FI87231C - Foerfarande foer framstaellning av 2-oxo-karboxylsyrareduktas och dess anvaendning - Google Patents

Description

1 87231 2-oksokarboksyylihapporeduktaasi, sen valmistus ja käyttö

Keksintö koskee uutta 2-oksokarboksyylihapporeduk-taasia, sen valmistusta samoin kuin sen käyttöä 2-oksokar-5 boksyylihappojen ja niiden estereiden pelkistykseen.

On tunnettua pelkistää 2-oksokarboksyylihappoja entsymaattisesti. Näihin pelkistyksiin käytetään entsyymejä, jotka tarvitsevat kosubstraatiksi pyridiininukleoti-deja. Esimerkkinä tällaisesta reaktiosta mainittakoon L-10 laktaatin valmistus pyruvaatista (J. Org. Chem. 47, 2816 (1982)). On lisäksi tunnettua valmistaa 2-hydroksikarbok-syylihappojen raseemisia seoksia optisesti puhtaiden 2-hydroksikarboksyylihappojen enantioselektiivisen, mikro-biaalisen hajottamisen avulla (Appi. Environ. Microbiol. 15 45, 884 (1983)). Entsymaattisella pelkistyksellä pyridii- ninukleotidista riippuvaisten reduktaasien avulla on kuitenkin se epäkohta, että tällöin tarvitaan vielä toinen entsyymi, joka regeneroi uudelleen hapetetun pyridiininuk-leotidin. Tämän lisäksi pyridiininukleotidit hajoavat pi-20 temmässä käytössä.

Nyt on keksitty entsyymi, jolla ei ole näitä haittoja.

Keksinnön kohteena on pyridiininukleotidista riippumaton ja flaviiniryhmiä sisältämätön 2-oksokarboksyyli-25 happoreduktaasi, sen valmistus ja käyttö. Keksinnölle on tunnusomaista se, mitä vaatimuksissa on mainittu.

Oksokarboksyylihapporeduktaasin molekyylipaino on noin 500 000. Sen isoelektrinen piste on arvossa 4,9. Sen käyttökelpoinen pH-alue on välillä 6-8 maksimin ollessa ' 30 arvossa 6,8. Seuraava taulukko osoittaa entsyymin aktivi teetin riippuvuutta lämpötilasta. Tarkistusarvona on aktiviteetti lämpötilassa 24 °C, jonka aktiviteetiksi merkittiin 100 %.

2 87231

Taulukko 1 T (°C) Aktiviteetti (%) T (°C) Aktiviteetti (%) 14 46 34 220 19 72 39 306 5 24 =100 44 368 29 150 49 440 45 °C:n lämpötilassa on hapetetun entsyymin puoliintumisaika fosfaattipuskuriliuoksessa tetrasykliinin 10 läsnäollessa noin 13 tuntia. 35 °C:ssa tämä aika on noin 55 tuntia ja pelkistetyssä tilassa pelkistetyn metyylivio-logeenin läsnäollessa noin 100 tuntia. Aktiviteettikäyrän muoto ei ole 1. asteen käyrä. 8 vast. 40 tunnin kuluttua ei hapetetussa entsyymissä ole havaittavissa vielä mitään 15 aktiviteetin heikkenemistä. EDTAilla ei ole mitään vaikutusta entsyymin aktiviteettiin.

Ainoana prosteettisena ryhmänä on tähän saakka voitu todeta hapolle labiili rikki, joka on luultavasti peräisin Fe/S-kasautumista. Flaviiniryhmiä ei ole spektrofo-20 tometrisesti todettavissa.

Erityisen kiintoisaa on se, että entsyymin aktiviteettia voidaan kohottaa hapetetun metyyliviologeenin avulla. Suurenevien MV**-konsentraatioiden ja 0,15 mM MV*:n läsnäollessa suhtautuvat alkunopeudet seuraavalla tavalla: 25 MV*+ U/ml mM_P.mirabills_P. vulgaris 0,01 18,1 13,3 0,08 41,9 24,4 0,16 46,0 31,3 : 30 0,75 62,0 41,5 (2 mm:n kyvetissä oli 0,3 ml 0,1 M trisasetaattipuskuria pH 7,0, 2 pmol 2-okso-4-metyylipentanoaattia, kussakin haudottiin sama entsyymimäärä samoin kuin 0,2 mM pelkistettyä metyyliviologeenia ja taulukossa ilmoitetut kon-35 sentraatiot hapetettua metyyliviologeenia).

