FI89007C - Foerfarande foer framstaellning av nya applikationsformer foer -interferon - Google Patents

Description

Menetelmä α-interferonien uusien appiikointimuotojen valmista miseksi - Förfarande för framställning av nya appiikations- former för a-interferon ! 89007

Keksinnön kohteena on menetelmä valmistaa uusia applikointi" muotoja α-interferonille, erityisesti kuitenkin ai fa-2-inter-feronille. Nämä muodostuvat happostabiloiduista a-interfero-neista, esimerkiksi ai fa-2-interferoneista olevasta, ei-lyofi" lisoidusta kuivakalvosta, lasista tai intertistä muovista olevan kantajan päällä, jolloin kantajat muodostuvat parhaiten a. ) silmäpuikoista, joiden päihin on tasaisesti laitettu a-interferoneja ja jotka on tarkoitettu oftalmologiseen käyttöön tehoaineen viemiseksi sidekalvopussiin, tai b. ) kuivakalvoampul1ista, jossa on sisäpintoihin kiinnittyvä α-interferonikalvo ja joka on tarkoitettu injektioliuosten valmistamiseksi.

Interferonit ovat tunnetusti proteiineja, joiden molekyy1ipai" no on välillä 15 ja 30 kD ja joiden säilyttäminen tuottaa suuria vaikeuksia niiden pysymättömyyden vuoksi. Kirjallisuudessa on jo esitetty useita ehdotuksia interferonipitoisten preparaattien stabi1oimiseksi. Stabilointiaineena on ehdotettu käytettäväksi esimerkiksi ihmisen seerumialbymiinia, glukoosia, mannitolia ja useita muita yhdisteitä, a- ja γ-interfe-roneja on suuniteltu myös käytettäväksi silmän virussairauksien hoitoon; kuitenkin on erityisen vaikeaa valmistaa voiteita tai tippoja, jotka kestävät riittävän pitkän ajan tehon heik-kenemättä.

Japanilaisessa patenttijulkaisussa Kokai Tokyo Koho J.P. 55/102591 (80 102.519) on kuvattu interfeonin stabi-1ointimenetelmää pakkaskuivaamal1 a tris(hyroksimetyyliamino)-metaanin ei-ionigeenisen polyetyleenipinta-aktiivisen aineen ja antibiootin läsnäollessa. US-patenttijulkaisussa 2 89007 4 252 791 on ilmoitettu, että lantanidi- ja kalsiumsuolat parantavat interferonin mekaanista ja termistä stabiili-suutta. Eurooppalaisesta patenttihakemuksesta 82.481 tiedetään, että aminohapot (esimerkiksi glysiini ja alaniini) stabiloivat puskuroitua (pH 7,0-7,4) lyofilisoitua interferonia. J.J. Sedmak'in et. ai (Adv. Exp. Med.

Biol. 1978, 110) humaani-fibroblasti-interferoni on stabiili alhaisissa pH-arvoissa vain, kun mukana on yli 5 μq/ml proteiinia, ja että mekaaninen rasitus inaktivoi. Yhteenvetona voidaan sanoa, että interferonit yleensä ja erityisesti alfa-2-interferonit menettävät aktiivisuutensa erittäin nopeasti vesiliuoksessa ilman stabilointiaineita. Myös interferoni-puhdaslyofilisaatit, jotka on valmistettu pakkaskuivaamalla happamia vesiliuoksia, kestävät säilytystä suhteellisen hyvin vain silloin, kun niihin on lisätty mukaan stabilointiaineita, esimerkiksi ihmisen seerumialbumiinia, ja mahdollisesti puskuriaineita, esimerkiksi ammoniumasetaattipuskuria.

Oftalmologiseen käyttöön kyseeseen tulevat silmäpuikot ovat saksalaisen patenttijulkaisun 2 441 191 kohteena.

