模化工厂化的细胞传代培养方法，同时克服细胞团块状分布的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种适于规模化工厂化的细胞传代培养方法。
本发明的另一目的在于提供一种吹打细胞的装置。
本发明提供的一种吹打细胞的装置，包括第1细胞瓶和第2细胞瓶、与2个细胞瓶分别契合的2个瓶塞、分别与2个瓶塞连接的2个打气泵；所述瓶塞均纵向贯穿插入3根管，分别为打气泵管、喷出管、回流管；其中打气泵管上端与打气泵相连，喷出管下端连接一个细针头，回流管下端连接一个软管；一个瓶塞的喷出管上端、回流管的上端分别与另一个瓶塞的回流管的上端、喷出管的上端相连。
在本发明的一个实施例中，所述的打气泵管、喷出管、回流管均为不锈钢管。打气泵管和回流管内径为10.0mm，喷出管内径为5.0mm；所述的细针头为中空细针头，内径为0.1mm；所述的软管为硅胶软管，内径为10.0mm。以上各管的规格参数可根据生产实际情况选择，不局限于本发明实施例提供的规格参数。
本发明的吹打细胞的装置中，一个瓶塞的喷出管上端、回流管的上端分别与同组的另一个瓶塞的回流管的上端、喷出管的上端通过管道相连通。
本发明的吹打细胞的装置在应用时，起初第1细胞瓶、第2细胞瓶中均含有消化后的细胞和营养液组成的细胞悬液，开启第1细胞瓶的瓶塞打气泵管连接的打气泵，细胞悬液由第1细胞瓶瓶塞的回流管前端的软管进入，从第2细胞瓶瓶塞的喷出管前段的细针头喷出进入第2细胞瓶；
关闭第1细胞瓶的瓶塞的打气泵，开启第2细胞瓶的瓶塞打气泵管连接的打气泵，细胞悬液由第2细胞瓶瓶塞的回流管前端的软管进入，从第1细胞瓶瓶塞的喷出管前段的细针头喷出进入第1细胞瓶；
如此交替开启2个瓶塞连接的打气泵，重复4-6次。
本发明提供了上述吹打细胞装置在细胞传代培养中的应用。
本发明提供了上述吹打细胞装置在生物制品制备中的应用。
本发明还提供了一种细胞的传代培养方法，包括以下步骤：
(1)将细胞生长良好的细胞瓶按每两瓶分为一组，标记为第1细胞瓶、第2细胞瓶；
(2)每个细胞瓶中加入消化液消化细胞；弃去消化液，加入营养液洗下贴壁细胞得细胞悬液；
(3)采用本发明上述的吹打细胞的装置吹打细胞悬液多次；
(4)细胞悬液吸入营养液瓶中，分装后培养。
其中，步骤(2)中加入营养液的量占细胞瓶总容积的2％-12％。本发明实施例中采用的消化液为胰酶溶液，浓度为0.025％。
其中，步骤(3)吹打细胞悬液的方法为：开启第1细胞瓶的瓶塞打气泵管连接的打气泵，细胞悬液由第1细胞瓶瓶塞的回流管前端的软管进入，从第2细胞瓶瓶塞的喷出管前段的细针头喷出进入第2细胞瓶；
关闭第1细胞瓶瓶塞的打气泵，开启第2细胞瓶瓶塞打气泵管连接的打气泵，细胞悬液由第2细胞瓶瓶塞的回流管前端的软管进入，从第1细胞瓶瓶塞的喷出管前段的细针头喷出进入第1细胞瓶；
如此交替开启2个瓶塞连接的打气泵，重复4-6次。优选地，重复5次。
上述方法中，打气泵的工作压力为0.01-0.03MPa，当工作压力为0.02MPa时，效果最好。
本发明的实施例中，提供了上述吹打细胞的装置在规模化传代培养PK-15细胞中的应用，包括以下步骤：
使用规格相同的第1细胞瓶和第2细胞瓶培养PK-15细胞后，加入胰酶消化细胞；弃去胰酶，加入营养液洗下贴壁细胞得细胞悬液，采用上述装置吹打细胞悬液，方法为：开启第1细胞瓶的瓶塞打气泵管连接的打气泵，细胞悬液由第1细胞瓶瓶塞的回流管前端的软管进入，从第2细胞瓶瓶塞的喷出管前段的细针头喷出进入第2细胞瓶；
关闭第1细胞瓶的瓶塞的打气泵，开启第2细胞瓶的瓶塞打气泵管连接的打气泵，细胞悬液由第2细胞瓶瓶塞的回流管前端的软管进入，从第1细胞瓶瓶塞的喷出管前段的细针头喷出进入第1细胞瓶；
如此交替开启2个瓶塞连接的打气泵，重复4-6次；将吹打后的细胞悬液吸入营养液瓶中，分装后培养。
本发明方法与现有技术方法相比，增加了吹打消化后细胞悬液的步骤，并且通过打气泵带动吹打细胞的装置，用力均匀，反复吹打可使细胞团块减少，细胞分布均匀，不容易老化脱落，可连续传代20-25代，大大节省了人力，完全满足工厂化规模化生产细胞以及后续用于制备生物制品的要求。
