FI88303C

FI88303C - Foerfarande foer framstaellning av terapeutiskt anvaendbara 2,3-disubstituerade isoxazolidiner

Info

Publication number: FI88303C
Application number: FI875503A
Authority: FI
Inventors: Dietrich Brocks; Stephan Henke; Volkmar Guenzler
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1986-12-17
Filing date: 1987-12-15
Publication date: 1993-04-26
Also published as: PH24746A; FI875503A; GR3006699T3; JPS63165374A; US5422342A; IL84841A; AU8258987A; FI875503A0; JP2703912B2; IL84841A0; KR960010349B1; PT86380B; DK662087D0; AU599177B2; FI88303B; US5610146A; HUT47956A; EP0271865A2; DK171894B1; DE3782149D1

Description

Menetelmä uusien terapeuttisesti käyttökelpoisten 2,3-di- substituoitujen isoksatsolidiinien valmistamiseksi 1 38303 US-patentista 4 457 936 tunnetaan hydroksifenyyli-5 tiatsoli-, -tiatsoliini- ja -tiatsolidiini-karboksyyliha-pot ja niiden käyttö inhibiittoreina, esim. propyylihydr-oksilaasin inhibiittoreina.

On tunnettua, että tietyllä tavalla substituoidut isoksatsolidiinijohdannaiset ovat tehokkaita propyylihydr-10 oksilaasin inhibiittoreita.

Keksintö koskee menetelmää kaavan I mukaisten yhdisteiden valmistamiseksi O.

N B-D-CH-E-F-R (I) i i A R8 jossa A merkitsee peptidikemiassa tavanomaista suojaryhmää, 20 tai kaavan Ha mukaista ryhmää R1-N— CH-C- (Ha)

I I H

R2 R3 0 25 R1 merkitsee bx) vetyä tai peptidikemiassa tavanomaista N-suoj aryhmää, cx) R2 merkitsee vetyä tai metyyliä; R3 merkitsee vetyä tai (Cj-CjJ-alkyyliä, 30 joka on mahdollisesti monosubstituoitu aminolla, bentsyy-lioksikarbonyyliaminolla, hydroksilla, karboksilla, karba-moyylillä, guanidinolla, ureidolla, merkaptolla, metyyli-merkaptolla, fenyylillä, 4-kloorifenyylillä, 4-fluorife-nyylillä, 4-nitrofenyylillä, 4-metoksifenyylillä, 4-hydr-• 35 oksifenyylillä, ftaali-imidolla, 4-imidatsolyylillä, 2 88 301) 3-indolyylillä, 2-tienyylillä, 3-tienyylillä, 2-pyridyy-lillä, 3-pyridyylillä tai sykloheksyylillä; c2) R2 ja R3 merkitsevät yhdessä [-CH2-CH2-CH2-] -ketjua, jossa yksi CH2-ryhmä voi olla kor-5 vattu 0:11a; tai c3) R2 ja R3 merkitsevät yhdessä - C«2 \ I ^ 10 B on karbonyyli, tiokarbonyyli tai CH2; di) D on imino, N-metyyli-imino, oksi tai metyleeni; 15 E on karbonyyli, tai jos F on sidos, niin E voi myös merkitä hydroksimetyleeniä; F on oksi, imino, N-metyyli-imino tai suora sidos; R4 merkitsee peptidikemiassa tavanomaista karboksyyli-suoj aryhmää; 20 R8 merkitsee vetyä tai (C1-C6)-alkyyliä.

(C2-C12 )-aryylillä tarkoitetaan esimerkiksi fenyy-liä, naftyyliä tai bifenyyliä. Vastaava koskee siitä johdettuja ryhmiä, kuten aroyyliä.

Alkyyli ja siitä johdetut ryhmät, kuten alkoksi, 25 voivat olla suoraketjuisia tai haarautuneita.

Kiraliteettikeskukset voivat olla, jollei toisin ole ilmoitettu, R- tai S-konfiguraatiossa. Keksintö koskee sekä optisesti puhtaita yhdisteitä että myös stereoisomee-riseoksia, kuten enantiomeeriseoksia ja diastereomeeri-30 seoksia.

Suoloina tulevat kyseeseen erityisesti alkali- ja maa-alkalisuolat, fysiologisesti hyväksyttävien amiinien kanssa muodostettavat suolat ja epäorgaanisten tai orgaanisten happojen, kuten esim. HCl:n, HBr:n, H2S04:n, maleii-35 nihapon tai fumaarihapon kanssa muodostettavat suolat.

3 8830*

Edullisina pidetään sellaisia kaavan I mukaisia yhdisteitä, joissa A on mahdollisesti substituoitu (Ci-Cg)-alkyyli, (Ci-Cg )-alkanoyyli tai mahdollisesti substituoitu (Cj-CeJ-alkoksikarbonyyli, ja sellaisia, joissa R8 on vety, 5 ja sellaisia, joissa B on karbonyyli, tiokarbonyyli tai CH2.

Edelleen edullisina pidetään kaavan 1 mukaisia yhdisteitä, joissa D on imino, oksi tai metyleeni, erityisen edullisesti imino, E on karbonyyli, F on oksi tai suora 10 sidos, ja/tai R4 on mahdollisesti substituoitu (C6-C12)~ aryyli tai mahdollisesti alkyyliosassa ja/tai mahdollisesti aryyliosassa substituoitu (Cg-Cj^-aryyli-iC^-CgJ-alkyy-li, jolloin aryyliosan substituentteina tulevat kyseeseen erityisesti halogeenit, pseudohalogeenit ja karboksiryh-15 mät, ja alkyyliosan substituentteina tulevat kyseeseen erityisesti karboksi-, (Cx-C4 )-alkoksikarbonyyli- ja amino-ryhmät.

Erityisen edullisina pidettyjä ovat sellaiset kaavan I mukaiset yhdisteet, joissa A on substituoitu (Cj-Cg)-20 alkanoyyli, jolloin substituentteina tulevat kyseeseen esimerkiksi (Cg-Cj^-aryyli-iCj-CgJ-alkyylisulfonyyli ja (C6-C12 )-aryyli-(Cj-C4 )-alkyylisulfinyyli, tai kaavan Ila mukainen ryhmä.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, 25 että yhdisteet rakennetaan tunnetulla tavalla fragmenteista esimerkiksi kytkennällä, mahdollisesti yksi tai useampi väliaikaisesti liitetty suojaryhmä lohkaistaan, karbonyy-lifunktiot muutetaan mahdollisesti tia-analogeiksi ja näin saadut kaavan I mukaiset yhdisteet muutetaan mahdollisesti 30 niiden fysiologisesti hyväksyttäviksi suoloiksi.

Fragmenteilla ymmärretään tässä aminohappoja, useampia aminohappoja sisältäviä segmenttejä, aminohappojen johdannaisia, modifioituja peptidisidoksia sisältävien peptidien johdannaisia, samoin kuin eri tavoin substituoi-35 tuja karboksyylihappoja, erilaisia alkoholeja ja niiden johdannaisia.

4 8830?

Kytkentä voi tapahtua siten, että esim. kaavan I mukaisen yhdisteen fragmentti kondensoidaan pääteasema!-sella karboksyyliryhmällä tai reaktiivisella happojohdannaisella, joka sisältää vastaavan toisen fragmentin, joka 5 taas sisältää esimerkiksi vapaan aminoryhmän, jolloin mahdollisesti esiintyvät reaktioon osallistumattomat funktionaaliset ryhmät voivat mahdollisesti olla suojattuja, ami-disidoksen muodostuessa inertissä liuoksessa. Amidisidok-sen muodostukseen soveltuvia menetelmiä on kuvattu teok-10 sessa Houben-Weyl; Methoden der organischen Chemie, Band 15/2.

Menetelmä suoritetaan edullisesti siten, että a) kaavan lila mukainen yhdiste kondensoidaan kaavan Illb mukaisella yhdisteellä A-X ^Ν/Χ B-D-CH-E-F-R4 H R8 (Ula) (Illb) 20 joissa A, B, D, E, F, R4 ja Re merkitsevät samaa kuin edellä ja X on nukleofiilisesti erotettava poistuva ryhmä, kuten OH, Cl, Br, I, tosyyli tai triflaatti, tai jos A on asyyliryhmä, niin myös X on aktiiviesteriryhmä; 25 b) kaavan iva mukainen yhdiste kondensoidaan kaavan IVb mukaisella yhdisteellä ΓΛ B-X H-D-CH-E-F-R4 30 A R8 (IVa) (IVb) joissa A, B, E, F, R4 ja R8 merkitsevät samaa kuin edellä, D on imino, N-metyyli-imino tai oksi ja X on nukleofiili-35 sesti erotettava poistuva ryhmä, kuten OH, Cl, Br, I, to- 5 88303 syyli tai triflaatti, tai jos B on karbonyyli, niin se myös on aktiiviesteriryhmä; tai c) kaavan Va mukainen yhdiste kondensoidaan kaavan Vb mukaisella yhdisteellä 5 «O.

x N B-D-CH-E-X H-F-R4 A k> (Va) (Vb) 10 joissa A, B, D, R4 ja R8 merkitsevät samaa kuin edellä, E merkitsee samaa kuin edellä hydroksimetyleeniä lukuunottamatta, F on oksi, imino tai N-metyyli-imino ja X on nuk-leofiilisesti erotettava poistuva ryhmä, kuten OH, Cl, Br, 15 I, tosyyli, triflaatti tai aktiiviesteriryhmä.