Näiden silmäpuikkojen avulla on mahdollista viedä silmäluomen ja silmämunan väliin oftalmologiassa tavanomaisia tehoaineita oikein annosteltuna; tässä patenttijulkaisussa mainitaan silmään applikoitavista aineista esimerkkeinä fluoreskeiini ja metoprololi. Tällaisten silmäpuikkojen avulla on tarkka annostelu mahdollista, jolloin silmää ei lainkaan ärsytetä päinvastoin kuin silmätippoja käytettäessä. Käyttö tapahtuu siten, että puikon pää laitetaan alemman silmäluomen alle ja puikkoa pyöritetään kaksi -kolme kertaa; tällöin tehoaine irtoaa täydellisesti.

Nyttemmin on havaittu, että protonoiduista α-interferoneista, erityisesti alfa-2-interferonista muodostuvilla, lyofili-soimattomilla kuivakalvoilla on erinomainen säilytyksen-kestävyys kiinnitettynä inerteille pinnoille, esimerkiksi li 3 89007 lasi- tai muovipinnoille. Lyofilisoimattomat kuivakalvot valmistetaan siten, että ^-interferoni liuotetaan täydellisesti happameen, vahvasti polaariseen liuottimeen pH-arvossa välillä 1,5 ja 5, parhaiten välillä 3 ja 4, liuos levitetään lasista tai inerteistä muoveista (esimerkiksi polystyreeni, polyetyleeni, polypropyleeni, polykarbonaatti) olevan inertin kantajan päälle ja liuotin poistetaan lämpötiloissa välillä 0 ja 80°C, parhaiten huoneen lämpötilassa. Liuottimiksi sopivat vesi, 1-4-hiiliatomiset alifaattiset alkoholit, 3-5-hiiliatomiset alifaattiset ketonit tai näiden liuottimien seokset. pH-arvon säädössä sopivat hapoiksi epäorgaaniset hapot, kuten rikkihappo, fosforihappo, erityisesti kuitenkin suolahappo. Orgaanisina happoina voidaan käyttää esimerkiksi fumaarihappoa, viinihappoa, meripihkahappoa tai sitruunahappoa.

Erityisen edullista on liuottaa a -interferoni veden ja alkoholin, kuten metanolin tai etanolin aseotrooppisesti tislattavaan seokseen, johon halutun pH-arvon säätämistä varten on etukäteen lisätty happoa, parhaiten suolahappoa, koska tämän liuoksen vastaavalle kantajalle levittämisen jälkeen voidaan helposti poistaa myös viimeiset mukanaolevat vesimäärät. Koska α-interferonien liukoisuus on suurimmil-laan happamiin, vesipitoisiin liuoksiin, on suositeltavaa lisätä näin valmistettua vesiliuosta sekä alkoholia, V jolloin mukana oleva vesi voidaan poistaa täydellisesti yhdessä alkoholin kanssa aseotrooppisena seoksena huoneen lämpötilassa ja alipaineessa. Kantajan päälle muodostetun kalvon säilytyksenkestävyys on suurempi, kun tämän kalvon kosteuspitoisuus on alhainen.

Ennen päällystämistä on suositeltavaa steriloida kantaja-materiaali ja samoin suodattaa tehoaineliuos steriiliksi. Päällystetty tuote voidaan kuitenkin myös myöhemmin, ja myös ylimääräisenä toimenpiteenä, steriloida säteilyt-tämällä (esimerkiksi β- tai 'r-säteillä) .

4 89007

Yllättävää on, että protonoidusta α-interferonista näin saadulla kuivakalvolla on vielä lähes koko aktiivisuutensa jäljellä myös säilytettäessä useita kuukausia huoneen lämpötilassa (tehoaineella on jäljellä vielä lähes 90 % alkuperäisestä aktiivisuudestaan viisipäiväisen säilyttämisen jälkeen 60°C:ssa), kun taas saman materiaalin kalvo on pakkaskuivaamisen jälkeen menettänyt jo noin 40 % lähtöaktiivisuudestaan. Edes pienet määrät jäljellä olevaa kosteutta eivät vaikuta tehoaineen stabiilisuuteen, jonka edellytyksenä on tehoaineen protonoituminen.