附图说明
图1为本发明吹打细胞装置中的单个瓶塞及其连接部件的剖面图，其中1为瓶塞，2、3、4分别为打气泵管、喷出管、回流管，5为细针头，6为硅胶软管。
图2为本发明吹打细胞装置的剖面图，其中1、9为瓶塞；2、3、4分别为打气泵管、喷出管、回流管；10、11、12分别为喷出管、回流管、打气泵管；5、13为细针头，6、14为硅胶软管；7为第1打气泵、15为第2打气泵；8、16为第1细胞瓶和第2细胞瓶。
图3A为未经吹打的细胞悬液显微镜下图片，图3B为经过本发明吹打细胞装置吹打的细胞悬液显微镜下图片。
图4A、图4C为现有技术方法(未增加吹打步骤)制备的细胞悬液培养24h和48h的生长情况，图4B、图4D为采用本发明的吹打细胞的装置吹打后的细胞悬液培养24h和48h的细胞生长情况。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1本发明的吹打细胞装置的构造
如图2所示，吹打细胞的装置：包括第1细胞瓶8和第2细胞瓶16，与第1细胞瓶8契合的瓶塞1、与第2细胞瓶16契合的瓶塞9,通过打气泵管2与瓶塞1连接的打气泵7，通过打气泵管12与瓶塞9连接的打气泵15；
瓶塞1纵向贯穿插入3根管，分别为打气泵管2、喷出管3、回流管4；瓶塞9纵向贯穿插入3根管，分别为喷出管10、回流管11、打气泵管12；
在本实施例中，打气泵管、喷出管、回流管均为不锈钢管，其中打气泵管和回流管内径为10.0mm，喷出管内径为5.0mm；
其中打气泵管2上端与打气泵7相连，打气泵管12上端与打气泵15相连；
喷出管3下端连接一个细针头5，喷出管10下端连接一个细针头13；细针头为中空细针头，本实施例采用的细针头内径为0.1mm；软管为硅胶软管，内径为10.0mm。
回流管4下端连接一个硅胶软管6；回流管11下端连接一个硅胶软管14；
喷出管3上端与回流管11的上端通过管道连接；
回流管4的上端与喷出管10的上端相连。
实施例2采用本发明的吹打细胞装置进行PK15细胞的传代培养
(1)将培养48h的PK15细胞下架，按组号排列，同一个组号的2瓶细胞放在一起，分别标记为第1细胞瓶和第2细胞瓶；2个细胞瓶均为1.5万ml瓶。
(2)逐瓶消化细胞：将细胞废液倒掉，加入约50ml胰酶溶液(胰酶浓度为0.025％)，旋转细胞瓶数次，让胰酶浸润到所有细胞，倒掉胰酶溶液，再次加入50ml胰酶溶液，旋转细胞瓶数次，倒掉胰酶溶液。
(3)当细胞消化到一定程度时，往每个细胞瓶加入约1000ml营养液(营养液配方为：MEM9.4g、青霉素钾0.13g、硫酸链霉素0.28g、谷氨酰胺0.3g、碳酸氢钠2.25g、新生犊牛血清100ml、注射用水加至1000ml，pH值调至7.2。)，旋转细胞瓶数次将细胞洗下。
(4)将如图1所示的瓶塞分别塞在2个细胞瓶上，再如图2所示连接好两个瓶塞。开启打气泵7，压力为0.02MPa，细胞悬液从第1细胞瓶的硅胶软管6进入，从第2细胞瓶的细针头13喷出；关闭打气泵7，开启打气泵15，细胞悬液从第2细胞瓶的硅胶软管14进入，从细针头5喷出。如此反复5次，完成细胞吹打过程。细胞悬液的显微镜下照片如图3B所示，多为单个细胞，且分布均匀。同时设对照试验，将步骤(3)得到的未经本发明的吹打细胞装置吹打的细胞悬液于显微镜下观察，如图3A所示，细胞呈现团块状，且分布不均匀。
(5)将两种方法得到的细胞悬液分别吸入营养液瓶，摇匀后进行分装，各分装4个1.5万ml细胞瓶，每瓶分装量为1200ml。同时各分装1个75cm2一次性细胞方瓶，每瓶分装量为20ml。
(6)适度摇晃细胞瓶，1.5万ml细胞瓶上转瓶机进行培养，培养温度为37℃，转瓶机转速为8r/h。一次性细胞方瓶静置培养，培养温度为37℃。
实施例3本发明方法与现有技术方法(未增加吹打步骤)的效果比较