Kaavan lila, IVa tai Va mukaisen karboksyyliryhmän reaktio vastaavan, kaavan IIIb, IVb tai Vb mukaisen yhdisteen kanssa, joka sisältää vapaan aminoryhmän, suoritetaan edullisesti peptidikemiassa tavanomaisessa liuottimessa 20 tai myös vesi/liuotin-seoksissa sopivan kondensaatioai-neen, kuten esimerkiksi seuraavien läsnäollessa: 1. Disykloheksyylikarbodi-imidi lisäten 1-hydroksibentso-triatsolia [DCC/HOBt -menetelmä; Chem. Ber 103 (1970, s. 788].

25 2. Disykloheksyylikarbodi-imidi lisäten 3-hydroksi-4- okso-3,4-dihydro-l,2,3-bentsotriatsiinia [DCC/HOOBt -menetelmä; Chem. Ber. 103 (1970), s. 2 034].

3. Disykloheksyylikarbodi-imidi lisäten N-hydroksisuk-kinimidiä [DCC/HONSu -menetelmä; Z. Naturforsch. 21b.

30 (1966), s. 426].

4. Alkaanifosforihappoanhydridi, kuten n-propyleenifos-fonihappoanhydridi [PPA -menetelmä; Angew. Chemie. Int. Ed. 19 (1980), s. 133].

5. Dialkyylifosfiinihappoanhydridi, kuten metyylietyyli- 35 fosfiinihappoanhydridi (ΜΕΡΑ -menetelmä; US-patenttijul kaisu 4 426 325).

6 88 303

Sopivina liuottimina keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetään liukenevuussyistä useimmiten polaarisia liuottimia, kuten esim. dimetyyliasetamidia, dimetyyli-formamidia, dimetyylisulfoksidia, fosforihappo-tris-(dime-5 tyyliamidia), N-metyylipyrrolidonia, vettä tai mainittujen liuottimien ja veden seoksia. Viimeksi mainittu pätee ennen kaikkea ΜΕΡΑ -menetelmässä. Mutta myös kloroformia tai etikkaesteriä voidaan käyttää. Synteesi voidaan suorittaa -10 - noin 50 °C:n välisessä lämpötilassa, edullisesti 10 -10 °C:n ja huoneen lämpötilan välisessä lämpötilassa.

Edullisesti aloitetaan noin 0 °C:ssa ja kohotetaan myöhemmin huoneen lämpötilaan.

Kaavan IVa tai Va mukaisen karboksyylihapon ja kaavan IVb tai Vb mukaisen alkoholin välinen kondensaatio-15 reaktio karboksyylihappoesteriksi voidaan suorittaa edul lisesti disykloheksyylikarbodi-imidi(DCC) -menetelmän mukaan [kuten julkaisussa Angew. Chem. 90 (1978), s. 556 on kuvattu] inertissä liuottimessa, kuten DMF:ssa käyttäen apuna 4-dimetyyliaminopyridiinin katalyysiä -20 - +40 °C:n 20 välisessä lämpötilassa, edullisesti -20 °C:n ja huoneen lämpötilan välisessä lämpötilassa.

Modifioidun peptidisidoksen valmistukseen soveltuvia menetelmiä on kuvattu julkaisussa Janssen Chimica Acta, Voi. 3, no. 2 (1985). Edullisesti käytetään seuraavia 25 menetelmiä:

Pelkistettyjä peptidisidoksia sisältävien johdannaisten synteesi aldehydien pelkistävällä aminoinnilla aminohappoesterien kanssa natriumsyanoboorihydridin avulla [Borch et ai.; J. Amer. Chem. Soc. 93 (1971) s. 2 897; ja 30 91 (1067), s. 3 996] tai N-alkyloimalla amiinit tai amino happo johdannaiset (Houben-Wey1; Methoden der organischen Chemie, Bd. 11/1), siten, että d) kaavan Via tai VIb mukainen yhdiste saatetaan reagoimaan kaavan IIIb mukaisen yhdisteen kanssa 7 88303

A * -CHO R^N- CH -C-H

I I ll R2 R3 0 (Via) (VIb) cx N B-D-CH-E-F-R4 H R8 (III)b) 10 joissa B, D, E, F, R1, R2, R3, R4 ja Re merkitsevät samaa kuin edellä ja A' merkitsee peptidikemiassa tavanomaista suojaryhmää, joka mahdollisesti on substituoitu; e1) kaavan Vila mukainen yhdiste saatetaan reagoimaan kaavan IVb mukaisen yhdisteen kanssa 15

cTA

NsvN/^Vs' CHO H-D-CH-E-F-R4 Ϊ R8

A

20 (Vila) (IVb) joissa A, E, F, R4 ja R8 merkitsevät samaa kuin edellä, ja Aon lisäksi [2,3:5,6]-di-isopropylideenimannofuranosyyli ) ja D on imino tai N-metyyli-imino; 25 e2) kaavan Villa mukainen yhdiste saatetaan reagoi maan kaavan VHIb mukaisen yhdisteen kanssa ί~Λ 30 ^N^^CHj-NH, X-CH-E-F-R4 ' ’e A R8 (Villa) (VHIb) joissa A, E, F, R4 ja R8 merkitsevät samaa kuin edellä, ja 35 jolloin A voi lisäksi olla myös H, ja X on nukleofiilises- 8 883Q3 ti erotettava poistuva ryhmä, kuten OH, Cl, Br, I, tosyyli tai triflaatti; tai e3) kohdassa b) kuvatun menetelmän mukaisesti saatetaan kaavan IVa mukainen yhdiste reagoimaan kaavan IVb mu-5 kaisen yhdisteen kanssa r\ X N B-X H-D-CH-E-F-R4 10 A R8 (IVa) (IVb) joissa A, E, F, R4 ja R8 merkitsevät samaa kuin edellä, B on -CH2-, D on imino, N-metyyli-imino tai oksi ja X on nuk-15 leofiilisesti erotettava poistuva ryhmä, kuten OH, Cl, Br, I, tosyyli tai triflaatti.

Pelkistävä aminointi suoritetaan tarkoituksenmukaisesti alemmassa alkoholissa, joka sisältää korkeintaan 4 C-atomia, kuten metanolissa 0 °C:n ja reaktioseoksen kiehu-20 mispisteen välisessä lämpötilassa, edullisesti 10 - 40 °C:ssa ja pH:n ollessa 4-5.

Kaavan I mukaisten ketometyleeni-analogien, joissa B on CO ja D on -CH2-, synteesi tapahtuu Grignard- tai Re-formatzky -reaktiota käyttäen siten, että 25 f) komponenttien IXa ja IXb / \ O V- CHO Hal-Me-CHZ-CH-R10

Xn' R8 30 R3 (IXa) (IXb) joissa R8 on edullisesti H, R9 on edullisesti trityyli tai [2,3:5,6]-di-isopropylideenimannofuranosyyli, Me on Mg tai Zn ja R10 on Grignard -reaktion olosuhteissa stabiili suo-35 jattu karboksyylifunktio, kuten ksatsolinyyli- tai 2,6,7- 9 88303 trioksabisyklo[2,2,2]-oktanyyli, saatetaan reagoimaan edullisesti eetterissä, kuten dietyylieetterissä, dibutyy-lieetterissä tai tetrahydrofuraanissa -80 °C:n ja reaktio-seoksen kiehumispisteen välisessä lämpötilassa. Näin saatu 5 alkoholi voidaan hapettaa kirjallisuudesta tunnettujen eri hapetusmenetelmien mukaisesti ketoniksi, ja suojaryhmä R9 poistetaan hapolla katalysoiden. Suorittamalla edellä kuvattujen menetelmien a) ja c) mukainen kondensaatioreaktio saadaan lopuksi kaavan I mukaisia ketometyleeniyhdisteitä.

10 Endotiopeptidejä saadaan edullisesti saattamalla yleisen tyypin I mukaiset yhdisteet reagoimaan Lawesson'in reagenssin kanssa [2,4-bis-(4-metoksifenyyli)-l,3-ditia- 2,4-difosfetaani-2,4-disulfidi; vrt. Synthesis 1979, s. 941] .

15 Muiden funktionaalisten ryhmien väliaikaiseen suo jaukseen soveltuvat sellaiset suojaryhmät, joita tavallisesti käytetään peptidikemiassa ja joita on esimerkiksi kuvattu julkaisuissa Kontakte Merck 3/79 sivuilla 14 -22 ja 1/80, sivuilla 25 - 35.

20 Aminofunktion uretaanisuojaryhmiä ovat esimerkiksi

Pyoc, Fmoc, Fcboc, Z, Boc, Ddz, Bpoc, Z-(N02), Dobz, Moc, Mboc, Iboc, Adoc, Adpoc, Msc tai Pioc; edullisia ovat Z tai Boc. Näiden aminosuojaryhmien poistaminen tapahtuu happojen tai emästen avulla tai pelkistäen.