Yllättävää myös on, että keksinnön mukaisesti saatu tehoainekalvo voidaan irrottaa helposti mekaanisesti, mikä on erittäin tärkeää silmän lääkitsemisen kannalta, ja että se liukenee erittäin nopeasti veteen, vieläkin paremmin esimerkiksi 0,1 N suolahappoliuokseen ja ennen kaikkea kuitenkin myös kyynelnesteeseen. Kalvo sopii siten hyvin sekä silmäpuikkojen päällystämiseen että ampullien käyttämiseen.

Päinvastoin kuin pakkauskuivauksessa toimitaan keksinnön mukaisia applikointimuotoja valmistettaessa yleensä huoneen lämpötilassa. Mitään erityisiä jäähdytyslaitteita ei tarvita eikä myöskään muita lisäaineita, esimerkiksi kantajia tai stabilointiaineita, joista oletettiin, että ne ovat välttämättömiä säilytystä kestävien interferoni-lääkeainemuotojen valmistamisesssa.

a-interferoneille, erityisesti alfa-2-interferonille tarkoitetut, oftalmologiassa sopivat applikointimuodot muodostuvat nk. silmäpuikoista (vrt. DE-B-2 441 191), joissa tähän tarkoitetut vyöhykkeet, jotka ovat näiden puikkojen toisessa päässä tai kummassakin päässä, kostutetaan ylt'ympäri tätä interferonia sisältävällä happamella, vesipitoisella tai vesi-alkoholipitoisella liuoksella tai happamella, parhaiten vettä sisältävällä dialkyyli- 5 89007 ketoni-, esimerkiksi asetoni-liuoksella ja liuotin poistetaan heti niin, että tällöin muodostuva kalvo tulee täysin kuivaksi.

Silmapuikkojen kostuttamiseen käytetyt liuokset sisältävät a-interferonia konsentraatiossa yleensä välillä 0,025 ja mg/ml, parhaiten 0,5 ja 1,5 mg/ml. Silmäpuikkoa kohti käytetty -interferonimäärä on välillä 0,5 - 50 ug, parhaiten 5 - 20 pg (jug = mikrogramma) .

α-interferoni, esimerkiksi rekombinantti-alfa-2-interferoni, joka puhtaana on jauhemainen, liuotetaan happameen puskuri-liuokseen (esimerkiksi HCl-glysiini-puskuriliuos), parhaiten kuitenkin veteen tai heikosti suolahappoiseen liuokseen, esimerkiksi 0,001 - 0,1 N suolahappoon, kunnes saadaan kirkas liuos. Tämän jälkeen liuos säädetään esimerkiksi etanolia lisäämällä haluttuun konsentraatioon, esimerkiksi 0,5 mg/ml interferoni-konsentraatioon ja 20 - 90 %, mieluummin 70 % (v/v) etanoli-konsentraatioon. Tällöin mitataan systeemispesifiseksi pH-arvoksi yleensä noin 1,5 - 4,5. Silmäpuikkoihin kiinnittymistä voidaan parantaa lisäämällä näin saatuun liuokseen vielä 0,05 - 2 paino-% .! perusainetta. Silmäpuikkoihin kiinnittymistä vielä parantavat perusaineet muodostuvat tällöin sellaisista aineista : kuin polyvinyylialkoholi, polyvinyylipyrrolidoni tai selluloosat, kuten metyyliselluloosa, hydroksipropyylime-tyyliselluloosa, karboksimetyyliselluloosa, hydroksietyyli-selluloosa, suurimolekyyliset kiinteät polyetyleeniglykolit tai näiden aineiden seokset. Kuitenkin voidaan käyttää myös muita perusaineita, mikäli interferonit pysyvät niissä stabiileina ja nämä perusaineet liukenevat hyvin nesteeseen ja ne sopivat silmään. Eräitä kantajamateriaaleja . . käytettäessä voidaan perusaineen mukaan sekoittaminen jättää kokonaan pois; kantajamateriaalien pinnan ominai-suuksista riippuu, ovatko tällaiset seokset toivottavia ·-·: vai ei. Perusaine toimii, kuten edellä jo mainittiin, 6 8 > O O 7 kiinnitysaineena. Se voi kuitenkin samanaikaisesti myös vaikuttaa edullisesti mekaaniseen kalvon pysyvyyteen ja lisäksi sen avulla voidaan myös säädellä päällystys-liuoksen viskositeettia. Kuivausajan lyhentämiseksi on edullista käyttää mahdollisimman korkeita konsentraatioita haihtuvaa liuotinta.