(1)用本发明方法与现有技术方法(未增加吹打步骤)制备的细胞悬液(来自实施例2中的一次性细胞方瓶)培养24h和48h的生长情况如图4A-图4D所示。
培养24h时，现有技术方法制备的细胞不能完全铺满，且有较多团块，见图4A。采用本发明的吹打细胞的装置吹打后的细胞悬液培养得到的细胞能完全铺满培养面，几乎无团块，见图4B。
培养48h时，现有技术方法制备的细胞虽能铺满培养面，但仍有大量团块聚集，见图4C。采用本发明的吹打细胞的装置吹打后的细胞悬液培养得到的细胞生长情况良好，几乎无团块，见图4D。
(2)从连续传代情况来看，本发明方法制备的细胞可连续传代20-25代，能够满足规模化工厂化生产细胞的要求；相对于现有技术方法制备的细胞仅可连续传代3-5代难以用于大规模细胞生产取得了显著的技术效果。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种吹打细胞的装置，其特征在于，包括第1细胞瓶和第2细胞瓶、与2个细胞瓶分别契合的2个瓶塞、分别与2个瓶塞连接的2个打气泵；所述瓶塞均纵向贯穿插入3根管，分别为打气泵管、喷出管、回流管；其中打气泵管上端与打气泵相连，喷出管下端连接一个细针头，回流管下端连接一个软管；一个瓶塞的喷出管上端、回流管的上端分别与另一个瓶塞的回流管的上端、喷出管的上端相连。
2.如权利要求1所述的吹打细胞的装置，其特征在于，所述的打气泵管、喷出管、回流管均为不锈钢管；所述的细针头为中空细针头；所述的软管为硅胶软管。
3.如权利要求1所述的吹打细胞的装置，其特征在于，一个瓶塞的喷出管上端、回流管的上端分别与同组的另一个瓶塞的回流管的上端、喷出管的上端通过管道相连通。
4.如权利要求1-3任一所述的吹打细胞的装置，其特征在于，该装置在应用时，起初第1细胞瓶、第2细胞瓶中均含有消化后的细胞和营养液组成的细胞悬液，开启第1细胞瓶瓶塞打气泵管连接的打气泵，细胞悬液由第1细胞瓶瓶塞的回流管前端的软管进入，从第2细胞瓶瓶塞的喷出管前段的细针头喷出进入第2细胞瓶；
关闭第1细胞瓶的瓶塞的打气泵，开启第2细胞瓶瓶塞打气泵管连接的打气泵，细胞悬液由第2细胞瓶瓶塞的回流管前端的软管进入，从第1细胞瓶瓶塞的喷出管前段的细针头喷出进入第1细胞瓶；
如此交替开启2个瓶塞连接的打气泵，重复4-6次。
5.权利要求1-4任一所述的吹打细胞装置在细胞传代培养中的应用。
6.权利要求1-4任一所述的吹打细胞装置在生物制品制备中的应用。
7.一种细胞的传代培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将细胞生长良好的细胞瓶按每两瓶分为一组，标记为第1细胞瓶、第2细胞瓶；
(2)每个细胞瓶中加入消化液消化细胞；弃去消化液，加入营养液洗下贴壁细胞得细胞悬液；
(3)采用权利要求1-4任一所述的吹打细胞的装置吹打细胞悬液多次；
(4)细胞悬液吸入营养液瓶中，分装后培养。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)中加入营养液的量占细胞瓶总容积的2％-12％。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(3)吹打细胞悬液的方法为：开启第1细胞瓶瓶塞打气泵管连接的打气泵，细胞悬液由第1细胞瓶瓶塞的回流管前端的软管进入，从第2细胞瓶瓶塞的喷出管前段的细针头喷出进入第2细胞瓶；
关闭第1细胞瓶的瓶塞的打气泵，开启第2细胞瓶瓶塞打气泵管连接的打气泵，细胞悬液由第2细胞瓶瓶塞的回流管前端的软管进入，从第1细胞瓶瓶塞的喷出管前段的细针头喷出进入第1细胞瓶；
如此交替开启2个瓶塞连接的打气泵，重复4-6次。
10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，打气泵的工作压力为0.01-0.03MPa。
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