CN202925027U - 一种大规模封闭式原代细胞制备装置 - Google Patents

Abstract

一种大规模封闭式原代细胞制备装置，包括组织消化单元⑴、细胞分散单元⑴、细胞过滤单元⑶、细胞盛装单元⑷以及动力系统，各单元之间、各单元内部通过硅胶管、多通管相连通。其优点在于：本装置使用管线连接各个功能单元，使用空气过滤器保证进入体系的气体是无菌的，连为一体的装置使得原代细胞的制备全程是相对密闭的，减少了内容物与外环境接触的次数，比传统原代细胞制备的操作方法降低了污染几率；降低了人工操作的劳动强度，比传统操作方法提高了工作效率，放大了生产规模；使用了自体循环，模拟吹打法制备原代细胞，对细胞的损伤小，所获细胞的活力高。本装置可用于生物制品行业大规模制备原代细胞。

Description

一种大规模封闭式原代细胞制备装置

技术领域

本实用新型涉及生物制品的生产装置，具体涉及一种大规模封闭式原代细胞制备装置。

背景技术

原代细胞是人们掌握较早的用于病毒培养的基质，在生物制品生产中有着广泛的应用。多种疫苗可应用原代细胞进行制备，包括原代沙鼠肾细胞制备的流行性出血热疫苗、原代牛睾丸细胞制备的猪瘟疫苗、原代地鼠肾细胞制备的乙脑疫苗、原代鸡胚成纤维细胞制备的鸡马立克氏病疫苗等。

由此，原代细胞的制备是某些生物制品生产的基础。尽管组织不同、需求量不同、条件不同，使得原代细胞的制备方法差异很大，但原代细胞制备的基本流程相同，即无菌采集组织，洗液将组织内的血液洗去，胰酶将组织消化分散成疏松的结构，细胞间连接不再紧密，加入血清中和胰酶，在外力作用下，分散出单个细胞，过滤将单个细胞和仍处于结团状态的细胞分离，过滤得到的单个细胞即为目的细胞。

在传统方法中，各个步骤涉及的操作多是开放的，每次加入液体、排出液体都要将盛装组织和/或细胞的容器敞开瓶口，倾倒液体或吸管转移液体。这样组织和/或细胞会与外环境（空气）接触，且操作涉及了多次的液体加入和排出过程。唯一控制无菌的方法是净化空气，降低外环境中的尘埃粒子数，做好环境消毒。但即使在GMP车间，百级环境操作，污染也时有发生。

再者，传统方法用吸管手动吹打细胞，使细胞分散，处理量往往很小，单次最多不过100ml，不适宜大规模制备原代细胞。而生物制品的生产往往对细胞的需求量较大，所以很多生物制品的制备首选易于放大的传代细胞系，但某些生物制品的制备尚未找到理想的可替代原代细胞的传代细胞系，比如鸡马立克氏病疫苗仅能使用原代鸡胚成纤维细胞进行生产。

已有生物反应器悬浮培养传代细胞系制备的生物制品上市，但在原代细胞制备方面却未有长足进展。究其原因，原代细胞的大规模制备技术是其瓶颈之一。

实用新型内容

本实用新型的目的是提供一种大规模封闭式原代细胞制备装置，能够为通过动物组织制备原代细胞提供一个密闭无菌环境，且可以实现大规模制备，动物组织在本装置中经过连续操作，最终获得原代细胞。

具体地，本实用新型提供一种大规模封闭式原代细胞制备装置，包括组织消化单元1、细胞分散单元2、细胞过滤单元3、细胞盛装单元4以及动力系统，各单元之间、各单元内部通过硅胶管、多通管相连通，其中：

所述组织消化单元1，包括组织进入端口101、洗液存放容器102、消化液存放容器103、废液存放容器104、消化容器105、空气过滤器5、硅胶管和连接头；所述洗液存放容器102、消化液存放容器103、废液存放容器104、消化容器105上设带有穿通盖体的中空不锈钢管道的密封盖；

所述洗液存放容器102的密封盖设有3根管道，第一管道1021上口和硅胶管相连，继而硅胶管和空气过滤器5相连；第二管道1022上口和硅胶管相连，继而硅胶管和连接头相连；第二管道1022下口和硅胶管相连，第三管道1023下口和硅胶管相连；

所述消化液存放容器103的密封盖设有3根管道，第一管道1031上口和硅胶管相连，继而硅胶管和空气过滤器5相连；第二管道1032上口和硅胶管相连，继而硅胶管和连接头相连；第二管道1032下口和硅胶管相连，第三管道1033下口和硅胶管相连；

所述废液存放容器104的密封盖设有2根管道，第一管道1041上口和硅胶管相连，继而硅胶管和空气过滤器5相连；第二管道1042下口和硅胶管相连；

所述消化容器105的密封盖设有2根管道，第一管道1051上口和硅胶管相连，继而硅胶管和空气过滤器5相连；第二管道1052下口和硅胶管1053相连；

所述细胞分散单元2，包括培养基存放容器201、细胞分散容器202、空气过滤器5、硅胶管和连接头；所述培养基存放容器201、细胞分散容器202上设带有穿通盖体的中空不锈钢管道的密封盖；

所述培养基存放容器201的密封盖设有3根管道，第一管道2011上口和硅胶管相连，继而硅胶管和空气过滤器5相连；第二管道2012上口和硅胶管相连，继而硅胶管和连接头相连；第二管道2012下口和硅胶管相连，第三管道2013下口和硅胶管相连；

所述细胞分散容器202的密封盖设有4根管道，第一管道2021上口和硅胶管相连，继而硅胶管和空气过滤器5相连；第二管道2022下口和硅胶管相连；下口为粗端口的第三管道2023和下口为细端口的第四管道2024在容器内的长度为细胞分散容器高度的1/3-1/2，且粗、细两端口的出口朝向细胞分散容器202的容器内壁。

所述细胞过滤单元3，包括两个以上细胞过滤器301，所述细胞过滤器301包括漏斗形外壁3011、过滤层3012、圆台形过滤层支架3013、过滤器支架3014以及带有穿通盖体的中空不锈钢管道3015的密封盖；所述圆台形过滤层支架3013由两个不同直径的圆形铁圈通过4个支杆相连而成，直径较大的圆形铁圈用于固定过滤层3012；