Silmäpuikkojen määrättyjen vyöhykkeiden kostuttaminen voi tapahtua saksalaisessa patenttijulkaisussa 2 441 191 kuvatuilla menetelmillä, esimerkiksi upottamalla silmäpuikkojen päät ohjatulla tavalla interferonia sisältävään, keksinnön mukaiseen liuokseen. Upotusmenetelmä aiheuttaa kuitenkin kalliin tehoaineen huomattavia tappioita. Sen vuoksi on suositeltavaa tiputtaa tehoaineliuos saksalaisessa patenttihakemuksessa P 35 13 288.4 kuvatulla menetelmällä koskematta pyörivien silmäpuikkojen tähän tarkoitettuihin vyöhykkeisiin, jolloin liuotin samanaikaisesti tai myöhemmin höyrystyy. Höyrystäminen tapahtuu parhaiten siten, että puikkojen pyöriviin vyöhykkeisiin kohdistetaan 40 - 80°C lämmin steriilikaasuvirta, esimerkiksi ilmavirta.

α-interferonia sisältävien kuiva-ampullien valmistamista varten täytetään hapan, interferonia sisältävä liuos sen steriilisuodattamisen jälkeen sopiviin, steriileihin muovimateriaalista tehtyihin säiliöihin. Liuotin poistetaan hitaasti huoneen lämpötilassa tai enintään 50°C lämpötiloissa alipaineessa; siten esimerkiksi säiliöiden täyttymisen jälkeen nämä jäähdytetään hitaasti evakuoimalla ja tämän jälkeen lämpötila nostetaan hitaasti tyhjön alla huoneen lämpötilaan, kunnes liuotin on kokonaan poistunut. Parhaiten käytetään kuitenkin tislausta matalassa lämpötilassa, jolloin on estettävä liuoksen jäätyminen. Näin päällystetyt säiliöt, esimerkiksi ampullit, tehdään tämän jälkeen tiiviiksi, esimerkiksi sulattamalla lasikaula kiinni.

Ennen applikointia liuotetaan kuiva-ampullin sisältö steriiliin isotoniseen liuokseen.

I, 7 89Q07 Tähän mennessä käytetyissä alfa-2-interferoni-valmisteiden stabilointimenetelmissä käytettiin nk. stabilointiaineita; eräs hyvänä pidetty stabilointiaine oli esimerkiksi ihmisen seerumialbumiini (HSA). Kun pakkaskuivaus korvataan keksinnön mukaisella kuivausmenetelmällä, saadaan tällaisten stabilointiaineiden läsnäollessa jopa huonompi säilytyksen-kestävyys kuin ilman näitä apuaineita. Tämä käy selville seuraavista havainnoista:

Alfa-2-interferonin happamaan liuokseen, joka oli valmistettu 5 mgrsta alfa-2-interferonia liuottamalla tämä 3 ml:aan 0,003 n suolahappoa yhdessä 10 mg:n kanssa HSA ja 25 mg:n kanssa metoseliä, lisättiin 7 ml etanolia (liuoksen pH-arvo 3,6), steriilisuodatettiin ja lisättiin tipottain pyörivän silmäpuikon kumpaankin päähän samanaikaisesti poistamalla liuotin ohijohdetun steriilin 60°C ilmavirran avulla. Silmäpuikkoa kohti lisättiin tipottain 10 ui päällystysliuosta, jolloin jokainen puikko sisälsi siten 5 μg alfa-2-interferonia = puikko A.

Alfa-2-interferonin keksinnön mukainen hapan liuos, joka oli valmistettu 5 mg:sta alfa-2-interferonia liuottamalla 3 ml:aan 0,0015 n suolahappoa ja lisäämällä 7 ml etanolia (päällystysliuoksen pH-arvo 4,2), laitettiin samalla tavalla silmäpuikkojen päiden päälle. Myös tässä tapauksessa jokainen puikko sisälsi 5 ^ig alfa-2-interferonia = puikko B.

