FI85811B

FI85811B - Dna-molekyl innehaollande en kodningssekvens foer en hybridpolypeptid.

Info

Publication number: FI85811B
Application number: FI853320A
Authority: FI
Inventors: James Francis Young
Original assignee: Smithkline Beckman Corp
Priority date: 1984-08-30
Filing date: 1985-08-29
Publication date: 1992-02-28
Also published as: FI853320A0; FI853320L; IE852103L; AU592954B2; EP0176493B1; ES546530A0; AU4668585A; HU196131B; FI85811C; GR852079B; ZA856467B; DK389085D0; ZW13485A1; HUT39362A; PT81061B; KR860001882A; DK389085A; IE58488B1; JPS6169731A; ES8800358A1

Description

1 85811

Hybridipolypeptidin koodaussekvenssin sisältävä DNA-molekyyli -DNA-molekyl innehällande en kodningsskevens för en hybridpolypep-tid Tämä keksintö koskee DNA-molekyyliä käsittäen koodaussekvenssin hybridipolypeptidille, joka voi stimuloida immuunivastetta eläimissä influenssaviruksen aiheuttamalle infektiolle.

Influenssavirusreaktio aiheuttaa äkillisen hengityselinsairauden ihmisellä, sialla, hevosilla ja siipikarjalla, joskus pandeemi-sissa mittasuhteissa. Influenssavirukset ovat ortomyksoviruksia ja näin ollen niillä on kuorellisia virioneja halkaisijaltaan 80-120 nanometriä ja kaksi erilaista glykoproteiiniuloketta.

Kolme tyyppiä, A, B ja C, infektoivat ihmisiä. Tyypin A virukset ovat aiheuttaneet suurimman osan ihmisen epidemioista uuden historian aikana, vaikka on myös satunnaisesti puhjenneita B-tyypin infektioita. Tunnetut sian, hevosen ja siipikarjan virukset ovat kaikki olleet tyyppiä A.

A-tyypin virukset on jaettu alatyyppeihin perustuen hemagglu-tiniini (HA) ja neuraminidaasi (NA) pintaglykoproteiinien antigeenisiin ominaisuuksiin. Tyypissä A, alatyypit Hl ("sikainflu-enssa"), H2 ("aasialaisinfluenssa") ja H3 ("hongkongilaisinflu-enssa") ovat vallitsevia ihmisen infektioissa.

Geneettisestä evoluutiosta johtuen, joka suunnilleen vuoden välein vaikuttaa HA- ja NA-proteiinien antigeenipaikkoihin, ei ole ollut mahdollista valmistaa "yleismaailmallista" influenssa-virusrokotetta käyttäen tavanomaisia tapettuja tai heikennettyjä viruksia, so. rokotetta, joka ei ole lajispesifinen. Äskettäin on tehty yrityksiä valmistaa sellaisia yleismaailmallisia tai puoli-yleismaailmallisia rokotteita virusvalikoimasta, joka on valmistettu yhdistelemällä eri kantoja. Aivan äskettäin sellaisissa yrityksissä on käytetty yhdistelmä-DNA-tekniikkaa tähdäten pääasiassa HA-proteiiniin.

Winter et ai., Nature, voi. 292, sivut 72-75 (1981) kuvaavat kannan A/PR/8/34 (H1N1) HA:n DNA-koodijärjestyksen. Tämän kannan HAI- ja HA2-alayksiköiden aminohappo- ja nukleotidijärjestysten 2 85811 homologiaprosenttia verrattiin alatyyppejä H2, H3 ja H7 edustavien kantojen vastaaviin.

Baez et ai., Nucl. Acids Res., voi. 8, sivut 5845-5857 (1980) kuvaavat kannan A/PR/8/34 ei-rakenneproteiinin (NS) DNA-koodijär-jestyksen.

Young et ai., kirjassa The Origin of Pandemic Influenza Viruses, 1983, edit. W.G. Laver, Elsevier Science Publishing Co., Young et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, vol. 80, sivut 6105-6109 (1983) kuvaavat cDNArn kloonauksen E. coli’ssa olevan kannan A/PR/8/34 kaikista kahdeksasta RNA-segmentistä ja kuvaavat E. colissa olevan NS1-proteiinin korkean asteen ilmenemisen.

US-patenttijulkaisussa 4 357 421 esitetään influenssaviruksen HA-geenin koodijärjestyksen kloonaus ja ilmeneminen ja että HA-polypeptidi on antigeeni, jota voidaan antaa rokotustarkoituk-siin.

The Morbidity and Mortality Weekly Report, voi. 33, numero 19, sivut 253-264, tarkastelee kaikkein viimeaikaisimpia influenssavirusten ehkäisy- ja kontrollistrategioita, mukaan lukien HA-proteiinia sisältävien ihmisrokotteiden annostus- ja antamistapa-protokolla.

Davis et ai., Gene, voi. 21, sivut 273-284 (1983) raportoivat immuunivasteista hiirellä HA-peräisiä polypeptidejä vastaan.