所述细胞盛装单元4，包括细胞盛装容器401、取样瓶402、空气过滤器5、硅胶管和连接头；所述细胞盛装容器401、取样瓶402上设带有穿通盖体的中空不锈钢管道的密封盖；所述细胞盛装容器401的密封盖设有3根管道，第一管道4011上口和硅胶管相连，继而硅胶管和空气过滤器5相连；第二管道4012下口和硅胶管相连，第三管道4013下口和硅胶管相连；所述取样瓶402的密封盖设有2根管道，第一管道4021上口和硅胶管相连，继而硅胶管和空气过滤器5相连；第二管道4022下口和硅胶管相连；

所述动力系统包括磁力搅拌组件，蠕动泵和/或微型气泵；所述磁力搅拌组件包括位于消化容器105内的磁力搅拌子601和位于消化容器105下方的磁力搅拌器602；

所述多通管包括第一三通管701、第二三通管702、第一四通管703、第二四通管704、第三四通管705、五通管706、六通管707，其连接方式如下：

所述六通管707通过硅胶管分别和组织进入端口101、洗液存放容器102的第三管道1023上口、消化液存放容器103的第三管道1033上口、消化容器105的第二管道1052上口、第一三通管701、废液存放容器104的第二管道1042上口相连；

所述第一三通管701通过硅胶管分别和六通管707、细胞分散容器202的第三管道2023上口、第一四通管703相连；

所述第一四通管703通过硅胶管分别和第一三通管701、细胞分散容器202的第二管道2022上口、第二四通管704、五通管706相连；

所述第二四通管704通过硅胶管分别和第一四通管703、细胞分散容器202的第四管道2024上口、培养基存放容器201的第三管道2013上口、第三四通管705相连；

所述第三四通管705通过硅胶管分别和第二四通管704、各细胞过滤器301的中空不锈钢管道3015上口相连；

所述五通管706通过硅胶管分别和第一四通管703、各细胞过滤器301的漏斗形外壁3011出液口、细胞盛装容器401的第二管道4012上口相连；

所述第二三通管702通过硅胶管分别和细胞盛装容器401的第三管道4013上口、取样瓶402的第二管道4022上口、供分装用的连接头相连。

所述密封盖，包括塑料外盖、带有穿通盖体的中空不锈钢管道的不锈钢内盖和密封圈，密封盖与所密封的容器为螺纹连接。

所述细胞分散容器202的第三管道2023出口内径为3-5mm，第四管道2024出口内径为1-3mm。

所述消化容器105和细胞分散容器202为圆底容器，下设支架。

所述洗液存放容器102、消化液存放容器103、培养基存放容器201上的连接头与过滤除菌设备上配置的连接头为插拔相连或螺纹相连。

所述细胞盛装单元4所配有的连接头为供分装用的连接头，所述连接头与细胞盛装单元以外的后续细胞盛装容器的连接头呈插拔相连或螺纹相连。

所述洗液存放容器102的第三管道1023下口设置的硅胶管、消化液存放容器103的第三管道1033下口设置的硅胶管、培养基存放容器201的第三管道2013下口设置的硅胶管、细胞分散容器202的第二管道2022下口设置的硅胶管、细胞盛装容器401的第三管道4013下口设置的硅胶管，其长度深达容器底部。

所述洗液存放容器102的第二管道1022下口设置的硅胶管、消化液存放容器103的第二管道1032下口设置的硅胶管、废液存放容器104的第二管道1042下口设置的硅胶管、培养基存放容器201的第二管道2012下口设置的硅胶管、细胞盛装容器401的第二管道4012下口设置的硅胶管、取样瓶402的第二管道4022下口设置的硅胶管，其管口高于容器内液面高度。

所述消化容器105的第二管道1052下口连接的硅胶管1053，其管口距容器底部2-5cm。

本实用新型一种大规模封闭式原代细胞制备装置及其应用方法的有益效果在于：

本实用新型的原代细胞制备装置使用管线连接各个功能单元，使用空气过滤器保证进入体系的气体是无菌的，连为一体的装置使得原代细胞的制备全程是相对密闭的，减少了内容物与外环境接触的次数，比传统原代细胞制备的操作方法降低了污染几率；

本实用新型的原代细胞制备装置使用动力系统进行组织和液体的流转、组织和液体的混合、细胞分散，降低了人工操作的劳动强度，比传统操作方法提高了工作效率，放大了生产规模；

本实用新型的原代细胞制备装置使用了自体循环，模拟吹打法制备原代细胞，对细胞的损伤小，所获细胞的活力高。

本装置可用于生物制品行业大规模制备原代细胞。

附图说明

图1为本实用新型制备装置的结构示意图。

图2为本实用新型制备装置中消化液存放容器的剖面结构示意图。

图3为本实用新型制备装置中利用物理力量分散细胞时用到的粗细端口的不锈钢钢管的剖面图。

图4为本实用新型制备装置中细胞过滤器的圆台形过滤层支架的结构示意图。

图5为本实用新型制备装置中细胞过滤器的结构示意图。

图中标记：1为组织消化单元，2为细胞分散单元，3为细胞过滤单元，4为细胞盛装单元，5为空气过滤器；

101为组织进入端口，102为洗液存放容器，103为消化液存放容器，104为废液存放容器，105为消化容器；

1021为洗液存放容器的第一管道，1022为洗液存放容器的第二管道，1023为洗液存放容器的第三管道；

1031为消化液存放容器的第一管道，1032为消化液存放容器的第二管道，1033为消化液存放容器的第三管道；

1041为废液存放容器的第一管道，1042为废液存放容器的第二管道；

1051为消化容器的第一管道，1052为消化容器的第二管道，1053为硅胶管；

201为培养基存放容器，202为细胞分散容器；

2011为培养基存放容器的第一管道，2012为培养基存放容器的第二管道，2013为培养基存放容器的第三管道；2021为细胞分散容器的第一管道，2022为细胞分散容器的第二管道，2023为细胞分散容器的第三管道，2024为细胞分散容器的第四管道；