i; 3 87231 2-oksokarboksyylihapporeduktaasia saadaan liuenta-malla mekaanisesti entsyymiä sisältävä mikro-organismi, esim. Proteus vulgaris DSM 30 118 tai Proteus mirabilis DSM 30 115, sentrifugoimalla, ultrasentrifugoimalla sakkaa 5 peittävä neste, liettämällä sakka detergenttiliuokseen ja poistamalla kiinteät epäpuhtaudet uudistetulla ultrasent-rifugoinnilla.

Ensimmäisen sentrifugoinnin tarkoituksena on poistaa karkeat epäpuhtaudet. Se suoritetaan yleensä keskipa-10 kokiihtyvyyden ollessa välillä 5000 - 20 000 g 5 - 10 minuutin pituisen ajan. Sakka heitetään pois. Sakkaa peittävä neste sentrifugoidaan sen jälkeen välillä 0 - 10 °C ja kiihtyvyyden ollessa 80 000 - 120 000 g 1-2 tunnin ajan. Näin saatu sakka lietetään kylmään puskuriliuokseen 15 ja sentrifugoidaan uudelleen kiihtyvyysarvo-välillä 80 000 - 120 000 g. Sakkaan lisätään dispergoimisainetta, kuten Triton X 100 tai ^ween 80 - ja puskuriliuosta (pH 6 - 8) ja sentrifugoidaan uudelleen kiihtyvyysarvoilla 80 000 - 120 000 g. Näin saatu sakkaa peittävä neste si-20 sältää entsyymin liuenneessa muodossa.

Uuden entsyymin avulla ovat yllättävästi useat 2-oksokarboksyylihapot ja niiden esterit pelkistettävissä stereospesifisesti vastaaviksi (2R)-hydroksikarboksyyli-hapoiksi vast, niiden estereiksi. Esimerkkejä tällaisista 25 hapoista ovat: 2-oksopropaanihappo (=palorypälehappo), 3-fluori-2-oksopropaanihappo, 3-metyyli-2-oksopentaanihappo (molemmat enatiomeeriset muodot), 4-metyyli-2-oksopentaa-nihappo, fenyyliketoetikkahappo, fenyylipalorypälehappo, 5-bentsyylioksi-8-indolyylipalorypälehappo, ketomeripih-30 kahappo, 2-oksoglutaarihappo, 2-oksoadipiinihappo, 2-okso- atselaiinihappo, 2-oksosebaslinihappo, 2-oksoundekaanidi-karboksyylihappo, 2-okso-4-(metyylitio)voihappo, indolyy-lipalorypälehappo, 2-okso-4-metyylifosfinovoihappo. Esimerkki esteristä on palorypälehappo-etyyliesteri. Pelkis-35 tystuotteet ovat yleensä jopa yli 98 %:eestikin optisesti 4 87231 puhtaita. Osaksi on optinen puhtaus jopa yli 99,5 %.

Uusi entsyymi ei myöskään tarvitse toimintaansa varten mitään pelkistettyjä pyridiininukleotidejä. Se pystyy siirtämään elektroneja suoraan elektronien kantajalta 5 - kuten metyyli- tai bentsyyliviologeenilta pelkistetyssä tilassa - substraatille.

Esimerkki 1

Proteus mirabilis'ta (DSM 30 115) viljeltiin täys-elatusväliaineessa (hiivauutetta 5,0 g, glukoosia 5,0 g, 10 lihasta saatua peptonia 20,0 g, K2HP04 5,0 g, H20 1000 ml, pH 7,2) 35 eC:ssa kaasuttamalla seoksella, jossa oli 97 % N2 ja 3 % 02. Korkeampia entsyymiaktiviteetteja saadaan raakauutoksessa käyttämällä Proteus vulgaris (DSM 30118). Tässä tapauksessa täytyy kuitenkin viljellä siten, että 15 hapen luoksepääsy on täysin estetty. Raakauutoksissa on saavutettavissa spesifisiksi entsyymiaktiviteeteiksi 7-9 U/mg proteiinia. Näin saadut solut korjattiin talteen aikaisessa stationäärisessä faasissa. 1 paino-osa kosteata bakteerimassaa lietettiin 3 osaan 20 mM kaliumfosfaatti-20 puskuria pH 7,0 ja käsiteltiin jäähauteessa N2-atmosfäärin alaisena ultraäänivärähtelygeneraattorin avulla siksi kunnes yli 90 % soluista oli avautunut, mikä todettiin makroskooppisesti .

