PT91600B - Processo para a preparacao de uma vacina contra o virus da gripe, contendo um polipeptido vacinal e de tal polipeptido - Google Patents

Description

SMITHKLINE BEECHAM CORPORATION E FRANCIS A. ENNIS, pretende obter privilégio de invenção era Portugal

RESUMO

O presente invento refere-se ao processo para a preparação de uma vacina para estimular a protecção, em animais, contra a infecção pelo virus da gripe. 0 processo compreende associar um pollpéptido, tendo uma determinante lmunogénlca numa região limitada pelo aminoàcido 64 e pelo aminoàcido 222 da subunldade HA2 da proteína HA do virus da gripe, fundido a um pollpéptido que obriga os referidos aminoácidos a assumir uma configuração lmunogénlca, com um veiculo ou dlluente e opcionalmente com um adjuvante estando o pollpéptido opcíonalmente, liofilizado, contendo uma dose simples da vacina cerca de 1 a 100 microgramas do pollpéptido.

O invento refere-se ainda ao processo de preparação de tais polipépt idos.

803

SKB CASE 14224-3

-2MEMORIA DESCRITIVA

Este pedido é uma continuação-em-parte do pedido com o Nq de série 07/238 801, apresentado a 31 de Agosto de 1988, como uma continuação em parte do pedido com o Nq de série 06/645 732 apresentado a 30 de Agosto de 1984, agora abandonado.

Âmbito do invento presente invento refere-se à preparação de uma vacina e, mais particularmente, à preparação de um polipéptido vacinai do vírus da gripe por técnicas de recombinação do DNA.

Antecedentes do invento

A infecção com o vírus da gripe causa doença respiratória aguda no Homem, cavalos e aves por vezes de proporções pandémicas. Os vírus da gripe são ortomixovírus e, como tal, têm viriões com envólucro de 80 a 120 nanometros de diâmetro, com dois picos diferentes de g1icoproteina. Três tipos. A, B e C, infectam os humanos. Os vírus do tipo A têm sido responsáveis pela maioria das epidemias humanas da história moderna, apesar de também existirem surtos esporádicos de infecções com o tipo B. Os vírus de suínos, equinos e aves conhecidos têm sido principalmente do tipo A, apesar de vírus do tipo C também terem sido isolados de suínos.

Os vírus do tipo A são divididos em subtipos baseados nas propriedades antigénicas das glicoproteinas de superfície: hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA). Dentro do tipo A, os subtipos Hl (gripe suína), H2 (gripe asiática) e H3 (gripe de Hong-Kong) são predominantes nas infecções humanas.

Dado a variação genética que, a intervalos aproximadamente anuais, afecta as determinantes antigénicas nas proteínas HA e NA, não foi possivel preparar uma vacina para o virus da gripe universal utilizando vírus atenuados ou mortos convencionais, isto é, uma vacina que seja não especifica de estirpe. Recentemente, foram feitas tentativas para preparar as referidas vacinas universais ou semi-universais, a partir de novas conformações reassortant de virus preparados por cruzamento de estirpes dife69 803

SKB CASE 14224-3

-3rentes. Mais recentemente, as referidas tentativas envolvem técnicas de recombinação do ADN focalizadas primariamente na proteína HA .

Desenvolvimentos relatados “ Winter e colab.., Nature, volume 292, pégs 72-75 (1981)“ descreveram uma sequência de codificação de ADN para HA da estirpe A/PR/8/34 CH1N1), constituída por um péptido sinal hidrofobo de 17 resíduos, uma subunidade HA1 (326 resíduos de comprimento) e uma subunidade HA2 (222 resíduos de comprimento), separadas por um único residuo de arginina (327), que se pensa ser reconhecido durante o processamento por uma enzima do tipo de tripsina. A homologia percentual das sequências de aminoácidos e de nucleótidos das subunidades HA1 e HA2 desta estirpe foi comparada às das estirpes representativas dos subtipos H2. H3 e H7.

Baez e colab., Nuc1 . Acids Res., volume 8, págs 5845-5857 (1980), descreveram uma sequência de codificação de ADN para a proteína não estrutural (NS) da estirpe A/PR/8/34.