301为细胞过滤器，3011为漏斗形外壁，3012为过滤层，3013为圆台形过滤层支架，3014为过滤器支架，3015为中空不锈钢管道；

401为细胞盛装容器，402为取样瓶；4011为细胞盛装容器的第一管道，4012为细胞盛装容器的第二管道，4013为细胞盛装容器的第三管道；4021为取样瓶的第一管道，4022为取样瓶的第二管道；

601为磁力搅拌子，602为磁力搅拌器；

701为第一三通管，702第二三通管，703为第一四通管，704为第二四通管，705为第三四通管，706为五通管，707为六通管；

8为控制夹，①-                                                

表示控制夹的序号。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本实用新型作进一步说明。应当理解的是，这些实施例仅仅是用于进一步解释和说明本实用新型，其不应被理解为是对本实用新型保护范围的限制。

本实用新型的大规模封闭式原代细胞制备装置由六个部分组成，包括组织消化单元1、细胞分散单元2、细胞过滤单元3、细胞盛装单元4、各单元内和/或各单元间的连接管线、动力系统。各单元用到的容器可由市售补料瓶做细部改动得来，每个容器配有一个空气过滤器5，用于过滤空气，保证装置内部无菌。各单元内和/或各单元间通过不锈钢三通管（701、702）、不锈钢四通管(703、704、705)、不锈钢五通管706、不锈钢六通管707和硅胶管连接。组织、细胞、液体在各单元间和/或单元内流转是由蠕动泵和/或微型气泵提供动力实现。细胞分散容器202设计了自体循环，组织和/或细胞液吹打容器瓶体内壁，机械力量促使已经消化疏松的组织和/或细胞团分散成单个细胞，使用两个管口直径不同的不锈钢管道2023、2024进行吹打分散，先用粗端口，再用细端口，既可避免堵塞，又能够达到较高的冲击力度。

具体地，本实用新型提供一种大规模封闭式原代细胞制备装置，其由六部分组成，包括，组织消化单元1、细胞分散单元2、细胞过滤单元3、细胞盛装单元4、各单元内和/或各单元间的连接管线、动力系统，其中：

组织消化单元1由组织进入端口101、洗液存放容器102、消化液存放容器103、废液存放容器104、消化容器105组成；其中，组织经组织进入端口流转到消化容器，洗液、消化液则分别由洗液存放容器、消化液存放容器流转到消化容器，消化容器中用毕废弃的洗液或消化液则再由消化容器流转到废液存放容器；消化好的组织上清经流转转移到细胞分散单元2；

细胞分散单元2由培养基存放容器201和细胞分散容器202组成；其中，培养基存放容器201中的培养基经流转与由消化容器流转过来的消化好的组织上清的混合液先后进入细胞分散容器202，此时培养基中的血清能够中和消化液，使消化液不再有消化活力；所述细胞分散容器202设有出口端一粗一细的两个不锈钢管道2023、2024，钢管出口端正对细胞分散容器202的容器内壁，由此，所述混合液先后经粗细端口不锈钢钢管在细胞分散容器内自体循环，所述混合液冲击吹打细胞分散容器内壁，借助冲击吹打细胞分散容器内壁的力量，消化好的组织进一步分散为单个细胞；在细胞分散单元2分散后，所述混合液经流转进入细胞过滤单元3；

细胞过滤单元3由多个独立的细胞过滤器301组成，使用时各细胞过滤器301逐个使用，可避免因堵塞引发的滤速减慢；细胞过滤单元3用于将经细胞分散单元2流转过来的混合液中的单个细胞与未分散的组织块儿分开，经细胞过滤器301过滤后，细胞流转到细胞盛装单元4；

细胞盛装单元4由细胞盛装容器401、取样瓶402、连接头组成，其中，细胞盛装容器401用于盛装或保存制备好的原代细胞，取样瓶402则用于取样计数细胞密度，根据需要将细胞稀释到适宜浓度；

各单元内和/或各单元间的连接管线总计由2个不锈钢三通管(701、702)、3个不锈钢四通管(703、704、705)、1个不锈钢五通管706、1个不锈钢六通管707和若干硅胶管组成，根据需要硅胶管上配有控制硅胶管通路的控制夹8；连接管线将各单元内和/或各单元间的各组件相互连接后，之间无断开或敞口的环节,由此实现原代细胞制备全程为封闭式操作；

动力系统由蠕动泵、微型气泵、磁力搅拌组件组成，其中磁力搅拌组件由磁力搅拌器602和磁力搅拌子601组成；组织、细胞、各种溶液（即消化液、洗液、培养基）、以及废液在单元间和/或单元内流转均由蠕动泵和/或微型气泵提供动力实现，消化容器内容物混合由磁力搅拌组件提供动力实现；

所述组织消化单元1、细胞分散单元2、细胞过滤单元3、细胞盛装单元4中所包含的各个容器为有盖容器，容器盖子与容器瓶体上部的瓶口呈螺纹密封相连；且容器盖子上设有穿通盖体的中空不锈钢钢管,由此与各单元内和/或各单元间的连接管线连接,从而实现各单元内和/或各单元间物质的流转。

装置内部与外部的气体流通要通过空气过滤器5过滤，在气体进入的同时将装置外部空气中的灰尘、细菌拦截在装置外，由此实现装置内部的原代细胞制备全程为无菌操作。

在本实用新型的优选技术方案中，所述培养基存放容器和细胞盛装容器的体积根据需求设置，所述取样瓶容积为100ml-250ml，其余各容器容积为5L-10L。

所述洗液存放容器102、消化液存放容器103、废液存放容器104、消化容器105、培养基存放容器201、细胞分散容器202、细胞盛装容器401、取样瓶402的瓶口设计同补料瓶的瓶口设计，容器盖子内径5cm-10cm，容器盖子外径为在容器盖子内径基础上增加1cm，容器盖子与容器瓶体上口以螺纹方式连接，容器盖子的组成包括塑料外盖、不锈钢内盖、密封圈，其中在不锈钢内盖上设有穿通盖体的中空不锈钢钢管，用于组织、细胞、各种溶液（即消化液、洗液、培养基）、以及废液在各单元内和/或各单元间的流转。

所述洗液存放容器102、消化液存放容器103、废液存放容器104、消化容器105、培养基存放容器201、细胞分散容器202、细胞盛装容器401、取样瓶402都设有进气口和/或排气口，所述进气口和/或排气口设计为，由各容器盖子上的一根穿通容器盖体的中空不锈钢钢管连接硅胶管后再连接空气过滤器5，如此保证了装置使用过程中内部不会进入有菌的空气。