64 ml näin saatua raakauutetta sentrifugoitiin 10 25 minuuttia kiihtyvyysarvolla 10 000 g ja 4 °C:ssa ja sakka heitettiin pois. Sakkaa peittävää nestettä sentrifugoitiin 90 minuuttia kiihtyvyysarvolla 100 000 g ja 4 °C:ssa ja sakkaa peittävä neste heitettiin pois. Sakka pestiin 32 ml:11a 20 mM kaliumfosfaattipuskuria pH 7,0 ja sentrifu-30 goitiin vielä 60 minuuttia kiihtyvyysarvolla 100 000 g. Sakkaa peittävä neste heitettiin jälleen pois. Sakka lietettiin 32 ml:aan 20 mM kaliumfosfaattipuskuria pH 7,0, joka sisälsi 0,2 g ®Witon X-100. 45 minuuttia kestäneen hämmentämisen jälkeen sentrifugoitiin 60 minuuttia kiihty-35 vyysarvolla 100 000 g 0 °C:ssa. Reduktaasi oli sakkaa peittävässä nesteessä. Saanto oli 80 %.

li 5 87231

Esimerkki 2 10 ml esimerkin 1 mukaan saatua raakauutetta, joka sisälsi yhteensä 300 U (ominaisaktiviteetti 1,3 U/mg proteiinia), kaadettiin %ephacryl S-1000-pylvään (täytöksen 5 tilavuus 425 ml) päälle ja evaluoitiin 20 mM kaliumfos-faattipuskurilla pH 7,0 tilavuusvirtausnopeuden ollessa 30 ml/tunti 4 eC:ssa. Entsyymiä ilmaantui kalvo-osasten yhteyteen noin 6 tunnin jälkeen. Aktiviteettia sisältävät fraktiot (55 ml) yhdistettiin ja väkevöitiin ultrasuoda-10 tuksen avulla 7 ml:ksi.

Nämä 7 ml sisälsivät 90 % raakauutoksen entsyymistä ominaisaktiviteetin ollessa 24 U/mg.

Esimerkki 3 50 g kosteata bakteerimassaa liuennettiin analogi-15 sesti esimerkin 1 kanssa. Viimeisen sentrifugoinnin jälkeen sakan päällä oleva nestetilavuus väkevöitiin ultra-suodatuksen avulla 11 mltksi (500 U/ml reduktaasia ja 37 mg proteiinia/ml), tämä kaadettiin ®Sepharose 6B-pylvään (tilavuus 440 ml) päälle ja eluoitiin liuoksella, joka si-20 saisi 20 mM kaliumfosfaattipuskuria pH 7,0, 0,05 % Triton X 100 ja 1 mM ditioerytriittiä. Yhdistetyt entsyymiä sisältävät fraktiot väkevöitiin ultrasuodatuksen avulla 35 ml:ksi. Laimennuksen jälkeen suoritetun toistetun ultra-suodatuksen avulla saatiin 35 ml liuosta, joka oli 10 mil-25 limolaarinen kaliumfosfaattipuskurin osalta. Sen jälkeen kun liuos oli kaadettu hydroksiapatiittipylvään (Bio Gel HTP) päälle, jonka täytöksen tilavuus oli 100 ml ja joka oli tasapainotettu liuoksella, joka oli 10 mM fosfaatti-puskurin osalta ja sisälsi 0,05 % Triton X 100 ja oli 1 30 mM ditioerytriitin osalta, eluoitiin pylväs lineaarisen gradientin mukaisesti 10 - 100 mM fosfaattipuskurilla ja edellä mainituilla lisäaineilla. Yhdistetyt entsyymiä sisältävät fraktiot väkevöitiin ultrasuodatuksen avulla 50 ml:ksi. Nämä sisälsivät 0,37 mg proteiinin/ml ja 26 U/ml 35 reduktaasia. 9 tuntia kestäneen dialyysin jälkeen, joka 6 87231 suoritettiin liuosta vastaan, joka oli 10 mM tris. HC1 pH 7,5:n osalta ja sisälsi 0,05 % Triton X 100, kaadettiin entsyymiliuos %EAE-Sephadex A25-pylvään päälle, jonka täytöksen tilavuus oli 35 ml, ja entsyymi eluoitiin line-5 aarisen gradientin mukaisesti, jolloin edellä mainittu puskuriliuos oli 0 - 700 mM KCl:n osalta. Sen jälkeen kun entsyymiä sisältävät yhdistetyt fraktiot oli ultrasuoda-tettu 8,2 ml:ksi, saatiin ominaisaktiviteetiksi 300 U/mg proteiinia (90 U/ml; 0,3 mg proteiinia/ml).