25 Guanidinoryhmän suojaryhmiä ovat esimerkiksi N02, tosyyli, Boc, Z, mesityleeni-2-sulfonyyli (Mts) jne. Loh-kaisu voi tapahtua hydrolyyttisesti tai hydrogenolyytti-sesti.

COOH-sivufunktiot suojataan alkyyliesterinä, edul- 30 lisesti metyyli-, etyyli- tai tert.-butyyliesterinä tai bentsyylisterinä (p-N02, p-Cl, p-Br jne.). Suojauksen poisto tapahtuu suorittamalla alkalinen tai hapan saippu-ointi tai hydraus.

Hydroksyylisuojaryhmiä ovat esimerkiksi tert.-bu- 35 tyyli tai bentsyyli.

10 8 8 3 0 ί

Keksinnön mukaisesti valmistetut aineet ovat pro-lyylihydroksilaasin irreversiibelejä estäjiä. Ne saavat aikaan kollageenispesifisen hydroksilointireaktion selektiivisen estymisen, minkä kuluessa proteiiniin sitoutunut 5 proliini hydroksiloituu propyylihydroksilaasi-entsyymin vaikutuksesta. Tämän reaktion estyessä inhibiittorin vaikutuksesta muodostuu toimintakyvytön alihydroksiloitu kol-lageenimolekyyli, jonka solu pystyy luovuttamaan ainoastaan vähäisessä määrin ekstraselluläärlseen eli solunul-10 koiseen tilaan. Alihydroksiloitua kollageenia ei tämän lisäksi voida liittää kollageenimatrlisiin ja se hajoaa hyvin helposti proteolyyttisesti. Näiden vaikutusten seurauksena solunulkoisesti varastoituneen kollageenin määrä vähenee. Prolyylihydroksilaasin estäjät soveltuvat tämän 15 johdosta sellaisten sairauksien hoitoon, joissa kollagee nin varastoitumisella on huomattava merkitys taudinkuvassa. Näihin sairauksiin kuuluvat mm. keuhkojen, maksan ja ihon fibroosi eli sidekudoksen poikkeuksellinen lisääntyminen (skleroderma eli ihon tulehduskovettuma), sekä ate-20 roskleroosi eli valtimon kovettumatauti.

Edelleen tiedetään, että kollageenituotannon estäjillä on kasvaimien kasvua estäviä ominaisuuksia. Alentamalla kollageenisynteesiä ja kollageenin varastoitumista vaikutetaan kasvaimen kasvulle välttämättömän peruskudok-25 sen muodostumiseen [H. Dvorak; N. Engl. J. of Med. 315 (1986), s. 1 650]; ja tyvikalvon muodostuksen estäjät soveltuvat estämään eri kasvainten kasvua [W. Klohs et ai.; J.N.C.I. 75 (1985), s. 353].

Tämän lisäksi tiedetään, että prolyylihydroksilaa-30 sin estyminen tunnettujen estäjien, kuten a,a-dipyridyylin vaikutuksesta johtaa makrofagien Clg-biosynteesin estymiseen [W. Mailer et ai.; FEBS Lett. 90, 218f (1978)]. Tämän johdosta komplementin aktivoitumisen klassinen reaktioket-ju jää pois. Prolyylihydroksilaasin inhibiittorit eli es-35 täjät vaikuttavat tämän johdosta myös immunosuppressiivi-sina aineina, esimerkiksi immunokompleksisairauksissa.

i 11 88303

Keksinnön mukaisesti valmistettuja aineita voidaan tämän johdosta käyttää fibrosuppressiivisina aineina, im-munosuppressiivisina aineina, ateroskleroosia eli valtimon kovettumatautia ehkäisevinä aineina, sekä kasvainten hoi-5 dossa.

Estovaikutus voidaan määrittää käyttäen entsyymi-testiä, joka perustuu julkaisussa B. Peterkovsky ja R. Di Blasio; Anal. Biochem. 66, (1975), ss. 279 - 286 kuvattuun menetelmään. Tällöin alihydroksiloitu kollageeni hydroksi-10 loidaan prolyylihydroksilaasin vaikutuksesta entsymaatti sesti rauta(II)ionien, α-ketoglukaraatin ja askorbaatin läsnäollessa.

Eston "tappaja" -luonteen määrittämiseksi esi-inku-boidaan entsyymiä rauta(II)ionien, α-ketoglukaraatin ja 15 askorbaatin läsnäollessa estoaineiden kanssa eri pituisia aikoja ja lopuksi määritetään peptidisubstraatin läsnäollessa entsyymin loppuaktiviteetti. Aktiviteetin määritykseen voidaan käyttää sekä edellä kuvattua Peterkovsky'n ja Di Blasio'n menetelmää että myös muita menetelmiä, kuten 20 esimerkiksi K. 1. Kivirikon ja R. Myllylän julkaisussa

Meth. Enzym. 80, (1082), ss. 245 - 304 kuvaamaa menetel mää.

Taulukossa 1 on esitetty joidenkin valittujen keksinnön mukaisten yhdisteiden estovaikutus. Tällöin on il-25 moitettu se konsentraatio, joka inaktivoi 50 % entsyymistä 1 tunnin kuluttua.

12 88303

Taulukko 1

Yhdiste_ipso [60 min; umol/l]

Ac-Pro-Opr-Gly-OtBu 8000,0 5 Ac-Pro-Opr-Gly-OBzl 60,0 Z-Ala-Opr-Gly-OtBu 40,0 Z-Ala-Opr-Gly-OH 330,0

Ac- Pro-Opr-Gly-NH-CH2-CH2-C6H5 4900,0

Ac-Pro-Opr-Gly-N(C2H5)2 16900,0 10 Ac-Pro-Opr-Gly-NH-CH2-C6H5 6000,0 Z-Ala-Opr-Gly-OBzl 3,0 Z-(D)-Ala-Opr-Gly-OBzl >10000,0 Z-Phe-Opr-Gly-OBzl 0,8

Msc-Glu(OBzl)-Opr-Gly-OBzl 30,0 15 Z-Val-Opr-Gly-OBzl 40,0 Z-Glu-Opr-Gly-OBzl 5000,0 C5H5-CH2-CO-Opr-Gly-OBzl 1000,0 C6H5-CH2-CO-Opr-Gly-O-CH2-C6H4-4-N02 540,0 Z-Phe-Opr-NH-CH2-CO-CH2-CH2-C6H5 3,4 20 C5H5-CH2-CH2-CO-Opr-Gly-OBzl 2000,0 Z-Tyr-Opr-Gly-OBzl 2,4 Z-Phe-Opr-Sar-OBzl > 10000,0 Z-Lys(Pht)-Opr-Gly-OBzl 11,0 Z-Phe-Opr-NH-CH2-CO-C6H5 2,4 25 C6H5-CH2-Opr-Gly-OBzl 610,0 Z-Phe(r)-Opr-Gly-OBzl 1,1 H- Phe- Opr- NH- CH2- CO- C6H4- 4- Cl 15,5 Z-Phe-Opr-NH-CH2-CO-C6H4-4-CN 1,1 Z-Phe-Opr-Gly-0-CH2-C6H4-4-F 0,8 30 Z-Phe-Opr-Gly-0-CH2-CH2-C5H5 0,9 Z-Tie-Opr-Gly-OBzl 1,5 13 88303

Estovaikutus voidaan myös määrittää solu- tai ku-dosviljelmää käyttäen. Tähän tarkoitukseen käytetään fib-roplasteja tai muita kollageenia tuottavia soluja tai pääkallon lakea tai muita kollageenia tuottavia elimiä.

5 Taulukkoon 2 on koottu joidenkin keksinnön mukais ten aineiden estovaikutus pääkallon laki -viljelmässä. Tällöin on ilmoitettu se konsentraatio, joka johtaa hydr-oksiproliini/proliini -osamäärän 50-%:iseen laskuun 14C-proliinia annettaessa.

10

Taulukko 2

Yhdiste_IC«« f^M] Z-Ala-Opr-Gly-OBzl 1650 15 Ac-Pro-Opr-Gly-OtBu 7500 Z-Vai-Opr-Gly-OBzl 380 Z-Pro-Opr-Gly-OtBu 550 C6H5-CH2-CO-Opr-Gly-OBzl 2000 Z-Ala-Opr-Gly-OBzl 2500 20 C6H5-CH2-C0-0pr-Gly-0CH2-C6H4-4-N02 2500

Antifibroottinen vaikutus voidaan määrittää käyttämällä mallina hiilitetrakloridilla aikaansaatua maksa-fibroosia eli maksan sidekudoksen poikkeuksellista lisään-25 tyrnistä.

Tätä tarkoitusta varten rottia käsitellään 2 kertaa viikossa oliiviöljyyn liuotetulla CCl4:llä (1 ml/kg). Testiaine annostellaan päivittäin, mahdollisesti 2 kertaa päivässä suun kautta tai intraperitoneaalisesti, liuotet-30 tuna hyväksyttävään sopivaan liuottimeen. Maksafibroosin laajuus määritetään histologisesti. Kollageenin osuus maksassa (hydroksiproliinin määritys) analysoidaan kuten julkaisussa Kivirikko et ai.; Anal. Biochem. 19, 249f (1967) on kuvattu. Fibrogeneesin aktiviteetti voidaan määrittää 35 kollageenifragmenttien ja prokollageenipeptidien radioim- 14 3 8 303 munologisella määrityksellä seerumissa. Keksinnön mukaisesti valmistetut yhdisteet vaikuttavat tässä koejärjestelyssä konsentraatioissa 1 - 100 mg/kg.