在本实用新型的优选技术方案中，所述洗液存放容器102、消化液存放容器103、培养基存放容器104分别设置有供洗液、消化液或培养基溶液进入的连接头，洗液存放容器102、消化液存放容器103、培养基存放容器104上的连接头与过滤除菌设备上配置的连接头是可以插拔相连的或螺纹相连的。

在本实用新型的优选技术方案中，所述细胞盛装单元4所配有的连接头是供分装用的连接头，其能够与细胞盛装单元4以外的后续细胞盛装容器的连接头呈插拔相连或螺纹相连。

在本实用新型的优选技术方案中，所述消化容器105和细胞分散容器202采用圆底设计，并且消化容器105内放置一枚磁力搅拌子601，使用时消化容器105置于磁力搅拌器602上，便于混合消化容器105内的混合液，使用磁力搅拌组件还便于对消化容器内的混合液加热控温。

在本实用新型的优选技术方案中，在所述细胞分散容器202内，设有的两个不锈钢钢管通过动力系统使消化好的组织先后通过粗细端口的不锈钢管管2023、2024撞击容器壁，机械力量使组织分散成单个细胞，其中，粗细端口的内径分别为4mm和2mm。

组织、细胞能够在细胞分散容器内循环撞击容器内壁，此即为自体循环。

洗液存放容器102、消化液存放容器103、废液存放容器104、培养基存放容器201、细胞盛装容器401、取样瓶402的进液管不会接触到液面；洗液存放容器102、消化液存放容器103、培养基存放容器201、细胞盛装容器401的出液管深达瓶底；消化容器105的进液管同时也是出液管，管口距瓶底2-5cm；细胞分散容器202的进液管同时也是出液管，管子深达瓶底；进液管或出液管的长短通过连接在容器盖子的中空不锈钢钢管上的硅胶管来进行控制。

在本实用新型的优选技术方案中，其中细胞过滤单元3的细胞过滤器301由漏斗形外壁3011、带有穿通盖体的中空不锈钢管道3015的密封盖、圆台形过滤层支架3013、过滤层3012以及过滤器支架3014共五个部分组成，其中：

细胞过滤器的外壁3011形似漏斗，漏斗大口端有螺口，可与配套盖子螺纹相连，漏斗出口外径同不锈钢钢管外径，便于与硅胶管连接；

细胞过滤器的连有1根中空不锈钢管道3015的盖子的形状与补料瓶的盖子相似，内径为15cm-25cm，外径比内径增加1cm；

细胞过滤器的圆台形过滤层支架3013由大小两个圆形铁圈通过4个支架相连，大小以可以稳定贴于漏斗形外壁3011为准，上口圆形铁圈有固定过滤层3012的作用；

过滤层3012为纱布或铜网，其中心下凹，使未过滤的液体不会未经过滤就流到下一环节；

细胞过滤器的过滤器支架3014支撑漏斗形外壁3011。

在本实用新型的优选技术方案中，装置中用于管线连接的不锈钢钢管和多通管的内径为6mm，外径为7mm，硅胶管的内径为6.4mm，外径为8mm。

在本实用新型的优选技术方案中，该装置使用前要经过121℃、30min湿热灭菌；各连接头在灭菌前用硫酸纸或牛皮纸包裹，使用前拆掉硫酸纸或牛皮纸包裹；灭菌时各容器盖子与容器瓶体间是旋松的，细胞过滤器盖子与圆锥体外壁是旋松的，灭菌结束后立即旋紧；控制夹在灭菌后使用前安装；蠕动泵和/或微型气泵使用时安装。

实施例1：利用大规模封闭式原代细胞制备装置制备原代鸡胚成纤维细胞

本实施例的动力系统采用蠕动泵和磁力搅拌组件。

参考附图1-5进行装置的组装和准备，参考附图1进行操作。

1、          将清洗干净、40℃-60℃烘干的各个容器和组件按照图1-5进行组装和连接，用包装无菌物品的包装纸包装组织进入端口、分装用的连接头、洗液存放容器的连接头、消化液存放容器的连接头、培养基存放容器的连接头。

2、          容器盖子与瓶体间呈旋松状态，细胞过滤器盖子与圆锥体外壁呈旋松状态，121℃、30min 湿热灭菌，灭菌结束后立即旋紧各个盖子。

3、          按照图1安装控制夹8(操作步骤中未提及的控制夹都处于关闭状态)。

4、          无菌条件下，洗液存放容器102的连接头去掉包装纸与滤芯式过滤器的出液端连接头连接，打开控制夹

，滤芯式过滤器过滤得到的无菌洗液4L-6L直接进入洗液存放容器102，关闭控制夹。

5、          无菌条件下，消化液存放容器103的连接头去掉包装纸与滤芯式过滤器的出液端连接头连接，打开控制夹，滤芯式过滤器过滤得到的无菌消化液2L-5L直接进入消化液存放容器103，关闭控制夹

。

6、          无菌条件下，培养基存放容器201的连接头去掉包装纸与滤芯式过滤器的出液端连接头连接，打开控制夹

，滤芯式过滤器过滤得到的无菌培养基10L-40L直接进入培养基存放容器，关闭控制夹

。

7、          消化液（常用消化液：0.05%-0.25%的胰酶溶液）预热至37℃，其余溶液预热至室温。

8、          取9-10日龄SPF鸡胚，常规方法取出胚体，去头、去内脏，同法操作其余鸡胚。放于组织绞碎机的盛装桶内，开启组织绞碎机，将鸡胚组织剪切为小块，使其横径小于6mm。加入洗液300ml（此处的洗液为另行配制和除菌的）至组织绞碎机的盛装桶内。共计用胚300枚。此时组织绞碎机的盛装桶内的混合物共计1.0L-1.5L。