10 Esimerkki 4 40 g kosteata Proteus vulgaris-bakteerimassaa lie-tettiin liuoksella, joka sisälsi 60 ml 0,01 M tris-HCl puskuria pH 7,5 ja 1 mM ditioerytriittiä, jonka jälkeen bakteerimassa liuennettiin ultraäänikäsittelyn avulla (30 15 minuuttia, 40 wattia, ei yli 6 °C). Lysaattia sentrifugoi-tiin 10 minuuttia kiihtyvyysarvolla 15 000 g ja sakan päällä olevaa nestettä sentrifugoitiin kiihtyvyysarvolla 100 000 g 120 minuuttia. Sedimentti lietettiin uudelleen 75 ml:11a 0,01 M tris-HCl pH 7,5 puskuria ja lietteeseen 20 lisättiin 1 % (til./til.) detergenttiä (Polyoksoetyleeni- 9-lauryylieetteriä (Sigma)). Sen jälkeen kun tätä suspensiota oli hämmennetty 45 minuuttia jäähauteessa, suoritettiin uudelleen sentrifugointi kiihtyvyysarvolla 100 000 g 90 minuutin ajan. Sakan päällä oleva neste sisälsi 2-okso-25 karboksyylihappo-reduktaasia.

Liuos kaadettiin DEAE-selluloosa-pylvään (0 = 2,5 cm, tilavuus 90 ml) päälle, joka oli tasapainoitettu liuoksella, joka oli 0,1 M tris-HCl pH 7,5:n osalta, 1 mM ditioerytriitin osalta, sisälsi 0,8 % detergenttiä (til./-30 til.) ja oli 4 mM ditioniitin osalta. Sen jälkeen kun pylväs oli jälkieluoitu noin kahdella pylvään tilavuudella edellä mainittua puskuriliuosta, käytettiin edellä mainitussa puskuriliuoksessa lineaarisen gradientin mukaan 0,1-0,7molaarista KC1 (2 x 225 ml). Entsyymi eluoitui suunnil-35 leen 250 mM:lla KClrllä ja sitä oli kaikkiaan noin 60 ml.

I: 7 87231

Entsyymiä sisältävät fraktiot yhdistettiin ja kaadettiin hydroksyyliapatiitti-pylvään (HA Bio-Gel, 0 = 1,5 cm, tilavuus 40 ml) päälle, joka oli tasapainotettu liuoksella, joka oli 0,01 M tris-HCl pH 7,5:n osalta, 1 mM ditioeryt-5 riitin osalta, sisälsi 0,4 % (til./til.) detergenttiä ja oli 4 M ditioniitin osalta. Edellä mainitulla tasapaino-tuspuskuriliuoksella (noin 1 pylvään tilavuus) suoritetun eluoinnin jälkeen eluoitiin lineaarisen gradientin mukaan liuoksilla, jotka olivat 0 - 150 mM kaliumfosfaatin (pH 10 7,5) osalta ja sisälsivät mainittuja lisäaineita, jolloin entsyymi eluoitui noin 60 mM kaliumfosfaattipuskurilla. Yhdistetyt fraktiot (noin 30 ml) kaadettiin toisen DEAE-selluloosa-pylvään (0=1 cm, tilavuus 20 ml) päälle, joka oli tasapainotettu edellä mainitulla puskuriliuoksella. 15 Lyhyen jälkieluoinnin jälkeen eluoitiin 2-oksokarboksyyli-happo-reduktaasi lineaarisen gradientin 0 - 0,4 M KC1 mukaan jälleen edellä mainitulla puskuriliuoksella. Entsyymiä sisältävät fraktiot, joissa oli pääasiallisin aktiviteetti, yhdistettiin ja väkevöitiin ultrasuodatuksen avul-20 la YM 30-kalvon (Amicon) läpi noin 6 ml:ksi. Tämä liuos kromatografoitiin käyttämällä Sepharose® cl 6B-pylvästä ( 0 = 2,5 cm, tilavuus 365 ml) joka oli tasapainotettu käyttämällä 0,01 M tris-HCl puskuri pH 7,5, 0,05 M KC1 ja edellä mainittuja lisäaineita.