Young e colab.,em The Oriqin of Pandemic Influenza Viruses, 1983, edit. por W. G. Laver, Elsevier Science Publishing Co.,e Young e colab., Proc. Nat1. Acad. Sei. USA, volume 80, págs 6105-6109 (1983) relataram a clonação do ADNc de todos os oito segmentos de ARN da estirpe A/PR/8/34 em E. Coli, e relataram alto nível de expressão da proteína NS1 em E. Coli.

Emtage e colab., patente dos EUA 4 357 421, revelaram a clonação e expressão de uma sequência de codificação para um gene HA do vírus da gripe, e revelaram que o polipéptido HA é um antigénio que pode ser administrado com o propósito da vacina.

The Morbidity and Mortality Weekly Report , volume 33, número 19, págs 253-261, revê as estratégias de prevenção e controlo mais recentes para o vírus da gripe, incluindo protocolos de dosagem e administração para as vacinas humanas contendo a proteina HA.

Davis e colab.. Gene, Volume 21, págs 273-284 (1983) descreveram respostas imunes em ratinhos para polipéptidos derivados da HA .

803

SKB CASE 14224-3

-4Referêncías adicionais descreveram a clonação e expressão da HA, Ns e outros genes do vírus da gripe da A/PR/8/34 e outras estirpes. Algumas destas referências são aqui citadas abaixo.

Descrição dos desenhos

A figura 1 ê a sequência de nucleótidos da região de codificação da proteina C13 e a sua sequência de aminoácidos. A região em caixa índica a sequência que liga o aminoácido 81 do terminal C (metionina) da NS1 e o aminoácido 1 do terminal N (glicina) da subunidade HA2 inteira (aminoácidos 1-222) .

A figura 2 ê a sequência de nucleótidos da região de codificação da proteína D e a sua sequência de aminoácidos. A região em caixa indica a sequência ligante entre o aminoácido 81 do terminal C (metionina) da NS1 e o aminoácido 65 do terminal N (alanína) da subunidade HA2 truncada. Estão também indicadas as posições dos aminoácidos 69 (ácido glutâmico), 81 (asparagina) e 150 (ácido glutâmico) da HA2, correspondentes aos aminoácidos do terminal N da subunidade HA2 truncada na proteina A, proteina C e proteina ZlD .

A figura 3 é a sequência de nucleótidos da região de codificação da proteina C13 curta e a sua sequência de aminoácidos. A região em caixa indica a sequência que liga o aminoácido 42 do terminal C (serlna) da NS1 e o aminoácido 1 do terminal N (gllclna) da subunidade HA2 inteira. 0 aminoácido 13 da NS1 (císteina) foi substituído por serlna.

A figura 4 é a sequência de nucleótidos da região de codificação da proteína D curta e a sua sequência de aminoácidos. A região em caixa índica a sequência ligante entre o aminoácido 42 do terminal C (serlna) da NS1 e o aminoácido 66 do terminal N (vallna) da subunidade HA2 truncada. 0 aminoácido 13 da Nsl (cisteina) foi substituído por serlna.

Sumário do invento

Num aspecto, o invento refere-se ao processo para a preparação de uma vacina para estimular a protecção. em animais, contra a

-n^

803

SKB CASE 14224-3

-5infecção pelo virus da gripe, a qual compreende um polipéptido, diferente da proteína HA, tendo uma determinante imunogénica da subunidade HA2 de uma proteina HA.

Noutro aspecto, o presente invento refere-se ao processo para a preparação de um polipéptido, diferente da proteina HA, o qual compreende uma determinante imunogénica da subunidade HA2, e que pode ser utilizado na vacina do invento.

Ainda num outro aspecto, o invento refere-se a um processo para purificar os polipéptidos do invento a partir do lisado celular de uma cultura de células hospedeiras recombinantes, compreendendo o referido processo:

a sujeição do lisado celular a um primeiro tratamento com detergente, a um pH na gama entre cerca de 6 e cerca de 8,5, a fim de solubilizar selectivamente os contaminantes das células hospedeiras e, desse modo, formar, uma fracção solúvel e uma fracção insolúvel, contendo, a fracção insolúvel, o polipéptido;

a separação da fracção solúvel da fracção insolúvel;

a sujeição da fracção insolúvel a ura segundo tratamento com detergente, a um pH na gama entre cerca de 9 e cerca de 11, a fim de solubilizar selectivamente os contaminantes das células hospedeiras e, desse modo, formar uma fracção solúvel e uma fracção insolúvel, contendo, a fracção insolúvel, o polipépt ido;

a separação da fracção solúvel da fracção insolúvel;

a sujeição da fracção insolúvel a um agente caotrópico, solubi1izando , desse modo, o polipéptido;

a separação da fracção solúvel da fracção insolúvel, contendo, a fracção solúvel, o polipéptido;

a adição de um agente redutor à fracção solúvel ; e a sujeição da fracção solúvel a cromatografia de permuta iónica e a recuperação do eluido contendo o polipéptido.