Toisena mallina antifibroottisen vaikutuksen arvi-5 oimiseksi on bleomysiinillä aikaansaatu keuhkofibroosi eli keuhkojen sidekudoksen poikkeuksellinen lisääntyminen, kuten julkaisussa Kelley et ai.; J. Lab. Clin. Med. 96 (1980), s. 954 on kuvattu. Keksinnön mukaisesti valmistettujen yhdisteiden granulaatiokudokseen kohdistuvan vaiku-10 tuksen arvioinnissa voidaan käyttää apuna vanutuppogranu-looman mallia, kuten on kuvattu julkaisussa Meier et ai.; Experentia 6, (1950), s. 469.

Seuraavat esimerkit selventävät esillä olevaa keksintöä, rajoittamatta sitä kuitenkaan niihin.

15 Esimerkeissä on käytetty seuraavia lyhenteitä; AA aminohappoanalyysi Ac asetyyli

Boc tert.-butoksikarbonyyli 20 DC ohutkerroskromatografia DCC disykloheksyylikarbodi-imidi DCH disykloheksyyliurea DMF dimetyyliformamidi DMSO dimetyylisulfoksidi 25 EE etikkahappoetyyliesteri FAB Fast atom bombardment

Fmoc 9-fluorenyylimetyylioksikarbonyyli HOBt 1-hydroksibentsotriatsoli HPhe homefenyylialaniini 30 M molekyylipiikki

MeOH metanoli MS massaspektri CHN alkuaineanalyysi NEM N-etyylimorfoliini 35 tBu tert.-butyyli 15 88303

Pht fralyyli Sp. sulamispiste THF tetrahydrofuraani Z bentsyylioksikarbonyyli ^ h tunti min minuutti RT huoneen lämpötila Tic 1,2,3,4-tetrahydroisokinoliili Phg fenyyliglysiini 10 Muut aminohapoille ja suojaryhmille käytetyt lyhen teet vastaavat peptidikemiassa tavanaomaisia kirjainkoodeja, joita on kuvattu esimerkiksi julkaisussa Europ. J. Biochem. 138 (1984), ss. 9 - 37. Jollei toisin ole ilmoitettu, on aina kyse L-konfiguraation omaavista aminoha- 15 poista.

Lyhenne "Opr" liitetään yhteisymmärryksessä tavanomaisen kolme-kirjain-koodin kanssa ei-luonnolliseen aminohappoon, 5-oksaproliiniin (isoksatsolidiini-3-karboksyy-lihappo). Opr, J-Opr-OH, Opr(r) ja Opr(t) vastaavat täten 20 seuraavia rakenteita:

Opr: H-Opr-OH: Opr(r): Opr(t): 25 I V / V / \ / \ N^CO- °vN/AsCO h °\n a °\N/^CS-

I I 2 , ch2" I

H 1 H-Opr-OtBu:n synteesi tapahtuu vastaavasti kuin 30 julkaisussa J.C.S. Chem. Conunun. 1981, ss. 97 - 99 on esitetty .

Kromatografia-eluointiainesysteemit: 1. CHClj/MeOH 9:1 2. EE/ 2:1 35 3. EE/ 1:1 ie 38 303 4. EE/ 4:1 5. EE/ 3:1 6. CHCI3CH3OH 11:1 7. CHCI3/CH3OH/EE 10:2:1 5

Esimerkit: Ä.l. Z-Phe-Opr-Gly-OBzl A.1.1. Z-Phe-Opr-OtBu 600 mg J-Opr-OtBu:n hydrokloridia, 860 mg 10 Z-Phe-OH:a, 0,36 ml NEM:a ja 395 mg HOBt:a liuotetaan DMF:iin. Sen jälkeen kun on lisätty 590 mg DCC:ä, annetaan reagoida 28 tuntia huoneen lämpötilassa. Liuotin haihdutetaan, jäännös liuotetaan 20 ml:aan EE:ä ja ravistellaan kulloinkin 3 kertaa 20 ml:n kanssa 20-%:ista vesipitoista 15 sitruunahappoa ja lopuksi 20 ml:n kanssa kyllästettyä vesipitoista natriumvetykarbonaattiliuosta. Orgaaninen faasi kuivataan natriumsulfaatilla, suodatetaan ja liuotin haihdutetaan. Eristetään 1,20 g Z-Phe-Opr-OtBu:a värittömänä jauheena. Raakatuotteelle suoritetaan suoraan ilman eri 20 puhdistusta seuraava reaktiovaihe A.1.2.

A.1.2. Z-Phe-Opr-OH

1,20 g Z-Phe-Opr-OtBu:a liuotetaan 10 ml:aan tri-fluorietikkahappoa. Sekoitetaan 1 tunti huoneen lämpötilassa, liuotin haihdutetaan korkeatyhjössä ja jäännös kro-25 matografoidaan silikageelillä (systeemiä 7 käyttäen).

Eristetään 800 mg Z-Phe-Opr-OH:a. Rf (systeemi 7) 0,2; MS (FAB): 399 (M+l).

A.1.3. Z-Phe-0pr-Gly-0Bzl 800 mg Z-Phe-Opr-OH:a, 640 mg H-Gly-OBzl:n hydro-30 kloridia, 260 μΐ NEM:a, 270 mg H0Bt:a ja 417 mg DCC:ä liuotetaan 20 ml:aan DMF:a ja sekoitetaan 18 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Liuotin haihdutetaan tyhjössä. Jäännös kromatografoidaan silikageelillä (systeemi 3). Eristetään 520 mg Z-Phe-0pr-Gly-0Bzl:a amorfisena kiinteänä ai-35 neena. Rf (systeemi 3) = 0,39; MS (FAB): 546 (M+l).

17 88303

Vastaavasti kuin esimerkissä A.1.1 on kuvattu syntetisoidaan esimerkkien A.2. - A.62. yhdisteet peptidikyt-kennällä, jolloin esimerkiksi liitetään aminohappo N-ter-minaalisesti H-Opr-OtBu:iin, ja lopuksi esteri hydrolysoi-5 daan ja toinen aminohappo lisätään.

A. 2. Z-Ala-Opr-Gly-OBzl A.3. Z-(D)-Ala-Opr-Gly-OBzl

A.4. Z-Ala-Opr-Gly-OtBU

10 A. 5. Z-Ala-Opr-Gly-OH

A.6. Z-Arg-Opr-Gly-OBzl A.7. Z-Arg(Z2)-0pr-Gly-0Bzl A.8. Z-Asp-Opr-Gly-OBzl A.9. Z-Asn-Opr-Gly-OBzl 15 A.10. Msc-Asn-Opr-Gly-OBzl A.11. Z-Dab-Opr-Gly-OBzl A.12. Z-Cys(Acm)-Opr-Gly-OBzl A.13. Z-Cys(Bzl)-Opr-Gly-OBzl A.14. Z-Cys-Opr-Gly-OBzl 20 A.15. Z-Gln-Opr-Gly-OBzl A.16. Z-Gln-0pr-Gly-0-CH2-C6H4 (P-NO2) A.17. Z-Glu(OBzl)-Opr-Gly-OBzl A.18. Z-Glu-Opr-Gly-OBzl A.19. Z-Gly-Opr-Gly-OBzl 25 A.20. Z-His-Opr-Gly-OBzl A.21. Z-Ile-Opr-Gly-OBzl A.22. Z-Leu-Opr-Gly-OBzl A.23. Msc-Leu-Opr-Gly-OBzl A.24. Z-Ly8(Msc)-Opr-Gly-OBzl 30 A.25. Z-Lys(Pht)-Opr-Gly-OBzl A.26. Z-Lys-Opr-Gly-OBzl A.27. Z-Orn-Opr-Gly-OBzl A.28. H-Phe-Opr-Gly-OBzl

A.29. Z-Phe-Opr-Gly-O-CH2-C6H4-4-F

35 A.30. Z-Phe-Opr-(D)-Ala-OBzl A.31. Z-Phe-Opr-Sar-OBzl A.32. Ac-Pro-Opr-Gly-OBzl A. 33. Z-Pro-Opr-Gly-OBzl ib 8 8 30 5 A.34. Ac-Pro-Opr-Gly-OtBu A.35. Z-Pro-Opr-Gly-OtBu A.36. Z-Opr-Opr-Gly-OBzl A.37. Z-Opr-Opr-Gly-O-CH2-C6H4-4-Cl 5 A.38. Z-Ser-Opr-Gly-OBzl A.39. Z-Thr(Bzl)-Opr-Gly-OBzl A.40. Z-Thr-Opr-Gly-OBzl A.41. Z-Tyr(CH3)- Opr-Gly-OBzl A.42. Z-Tyr-Opr-Gly-OBzl 10 A.43. Z-Trp-Opr-Gly-OBzl A.44. Z-Val-Opr-Gly-OBzl A.45. Z-Phe-Opr-Gly-0-CH2-CH2-C6H5 A.46. Z-Tic-Opr-Gly-OBzl A.47. Z-Phe-Opr-Gly-OEt 15 A.48. Z-Phe-Opr-Gly-(O-CH2-CH2)3-OCH3 A.49. Z-Phe-0pr-Gly-0-CH(C6H5)2 A.50. Z-Phe-Opr-Gly-O-CH2-(C5H4N)