25 Entsyymin ominaisaktiviteetti on 350 U/mg proteii nia. Oheinen kaavio esittää puhdistuksen kulkua.

8 87231 a 1 1 lii.

[Λ ·Η ίβ (0 «.

ο ο ϋ > ο > ο (Ν ro

<#> Ο 00 I ΟΙ 00 (Ν ι—I

ι—I C 'Η ·Η 1 ill C Ρ I Γ

•H W II) M CN

(Ö3 Ε S3 -Ρ -Ρ γμ m y W ιο ro - - m Φ <q *> «· o r~ rs Λί At I (N Ν' ι—I ΓΟ r-l a u

t/1 I

•Η ·Η ·Η ^-s läst H 4J 1) \ ^ to rj E © D «< - ·> cm oo m o

OtO-P'-^WCNr·' -H CN O LO

ι-H ro

•H

+j I 0)

SB

g >

Ο -H OO O O O O

^4-)^ 00 o m o m 0 D ffi ο ο ο o <H m

« io -U in τί ro -H nH

g.

p -Η -Γ-ί ^

> > -P H

ΙΟ Ή +J g UO

H +J 5)\ . " ID O

w X ® D m ° n* oo in cm Ε-ι Φ -P ^ > m m in Ν' ,η cm

'jj II I

S Φ S -8 00 CM

C-Ptg-P^ N· m r~ in in § Ρ Ο $ έί ο γ- ir ι-T ,η o

S ft y ie u rH

$ ι Λ * SS ~

Sm φ ·η σ e 0| nO g Ν' o CO-Pp'-'OO 00 00 - 00 •H^p:rojMinin Ν’ in o ·.

j 3 sf3 s 10 M H h ^ φ a Ό Ή 2 ^ in Q);HpH00 m Ο μ Η > E σ oo m n* in ro •H ' s >

IS

* |E g , , a g) Ö Ö (b as Ό ij H c h +J d u+1 c § § s p 38 g, 3sS ς.^1

I 3 B tl I 8 3 jJSS SABfi BASS

äa fl MJ Λ Ι-ΓΟ Ο-Ηφίφφίϋφφ 7 I 1 |a 3e £S3 9s|a -fis|iä

As! ,5 d S Rm £8-¾ Rass MSS

9 87231

Esimerkki 5 Sähkökemiallisessa kennossa pelkistettiin 25 ml liuosta, joka oli 100 mM kaliumfosfaattipuskurin pH 7,0 osalta, 4 mM metyyliviologeenin osalta ja 40 mM fenyyli-5 pyruvaatin osalta, 0,5 mg:11a esimerkin 3 mukaista 2-okso-happoreduktaasia, jännityksen ollessa -700 mV standardika-lomelielektrodin suhteen. Virran voimakkuus 5,8 mA putosi jyrkästi 9 tunnin kuluttua. Reaktioliuos sisälsi HPLC-ana-lyysin mukaan 88 % odotetusta fenyylimaitohaposta. Lai-10 mealla rikkihapolla pH-arvoon 1,8 hapotuksen jälkeen uutettiin eetterillä. Kiteinen jäännös, 78 % teoreettisesta arvosta, osoittaa natriumsuolaksi muuttamisen jälkeen kiertokulmaa [a]RT589 = 21,1°; 0,09 millimoolia/ml H20.

(2S)-natriumfenyylilaktaatin puhdas kaupallinen valmiste 15 osoitti samoissa olosuhteissa mitattuna arvoa -21,4°.