303

SKB CASE 14224-3

-6estando o referido eluido substancialmente Isento de ácidos nucleicos, endotoxinas e polipéptidos da célula hospedeira, contami nantes.

Noutros aspectos, o invento refere-se a uma molécula de ADN compreendendo uma sequência de codificação para o polipéptido vacinai do invento, incluindo a sequência de codificação só ou incorporada numa molécula maior, tal como um vector de expressão ou clonação do ADN, e a um microorganismo ou célula, transformado com a referida molécula de ADN.

Descrição detalhada do invento

Frequentemente, as determinantes imunogénicas não estimulam uma resposta imunoprotectora. Acredita-se que isto se deva, em grande parte, a uma falha na apresentação da determinante a um sistema de defesa do organismo do hospedeiro numa configuração apropriada.

Tal como é revelado e amplamente descrito aqui em seguida, a determinante imunogénlca (a qual pode compreender um ou mais haptenos contíguos ou separados) da subunidade HA2 da proteína HA, surpreendentemente, induz uma resposta das células T cltotõxlcas contra estirpes diferentes dentro do subtipo de origem. Assim, a determinante imunogénica de HA2 pode provocar uma resposta imune protectora se é apresentada numa configuração imunogénica, a qual é especifica do subtipo em vez de especifica da estirpe. Por exemplo, a determinante de HA2 pode ser apresentada num pollpéptldo vacinai compreendendo a subunidade HA2, isto é, substanclalraente a subunidade HA2 inteira da proteína HA fundida a um segundo polipéptido, o qual permite uma resposta imune à determinante lmunogéníca por obrigar a subunidade HA2 a assumir uma configuração imunogénica.

Preferivelmente, o polipéptido que permite a referida resposta imunedeterminante imunogénica de HA2 compreende uma sequência de aminoácidos, que é expressa em niveis altos por um hospedeiro recombinante, procariota ou eucariota, fundida ao terminal N da subunidade HA2 substancialmente inteira, é especialmente prefe69 803

SKB CASE 14224-3

-7rido um polipéptido derivado de uma proteina do virus da gripe. 0 polipéptido vacinai não é a proteina HA, dado que a resposta imunoprotectora à proteína HA parece ser específica de estirpe.

Para expressão do referido polipéptido vacinai portador da determinante imunonogénica de HA2 em E. Coli, o polipéptido que permite uma resposta imune à determinante de HA2 é preferivelmente o terminal N da proteina do virus da gripe, NS1. Uma sua concretização particular e preferida é uma proteína aqui referida como C13. Tal como representada na Figura 1, a proteína C13 tem os primeiros 81 aminoácidos da proteína NS1 fundidos, por meio de uma sequência ligante que codifica aspartato-leucina, a um péptido compreendendo o aminoácido 326 (serina) da subunidade HA1 da proteina HA, o aminoáciddo 327 (arginina) da HA que separa a HA1 da HA2, e a subunidade HA2 inteira (aminoácidos 1-222). (Numeração dos aminoácidos de HA de Winter e colab., Nature, 292:72 (1981)).

Numa outra concretização, o polipéptido vacinai é uma proteina designada como C13 curta. Como representada na figura 3, a C13 curta compreende os primeiros 42 aminoácidos da proteína NS1 (com a excepção do aminoácido 13 (cisteina) estar substituído por serina) fundidos, por meio de uma sequência ligante que codifica metionina-aspartato-leucina, a um péptido compreendendo o aminoácido 326 (serina) da subunidade HA1 da proteína HA, o aminoácido 327 (arginina) de HA que separa a HA1 da HA2, e a subunidade HA2 inteira (aminoácidos 1-222).