A.51. Z-Phe-Opr-Gly-0-CH2-C6H4-2-F

A.52. Z-Phe-Opr-Gly-0-CH2-C6H4-3-F

20 A.53. Z-Phe-Opr-Gly-0-CH2-C5H4-4-F

A.54. Z-Phe-Opr-Gly-O-(CH2)3-C6H5

A.55. Z-Phe-Opr-Gly-O-(CH2)2-C6H4-4-F

A.56. Z-(4'-Cl)Phe-Opr-Gly-OBzl A.57. Z-(4'-F)Phe-0pr-Gly-0Bzl 25 A.58. Z-(4'-N02)Phe-Opr-Gly-OBzl A.59. Z-Phe-Opr-Gly-0-CH2-CH(C02Et)-CH2-CgHs A.60. Z-Phe-Opr-Gly-0-CH2-CH(COOH)-CH2-C6H5 A.61. Z-Phg-Opr-Gly-OBzl A.62. Z-HPhe-Opr-Gly-OBzl 30 Näin valmistettujen peptidien rakenteiden osoittamiseksi käytettiin erilaisia analyyttisiä ja spektroskooppisia menetelmiä. Joitakin tuloksia on koottu taulukkoon 35 3.

19 88303

Taulukko 3

Tripeptidien Ä-Opr-B analyyttiset arvot (esimerkit A.l. - A.62.).

Nro g-H(Opr) 3-H2(Opr) 4-H?(0pr) 2-H(A) 3-Hx;A) 2-Hy(B) Muut 5 ~ ' ” ‘

A.l. 4,85 2,5 -2,7 3,95-4,2 5,1 3,1 3,95 MS; CHN

A.2. 4,75 2,55-4,2 3,95-4,2 4,85 1,45 4,05 MS; CHN

A.3. 4,8 2,55-2,8 3,9 -4,05 4,2 1,35 3,95 MS; CHN

A.4. 4,75 2,55-2,9 3,9 -4,1 4,8 1,45 4,0 MS; CHN

A.5. 4,75 2,5 -2,75 3,9 -4,1 4,8 1,45 4,05 MS

A.6. 4,8 2,5 -2,75 3,95-4,1 4,85 1,75 4,0 MS

10 A.7. 4,8 2,5 -2,75 3,9 -4,1 4,75 1,75 4,0 MS; CHN

A.8. 4,8 2,55-2,7 3,9 -4,15 4,9 2,8 3,9 MS

A.9. 4,75 2,55-2,7 3,9 -4,1 4,85 2,7 3,95 MS

A.10. 4,9 2,55-2,7 3,9 -4,1 4,9 2,65 4,0 MS; CHN

A.11. 4,9 2,5 -2,75 3,95-4,1 4,9 2,1 3,95 MS

A.12. 4,8 2,55-1,8 3,9 -4,15 4,95 3,1 4,0 MS

15 A.13. 4,85 2,55-2,75 3,9 -4,1 4,95 3,0 3,95 MS

A.14. 4,85 2,55-2,75 3,9 -4,05 5,0 3,05 3,95 MS; CHN

A.15. 4,85 2,5 -2,75 3,95-4,1 4,9 2,45 3,95 MS; CHN

A.16. 4,85 2,5 -2,75 3,95-4,1 4,9 2,5 4.0 MS

A.17. 4,7 2,5 -2,7 3,9 -4,1 4,85 2,2 4,0 MS; CHN

A.18. 4,85 2,55-2,7 3,9 -4,15 4,8 2,2 4,05 MS; CHN

20 A.19. 4,95 2,5 -2,7 3,9 -4,1 4,1 - 4,0 MS; CHN

A.20. 4,9 2,5 -2,75 3,9 -4,15 4,9 3,2 3,95 MS

A.21. 4,9 2,55-2,7 3,95-4,1 4,85 2,0 4,0 MS

A.22. 4,9 2,5 -2,85 4,0 -4,05 4,9 1,95 4,05 MS

A.23. 4,8 2,50-2,8 3,95-4,1 4,95 1,9 4,0 MS

A.24. 4,85 2,55-2.8 3,95-4,2 4,8 1,8 4,1 MS; CHN

25 A.25. 4·75 2·5 *2'75 3’9 *4·05 4·9 1.85 4·05 MS

A.26. 4,9 2,55-2,75 3,85-4,15 4,9 1,85 4,05 MS; CHN

A.27. 4,9 2,5 -2,75 3,9 -4,05 4,85 2,05 4,0 MS

A.28. 4,85 2,55-2,80 3,9 -4,1 4,25 2,95 3,95 MS

A.29. 4,85 2,5 -2,75 3,9 -4,15 5,0 3,1 3,95 MS; CHN

A.30. 5,05 2,5 -2,7 3,9 -4,2 4,8 3,1 4,55 MS; CHN

3Q A.31. 4,95 2,5 -2,65 4,0 -4,3 5,1 3,1 3,75; 4,6 MS; CHN

A.32. 4,95 2,55-2,65 4,05-4,15 5,0 2,1 4,05 MS; CHN

A.33. 4,9 2,5 -2,6 3,6 -4,0 4,9 2,1 3,95 MS; CHN

A.34. 4,9 2,55-2,7 3,8 -3,85 4,85 2,1 4,1 MS; CHN

A.35. 4,9 2,5 -2,65 3,65-4,0 5,05 2,1 4,0 MS; CHN

A.36. 4,9 2,5 -2,7 3,75-3,95 5,0 2,6 4,1 MS

A.37. 4,8 2,55-2,7 3,7 -4,0 5,0 2,55 4,0 MS

35 A.38. 4,9 2,5 -2,7 3,75-4,05 5,0 2,75 4,0 MS

A.39. 4,95 2,5-2,75 3,9-4,15 5,05 3,9 4,0 MS

A.40. 4,95 2,5 -2,7 3,9 -4,1 4,85 3,9 4,0 MS; CHN

on R8303 20

Fro 2-H(0pr) 3-H2(Qpr) 4-H2(Opr) 2-H(A) 3-Hx(A) 2-Hy(B) Muut

A.41. 4,8 2,5 -2,7 3,9 -4,15 4,9 3,1 3,95 MS

A.42. 4,85 2,5 -2,7 3,9 -4,15 4,9 3,0 4,05 MS; CHN

A.43. 4,95 2,5 -2,65 3,9 -4,1 4,95 3,0 4,05 MS; CHN

A.44. 4,7 2,55-2,7 3,9 -4,1 4,9 2,1 4,05 MS; CHN

A.45. 4,85 2,5 -2,7 3,9 -4,15 5,0 3,0 4,05 MS; CHN

5 A.46. 4,8 2,5 -2,75 3,85-4,1 5,1 3,0-3,25 3,95 MS; CHN

A.47. 4,8 2,5 -2,8 3,9 -4,2 4,8 3,0-3,3 3,9 MS; CHN

A.48. 4,85 2,5 -2,85 3,9 -4,25 5,1 3,0-3,2 4,0 MS; CHN

A.49. 4,85 2,5 -2,8 3,85-4,2 5,05 3,1 3,9-4,15 MS; CHN

A.50. 4,85 2,5 -2,8 3,9 -4,15 5,1 3,1 4,05 MS; CHN

A.51. 4,85 2,5 -2,8 3,9 -4,15 5,05 3,1 3,95 MS; CHN

10 A.52. 4,8 2,5 -2,75 3,9 -4,2 5,05 3,1 3,95 MS; CHN

A.53. 4,8 2,5 -2,8 3,9 -4,2 5,1 3,1 3,95 MS; CHN

A.54. 4,85 2,45-2,8 3,9 -4,2 5,1 3,0-3,2 3,9 MS; CHN

A.55. 4,8 2,5 -2,8 3,9 -4,2 5,1 3,0-3,2 3,95 MS; CHN

A.56. 4,8 2,5 -2,9 3,9 -4,25 5,1 3,0-3,3 4,0-4,2 MS; CHN

A.57. 4,8 2,5 -2,85 3,9 -4,25 5,1 3,05-3,3 4,0-4,2 MS; CHN

15 A.58. 4,8 2,5 -2,9 3,9 -4,3 5,1 3,1-3,35 4,0-4,2 MS; CHN

A.59. 4,9 2,45-2,8 3,95-4,2 5,1 3,1-3,3 4,0 MS; CHN

A.60. 4,8 2,5 -2,8 3,85-4,2 5,1 3,0-3,3 4,0 MS; CHN

A.61. 4,9 2,5 -2,8 3,9 -4,2 5,8 - 3,95 MS; CHN

A.62. 4.75 2.4 -2.8 3,8 -4.2 4,85 1.8-2,1 3.9-4.1 MS; CHN

20 B.l. N-fenyyliasetyyli-0pr-Gly-4-nitrobentsyyliesteri B.1.1. N-fenyyliasetyyli-Opr-OtBu 500 mg:aan H-0pr-0tBu:n hydrokloridia, 324 mg:aan fenyylietikkahappoa, 320 mg:aan HOBt:a ja 300 yl:aan NEM:a 10 ml:ssa dimetyyliformamidia lisätään 490 mg DCC:ä ja 25 sekoitetaan 48 tuntia huoneen lämpötilassa. Urea suodatetaan erilleen, liuotin haihdutetaan tyhjössä, jäännös liuotetaan etikkaesteriin ja pestään vesipitoisella sitruunahapolla ja vesipitoisella natriumsulfaatilla. Kun liuotin on poistettu tislaamalla, eristetään 600 mg vähän 30 epäpuhdasta yhdistettä, N-fenyyliasetyyli-Opr-OtBu:a.