9、          将细胞分散容器202的第二管道2022和第一四通管703之间的硅胶管，安装到蠕动泵上。

10、     打开控制夹⑦、⑩，蠕动泵针对细胞分散容器202呈进液状态，启动蠕动泵，将培养基2L-4L流转到细胞分散容器202，关闭蠕动泵，关闭控制夹⑦、⑩。

11、     将细胞分散容器202的第二管道2022和第一四通管703之间的硅胶管，从蠕动泵上卸下。

12、     将消化容器105的第二管道1052和六通管707之间的硅胶管，安装到蠕动泵上。

13、     打开控制夹①，蠕动泵针对消化容器105呈进液状态，去掉组织进入端口101的包装纸，组织进入端口101的入口端置于组织绞碎机的盛装桶内，启动蠕动泵，将鸡胚组织流转到消化容器105，关闭蠕动泵，关闭控制夹①。

14、     打开控制夹②，蠕动泵针对消化容器105呈进液状态，启动蠕动泵，将2L-3L洗液流转到消化容器105，关闭蠕动泵，关闭控制夹②。

15、     打开磁力搅拌器602，使磁力搅拌子601在消化容器105内转动，洗液与组织充分接触，1min-3min，关闭磁力搅拌器602，静置使组织沉降。

16、     打开控制夹④，蠕动泵针对消化容器105呈排液状态，启动蠕动泵，将消化容器内2L-3L洗液流转到废液存放容器104，关闭蠕动泵，关闭控制夹④。

17、     重复步骤14-16的操作。

18、     打开控制夹③，蠕动泵针对消化容器105呈进液状态，启动蠕动泵，将消化液1L流转到消化容器105，关闭蠕动泵，关闭控制夹③。

19、     打开磁力搅拌器602，使磁力搅拌子601在消化容器105内转动，消化液与组织充分接触，0.5min-1min，关闭磁力搅拌器602，静置使组织沉降。

20、     打开控制夹④，蠕动泵针对消化容器105呈排液状态，启动蠕动泵，将消化容器105内1L消化液流转到废液存放容器104，关闭蠕动泵，关闭控制夹④。

21、     重复步骤18的操作。

22、     打开磁力搅拌器602，使磁力搅拌子601在消化容器105内转动，消化液与组织充分接触，打开磁力搅拌器602的加热开关，调控温度使消化容器105内容物温度为37℃，10min-40min，关闭磁力搅拌器602，静置使未分散的大块组织沉降。

23、     打开控制夹⑤、⑥，蠕动泵针对消化容器105呈排液状态，启动蠕动泵，将分散了的小块鸡胚组织1L流转到细胞分散容器202，关闭蠕动泵，关闭⑤、⑥控制夹。

24、     重复步骤21-23的操作，根据剩余组织的多少确定重复次数，重复次数为0次到多次。

25、     将消化容器105的第二管道1052和六通管707之间的硅胶管，从蠕动泵上卸下。

26、     将细胞分散容器202的第二管道2022和第一四通管703之间的硅胶管，安装到蠕动泵上。

27、     打开控制夹⑥、⑧，蠕动泵针对细胞分散容器202呈排液状态，启动蠕动泵，将组织在细胞分散容器202内循环，组织撞击容器内壁，使得已经分散的组织在机械撞击的情况下进一步分散成小块，达到3倍体积（1倍体积：细胞分散容器内混合液的总体）循环时（蠕动泵设置的速度和时间，可以控制液体循环量），关闭蠕动泵，关闭控制夹⑥、⑧。

28、     打开控制夹⑦、⑨，蠕动泵针对细胞分散容器202呈排液状态，启动蠕动泵，将小块组织在分散容器内循环，小块组织撞击容器壁，使得已经分散的小块组织在机械撞击的情况下进一步分散成单个细胞，达到3倍体积循环时，关闭蠕动泵，关闭控制夹⑨（此时控制夹⑦打开）。

29、     打开控制夹、、

（此时控制夹⑦、

、

、

打开），蠕动泵针对细胞分散容器202呈排液状态，启动蠕动泵，将分散的细胞通过细胞过滤器301，流转到细胞盛装容器401。

30、     组织沉渣过多，过滤受阻时，关闭控制夹，打开控制夹

（此时控制夹⑦、

、

、

打开）继续过滤。

31、     组织沉渣过多，过滤受阻时，关闭控制夹

，打开控制夹

（此时控制夹⑦、

、

、打开）继续过滤。滤器数量的设置根据具体情况而定。过滤结束，关闭蠕动泵，关闭控制夹⑦、

、

、

。

32、     将细胞分散容器202的第二管道2022和第一四通管703之间的硅胶管，从蠕动泵上卸下。

33、     将细胞盛装容器401的第三管道4013和第二三通管702之间的硅胶管，安装到蠕动泵上。

34、     打开控制夹

，蠕动泵针对细胞盛装容器401呈排液状态，启动蠕动泵，将细胞盛装容器401内的细胞流转20ml-50ml到取样瓶402。关闭控制夹

。

35、     取下取样瓶402盛装细胞的下部玻璃瓶，将细胞适当倍数（5倍-50倍）稀释，台盼蓝染色细胞，在细胞计数板上计数活细胞数和死细胞数，通过计算得到每毫升溶液内细胞数目和活细胞的比例，即细胞浓度和细胞活率。

36、     将细胞盛装容器401的第三管道4013和第二三通管702之间的硅胶管，从蠕动泵上卸下。

37、     将细胞分散容器202的第二管道2022和第一四通管703之间的硅胶管，安装到蠕动泵上。

38、     根据细胞计数结果和后续细胞液用量，补充培养基到细胞盛装容器。打开控制夹⑦、⑩，蠕动泵针对细胞分散容器202呈进液状态，启动蠕动泵，将培养基流转到细胞分散容器202，关闭蠕动泵，关闭控制夹⑦、⑩。打开控制夹

、

，蠕动泵针对细胞分散容器202呈排液状态，启动蠕动泵，将培养基由细胞分散容器202流转到细胞盛装容器401。关闭控制夹

、

。

39、     根据需要补充培养基的量，重复步骤38，至细胞盛装容器内的培养基的量达到要求。如后续使用生物反应器平台操作，接步骤40；如后续使用转瓶操作，接步骤41。

40、     制备的细胞后续使用生物反应器平台操作，将控制夹所在的硅胶管的非细胞盛装容器端与不锈钢五通管分离。使得细胞盛装容器成为独立单元，可转移到生物反应器平台进行后续操作，细胞盛装容器也为后续操作预留有包装纸包装的无菌连接头，可供连接时使用。