Mais preferida, devido à relativa facilidade de isolamento e purificação, é a proteina D. Tal como representada na Figura 2, a proteina D compreende os primeiros 81 aminoácidos de NS1 fundidos, por meio de uma sequência ligante que codifica glutamina-isoleucina-prolina, ao aminoácido 65 do terminal N da subunidade HA2 truncada (aminoácidos 65-222). Uma sequência de codificação de ADN para a proteina D é preparada por restrição da sequência de codificação para HA2 com Pvu II e ligação da região terminal C do sítio Nco I entre os aminoácidos 81 e 82 na sequência de codificação para NS1 por meio de um ligante oligonucleótido sintético.

803

SKB CASE 14224-3

-8Noutras concretizações» os polipéptidos vacinais compreendem derivados da proteina D» nomeadamente a proteina A e a proteina C em que os primeiros 81 aminoácidos de NSI estão fundidos, por meio de uma sequência ligante que codifica glutamina-isoleucina-prolina, ao aminoácido 69 do terminal N da subunidade HA2 truncada (aminoácidos 69-222) (proteina A), e ao aminoácido 81 do terminal N da subunidade HA2 truncada (aminoácidos 81-222) (proteina C) , respectivamente. Um terceiro derivado da proteina D é a proteina ôD que compreende os primeiros 81 aminoácidos da NSI fundidos, por meio de uma sequência ligante que codifica glutamina-iso-leucina-prolina-valina, ao aminoácido 150 do terminal N da subunidade HA2 truncada (aminoácidos 150-222).

Ainda numa outra concretização, o polipéptido vacinai ê uma proteina designada por D curta. Como representada na Figura 4., a D curta compreende os primeiros 42 aminoácidos da proteina NSI (com excepção do aminoácido 13 (cisteina) estar substituído por serina) fundidos, por meio de uma sequência ligante que codifica met ionlna-aspartato-h ist idi na-met ionlna-leuclna-treoni na-ser1na-treonlna-arglnlna-serlna, ao aminoácido 66 do terminal N da subunidade HA2 truncada (aminoácido 66-222).

Os polipéptidos vacinais do invento podem ser preparados por técnicas de síntese química. Preferivelmente, contudo são preparados por técnicas de recomblnação do ADN conhecidas, por clonação e expressão, numa célula ou microorganismo hospedeiro, de um fragmento de ADN portador de uma sequência de codificação do polipéptido. 0 hospedeiro preferido é a E. Coli dado que pode ser utilizada para produzir grandes quantidades das proteinas desejadas de forma segura e barata.

As sequências de codificação para a HA2, NSI e outras proteinas virais do virus da gripe podem ser preparadas sinteticamente ou podem ser derivadas a partir do ARN virai por técnicas conhecidas, ou a partir de plasmídeos contendo o ADNc disponíveis. Por exemplo, além das referências citadas acima, uma seqêncía de codificação de ADN para HA da estirpe A/Japan/305/57 foi clonada.

803

SKB CASE 14224-3

-9sequenciada e descrita por Gething e colab., Nature, volume 287, págs 301-306 (1980); uma sequência de codificação para HA para a estirpe A/NT/60/68 foi clonada como descrito por Sleigh e colab., e por Both e colab. ambos em Developments in Cell Biology, Elsevier Science Publishing Co., págs 69-79 e 81-89, 1980; e uma sequência de codificação para HA para a estirpe A/WSN/33 foi clonada como descrito por Davis e colab.. Gene, volume 10, págs 205-218 (1980); e por Hiti e colab., V iroloqy, volume 111, págs 113-124 (1981). Um sequência de codificação para HA para o vírus da peste das aves foi clonada como descrito por Porter e colab. e por Emtage e colab., ambos em Developments in Cell Biology, citado acima nas págs 39-49 e 157-168. Também, os vírus da gripe, incluindo outras estirpes, subtipos e tipos, estão disponíveis a partir de espécimes clínicas e a partir de depósitos públicos, tais como a American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, E.U.A.·'

Os sistemas para clonação e expressão do polipéptido vacinai em vários microorganismos e células, incluindo, por exemplo, E. Coli, Baci11us, Streptomyces, Saccharomyces, células de mamíferos e de insectos, são conhecidos e estão disponíveis a partir de laboratórios e depósitos privados e públicos e a partir de vendedores comerciais.