B.l.2. N-fenyyliasetyyli-Opr-OH

600 mg kohdan B.1.1. raakatuotetta liuotetaan 5 ml:aan trifluorietikkahappoa ja sekoitetaan 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Sen jälkeen kun on haihdutettu kor-35 keatyhjössä, kiteytetään uudelleen EE:stä. Eristetään 250 2i 88303 mg N-fenyyliasetyyli-Opr-OH:a. Rf (systeemi 7) = 0,65; MS (FAB): 235 (M+l).

B.1.3. N-fenyyliasetyyli-Opr-Gly-4-nitrobentsyyliesteri 70 mg N-fenyyliasetyyli-Opr-OH:a, 87 mg 5 H-Gly-0Bzl-N02:n vetybromidia, 40 μΐ NEM:a ja 41 mg H0Bt:a liuotetaan DMF:iin. Lisätään 62 mg CDD:ä ja sekoitetaan 8 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Sen jälkeen kun liuotin on haihdutettu, kromatografoidaan silikageelillä (systeemi 5). Rf (systeemi 5) = 0,43; MS (FAB): 428 (M+l).

10 Vastaavasti kuin esimerkissä B.l. syntetisoidaan esimerkkien B.2. - B.19. yhdisteet, jolloin ensiksi kytketään karboksyylihappo N-terminaalisesti H-0pr-0tBu:iin ja lopuksi esteri saippuoidaan ja C-terminaalinen rakenneosa liitetään.

15 Esimerkki nro B.2. N-bentsyyli-Opr-Gly-OBzl B. 3. N-4-klooribentsoyyli-Opr-Gly-OBzl

B. 4. N-2-fluoribentsoyyli- Opr-Gly-OBzJ

B. 5 . N-3-hydroksifenyyliasetyyli- Opr-Gly-OBzl B. 6. N-4-fluorifenyyliasetyyli- Opr-Gly-OBzl B.7. N-bentsyylioksikarbonyyli- Opr-Gly-OBzl B.8. N- 3-f enyylipropionyy li- Opr-Gly-OBzl B.9. N-fenoksiasetyyli-Opr-Gly-OBzl B.10 N-4-fenyylibutyryyli-Opr-Gly-OBzl 25 B.11. N-4,4-di-p-fluorifenyylibutyyli-Opr-Gly-OBzl B.12. N-difenyyliasetyyli-Opr-Gly-OBzl B.13. Pivaloyyli-Opr-Gly-OBzl B.14. N-(3-fenyylipropionvyli)-0pr-Gly-0CH2”C6H4-4-N02 B. 15 4-CH3-C6H4-SO2-Opr-Gly-OBzl 30 B.16. N-fenyyliasetyyli-Opr-Gly-0-CH(CH3>2 B.17. n-(2-asetoksi-3-fenyylipropionyyli)- Opr-Gly-OBzl B.18. N-(2-hydroksi-3-fenyylipropionyyli) - Opr-Gly-OBzl B.19. N-iC6H5-(CH2)2-CO-O-CH(CH2-C6H5)-CO]-Opr-Gly-OBzl 22 88303

Taulukko 4

Dlpeptidien A-Opr-Gly-OR analyyttiset arvot (esimerkit B. 2. - B.19.) ^-NMR : β [ppm] = 5 Nro 2-H(0pr) 3-Hz(0pr) 4-H2(Opr) CH2(G1y) CHx-CO(A) Muut

B.l. 4,85 2,45-2,85 3,65-4,15 4,1 3,8 MS; CHN

B.2. 4,9 2,5 -2,8 3,65-4,1 4,0 - MS; CHN

B.3. 4,95 2,55-2,8 3,65-4,05 4,05 - MS; CHN

B.4. 4,9 2,5 -2,8 3,65-4,1 4,0 - MS; CHN

B.5. 4,85 2,5 -2,8 3,65-4,1 4,05 3,75 MS; CHN

B.6. 4,9 2,5 -2,8 3,65-4,15 4,05 4,0 MS; CHN

B.7. 4,9 2,5 -2,8 3,65-4,1 4,0 5,2 MS; CHN

B.8. 4,85 2,45-2,7 3,55-4,1 4,05 2,7 MS; CHN

B.9. 4,9 2,5 -2,8 3,6 -4,1 4,05 4,7 MS; CHN

B.10. 4,9 2,5 -2,75 3,6 -4,1 4,0 2,7 MS; CHN

B.ll. 4,9 2,5 -2,8 3,6 -4,1 4,05 2,65 MS; CHN

15 B.12. 4,85 2,55-1,85 3,65-4,05 4,05 5,05 MS; CHN

B.13. 4,9 2,5 -2,8 3,6 -4,05 4,0 - MS; CHN

B.14. 4,85 2,45-2,75 3,6 -4,1 4,1 3,7 MS; CHN

B.15. 4,15 2,5 -2,75 3,7 -4,05 4,2 - MS; CHN

B.16. 4,85 2,45-2,8 3,7 -4,1 4,1 3,8 MS; CHN

B.17. 4,9 2,5 -2,8 4,0 -4,25 4,1 5,6 MS; CHN

20 B.18. 4,95 2,5 -2,8 4,0 -4,2 4,0 4,0 MS; CHN

B.19. 4 ° 2,5 -2,8 3,8 -4,1 4,0 5,5 MS; CHN

C. 1. N-4-fluoribentsyyli-Opr-Gly-OBzl

C.1.1. N-4-fluoribentsyyli-Opr-OH

25 145 mg:aan 4-fluoribentsaldehydiä ja 150 mg:aan H-Opr-OtyBu:n hydrokloridia 20 ml:ssa kuivaa metanolia lisätään 30 mg natriumsyanoboorihydridiä. Lisäämällä 0,01 N metanolipitoista HCl:a pidetään liuoksen pH arvossa 4,0. Sekoitetaan 6 tuntia huoneen lämpötilassa ja lopuksi haih-30 dutetaan tyhjössä melkein kuiviin ja liuotetaan 100 ml:aan 2 N vesipitoista HCl:a. Kuumennetaan 30 minuutin ajan 50 °C:ssa, annetaan jäähtyä ja uutetaan EErllä. Sen jälkeen kun orgaaninen liuos on kuivattu magnesiumsulfaatilla, suodatetaan, liuotin haihdutetaan tyhjössä ja jäännös kro-35 matografoidaan silikageelillä (systeemi 7). Eristetään 160 mg N-4-fluoribentsyyli-Opr-OH:a valkoisena kiinteänä aineena. Rf (systeemi 7) = 0,15; MS (FAB): 226 (M+l).

23 88 303 C.1.2. N-4-fluoribentsyyli-Opr-Gly-OBzl 160 mg N-4-fluoribentsyyli-Opr-OH:a, 105 mg H-Gly-OBzl:a, 100 μΐ NEM:a, 100 mg HOBt:a ja 150 mg DCC:ä liuotetaan 24 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Haihdute-5 taan tyhjössä, liuotetaan 20 ml:aan metyleenikloridia, suodatetaan DCH:sta erilleen ja haihdutetaan uudelleen. Sen jälkeen kun on kromatografoitu silikageelillä (systeemi 3), eristetään 180 mg N-4-fluoribentsyyli-0pr-Gly-0Bzl:a. Rf (systeemi 3) - 0,45; MS (FAB): 373 (M+l).