Lisäviitteet raportoivat A/PR/8/34 ja muiden kantojen HA, NS ja muiden kantojen influenssavirusgeenien kloonausta ja ilmenemistä. Joitakin sellaisia viitteitä on siteerattu seuraavassa.

Keksinnön mukaista DNA-molekyyliä hyödyntäen voidaan valmistaa rokote, joka stimuloi eläimillä suojan influenssavirusinfektiota vastaan, joka rokote käsittää polypeptidin, muun kuin HA-proteii-nin, jossa on HA-proteiinin HA2-alayksikön immunogeeninen paikka.

Keksinnön mukaisella DNA-molekyylillä saadaan aikaan polypeptidi, muu kuin HA-proteiini, joka käsittää HA2-alayksikön immunogeeni-sen paikan, jota polypeptidiä voidaan käyttää edellä mainitussa 3 85811 rokotteessa. Keksinnön tässä mielessä edullista suoritusmuotoa referoidaan C13-proteiiniksi.

Keksintö koskee siis DNA-molekyyliä käsittäen koodaussekvenssin hybridipolypeptidille, joka sisältää influenssavirus HA-proteii-nin HA2-alayksikön immunogeenisen determinantin, joka proteiini on johdettu tyyppi A influenssaviruksen Hl-, H2- tai H3-alatyy-pistä, joka on muu kuin HA-proteiini, fuusioituna muun kuin E. colista peräisin olevan polypeptidin kanssa. Keksinnölle on tunnusomaista se, että se käsittää noin 80 NS1-proteiinin N-pään aminohappoa, jotka aminohapot on fuusioitu HA2-alayksikön N-päähän saaden aikaan C13-proteiinin, joka aiheuttaa HA2-immuno-geeniselle determinantille immunogeenisen konfiguraation edellyttäen, että HA2-alayksikön immunogeenistä determinanttia koodaa jokin muu aminohappokoodaussekvenssi kuin se, joka koodaa HA2-alayksikön N-pään 1-80 aminohappoa.

Usein immunogeeniset paikat eivät stimuloi immuunisuojavastetta. Tämän uskotaan johtuvan suurelta osin siitä, ettei immunogeenisen paikan sijoittuminen isännän kehon puolustusjärjestelmään sopivassa konfiguraatiossa onnistu.

Kuten on saatettu julki ja täysin kuvailtu jäljempänä, HA-prote-iinin HA2-alayksikön immunogeeninen paikka (joka saattaa sisältää yhden tai useamman vierekkäisiä tai erillisiä hapteeneja), yllättäen indusoi sytotoksisen T-soluvasteen alkuperäisen alatyypin eri kantoja vastaan. Näin ollen HA2-immunogeeninen paikka voi aiheuttaa suojaavan immuunivasteen, jos se annetaan immunogeeni-sessä konfiguraatiossa, joka on alatyyppispesifinen mieluummin kuin lajispesifinen. Esimerkiksi HA2-immunogeeninen paikka voidaan ottaa mukaan rokotepolypeptidiin, jossa on HA2-alayksik-kö, so. valtaosin HA-proteiinin koko HA2-alayksikkö, yhdistettynä toiseen polypeptidiin, joka antaa immunogeeniselle paikalle immuunivasteen aiheuttamalla HA2-alayksikölle immunogeenisen . " konfiguraation.

—: Edullisesti polypeptidi, joka antaa sellaisen immuunivasteen HA2-immunogeeniselle paikalle, käsittää aminohappojärjestyksen, joka ilmenee suuressa määrin rekombinantti-isännässä, pro- 4 85811 karioottisessa tai eukarioottisessa, yhtyneenä suuressa määrin koko IIA2-alayksikön N-päähän.

Erityisen edullinen on polypeptidi, joka on peräisin influenssavirus-proteiinista. Rokotepolypeptidi ei ole HA-proteiini, koska immuunisuojavaste HA-proteiinia kohtaan näyttää olevan lajispesifinen.

Sellaisen rokotepolypeptidin ilmenemiseksi, jolla on ΠΛ2-immunogeeninen paikka E. coli'ssa, on polypeptidi, joka antaa immuunivasteen HA2-immunogeeniselle paikalle, edullisesti NSl-influenssaproteiinin N-pää. Erityinen ja edullinen suoritusmuoto siitä on proteiini, jota tässä nimitetään C13. C13-proteiinissa on 81 NSl-proteiinin ensimmäistä aminohappoa yhtyneenä HAl:stä peräisin olevien seriinin ja arginiinin välityksellä koko HA2-alayksikköön.

Rokotepolypeptidiä voidaan valmistaa kemiallisilla synteesimenetelmillä. Edullisesti kuitenkin, sitä valmistetaan tunnetuilla yhdistelmä-DNA-menetelmillä kloonaamalla ja ilmentämällä isäntämikrobissa tai solussa DNA-kappale, jossa on polypeptidin koodijärjestys. Edullinen isäntä on E. coli, koska sitä voidaan käyttää halutun proteiinin suurten määrien tuottamiseksi turvallisesti ja edullisesti.