O processo do presente invento envolve a sujeição de um lisado celular, derivado de uma cultura de células hospedeiras recombinantes e contendo contaminantes pirogénicos, proteicos e de ácido nucleico de origem celular, a uma série de procedimentos de solubilização e separação, incluindo centrifugação e cromatografia, para produzir os polipéptidos desejados substancialmente isentos de contaminantes.

hospedeiro recombinante é preparado tal como descrito aqui em seguida. As referidas células recombinantes são cultivadas em meios nutrientes contendo fontes assimiláveis de carbono, azoto e minerais, na presença de oxigénio, por técnicas de fermentação padrão. Após a fermentação durante um periodo de tempo suficiente . - 69 803

SKB CASE 14224-3

-10para expressar o polipéptido recombinante, as células sâo recolhidas, por exemplo, por centrifugação ou filtração. A massa celular resultante é então ressuspensa e submetida a lise.

A lise celular pode ser realizada pela adição de lisozima, ou outro agente de lise ou permeabi1ização, a uma suspensão tamponada (entre pH 6 e pH 8,5, sendo preferido o pH 8) da pelota celular, numa concentração celular de cerca de 100-300 g/1, baseada no peso da pelota celular húmida. 0 peso da pelota celular numa operação à escala de produção pode variar entre 800—3000 g, dependendo da purificação a que é submetido o polipéptido particular. Um tampão de lise adequado é Tris (50mM) , EDTA (2mM) , ditiotreitol (DTT) (0,lmM) e glicerol (5%) tendo um pH de cerca de 8,0. A lise pode também ser efectuada por meios de ruptura mecânicos ou ultra-sónicos na ausência de lisozima foram obtidos resultados satisfatórios utilizando um homogeneizador Gaulin (APV Gaulin, Inc., Everett, Massachusetts). Se desejado, pode ser empregue uma combinação de meios de lise quimicos, mecânicos e/ou ultra-sónicos.

A suspensão do lisado é, em seguida tratada, a um pH na gama entre cerca de 6 e 8,5, sendo o preferido o pH 8 com um detergente, por exemplo, um detergente iónico tal como desoxicolato, por exemplo, mono-hidrato de sal de sódio (aprox. 0,1%), para evitar a ligação do polipéptido recombinante desejado aos detritos celulares (membranas e proteinas), e/ou um detergente não iónico, que dissolve as membranas citoplasmicas sem desnaturar a proteina, tal como Trinton X-100 (International Biotechnologies, Inc., New Haven, Connecticut) . A suspensão do lisado é clarificada, por exemplo, por centrifugação contínua a cerca de 25 000 x g num rotor Beckman JCF-G a um caudal de 100-500 ml/min; o sobrenadante contendo os contaminantes das células hospedeiras solubi1izados é rejeitado e a fracção insolúvel contendo o polipéptido, é submetida a purificação adicional.

lisado celular pode ser sujeito a tratamentos adicionais com detergentes para a remoção de ainda outros contaminantes das células hospedeiras. Por exemplo, a pelota contendo o polipéptido

803

SKB CASE 14224-3

-11pode ser ressuspensa num tampão adequado a um pH na gama entre cerca de 9,5 e cerca de 11. Um tampão particularmente útil é gli— cina-NaOH (50mM), EDTA (2mM) e glicerol (5%), a um pH entre 9,5 e 11, preferivelmente a um pH entre 10 e 10,5, sendo 10,5 o mais preferido. A ressuspensão pode ser facilitada pela utilização de um bomogeneizador . Um detergente não iónico tal como Trinton X-100 pode ser adicionado à suspensão a fim de solubilizar as membranas das células hospedeiras adicionais que estão complexadas com o polipéptido, e que não foram anteriormente solubi1lzadas ao pH mais baixo do passo anterior de tratamento com detergente. A suspensão é clarificada por centrifugação (25 000 x g), e o sobrenadante contendo os contaminantes das células hospedeiras solubilizadas é rejeitado e a fracção insolúvel pelotizada contendo o polipéptido é submetida a tratamento adicional.