41、     制备的细胞后续使用转瓶培养，将细胞分散容器202的第二管道2022和第一四通管703之间的硅胶管，从蠕动泵上卸下。将细胞盛装容器401的第三管道4013和第二三通管702之间的硅胶管，安装到蠕动泵上。将细胞盛装单元4的连接头去掉包装纸与转瓶分装端口的连接头连接，打开控制夹

，打开与转瓶相连的各个硅胶管上的控制夹，蠕动泵针对细胞盛装容器401呈排液状态，启动蠕动泵，将细胞流转到各个转瓶，各个转瓶内的细胞达到一定体积，关闭各自对应的控制夹。所有流转分装结束，关闭蠕动泵。关控制夹。无菌条件下，拔掉转瓶进液不锈钢管上的硅胶管，将无菌堵头连接到转瓶的进液不锈钢管上。转瓶送到温室转瓶机上培养。

42、     使用结束，将装置拆卸、清洗、烤干，备用。

计数制备的原代鸡胚成纤维细胞，获得细胞4.5×10¹⁰个-6.0×10¹⁰个，单胚细胞产量1.5×10⁸个-2.0×10⁸个，活率80%以上。如定容终体积36000ml，则细胞密度1.25×10⁶个/ml -1.67×10⁶个/ml，作为种细胞可供10L转瓶36个；如定容终体积10000ml，则细胞密度4.5×10⁶个/ml-6.0×10⁶个/ml，可为2.5g /L cytodex1微载体的10L体积生物反应器做种细胞。

相比之下，采用传统方法制备原代鸡胚成纤维细胞，每次最多操作量为鸡胚20-30枚。使用本实用新型的大规模封闭式原代细胞制备装置制备的原代细胞与传统方法比较，生产规模是传统法的10倍甚至更高，可有效地解决原代细胞大量制备工作量大、易污染的问题，满足规模化生产的需求。

实施例2：利用大规模封闭式原代细胞制备装置制备原代地鼠肾细胞

本实施例的动力系统采用蠕动泵、微型气泵和磁力搅拌组件。

1、          将清洗干净、40℃-60℃烘干的各个容器和组件按照图1-5进行组装和连接，用包装无菌物品的包装纸包装组织进入端口、分装用的连接头、洗液存放容器的连接头、消化液存放容器的连接头、培养基存放容器的连接头。

2、          容器盖子与瓶体间呈旋松状态，细胞过滤器盖子与圆锥体外壁呈旋松状态，121℃、30min 湿热灭菌，灭菌结束后立即旋紧各个盖子。

3、          按照图1安装控制夹8(操作步骤中未提及的控制夹都处于关闭状态)。

4、          无菌条件下，洗液存放容器102的连接头去掉包装纸与滤芯式过滤器的出液端连接头连接，打开控制夹

，滤芯式过滤器过滤得到的无菌洗液4L-6L直接进入洗液存放容器102，关闭控制夹

。

5、          无菌条件下，消化液存放容器103的连接头去掉包装纸与滤芯式过滤器的出液端连接头连接，打开控制夹

，滤芯式过滤器过滤得到的无菌消化液2L-5L直接进入消化液存放容器103，关闭控制夹

。

6、          无菌条件下，培养基存放容器201的连接头去掉包装纸与滤芯式过滤器的出液端连接头连接，打开控制夹

，滤芯式过滤器过滤得到的无菌培养基10L-40L直接进入培养基存放容器，关闭控制夹。

7、          取12-14日龄的健康地鼠，经无菌手续取肾，放于组织绞碎机的盛装桶内，开启组织绞碎机，将地鼠肾组织剪切为小块，使其横径小于6mm。加入洗液300ml（此处的洗液为另行配制和除菌的）至组织绞碎机的盛装桶内。

8、          将细胞分散容器202的第二管道2022和第一四通管703之间的硅胶管，安装到蠕动泵上。

9、          打开控制夹⑦、⑩，蠕动泵针对细胞分散容器202呈进液状态，启动蠕动泵，将培养基2L-4L流转到细胞分散容器202，关闭蠕动泵，关闭控制夹⑦、⑩。

10、     在消化容器105的空气过滤器5上口连接微型气泵。

11、     打开控制夹①，微型气泵针对消化容器105排气状态，去掉组织进入端口101的包装纸，组织进入端口101的入口端置于组织绞碎机的盛装桶内，启动微型气泵，将地鼠肾组织流转到消化容器，关闭微型气泵，关闭控制夹①。

12、     打开控制夹②，微型气泵针对消化容器105排气状态，启动微型气泵，将2L-3L洗液流转到消化容器105，关闭微型气泵，关闭控制夹②。

13、     打开磁力搅拌器602，使磁力搅拌子601在消化容器105内转动，洗液与组织充分接触，1min-3min，关闭磁力搅拌器602，静置使组织沉降。

14、     打开控制夹④，微型气泵针对消化容器105呈进气状态，启动微型气泵，将消化容器内2L-3L洗液流转到废液存放容器104，关闭微型气泵，关闭控制夹④。

15、     重复步骤12-14的操作。

16、     打开控制夹③，微型气泵针对消化容器105呈排气状态，启动微型气泵，将消化液1L流转到消化容器105，关闭微型气泵，关闭控制夹③。

17、     打开磁力搅拌器602，使磁力搅拌子601在消化容器内转动，消化液与组织充分接触，0.5min-1min，关闭磁力搅拌器602，静置使组织沉降。

18、     打开控制夹④，微型气泵针对消化容器105呈进气状态，启动微型气泵，将消化容器内1L消化液流转到废液存放容器104，关闭微型气泵，关闭控制夹④。

19、     重复步骤16的操作。

20、     打开磁力搅拌器602，使磁力搅拌子601在消化容器内转动，消化液与组织充分接触，10min-40min，关闭磁力搅拌器，静置使未分散的大块组织沉降。