* · · • ·' HA2, NSl ja muita influenssaviruksen virusproteiineja voidaan : .· valmistaa synteettisesti tai voidaan erottaa virus RNA:sta : tunnetuilla menetelmillä tai saatavilla olevista cDNA: ta si- : : : sältävistä plasmideista. Esimerkiksi, yllä esitettyjen viit teiden lisäksi A/Japan/305/57-kannan HA:n DNA-koodijärjestyksen ....: kloonasi, sekventoi ja raportoi Gething et ai., Nature, volyymi 87, sivut 301-306 (1980);. kannan A/NT/60/68 HA-koodi järjesty s * * · * ^ kloonattiin kuten raportoivat Sleigh et ai., ja Both et ai., ' ‘ kumpikin sarjassa Developments in Cell Biology, Elsevier * * Science Publishing Co., sivut 69-79 ja 81-89, 1980; kannan A/WSN/33 HA-koodi järjestys kloonattiin kuten raportoivat Davis et-al., Gene, volyymi 10, sivut 205-218 (1980) ja Miti et ai., Virology, volyymi 111, sivut 119-124 (1981). Kanarutto-

II

5 85811 viruksen HA-koodijärjestys kloonattiin kuten raportoivat Porter et ai., ja Emtage et ai., kumpikin sarjassa Development in Cell Biology, joka yllä mainittiin, sivuilin 39-49 ja 157-168. Influenssaviruksia, mukaanlukien muita kantoja, alatyyppejä ja tyyppejä, on myös saatavilla kliinisistä näytteistä ja yleisistä kantakokoelmista kuten American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA.

Systeemit rokotepolypeptidin kloonaamiseksi ja ilmentämiseksi eri mikrc-organismeissa ja soluissa, mukaanlukien esimerkiksi, E. coli, Bacillus, Streptomyces, Saccharomyces ja nisäkäs-ja hyönteissolut, tunnetaan ja ovat saatavissa yksityisistä ja julkisista laboratorioista ja kantakokoelmista ja kaupallisilta toimittajilta.

Keksinnön mukaisella DNA-molekyylillä aikaansaatu rokote käsittää yhden tai useaimian keksinnön mukaisen rokotepolypeptidin ja kantajan tai taimenta jän sitä varten. Esimerkiksi sellainen rokote voi sisältää huomattavan suuren osan kunkin lukuisan alatyypin koko HA2-alayksi-köstä kukin liittyneenä NSl-proteiinin N-pään aminohappoihin, joka rokote on pääosin säilöttynä normaaliin saliini in tai muuhun fysiologiseen liuokseen. Apuaineen käyttö, kuten alumii-„···. nihydroksidi, voi osoittautua toivottavaksi. Edullinen rokote **'. käsittää kolme rokotepolypeptidiä kukin sisältäen huomattavan suuren osan koko HA2-alayksiköstä, peräisin yhdestä Hl-, H2-ja H3 -alatyypistä, yhtyneenä NSl-proteiinin noin 80:een ' ·' ensimmäiseen aminohappoon kuten tapauksessa C13-proteiini.

: Vaihtoehtoisesti polyvalenttia rokotetta voidaan valmistaa yhdestä tai useammasta keksinnön mukaisesta polypeptidistä yhdistettynä lisäimmunogeeneihin, jotka ovat peräisin influens-'f: saviruksesta tai muista patogeeneistä, kuten alayksikkö- tai polypeptidiantigeenit tai tapetut virukset tai bakteerit, rokotteen tuottamiseksi, joka voi stimuloida suojan influenssavirusta vastaan kuten myös muita tunkeutuvia organismeja tai viruksia vastaan. Menetelmät sellaisten rokotteiden muo- » dostamiseksi ovat hyvin tunnettuja. Esimerkiksi rokotepoly-: peptidi ja muut immunogeenit yhdistelmärokotteen tapauksessa voidaan lyofilisoida myöhempää saliiniin tai muuhun fysiologiseen liuokseen liuottamista varten.

6 85811

Protokollaa annostuksesta ja antamistavasta voidaan optimoida standardi rokotuskäytännön mukaisesti. Tyypillisesti rokote tullaan antamaan lihaksen kautta, vaikkakin muita antamis-reittejä voidaan käyttää kuten suun kautta antaminen, silmän ja nenän kautta antaminen. Perustuen siihen, mitä tiedetään muista polypeptidirokotteista, on odotettavissa, että hyödyllinen yksittäisannos keskiverto aikuiselle ihmiselle on alueella 1,5-150 mikrogrammaa, edullisesti 10-100 mikrogrammaa. Rokote voidaan antaa aluksi myöhäiskesällä tai varhaissyksyllä ja voidaan antaa uudelleen kahdesta kuuteen viikkoa myöhemmin niin haluttaessa tai määräajoin, kun immuniteetti heikkenee, esimerkiksi joka toinen tai viides vuosi.