Após o tratamento com detergentes, a pelota contendo o polipéptido recombinante é tratada com um agente caotrópico adequado» por exemplo ureia ou cloridrato de guanidina, sendo preferida a ureia. Quando a ureia é utilizada como agente caotrópico, a pelota contendo o polipéptido recombinante é dissolvida num tampão de ureia, por exemplo , ureia 8M em Tris 50mM a um pH entre 7,5 e 9, preferivelmente a pH 8. Os contaminantes das células hospedeiras insolúveis são removidos por centrifugação, por exemplo a 25 000 x x g. 0 polipéptido solubilizado permanece no sobrenadante.

A purificação parcial do lisado celular da forma agora descrita reduz signlficat1vamente a quantidade de contaminantes das células hospedeiras inicialmente presentes no lisado celular.

A separação adicional de contaminantes das células hospedeiras residuais, particularmente ácidos nucleicos e endotoxinas, do polipéptido parcialmente purificado pode ser levada a cabo por cromatografia de permuta iónica utilizando um empacotamento de coluna microparticulado tendo grupos de permuta anlónlca tais como dietilamino etilo (DEAE) , amlnoetllo quaternário (QAE) , e polietileno-imina (PEI), ligados a uma matriz adequada. 0 permutador iónico deve fornecer uma matriz aberta, suficientemente porosa

803

SKB CASE 14224-3

-12para a passagem do polipéptido a ser purificado. Foi alcançada uma redução significativa de ácidos nucleicos, endotoxinas e, em menor extensão de proteinas de baixo peso molecular contaminantes das células hospedeiras, a partir de um lisado celular parcialmente purificado contendo o polipéptido, num suporte de permuta aniónica, por exemplo, numa coluna DAEA Fast Flow Sepharose, equilibrada com o mesmo tampão no qual a proteina recombinante está solubilizada, por exemplo, ureia 8M , Tris 50mM, a pH 8.

A adição de um agente redutor, por exemplo, ditiotreitol ou

2-mercaptoetanol, à solução tampão auxilia na remoção por cromatografia de permuta iónica, das proteínas das células hospedeiras e dos produtos de clivagem de baixo peso molecular.

A solução contendo o péptido é colocada em contacto com o suporte de permuta iónica e, em seguida, é daí eluída. A eluição pode ser efectuada utilizando uma solução tampão adequada que fornece uma fracção contendo o polipéptido·imunogénico desejado, substancialmente isenta de ácidos nucleicos e proteinas das células hospedeiras, contaminantes. As soluções tampão aqui utilizadas como eluentes são largamente utilizadas em cromatografia de permuta iónica de substância biológicas. A eluição de gradiente de um suporte de permuta aniónica é utilizada vantajosamente com os polipéptidos do presente invento por exemplo um gradiente de NAC1 de 0,0 a 0,5M, preferivelmente de 0,0 a 0,3M, sobre um volume de coluna 5 vezes superior ou maior. Os contaminantes das células hospedeiras e o polipéptido desejado estão adsorvidos na matriz de permuta iónica e o polipéptico desejado é diferencialmente dessorvido em fracções separadas dos contaminantes. 0 eluido contendo a proteína pode ser passado diversas vezes em sucessão através da mesma coluna de permuta iónica, ou através de colunas separadas tendo empacotamentos diferentes.

Uma redução adicional significativa de ácidos nucleicos, proteínas de baixo peso molecular contaminantes das células hospedeiras e, particularmente, endotoxinas do lisado celular purificado recuperado a partir da cromatografia de permuta aniónica ( por : CS*

803

SKB CASE 14224-3

-13exemplo, DEAE Fast Flown Sepharose) descrita imediatamente acima, pode ser efectuada por tratamento do lisado com um desnaturante forte, tal como dodecil sulfato de sódio (SDS), num ambiente redutor (alcançado pela adição de um agente redutor, por exemplo, ditiotreitol). Está teorizado que o desnaturante faz com que a proteína com interesse se desdobre e o ambiente redutor quebra as ligações dissulfeto da proteína para permitir um desdobramento ainda maior, desse modo solubi1izando os contaminantes das células hospedeiras que se acredita estarem agregados com a proteina. A cromatografia do lisado celular assim tratado, por cromatografia de exclusão de tamanho por exemplo em Bio-Gel A e Bio-Gel PC (Bio-Rad, Richmond, CA EUA); Superose 12, Sephadaxe, Sephacryl-HR, Sepharose e Superdex (Pharmacia) sendo a cromatografia com Superose 12 (Pharmacia) particularmemte preferida, resulta na eluição de uma fracção contendo a proteína com substancialmente maior pureza por remoção de contaminantes das células hospedeiras previamente agregados à mesma. Podem ser ainda efectuadas reduções adicionais dos contaminantes das células hospedeiras por repetição do tratamento do lisado celular purificado com desnaturantes fortes e agentes redutores seguido por cromatografia de exclusão de tamanho .