Puikkojen A ja B säilytyksenkestävyys toisiinsa verrattuna tutkittiin kerran säilyttämällä 48 tuntia 60°C:ssa ja toisen kerran säilyttämällä 1 kuukausi 41°C:ssa. Sen jälkeen määritettiin (ELISA-testausmenetelmä) säilytetyn tehoaineen aktiivisuus ja ilmoitettiin prosentteina lähtöaktiivisuudesta (= 100 %). Seuraava taulukko sisältää tällöin saadut arvot: 8 39007

Tehoaineen aktiivisuus seuraavien säilytysaikojen ja -lämpötilojen jälkeen 48 tuntia/60°C 1 kuukausi/41°C

Puikko A 81,4 % 69,8 %

Puikko B 94,0 % 84,0 %

Keksinnön mukaiset apuainetta sisältämättömät applikointi-muodot ovat siten selvästi säilytystä kestävämpiä kuin vastaavat, lisäaineilla stabiloidut muodot. Kuten aikaisemmin on jo kerrottu, ovat pakkaskuivattujen muotojen tehoaine-aktiivisuudet vielä huomattavasti alhaisempia (vrt. tätä koskevat tiedot sivulla 4).

Seuraavat esimerkit selventävät lähemmin keksinnön kohdetta (pg = mikrogramma, μι = mikrolitra):

Esimerkki 1

Silmäpuikot 50 mg jauhemaista, rekombinantti-alfa-2-interferonia liuotettiin 10 ml:aan 0,01 n suolahappoa ja liuokseen lisättiin 90 ml puhdasta etanolia. Tähän liuokseen lisättiin 0,5 g hydroksipropyylimetyyliselluloosaa. Näin saatu liuos (pH-arvo: 3,5) suodatettiin steriiliksi. 10 |il lisättiin tipottain steriilien, pyörivien silmäpuikkojen toiseen päähän ja samanaikaisesti kuivattiin 60°C steriilissä ilmavirrassa.

Puikkoa kohti päälle tiputettu liuosmäärä sisältää 5 pg alfa-2-interferonia.

Puikkoja säilytettiin 5 päivää 60°C:ssa, minkä jälkeen tehoainepitoisuudeksi määritettiin 85 % lähtöarvosta laskettuna.

I: 5 89007

Analogisella tavalla kostutettiin seuraavat esimerkkien 2-6 silmäpuikot koostumukseltaan seuraavanlaisilla alfa-2-interferonin happamilla liuoksilla:

Aine_Määrä_2_3_4_5_6__

Alfa-2-in- terferoni mg/ml 0,5 0,5 1,5 1,0 1,5

Metanoli % v/v 50

Etanoli % v/v 70 90 70 - 70

Suolahappo ad pH 3,5 3,0 4,2 4,0 3,5

Metyyli- selluloosa p-% - - 0,2

Polyvinyyli- alkoholi p-% - 2

Toisesta päästä kostutetun silmäpuikon päällystystilavuus oli jokaisessa esimerkissä 2 - 6 10 /il. Silmäpuikot muodostuivat lasista ja polystyreenistä.

Esimerkki 7

Alfa-2-interferonia sisältävät kuiva-ampullit 20 mg jauhemaista, rekombinantti-alfa-2-interferonia otettiin 4 ml:aan 0,1 n suolahappoa ja liuokseen lisättiin 36 ml puhdasta etanolia, liuoksen pH-arvo 2,7. Näin saatu liuos suodatettiin steriiliksi. Tästä liuoksesta täytettiin kulloinkin 40 /il steriloituun lasiampulliin. Tehoaineen määrä ampullia kohti: 20 /ig. Tämän jälkeen ampullien annettiin hitaasti jäähtyä tyhjön alla ja loput liuotinmäärät poistettiin tyhjössä sen jälkeen, kun ampullit oli lämmitetty huoneen lämpötilaan tai enintään 40°C lämpötiloihin. Kuivakalvon sisältämät ampullit suljettiin sinänsä tunnetulla tavalla ilmatiiviiksi.