Seuraavat esimerkit ovat keksintöä valaisevia, eikä sitä rajoittavia .

Esimerkki 1. Plasmidi pM30

Plasmidi pAPR701 on pBR322-peräinen kloonausvektori, jossa on koodialueet Ml ja M2 influenssavirusproteiineille (A/PR/8/34). Sitä kuvaavat Young et ai., kirjassa The Origin of Pandemic Influenza Viruses, 1983, W.G. Laver'in toimittama, Elsevier Publishing Co.

Plasmidi pAPR801 on pBR322-peräinen kloonausvektori, jossa on NSl-koodialue (A/PR/8/34). Sitä kuvaavat Young et ai., siteerattuna yllä.

Plasmidi pASl on pBR322-peräinen ilmentämisvektori, joka si-sältää PL-promoottorin, N-hyödyntämispaikan (helpottamaan transkriptionaalisia polaarisia vaikutuksia N-proteiinin läs-: näollessa) ja cll-ribosomisidospaikan sisältäen cll-translaa- tioaloituskoodin, jota seuraa välittömästi Bam HI-paikka.

Sitä kuvaavat Rosenberg et ai., Methods Enzymol., volyymi 101, ... ; sivut 123-238 (1983) .

Plasmidi pASldeltaEH valmistettiin poistamalla pASl:stä ”"·* ei-välttämätön pBR322-peräinen Eco RI-Hin dlll-alue. pAPR801:n : : 1236 emäsparia sisältävä Bam HI-palanen, jossa on NSl-koodi- alue virusperäisenä 861:ssä emäsparissa ja 375 emäsparia 7 85811 pBR322-peräisenä, liitettiin pASldel taEH : n Bam HI-paikkaan. Syntynyt plasmidi, pASldeltaEH/801 ilmentää alkuperäisen NSl:n (230 aminohappoa). Tässä plasmidissa on Neo I-paikka aminohappojen 81 ja 82 kodonien välissä ja Nru I-paikka 3' NS järjestyksille. Bam HI-paikka aminohappojen 1 ja 2 välissä on jäljellä.

571:n emäsparin kappale, jossa on koodijärjestys Ml-proteiinin C-pään 50:lie aminohapolle, saatiin katkaisemalla pAPR701 Neo I:n ja Eco R5:n kanssa. Tämä kappale liitettiin plasmidin pASldeltaEH/801:n Neo I:n ja Nru I:n väliin tuon kappaleen poistamisen jälkeen plasmidista. Syntyneessä plasmidissa pM 30 on koodi yhdistyneelle proteiinille, joka käsittää NSl:n 81 ensimmäistä amonohappoa yhdistyneenä Ml:n 50:een viimeiseen aminohappoon. Neo I ja Bam HI jäävät jäljelle.

Esimerkki 2. Plasmidi pC13

Plasmidi pJZ102 on pBR322-peräinen kloonausvektori, jossa on koko HA-proteiinin (A/PR/8/34) koodialue. Sitä kuvaavat Young et ai., siteerattu esimerkissä 1.

Plasmidi pBgl II on pBR322-peräinen kloonausvektori, jossa on Bgl II-linkkeri pBR322:n Nru I-paikassa.

pJZ102 katkaistiin Mn I:llä. Bgl II-linkkerit liitettiin kaikkiin päihin ja HA2:n sisältämä kappale pistettiin paikalleen. Syntyneen plasmidin 5' liitoskohta, pBgl II/HA2, sekventoitiin . ‘ seuraavasti: 12 3 5' AGATCTG TCCAGA GGT___3'

Alue 1 on peräisin Bgl II-linkkeristä ja koodaa asparagiinin ja leusiinin. Alue 2 on peräisin HAl:stä ja koodaa seriinin ja arginiinin. Alue 3 on peräisin HA2:sta ja koodaa kaikki : ·.: HA2-alayksikön aminohapot.

Liitoskohta 3' sekventoitiin seuraavasti: 3 4 5 6

5'___ATATGCATC TGA GATTAGAATTTCA CAGATCT

8 85811

Alue 4 on HA2-loppukodoni. Alueella 5 on virusperäisiä 3' ei-koodaavia järjestyksiä. Alue 6 on peräisin Bgl II-linkke-ristä.

Kappale, jossa on 691 emäsparia ja HA2-koodijärjestys, saatiin katkaisemalla pBgl II/HA2 Bgl II:11a. Kappale täytettiin päästä DNApolI (KLenow):lla ja liitettiin pASldelta EH/801:een, joka oli katkaistu Neo Irllä ja samoin päästä täytetty (Klenow). Syntynyt plasmidi on pC13. NS1-HA2, tasapäinen liitoskohta sekventoitiin seuraavasti: 7 12 3 5' AAAATGACCATG GATCTG TCCAGA GGT 3'

Alue 7 on peräisin NSl-geenistä. Alueet 1, 2 ja 3 ovat kuten yllä on kuvattu.