21、     从消化容器105的空气过滤器5上口卸下微型气泵。

22、     打开控制夹⑤、⑥，蠕动泵针对细胞分散容器202呈进液状态，启动蠕动泵，将分散了的小块地鼠肾组织1L流转到分散容器，关闭蠕动泵，关闭控制夹⑤、⑥。

23、     在消化容器105的空气过滤器5上口连接微型气泵。

24、     重复步骤19-23的操作，根据剩余组织的多少确定重复次数，重复次数为0次到多次。

25、     打开控制夹⑥、⑧，蠕动泵针对细胞分散容器202呈排液状态，启动蠕动泵，将组织在细胞分散容器202内循环，组织撞击容器内壁，使得已经分散的组织在机械撞击的情况下进一步分散成小块，达到3倍体积（1倍体积：细胞分散容器内混合液的总体）循环时（蠕动泵设置的速度和时间，可以控制液体循环量），关闭蠕动泵，关闭控制夹⑥、⑧。

26、     打开控制夹⑦、⑨，蠕动泵针对细胞分散容器202呈排液状态，启动蠕动泵，将小块组织在分散容器内循环，小块组织撞击容器壁，使得已经分散的小块组织在机械撞击的情况下进一步分散成单个细胞，达到3倍体积循环时，关闭蠕动泵，关闭控制夹⑨，此时控制夹⑦打开。

27、     打开控制夹、

、

（此时控制夹打开⑦、

、

、

），蠕动泵针对细胞分散容器202呈排液状态，启动蠕动泵，将分散的细胞通过细胞过滤器301，流转到细胞盛装容器401。

28、     组织沉渣过多，过滤受阻时，关闭控制夹，打开控制夹（此时控制夹⑦、

、、

打开）继续过滤。

29、     组织沉渣过多，过滤受阻时，关闭控制夹，打开控制夹

（此时控制夹⑦、

、

、

打开）继续过滤。滤器数量的设置根据具体情况而定。过滤结束，关闭蠕动泵，关闭控制夹⑦、

、

、。

30、     从消化容器105的空气过滤器5上口卸下微型气泵。

31、     在细胞盛装容器401的空气过滤器5上口连接微型气泵。

32、     打开控制夹

，微型气泵针对细胞盛装容器401呈进气状态，启动微型气泵，将细胞盛装容器内的细胞流转到取样瓶20ml-50ml，关闭微型气泵。关闭控制夹

，从细胞盛装容器401的空气过滤器5上口卸下微型气泵。

33、     取下取样瓶402盛装细胞的下部玻璃瓶，将细胞适当倍数（5倍-50倍）稀释，台盼蓝染色细胞，在细胞计数板上计数活细胞数和死细胞数，通过计算得到每毫升溶液内细胞数目和活细胞的比例，即细胞浓度和细胞活率。

34、     根据细胞计数结果和后续细胞液用量，补充培养基到细胞盛装容器401。打开控制夹⑦、⑩，蠕动泵针对细胞分散容器202呈进液状态，启动蠕动泵，将培养基流转到分散容器202，关闭蠕动泵，关闭控制夹⑦、⑩。打开控制夹

、

，蠕动泵针对细胞分散容器202呈排液状态，启动蠕动泵，将培养基由分散容器202流转到细胞盛装容器401。关闭控制夹

、

。

35、     根据需要补充培养基的量，重复步骤34，至细胞盛装容器内的培养基的量达到要求。如后续使用生物反应器平台操作，接步骤36；如后续使用转瓶操作，接步骤37。

36、     制备的细胞后续使用生物反应器平台操作，将控制夹

所在的硅胶管的非细胞盛装容器端与不锈钢五通管分离。使得细胞盛装容器成为独立单元，可转移到生物反应器平台进行后续操作，细胞盛装容器也为后续操作预留有包装纸包装的无菌连接头，可供连接时使用。

37、     制备的细胞后续使用转瓶培养。将细胞盛装单元的连接头去掉包装纸与转瓶分装端口的连接头连接，在细胞盛装容器401的空气过滤器5上口连接微型气泵，微型气泵针对细胞盛装容器401进气状态，开控制夹

，打开与转瓶相连的各个硅胶管上的控制夹，开微型气泵，靠压力将细胞流转到各个转瓶，各个转瓶内的细胞达到一定体积，关闭各自对应的控制夹。所有流转分装结束，关闭微型气泵。无菌条件下，拔掉转瓶进液不锈钢管上的硅胶管，将无菌堵头连接到转瓶的进液不锈钢管上。转瓶送到温室转瓶机上培养。

38、     使用结束，将装置拆卸、清洗、烤干，备用。

Claims (9)

1.一种大规模封闭式原代细胞制备装置，包括组织消化单元⑴、细胞分散单元⑵、细胞过滤单元⑶、细胞盛装单元⑷以及动力系统，各单元之间、各单元内部通过硅胶管、多通管相连通，其特征在于：

所述组织消化单元⑴，包括组织进入端口（101）、洗液存放容器（102）、消化液存放容器（103）、废液存放容器（104）、消化容器（105）、空气过滤器⑸、硅胶管和连接头；所述洗液存放容器（102）、消化液存放容器（103）、废液存放容器（104）、消化容器（105）上设带有穿通盖体的中空不锈钢管道的密封盖；

所述洗液存放容器（102）的密封盖设有3根管道，第一管道（1021）上口和硅胶管相连，继而硅胶管和空气过滤器⑸相连；第二管道（1022）上口和硅胶管相连，继而硅胶管和连接头相连；第二管道（1022）下口和硅胶管相连，第三管道（1023）下口和硅胶管相连；

所述消化液存放容器（103）的密封盖设有3根管道，第一管道（1031）上口和硅胶管相连，继而硅胶管和空气过滤器⑸相连；第二管道（1032）上口和硅胶管相连，继而硅胶管和连接头相连；第二管道（1032）下口和硅胶管相连，第三管道（1033）下口和硅胶管相连；

所述废液存放容器（104）的密封盖设有2根管道，第一管道（1041）上口和硅胶管相连，继而硅胶管和空气过滤器⑸相连；第二管道（1042）下口和硅胶管相连；

所述消化容器（105）的密封盖设有2根管道，第一管道（1051）上口和硅胶管相连，继而硅胶管和空气过滤器⑸相连；第二管道（1052）下口和硅胶管（1053）相连；

所述细胞分散单元⑵，包括培养基存放容器（201）、细胞分散容器（202）、空气过滤器⑸、硅胶管和连接头；所述培养基存放容器（201）、细胞分散容器（202）上设带有穿通盖体的中空不锈钢管道的密封盖；