10 Vastaavasti kuin esimerkissä C.l. syntetisoidaan esimerkkien C.2. - C.6. yhdisteet.

Esimerkki nro C.2. CgHs-CH2-Opr-Gly-OBzl C.3. 4-Cl-C6H4-CH2-0pr-Gly-0Bzl 15 C.4. 4-CH3-CgH4-CH2"Opr-Gly-OBzl C.5. 4-CH3O-CgH4-CH2-Opr-Gly-OBzl C. 6. Z-Phe(r)-Opr-Gly-OBzl

Taulukko 5 20 Esimerkkien C.l. - C.6. dipeptidien analyyttiset arvot iH-NMR : e [ppm] *

Nro 2-H(Opr) 3-H2(Opr) 4-H2(Opr) CH2(Qly) Muut

C.l. 4,1 2,55-2,8 3,85-4,05 4,05 MS; CHN

C.2. 4.1 2,5 -2,8 3,9 -4,1 4,05 MS; CHN

C.3. 4,05 2,5 -2,8 3,85-4,05 4,0 MS

C.4. 4,05 2,5 -2,8 3,9 -4,05 4,05 MS

C.5. 4,05 2,55-2,8 3,9 -4,1 4,05 MS

C.6. 4,05 2,5 -2,75 3,85-4,05 4,05 MS; CHN

30 D. 1. Z-Phe-0pr-NH-CH2-C0-CH2-CH2-C6H5 D.l.l. (D,L)-4-fenyyli-2-hydroksibutyyliamiini-(l) 6,70 g dihydrokanelialdehydiä liuotetaan 20 ml:aan vedetöntä etanolia, lisätään 10 ml nitrometaania ja 1 ml 35 tetrametyyliguanidiinia ja sekoitetaan 1 tunnin ajan huo- 24 88303 neen lämpötilassa. Haihdutetaan tyhjössä, liuotetaan 200 ml:aan etanolia ja 5 ml:aan jääetikkaa, ja sen jälkeen kun on lisätty 10 g aktivoitua Raney-nikkeliä, hydrataan 5 tuntia 50 °C:ssa 25 bar'in H2-paineessa. Suodatetaan kata-5 lysaattorista erilleen ja haihdutetaan tyhjössä, liuotetaan kyllästettyyn vesipitoiseen natriumvetykarbonaatti-liuokseen ja poistetaan polaarittomat epäpuhtaudet uuttamalla dietyylieetterillä. Uuttamalla 3 kertaa tetrahydro-furaanilla, kuivaamalla natriumsulfaatilla ja haihdutta-10 maila tyhjössä, saadaan 5,75 g (D,L)-4-fenyyli-2-hydrok-sibutyyliamiini-(l:tä) värittömänä öljynä.

D. 1.2. Z - Phe - Opr - NH- CH2- CH0H-CH2-CH2-C6Hs 843 mg Z-Phe-0pr-0H:a, 700 mg 4-fenyyli-2-hydroksi-butyyliamiini-(1:tä), 285 mg H0Bt:a ja 436 mg DCC:ä liuo-15 tetaan 10 ml:aan DMF:a. Sen jälkeen kun on lisätty 270 μΐ NEM:a, annetaan reagoida 18 tuntia huoneen lämpötilassa. Liuotin haihdutetaan tyhjössä, jäännös liuotetaan etikka-esteriin ja käsitellään 3 kertaa vesipitoisella sitruuna-happoliuoksella sekä kyllästetyllä vesipitoisella natrium-20 vetykarbonaattiliuoksella. Sen jälkeen kun liuos on kuivattu natriumsulfaatilla, suodatetaan ja haihdutetaan. Kromatografoidaan silikageelillä (systeemi 4) ja eristetään 680 mg yhdistettä. Rf (systeemi 4) = 0,35; MS (FAB): 546 (M+l).

25 D.1.3. Z-Phe-0pr-NH-CH2-C0-CH2-C6H5 200 mg Z-Phe-Opr-NH-CH2-CHOH-CH2-CH2-C6H5:a liuotetaan 20 ml:aan vedetöntä metyleenikloridia ja sen jälkeen kun on lisätty 800 mg pyridiinikloorikromaattia, sekoitetaan 6 tuntia huoneen lämpötilassa. Haihdutetaan tyhjössä 30 ja poistetaan kromisuolat ja vähäisessä määrin muodostu neet sivuyhdisteet kromatografoimalla silikageelillä (systeemi 4). Eristetään 128 mg ketonia. Rf (systeemi 4) -0,68; MS (FAB): 544 (M+l).

Vastaavasti kuin esimerkissä D.l. valmistetaan yh- 35 disteet D.2. - D.28.

25 38303

Esimerkki nro D.2. Z-Phe-Opr-NH-CH2-CO-C5H5

D.3. Z-Phe-Opr-NH-CH2-CO-C5H4-4-OH

D.4. Z-Phe-Opr-NH-CH2-CO-C6H4-4-OCH3 5 D.5. Z-Phe-Opr-NH-CH2-CO-CH2-C5H5

D.6. Z-Phe-Opr-NH-CH2-CO-CH2-C6H4-4-OH

D.7. Z-Phe-Opr-NH-CH2-CO-CH2-CH2-CeH4-4-Cl D.8. Z-Phe-Opr-NH-CH2-CO-CH2-CH2-CH2-C6H5 D.9. Z-Phe-Opr-NH-CH2-CO-CeH4-4-CH(CH3)2 10 D.IO. CgH5-CO-Opr-NH-CH2-CO-CH2-C5H5

D.11. Z-Phe-Opr-NH-CH2-CO-C6H4-4-CN

D.12. H-Phe-Opr-NH-CH2-CO-C6H4-4-Cl D.13. Z-Phe-Opr-NH-CH2-CO-j^Qj^j D.14. Z-Phe-Opr-NH-CH2-CO-CgH4-4-Cl

D.15. Z-Phe-Opr-NH-CH2-CO-C6H4-4-F

D.16. Z-Phe-Opr-NH-CH2-CO-C6H4-4-CF3

D.17. Z-Phe-Opr-NH-CH2-CO-C6H4-4-COOH

D.18. Z-Phe-Opr-NH-CH2-CO-C6H4-3-CN

20 D.19. N- [C6H5- (CH2) 2- CO- O- CH (CH2- CfcH5) - CO] - Opr- Gly-(o)- Cl D.20. N-(2-asetoksi-3-fenyylipropionyyli)-

Opr-NH-CH2- CO- c6H4-C1 D‘21* N-(2-hydroksi-3-fenyylipropionyyli)-

Opr-NH-CH2-CO- CeH4-Cl 25 D.22. Z-Phe-0pr-NH-CH2-C0-C6H4-4-C02CH3 D.23. Boc-Phe-Opr-NH-CH2-CO-C6H4-4-Cl D.24. Z-Glu-Opr-NH-CH2-CO-C6H4-4-Cl D.25. Z-Cys-Opr-NH-CH2-CO-C6H4-4-Cl D.26. Z-Phe-Opr-NH-CH2- CO-CH2-CH(C02Et)-CH2-C6H5 30 D.27. C6H5-(CH2)2-S02-CH2-CH(CH2-C6H5)-CO-Opr-

NH- CH2- CO- C6H4- 4- CN

D.28. CgHs-(CH2)2-S02-CH2-CH{CH2-C5H5)-CO-Opr-NH- CH2-CO-CH2-CH(CH2-C6H5)-C02C2H5 26 88303

Taulukko 6

Esimerkkien D.l. - D.28. dipeptidien analyyttiset arvot iH-NMR s β [ppm] =

Nro 2-H(Opr) 3-H2(Opr) 4-H2(Opr) N-CH2-CO Muut 5 ““ —

D.l. 4.9 2,55-2,7 3,95-4,2 4,0 MS; CHN

D.2. 5,1 2,6 -2,8 3,95-4,25 4,7 MS; CHN

D.3. 5,0 2,55-2,7 3,9 -4,2 4,6 MS; CHN

D.4. 4,9 2,5 -2,7 3,9 -4,15 4,6 MS

D.5. 5,0 2,55-2,7 3,9 -4,1 4,1 MS; CHN

10 D·6· 5,0 2,55-2,7 3,95-4,05 4,05 MS

D.7. 5,0 2,55-2,7 3,9 -4,15 4,1 MS; CHN

D.8. 4,9 2,55-2,7 3,9 -4,15 4,0 MS; CHN

D.9. 5,1 2,6 -2,8 3,95-4,2 4,7 MS; CHN

D.10. 4,9 2,5 -2,8 3,65-4,1 4,15 MS; CHN

D.ll. 4,9 2,6 -2,8 3,95-4,25 4,7 MS; CHN

15 D.12. 4,95 2,5 -2,7 3,9 -4,15 4,65 MS; CHN

D.13. 4,9 z,5 -2,85 3,9 -4,3 4,85 MS; CHN

D.14. 4,9 2,5 -2,7 3,95-4,3 4,6-4,8 MS; CHN

D.15. 4,95 2,55-2,85 3,9 -4,3 4,7 MS; CHN

D.16. 4,9 2,45-2,8 3,9 -4,3 4,7 MS; CHN

D.17. 4,9 2,50-2,85 3,9 -4,25 4,7 MS; CHN

D. 18. 4,9 2,5 -2,85 3,9 -4,25 4,7 MS; CHN

20

D.19. 4,9 2,5 -2,75 3,9 -4,2 4,6-4,8 MS; CHN

D.20. 4,9 2,45-2,8 3,9 -4,25 4,7 MS; CHN

D.21. 4,95 2,5 -2,8 3,9 -4,3 4,6-4,8 MS; CHN

D.22. 4,9 2,5 -2,85 3,9 -4,3 4,7 MS; CHN

D.23. 4,9 2,5 -2,85 3,9 -4,3 4,65 MS; CHN

D.24. 4,75 2,5 -2,8 3,8 -4,25 4,55 MS; CHN

25 D.25. 4,95 2,55-2,85 3,9 -4,3 4,6-4,8 MS; CHN

D.26. 5,0 2,5 -2,75 3,9 -4,3 4.1 MS; CHN

D.27. 4,9 2,5 -2,8 3,9 -4,25 4,7 MS; CHN

D.28. 4,9 2,5 -2,75 3,9 -4,35 4,1 MS; CHN

E.l. Z-Phe-Opr(t)-Gly-OBzl 30 800 mg Z-Phe-Opr-Gly-OBzl:a sekoitetaan 350 mg:n kanssa Lawesson'in reagenssia ja suspendoidaan 10 ml:aan vedetöntä bentseeniä. Kuumennettaessa 80 °C:seen liuos tulee homogeeniseksi. Sekoitetaan 1 tunti tässä lämpötilassa, haihdutetaan tyhjössä ja jäännös kromatografoidaan si-35 likageelillä (systeemi 3). Eristetään 210 mg tioamidia i 27 88303 Z-Phe-Opr(t)-Gly-OBzl [Rf (systeemi 3) - 0,45; MS (FAB): 562 (M+l)] ja 62 mg tioamidia Z-Phe(t)-Opr-Gly-OBzl [Rf (systeemi 3) = 0,61; MS (FAB): 562 (M+l)].