Esimerkki 3. C13-proteiinin tuottaminen E. coli isäntäkanta N5151, lämpötilaherkkä lambda lysogeeni (cl857) transformoitiin pC13:n kanssa. Transformantteja kasvatettiin 32°C:ssa keskilogaritmivaiheeseen (A26q=0,6) LB-liemessä, johon oli lisätty 100 mikrogrammaa/ml ampisil-liinia. Viljelmät siirrettiin sitten 42°C:een cl:n inaktivoi-miseksi ja siten C13-proteiinin synteesin indusoimiseksi.

Kahden tunnin kuluttua 42°C:ssa bakteerit otettiin talteen sentrifugoimalla (3500 kierr/min, 20 min) ja bakteeripelletti ... jäähdytettiin -20°C:ssa.

; ’’ Pelletti sulatettiin sitten ja suspendoitiin puskuriin A

(50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 2 mM EDTA, 1 mM diotiotreitoli, . 5 % (tilavuus/tilavuus) glyseroli). Lysotsyymiä lisättiin niin, että loppupitoisuus oli 0,2 mg/ml, ja seosta inkuboitiin jää-·. :hauteella 20 min. Seosta käsiteltiin sen jälkeen Waring- sekoittajalla suurella nopeudella kuusi jaksoa kukin 15 s.

: Suspensiota sonikoitiin sitten yksi min Branson 1 in värähtelijä- sonikaattorilla. Seos sentrifugoitiin sen jälkeen (15 OOOkierr/ min, 30 min).

Pelletti suspendoitiin uudelleen puskuri A:han sonikoiden ....: (4 x 15 sekunnin jaksoa). Seos tehtiin sen jälkeen 0,1 %:seksi 9 85811 deoksikolaatin suhteen, ja sitä sekoitettiin yksi tunti 4°C:ssa. Seosta sentrifugoitiin (15 000 kierr/min, 30 min) ja proteiini pelletoitui. Deoksikolaattikäsittely uusittiin ja syntynyt pelletti suspendoitiin puskuri A:han sonikoiden. Suspensio tehtiin sitten 1 % :seksi Triton x-100:n suhteen, ja sitä sekoitettiin yksi tunti 4°C:ssa. Seos sentrifugoitiin jälleen (15 000 kierr/min, 30 min) ja proteiinipelletti otettiin talteen. Proteiini suspendoitiin uudelleen sonikoiden, ja proteiini liuotettiin ureaan (4M loppukonsentraatio). Tätä liuosta sentrifugoitiin partikkeliaineksen poistamiseksi (15 000 kierr/min, 30 min), ja supernatantti otettiin talteen ja dialysoitiin vasten kolmea yhden litran erää 10 mM Tris-HCl:ää, pH 7,5, 1 mM EDTA, urean poistamiseksi. Proteiini-liuosta sentrifugoitiin jälleen partikkeleiden pois taimi seksi (15 000 kierr/min, 30 min), ja supernatantti, joka sisälsi C13-proteiinin otettiin talteen ja käytettiin määrityksiin.

Esimerkki 4. T-solumääritys C13-proteiinin kykyä indusoida sytotoksinen T-soluvaste in vitro-määrityksessä verrattiin muiden proteiinien vastaavaan myös A/PR/8/34 alkuperää. Muut proteiinit on oheisena identifioitu näin: C7 (täydellinen HA)

Delta 7 (HAI:n ja HA2:n 80 N-terminaaliset jäännök set) C36 (HA2)

Delta 13 (NSl:n 80 N-terminaaliset jäännökset ja HA2:n 80 N-terminaaliset jäännökset) NS1 (NS1) NS2 (NS2) M30 (NS1 ja M) (katso esimerkki 1)

Molekyylit, jotka sisälsivät kullekin näistä koodijärjes-,·_ ; tyksen, saatiin kuten kuvasivat Young et ai., kirjassa The

Origin of Pandemic Influenza Viruses, 1983, edit. W.G. Laver, Elsevier Science Publishing Co., ja ilmenivät pASldeltaEH:ssa suuresti, kuten yllä on kuvattu. Proteiinia tuotettiin huo-: mattavasti, kuten on yllä kuvattu, paitsi että bakteeripelle- 10 8581 1 tin uudelleen suspendoinnin, lysotsyymikäsittelyn, sonikoin-nin ja sentrifugoinnin jälkeen NSl-proteiini pysyi superna-tantissa.