Analogisella tavalla päällystettiin seuraavissa esimerkeissä 8-11 ampullit 30 /ui: 11a alfa-2-interferonin 10 39007 happamilla liuoksilla, joilla oli seuraavat koostumukset:

Aine Tilavuus- tai Esimerkki määräsuhde 8 9 10 11

Alfa-2-inter-feroni-kon- sentraatti mg/ml 0,5 1,0 1,0 0,5

Etanoli % v/v 70 - 50

Metanoli % v/v 85

Suolahappo adpH .3,0 2,5 - 3,5

Rikkihappo ad pH - - 3,8 ug IFN/30 pl = kuiva-aine ampullia kohti 15 30 30 15

Esimerkissä 11 liuottimena oli vain vesi.

Esimerkki 12

Silmäpuikot

Reseptillä seuraava koostumus 1 silmäpuikkoa kohti:

Alf a-2-itnerferoni 5 jug

Polyvinyylipyrrolidoni 25 /ug

Sitruunahappo x H20 2,5 pg H^O/etanoli (70%, v/v) ad 10 μΐ

Liuoksen valmistaminen ja silmäpuikkojen kostuttaminen tapahtui esimerkissä 1 kuvatulla tavalla.

Esimerkki 13

Silmäpuikot

Reseptillä oli seuraava koostumus 1 silmäpuikkoa kohti: li n 89007

Alfa-2-interferoni 8 pg

Hydroksipropyylimetyyliselluloosa 10 pg 0,001 n suolahappo/etanoli (50%, v/v) ad 10 pl

Liuoksen valmistaminen ja silmäpuikkojen kostuttaminen tapahtui esimerkissä 1 kuvatulla tavalla.

Esimerkki 14

Silmäpuikot

Reseptillä oli seuraava koostumus 1 silmäpuikkoa kohti:

Alfa-2-interferoni 10 pg

Polyvinyylialkoholi 50 pg 0,01n suolahappo/etanoli (70%, v/v) ad 10 pl

Liuoksen valmistaminen ja silmäpuikkojen kostuttaminen tapahtui esimerkissä 1 kuvatulla tavalla.

Claims (4)

12 89007

1. Menetelmä a-interferonien uusien appiikointimuotojen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että α-interferoni liuotetaan kvantitatiivisesti happameen, vahvasti polaariseen liuottimeen, joka on vesi,- aiifaattinen alkoholi, jossa on 1-4 hiiliatomia, alifaattinen ketoni, jossa on 3 - 5 hiiliatomia tai näiden seos, pH-arvossa välillä 1 ja 5, liuos, joka mahdollisesti on sterii 1 isuodatettu, laitetaan inertin kantajan päälle ja liuotin poistetaan lämpötiloissa välillä 0 ja 80°C.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tilavuussuhteet vesipitoisissa seoksissa valitaan siten, että nämä voidaan tislata pois atseotrooppisina seoksina .

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että happamen, polaarisen liuottimen valmistamiseen käytetään fysiologisesti hyväksyttävänä epäorgaanisena tai orgaanisena happona rikkihappoa, fosforihappoa, erityisesti suolahappoa, fumaarihappoa, viinihappoa, meripihkahappoa tai sitruunahappoa ja näin pH-arvo säädetään välille 2-4.

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että α-interferonin sisältävä hapan, vesipitoinen tai vesi-alkoholipitoinen liuos tai hapan, vesipitoinen dialkyyliketoniliuos a. ) kostutetaan silmäpuikon toiseen tai kumpaankin päähän ylfympäri ja heti poistetaan liuotin, kunnes muodostuva kalvo on täysin kuiva, tai että b. ) täytetään muovimateriaalista tai lasista oleviin kuiva- ampulleihin ja liuotin poistetaan 80°C asti ulottuvissa lämpötiloissa alipaineessa ja välttämällä jäätyminen, minkä jälkeen ampullit suljetaan, mahdollisesti käytettyjen liuosten ennalta tapahtuneen sterii-1isuodatuksen ja kantajan steriloinnin jälkeen. I: 13 89007