所述培养基存放容器（201）的密封盖设有3根管道，第一管道（2011）上口和硅胶管相连，继而硅胶管和空气过滤器⑸相连；第二管道（2012）上口和硅胶管相连，继而硅胶管和连接头相连；第二管道（2012）下口和硅胶管相连，第三管道（2013）下口和硅胶管相连；

所述细胞分散容器（202）的密封盖设有4根管道，第一管道（2021）上口和硅胶管相连，继而硅胶管和空气过滤器⑸相连；第二管道（2022）下口和硅胶管相连；下口为粗端口的第三管道（2023）和下口为细端口的第四管道（2024）在容器内的长度为细胞分散容器高度的1/3-1/2，且粗、细两端口的出口朝向细胞分散容器（202）的容器内壁；

所述细胞过滤单元⑶，包括两个以上细胞过滤器（301），所述细胞过滤器（301）包括漏斗形外壁（3011）、过滤层（3012）、圆台形过滤层支架（3013）、过滤器支架（3014）以及带有穿通盖体的中空不锈钢管道（3015）的密封盖；所述圆台形过滤层支架（3013）由两个不同直径的圆形铁圈通过4个支杆相连而成；

所述细胞盛装单元⑷，包括细胞盛装容器（401）、取样瓶（402）、空气过滤器⑸、硅胶管和连接头；所述细胞盛装容器（401）、取样瓶（402）上设带有穿通盖体的中空不锈钢管道的密封盖；所述细胞盛装容器（401）的密封盖设有3根管道，第一管道（4011）上口和硅胶管相连，继而硅胶管和空气过滤器⑸相连；第二管道（4012）下口和硅胶管相连，第三管道（4013）下口和硅胶管相连；所述取样瓶（402）的密封盖设有2根管道，第一管道（4021）上口和硅胶管相连，继而硅胶管和空气过滤器⑸相连；第二管道（4022）下口和硅胶管相连；

所述动力系统包括磁力搅拌组件，蠕动泵和/或微型气泵；所述磁力搅拌组件包括位于消化容器（105）内的磁力搅拌子（601）和位于消化容器（105）下方的磁力搅拌器（602）；

所述多通管包括第一三通管（701）、第二三通管（702）、第一四通管(703）、第二四通管（704）、第三四通管（705)、五通管（706）、六通管（707），其连接方式如下：

所述六通管（707）通过硅胶管分别和组织进入端口（101）、洗液存放容器（102）的第三管道（1023）上口、消化液存放容器（103）的第三管道（1033）上口、消化容器（105）的第二管道（1052）上口、第一三通管（701）、废液存放容器（104）的第二管道（1042）上口相连；

所述第一三通管（701）通过硅胶管分别和六通管（707）、细胞分散容器（202）的第三管道（2023）上口、第一四通管（703）相连；

所述第一四通管（703）通过硅胶管分别和第一三通管（701）、细胞分散容器（202）的第二管道（2022）上口、第二四通管（704）、五通管（706）相连；

所述第二四通管（704）通过硅胶管分别和第一四通管（703）、细胞分散容器（202）的第四管道（2024）上口、培养基存放容器（201）的第三管道（2013）上口、第三四通管（705）相连；

所述第三四通管（705）通过硅胶管分别和第二四通管（704）、各细胞过滤器（301）的中空不锈钢管道（3015）上口相连；

所述五通管（706）通过硅胶管分别和第一四通管（703）、各细胞过滤器（301）的漏斗形外壁（3011）出液口、细胞盛装容器（401）的第二管道（4012）上口相连；

所述第二三通管（702）通过硅胶管分别和细胞盛装容器（401）的第三管道（4013）上口、取样瓶（402）的第二管道（4022）上口、供分装用的连接头相连。

2.如权利要求1所述的一种大规模封闭式原代细胞制备装置，其特征在于：所述密封盖，包括塑料外盖、带有穿通盖体的中空不锈钢管道的不锈钢内盖和密封圈，密封盖与所密封的容器为螺纹连接。

3.如权利要求1所述的一种大规模封闭式原代细胞制备装置，其特征在于：所述细胞分散容器（202）的第三管道（2023）出口内径为3-5mm，第四管道（2024）出口内径为1-3mm。

4.如权利要求1所述的一种大规模封闭式原代细胞制备装置，其特征在于：所述消化容器（105）和细胞分散容器（202）为圆底容器，下设支架。

5.如权利要求1所述的一种大规模封闭式原代细胞制备装置，其特征在于：所述洗液存放容器（102）、消化液存放容器（103）、培养基存放容器（201）上的连接头与过滤除菌设备上配置的连接头为插拔相连或螺纹相连。

6.如权利要求1所述的一种大规模封闭式原代细胞制备装置，其特征在于：所述细胞盛装单元⑷所配有的连接头为供分装用的连接头，所述连接头与细胞盛装单元以外的后续细胞盛装容器的连接头呈插拔相连或螺纹相连。

7.如权利要求1所述的一种大规模封闭式原代细胞制备装置，其特征在于：所述洗液存放容器（102）的第三管道（1023）下口设置的硅胶管、消化液存放容器（103）的第三管道（1033）下口设置的硅胶管、培养基存放容器（201）的第三管道（2013）下口设置的硅胶管、细胞分散容器（202）的第二管道（2022）下口设置的硅胶管、细胞盛装容器（401）的第三管道（4013）下口设置的硅胶管，其长度深达容器底部。

8.如权利要求1所述的一种大规模封闭式原代细胞制备装置，其特征在于：所述洗液存放容器（102）的第二管道（1022）下口设置的硅胶管、消化液存放容器（103）的第二管道（1032）下口设置的硅胶管、废液存放容器（104）的第二管道（1042）下口设置的硅胶管、培养基存放容器（201）的第二管道（2012）下口设置的硅胶管、细胞盛装容器（401）的第二管道（4012）下口设置的硅胶管、取样瓶（402）的第二管道（4022）下口设置的硅胶管，其管口高于容器内液面高度。

9.如权利要求1所述的一种大规模封闭式原代细胞制备装置，其特征在于：所述消化容器（105）的第二管道（1052）下口连接的硅胶管（1053），其管口距容器底部2-5cm。

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