Supernatantti tehtiin 100 mM:ksi MgCl2:n suhteen, ja sitä sekoitettiin yksi tunti 4°C:ssa. Liuos sentrifugoitiin sitten (15 000 kierr/min, 30 min) NSl:n saamiseksi pellettiin. Pelletti suspendoitiin puskuri A:han ja käsiteltiin jälleen 100 mM MgCl2:Ha NSl-proteiinin uudelleensaostamiseksi. Sentrifugoinnin jälkeen pelletti suspendoitiin puskuri A:han ja dia-lysoitiin vasten kolmea yhden litran erää 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA. Liuos sentrifugoitiin sitten jälleen kaikkien partikkeleiden poistamiseksi, ja supernatantti, jossa oli NSl-proteiini otettiin talteen ja käytettiin määrityksiin.

Sytotoksinen T-solumääritys suoritettiin pääosin seuraavasti. Pernasoluja eristettiin virus-immuuneilta ja ei-immuuneilta hiiriltä ja viljeltiin in vitro. Solut jaettiin eriin ja altistettiin eri antigeeneille 90 minuutin ajaksi in vitro. Antigeenit poistettiin sitten soluja toistuvasti pesten, ja soluja viljeltiin sitten viisi päivää antaen stimuloitujen populaatioiden laajentua. Stimuloidut solut, so. efektori-solut, sekoitettiin virusinfektoiduilla tai ei-infektoiduilla P815-kohdesoluilla, jotka oli esikäsitelty ^‘*'Cr:llä. Merkittävä ^Cr:n vapautuminen kasvualustaan osoitti sekundääristen sytotoksisten T-solujen läsnäolon (2° CTL), jotka olivat muo-.·. : dostuneet in vitro antigeenistimulaatiossa. Tappamisen spe- . sifisyyttä tutkittiin kahdella tavalla: (1) kohdesoluilta, jotka oli infektoitu eri antigeeneillä testattiin tappokyky ja (2) ; pernasoluja eristettiin hiiristä, jotka oli immunisoitu eri ' viruksilla. Määrityksen lineaarisuutta tutkittiin käyttäen erilaista kohdetta: efektorisolusuhteita ja käyttäen eri antigeenimääriä, kuten on esitetty seuraavassa taulukossa, jotka osoittavat kuvaavia tuloksia. Alla listatut tulokset osoittivat efektorikohdesolujen suhteita, jotka olivat ‘ . 30:1 ja 10:1.

: : 51 •y Taulukoiden arvot on esitetty prosentteina Cr:n vapautumi- 51 sesta alustaan verrattuna Cr:n kokonaismäärään soluissa l! 11 85811 määritettynä solujen detergenttiliuotuksella. Merkittävät positiiviset tulokset on laatikoitu. Määrityksissä käytetyt virukset olivat: A/PR/8/34 (HINl) ("PR8") A/Port Chalmers/174 (H3N2) ("A/PC") A/Braz il/178 (H2N1) (''Α/Β2") A/Singapore/157 (H2N2) ("A/Sing")

Taulukko 1 2° CTL:n vasteen stimulointi E. coli-peräislllä polypeptideillä 2°:een stimulointiin käytetty PR8-P815 Ei-infektoitu P815 antigeeni _30_10_30_10 PR8 |36,0 27,2 | 0,2 -5,2 C13 24 /ug/ml 10,7 10,7l 0,5 -4,4 12 ^,ug/ml 10,6 8,1 0,5 -3,6 6 yug/ml 9,5 4,4 1,4 -4,1 NS2 24 ^ug/ml 0,4 2,8 -4,0 -2,7 12 yug/ml -1,8 -1,5 0,2 -4,1 6 ^,ug/ml -0,5 -2,0 -0,3 -5,2 M30 24 /ug/ml -1,0 -3,9 -1,6 -3,3 12 ^ug/ml -1,8 -1,2 -1,9 1,1 6 ^ug/ml 5,7 -1,5 -3,6 -6,2 : No -2,7 -4,1 -4,7 -4,0 i2 8581 1

Taulukko 2 2° CTL;n vasteen stimulointi E. coli-peräisillä polypeptideillä* 2°:een stimulointiin käytetty PR8-P815 Ei-infektoitu P815 antigeeni_30__30_10 PR8** l 60,5_37,4| 6,7 2,6 NS1 ~5,2 -8,7 4,3 0,0 C13 | 15, p| -1,1 0,5 -0,5 Δ13 -8,6 -10,1 -1,3 0,0 Δ 7 -3,2 -7,4 2,9 -0,9

No -5,4 -2,0 1,9 3,2 * Pernasoluja otettuna PR8-immuunilta hiireltä stimuloitiin in vitro antigeeneillä (5 ^ug/ml) .