Analogisesti samalla tavalla valmistettiin (R)-mantelihap-poa ja (R)-2-hydroksi-4-metyylipentanaattia.

Seuraava taulukko 2 esittää suhteellisia nopeuksia joilla 2-okso-karboksyylihapot pelkistyvät, kun fenyyli-20 pyruvaatin arvoksi merkitään 1. 3-oksokarboksyylihapot ja hydroksiasetoni eivät pelkisty.

Taulukko 2

Substraatti Suhteelliset nopeudet 25 _P.mirabilis P. vulgaris

Fenyylipyruvaatti =1,00 =1,00

Pyruvaatti 0,92 0,85

Oksaaliasetaatti 0,73 0,50 2-oksoglutaraatti 0,78 0,62 30 2-oksoadipaatti 0,70

Indolypyruvaatti 0,35 0,67 5-bentsyylioksi-indolyylipyruvaatti 0,30 2- oksopatoaatti 0,07 0,04 3- fluoripyruvaatti 0,22 0,20 35 2-okso-4-metyylipentanoaatti 0,81 10 87231 (+) 2-okso-3-metyylipentanoaatti 0,28 0,25 (+) 2-okso-3-metyylipentanoaatti 0,46

Fenyyliglyoksylaatti 0,16 0,05 3-oksoglutaraatti 0 5 Hydroksiasetoni 0 li

Claims (3)

1. 87231 1. 2-oksokarboksyylihapporeduktaasi, tunnet-t u siitä, että se on pyridiininukleotidistä riippumaton 5 eikä sisällä lainkaan flaviiniryhmiä ja sen molekyylipaino on noin 500 000, käyttökelpoinen pH-alue on välillä 6-8, maksimin ollessa arvossa 6,8 ja isoelektrinen piste arvossa 4,9 ja että se on valmistettavissa menetelmällä, jossa Proteus mirabilis DSM 30115 tai Proteus vulgaris DSM 30118 10 liuennetaan, raakauutos sentrifugoidaan, sakan päällä ole va neste ultrasentrifugoidaan, sakka lietetään deter-genttiliuokseen ja kiinteät epäpuhtaudet poistetaan uuden ultarasentrifugoinnin avulla.
2. 2. Förfarande för framställning av 2-oxokarboxyl-15 syrareduktas enligt patentkravet 1, känneteck- n a t därav, att man upplöser Proteus mirabilis DSM 30115 eller Proteus vulgaris DSM 30018, centrifugerar räextraktet, ultracentrifugerar den ovanför fällningen belägna vätskan, suspenderar fällningen i en detergentlösning och 20 avlägsnar fasta föroreningar genoro förnyad ultracentrifu-gering.

   2. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 mukaisen 2-okso- 15 karboksyylihapporeduktaasin valmistamiseksi, tunnet- t u siitä, että Proteus mirabilis DSM 30115 tai Proteus vulgaris DSM 30118 liuennetaan, raakauutos sentrifugoidaan, sakan päällä oleva neste ultrasentrifugoidaan, sakka lietetään detergenttiliuokseen ja kiinteät epäpuhtaudet 20 poistetaan uuden ultrasentrifugoinnin avulla.

   3. Patenttivaatimuksen 1 mukaisen 2-oksokarboksyy-lihapporeduktaasin käyttö 2-oksokarboksyylihappojen ja niiden esterien pelkistykseen. 87231 1. 2-oxokarboxylsyrareduktas, känneteck-n a t därav, att det är oavhängigt pyridinnukleotid och 5 saknar flavingrupper, är användbart inom pH-omrädet 6-8, varvid det maximala pH-värdet är 6,8 och har en molekyl-vikt pä ca 500 000 och vars isoelektriska punkt är 4,9 och att det kan framställas enligt ett förfarande där roan upp-löser Proteus mirabilis DSM 30115 eller Proteus vulgaris 10 DSM 30118, centrifugerar räextraktet, ultracentrifugerar den ovanför fällningen belägna vätskan, suspenderar fäll-ningen 1 en detergentlösning och avlägsnar fasta förore-nlngar genoro förnyad ultracentrifugering.
3. 3. Användning av 2-oxokarboxylsyrareduktaset enligt patentkravet 1 för reduktion av 2-oxokarboxylsyror och de-ras estrar. i!