Vastaavasti kuin esimerkissä E.l. valmistetaan yh-5 disteet E.2. ja E.3.

Esimerkki nro E. 2. Z-Phe-Opr (t) -NH-CH2-CO-CH2-C6H5 E. 3. 4-F-C6H4-CO-Opr( t) -NH-CH2-CO-CH2-C6H4-4-Cl 10 Taulukko 7

Esimerkkien E.l. - E.3. dipeptidien analyyttiset arvot iH-NMR : 6 [ppm] =

Nro 2 - H (Opr) (t) 3-H2(Opr(t)) 4-H2(Opr(t)) N-CH2-CO Muut

E.l. 5,2 2,55-2,75 3,95-4,2 4,1 MS

E.2. 5,1 2,5 -2,7 3,9 -4,25 4,15 MS

E.3. 5,0 2,55-2,1 3,75-4,1 4,05 MS

20 F. Yleisen rakennetyypin A-Opr(r)-Gly-F-R4 mukaisten yhdisteiden synteesi tapahtuu ryhmistä A, F ja R4 riippuen jonkin kohdissa e2), e2) tai e3) sivuilla 7 ja 8 kuvatun menetelmän mukaisesti.

Esimerkki nro 25 F. 1. Z-Phe-Opr (r)-Gly-O-Bzl F.2. Z-Phe-Opr(r)-Gly-0-CH2-C6H4-4-Cl F.3. Z-Phe-Opr(r)-NH-CH2-CO-C6H5

F.4. Z-Phe-Opr(r)-NH-CH2-CO-C6H4-4-OH

F.5. Z-Phe-Opr(r)-NH-CH2-C0-C6H4-4-0CH3 30 F.6. Z-Phe-Opr(r)-NH-CH2-CO-CH2-C6H5 F.7. Z-Phe-Opr(r)-NH-CH2-CO-CH2-C6H4-4-Cl F.8. Z-NH-CH(C5H5)-CO-Opr(r)-NH-CH2-CO-CH2-CgHs F.9. C6H5-CH2-CH2-CO-O-CH(CH2-C5H5)- CO-Opr(r) -

NH- CH2- CO- C6H4- 4- CN

35 28 Q Q 7. Π 7 F. 10. C6Hs-CH2-CH2-S02-CH2-CH(CH2-C6H5)-CO-Opr (r) - NH- CH2- CO- C6H4- 4- Cl F. 11. C5H5-CH2- CH2- SO- CH2- CH (CH2- C6H5) - CO- Opr (r) - NH-CH2-CO-C6H4-4-Cl 5 F.12. C5H5-CH2-CH2-S02-CH2-CH(CH2-CgH5)-CO-Opr(r) - NH-CH2-CO-CH2-CH(CH2-C6H5)-C02C2H5 F. 13. C6H5- CH2- CH2- S02- CH2- CH (CH2- C6H5) - CO- Opr (r) -

NH- CH2- CO- CH2- CH (CH2- C6H5) - COOH

G. Kaavan A=Opr-CH2-CH2-CO-F-R4 mukaisten ketometylee- 10 nlanaloglen synteesi tapahtuu sivuilla 8 ja 9 kuvatun menetelmän mukaisesti.

Esimerkki nro G. 1. Z-Phe-Opr-CH2-CH2-CO-CH2-CgHs G.2. Z-Phe-Opr-CH2-CH2-CO-CgH5 15 G.3. Z-Phe-0pr-CH2-CH2-C0-C6H4-4-0CH3 G.4. Z-Phe-Opr-CH2-CH2-CO-CH2-C6H4-4-OCH3 G.5. Z-Phe-Opr-CH2-CH2-CO-CH2-CgH4 G. 7 . Z- NH- CH (C6H5) - CO- Opr- CH2- CH2- CO- CH2- C6H5 G.8. Z-Trp-Opr-CH2-CH2-CO-CH2-CgHs 20

Taulukko 9

Esimerkkien G.l. - G.8. dipeptidien analyyttiset arvot !h-NMR : 6 [ppm] = 25 2-H(Opr) 3-H2(Opr) 4-H2(0pr)_

G.l. 5,2 2,55-2,75 3,9 -4,15 MS; CHN

G.2. 5,1 2,55-2,8 3,85-4,05 MS

G.3. 5,2 2,55-2,75 3,85-4,1 MS

30 G.4. 5,2 2,55-2,75 3,8 -4,05 MS; CHN

G.5. 5,1 2,55-2,8 3,8 -4,05 MS

G.6. 5,15 2,55-2,8 3,8 -4,1 MS

G.7. 5,2 2,55-2,75 3,9 -4,1 MS

G.8. 5,2 2,5 -2,8 3,8 -4,0 MS

Claims

29 88 303

1. Menetelmä kaavan 1 mukaisten terapeuttisesti käyttökelpoisten 2,3-disubstituoitujen isoksatsolidiinien 5 ja niiden fysiologisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi r~\ ° A N B-D-CH-E-F-R4 (I) f I

10. R® jossa A merkitsee peptidikemiassa tavanomaista suojaryhmää, tai kaavan lla mukaista ryhmää

15 R1-N— CH-C- (Ha) l I a R2 R3 0 R1 merkitsee b2) vetyä tai peptidikemiassa tavanomaista 20 N-suojaryhmää, ct) R2 merkitsee vetyä tai metyyliä; R3 merkitsee vetyä tai (Ci-CjJ-alkyyliä, joka on mahdollisesti monosubstituoitu aminolla, bentsyy-lioksikarbonyyliaminolla, hydroksilla, karboksilla, karba-25 moyylillä, guanidinolla, ureidolla, merkaptolla, metyyli-merkaptolla, fenyylillä, 4-kloorifenyylillä, 4-fluorife-nyylillä, 4-nitrofenyylillä, 4-metoksifenyylillä, 4-hydr-oksifenyylillä, ftaali-imidolla, 4-imidatsolyylillä, 3-indolyylillä, 2-tienyylillä, 3-tienyylillä, 2-pyridyy-30 Iillä, 3-pyridyylillä tai sykloheksyyllllä; c2) R! ja R3 merkitsevät yhdessä [-CH2-CH2-CH2-] -ketjua, jossa yksi CH2-ryhmä voi olla korvattu 0:11a; tai c3) R2 ja R3 merkitsevät yhdessä cc" 35 30 88303 B on karbonyyli, tiokarbonyyli tai CH2; di) D on imino, N-metyyli-imino, oksi tai metyleeni; E on karbonyyli, tai jos F on sidos, niin E voi myös 5 merkitä hydroksimetyleeniä; F on oksi, imino, N-metyyli-imino tai suora sidos; R4 merkitsee peptidikemiassa tavanomaista karboksyyli-suoj aryhmää; R8 merkitsee vetyä tai (Cj-C^-alkyyliä; 10 tunnettu siitä, että yhdiste rakennetaan tunnetul la tavalla fragmenteista, mahdollisesti yksi tai useampi väliaikaisesti liitetty suojaryhraä lohkaistaan, karbonyyli funktiot muutetaan mahdollisesti tia-analogeiksi, ja näin saatu kaavan I mukainen yhdiste muutetaan mahdolli- 15 sesti sen fysiologisesti hyväksyttäväksi suolaksi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan I mukainen yhdiste, jossa A on mahdollisesti substituoitu (Cj-Ce)-alkyyli, (Cj-CeJ-alkanoyyli tai mahdollisesti substituoitu 20 (Ci-CaJ-alkoksikarbonyyli, tai se merkitsee kaavan Ha mukaista tähdettä.

3. Yhden tai useamman patenttivaatimuksista 1 ja 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmis tetaan kaavan I mukainen yhdiste, jossa D on imino, oksi 25 tai metyleeni.

4. Yhden tai useamman patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmis tetaan kaavan I mukainen yhdiste, Jossa E on karbonyyli.

5. Yhden tai useamman patenttivaatimuksista 1-4 30 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmis tetaan kaavan I mukainen yhdiste, jossa F on oksi tai suora sidos. 31 88303