** PR8-infektoidut syngeeniset pernasolut.

li i3 8581 1 LO I—I 00 Ch fN H n ^ ^ 00 00 ONrolO ($ O ^ S ^ ^ «. v *»%,%, J—j

f—j Ο ΓΝ rH rH O rH ro O O I—1 rH

3 I I I H

-μ in •h 0 3 -μ μ Λί ·Η a; >

>μ <ν ro h co oo <N id μ< rH

go ' ' ' ' ~ ' ' :rö

-H Γ0 μ< (N rH μ« O <J\ O CN CN ro rH

1 i—I i—I

•H Ή 03 W >ι

>1 -P

>1 O) tn +j •μ -μ mh tn H ___— — — φ tn oo ro μ ro in O o r- ro φ O * ^ ^ v ^ 0 ft i—i in cn ¢3 cn cn r^o m ro id μ tn m m m ι i m oo lii -h

tn rH —I1— — — O

3 oo tn

μ ft -H

•H I d > U 3 1 Cu — — _ — g J \ oo cn μ μ ro m rH ro cn cn g ro [H < o » ·. «.«.». ·μ

CJ ro CN μ O CN CN μ m μ rH O I

O r- I oo i -h .X aj — — L— — tn

MB V

3 -H

rH o -μ

Jd r-1 rH

rt 3 O

eh e

μ cD

-P .X

tn — — — — — -P

rH oo en (N en id o fN in O

CD O ' *· ' " ·. j *·** ( i

-P rH en id μ co H mm rHrHrH

••m m r~ rH r-~ r-~ i Γ0 rH — — — — — :iö

rH 00 P

: U ft tn - - - i -μ • - ·μ oo _ _ ____— _ u Ό ft fm oil (Noo föl ro io cn ·μ -μ ft O .μ -μ ro or^rorHoo ιο cn id μ m ,d ft oot^rorH σ> en <υ — — d - - ft rH I—It—I I—It—It—I ·μ

>i E E £ EEE-P

rH \ N. N \ \ N P

O tn Cn Cn tr O' t? P

- ft 3 3 3 3 3 3 <D

\ \ \ \ \ \ P

::: tn μ cn ιο μ m ίο ·μ (N rH CN rH μ U U Cl> μΟ 00 ft ro 00 ft ro - : μ m ft \ rH ft \ η μι ·- : o ft < u ft < u 3

... μ» rH

: : : M 0 0) tn m id ____: w d - · μ

* U CD

oo ft ft ·...· Oft \ rH ft I < H< i4 858 1 1 O O M3 I—I LT) CTi O 00 O * *k k. k. kk * % ^ 3 r-l rO CO O r-l I—I CM «N 00

4-1 I I

-r-f o 4-> λ;

CU

44 M* r—I 00 O O ΓΟ r-l r-l CO k. »V».

•h n oo *cj* oo cm cm cm in vn

•H

W

O in ro in VO ro VO O

O ·*·**»·>·

I—I σ\ h 00 LO (N (N

U r- en ft >1 \ >i <; oor^cMro cm in oo en en o * " » — — •H ro CM in en O ro CM M* *3* m σο i—t .—i -H en (1) oo o vo m* i~~ r-' m fO O S ^ K V ^ ^ k.

tn rH r^ouo·^ vo rOvOCM

tn ϋ| r-l

3 Z

>4 H

•h m

> \ VO 00 en O ro VO (M VO

I rl, O - v k k U ro o m en cm m in ro

E-· ro H

to ---”1 ^S in ro cm *3· ro vo ro en •H O ^ «.

OO i—i uOrHvooo vo ro r-' cm

X >H r·' m* r-ι i—I

X C esj

3 £ OQ

r—I *H X

3-P < to tn oouoldo o ^ vo en O ^ ^ ^ ^ k (0 ro CM LTO ro in ΟΟΓ^Ο 4-1 00 VO VO i—I r-l ·· ro I—I .—. O vo 140 O 00 voroejv CJ i—l O k· »· v ^ *. kk kk - Z r-l CM VO ^ o ooo •H iH Γ~~ ·Μ· M· CM | | |

Ό X

♦ * * *H

- 4-) 00

Qj \ .·. : ei) ft

Oi ft LncriiHt^k VO CO h 03 t>i \ O »k »k ^ k. «k «k k. k.

" - · Ή <CO VOOOO O O O r-l O e-· vo tn r-ι i

. . ft _____J

- - i—I r-H rH i—I i—I r-1 ·;·.· ^ε ^ε ^ε ^ ε ε -- O' O' 01 O' O' O' 3 3 3 3 3 3 \ \ M M \ \

. . -H OO M· CM 00 'S' CM

* · - H M· CM r—I ^ (M H

0 4-> 00 ro 00 ro : : : x o x r-ι λ r-i

Q) CM ft U ft U

4-1 ____: w 00

O Ä O

Ή ft Z

i5 8531 1

Kuten on osoitettu edeltävissä taulukoissa, indusoi C13 sekundäärisen sytotoksisen T-soluvasteen käytettäessä hiirien immuuneja pernasoluja, jotka on aikaisemmin infektoitu PR8-viruksen sub-letaaleilla annoksilla. Kaikki muut peptidijohdannaiset, joita tutkittiin, käsittäen NSl:n, delta7:n, deltal3:n tai M30:n, NS2:n ja C36:n, eivät pystyneet indusoimaan sellaista vastetta kuin on tietyillä hemagglutiiniraken-teilla. Cl3-peptid.in aiheuttama vaste on annoksesta riippuvainen ja tasot 5-24 mikrogrammaa/ml indusoivat sekundääriset sytotoksiset T-soluvasteet.

Havaittujen vasteiden virusspesifisyys on huomiota herättävä siinä suhteessa, että C13 stimuloi hiirien immuuneja pernasoluja, jotka aikaisemmin oli infektoitu HlNl-viruksilla mutta eivät stimuloineet hiirien immuuneja pernasoluja, jotka aikaisemmin oli infektoitu H3N2-viruksella (A/PC). Tämä on toisin kuin alatyyppiristireaktiiviset sytotoksiset T-lymfosyyttivas-teet, joita havaitaan stimuloitaessa samoja pernasoluja elävillä viruksilla johtuen ainakin osittain ristireaktiivisista sisäisistä antigeeneistä. Lisäksi Cl3:n aiheuttama stimulaatio on ristireaktiivinen HINl-alatyypin viruskannoilla; PR8-immuunit pernasolut, jotka C13 oli stimuloinut, kykenivät tunnistamaan ja tappamaan kohdesoluja, jotka oli infektoitu PR8:lla (HINl-kanta vuodelta 1934) kuin myös kohdesoluja, jotka oli infektoitu A/Brazil-kannalla (HINl-kanta vuodelta 1978) annosmäärinä 12-48 mikrogrammaa ja suurella sytotoksi-suusaktiivisuudella.

Perustuen huomattavaan määrään tietoja, jotka osoittavat, että sytotoksiset T-lymfosyytit näyttävät myötävaikuttavan toipumiseen influenssavirusinfektiosta hiirien systeemeissä, ja että sellaiset lymfosyyttivasteet voidaan havaita sekä immuuneissa hiirissä että ihmisissä (ks. Ennis et ai., Microbiology -: 1984, sivut 427-430, Amer. Soc. Microbiology). C13-proteiinin : : : kyky indusoida sellainen sytotoksinen T-soluvaste poikki ‘ - lajien osoittaa sen käyttökelpoisuuden, ja HA2-immunogeeni-sen paikan käyttökelpoisuuden indusoida immuunivaste, joka ;* on vastustuskykyinen influenssavirusinfektioille; vaste on ie 85811 puoliuniversaalinen siinä suhteessa, että se on alatyyppi-vaan ei lajispesifinen.

Keksintöä ja sen edullisia suoritusmuotoja on täysin esitelty yllä. Keksintö ei kuitenkaan ole rajoittunut sellaisiin spesifisesti esitettyihin suoritusmuotoihin. Paremminkin siihen kuuluu kaikki modifikaatiot ja vaihtelut, jotka esiintyvät seuraavissa patenttivaatimuksissa.

I:

Claims

17 8531 1 Patenttivaat imukset

1. DNA-molekyl omfattande en kodnigssekvens för en hyb-ridpolypeptid, som innehäller en immunogenisk determinant av ett influensavirus HA-proteins HA2-underenhet, vilket protein är härlett frän ett Hl-, H2- eller H3-underenhet av typ-A influensavirus, vilket enhet är annat än HA-pro-tein, fusionerat med en polypeptid härstammande frän annan än E.coli, kännetecknad av att den innefattar cirka 80 N-terminala aminosyror av NSl-proteinet, vilka aminosyror är fusionerade tili HA2-underenhetets N-terminal ästadskom-mande ett C13-protein, som föranleder en immunogenisk konfi-guration till HA2-immunogenisk determinant förutsatt, att HA2-underenhetets immunogeniska determinant kodas av nägon annan aminosyrakodningssekvens än den, som kodar HA2-under-enhetets N-terminala 1-80 aminosyror.

1. DNA-molekyyli käsittäen koodaussekvenssin hybridipoly-peptidille, joka sisältää influenssavirus HA-proteiinin HA2-alayksikön immunogeenisen determinantin, joka proteiini on johdettu tyyppi A influenssaviruksen Hl-, H2- tai H3-alatyypistä, joka on muu kuin HA-proteiini, fuusioituna muun kuin E. colista peräisin olevan polypeptidin kanssa, tunnettu siitä, että se käsittää noin 80 NSl-proteiinin N-pään aminohappoa, jotka aminohapot on fuusioitu HA2-alayksi-kön N-päähän saaden aikaan C13-proteiinin, joka aiheuttaa HA2-immunogeeniselle determinantille immunogeenisen konfiguraation edellyttäen, että HA2-alayksikön immunogeenistä determinanttia koodaa jokin muu aminohappokoodaussekvenssi kuin se, joka koodaa HA2-alayksikön N-pään 1-80 aminohappoa.

2. Ilmentymisvektori, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 1 mukaisen DNA-molekyylin.

2. Expressionsvektor, kännetecknad av att den innehäller en DNA-molekyl enligt patentkravet 1.