das a partir submetidas a uma cromatografia

Para efectuar a remoção do desnaturante acima descrito do lisado celular purificado, as fracções contendo a proteina recuperada cromatografia de exclusão de tamanho podem ser de exclusão de tamanho adicional.

Verificou-se que as colunas de cromatografia conhecidas na especialidade como colunas de dessalificação , por exemplo as colunas de cromatografia fina Sephadex G50 ou preferivelmente G25 (Pharmacia), podem ser utilizadas vantajosamente para remover desnaturantes, particularmente quando o desnaturante é SDS. A remoção do desnaturante é particularmente aumentada quando efectuada em presença de . um agente caotrópico, por exemplo, ureia. A guiza de exemplo, tem-se verificado a aplicação de fracções contendo SDS a uma coluna de dessalificação previamente equilibrada com uma solução tampão contendo ureia 8M, e a eluição subsequente das referi69 803

SKB CASE 14224-3

-14das fracções com o tampão de equilíbrio é particularmente eficaz na maximização da recuperação da proteína livre de contaminação por SDS.

lisado celular, após tratamento para remoção dos polipéptidos, endotoxinas e ácidos nucleicos contaminantes, tal como descrito acima, é tornado substancialmente isento de contaminantes residuais das células hospedeiras.

Vários outros procedimentos podem ser empregues em conexão com o processo do presente invento, embora os referidos esses outros procedimentos não sejam necessários para alcançar um produto de qualidade farmacêutica altamente purificado. Os referidos procedimentos podem ser empregues entre, antes ou depois dos passos do processo acima descrito. Um tal passo óptimo é a diafiltração.

termo diafi1 tração é aqui utilizado no sentido reconhecido na especialidade, para designar uma forma de diálise continua que é extremamente eficaz na realização de muitas permutas de tampão. A diafiltração é preferivelmente levada a cabo através de um ultrafiltro ou membrana celulósica. Membranas/fi1tros adequados são aqueles tendo uma separação (cut-off) de peso molecular (PM) de cerca de 1 000 até àqueles tendo um tamanho de poro até 2,4 um de diâmetro. Um certo número de sistemas diferentes adaptáveis à diafiltração estão disponíveis comercialmente, tal como o sistema de cartucho de espiral dupla 10 K Amicon. No processo do presente invento, a diafiltração, utilizando um tampão Tris 20mM a pH de cerca de 8, pode ser efectivamente empregue na purificação e concentração subsequente do polipétpido.

A vacina do invento compreende um ou mais polipéptidos vacinais do invento, e um veículo ou diluente. Por exemplo, a referida vacina pode compreender substancialmente a subunidade HA2 inteira de cada um dos diversos subtipos, cada um fundido aos aminoácidos do terminal N da proteina NS1, a qual é altamente conservada, em solução salina normal ou noutra solução fisiológica. A utilização de um adjuvante, tal como hidróxido de alumínio, pode revelar-se

803

SKB CASE 14224-3

-15como sendo desejável. Uma vacina preferida compreende três polipéptidos vacinais, cada um deles compreendendo substancialmente a subunidade HA2 inteira de um dos subtipos Hl, H2 e H3 fundida a cerca dos primeiros 81 aminoácidos de qualquer proteína NS1, tal como no caso da proteína C13. Alternativamente, uma vacina polivalente pode ser preparada a partir de um ou mais polipéptidos do invento, combinados com imunogénios adicionais derivados do virus da gripe ou de outros agentes patogénicos, tais como antigénios polipeptídicos ou subunidades ou bactérias ou vírus mortos, para produzir uma vacina que pode estimular a protecção contra o vírus da gripe assim como contra outros organismos invasivos ou virus. As técnicas para a formulação das referidas vacinas são bem conhecidas. Por exemplo, o polipéptido vacinai, e outros imunogénios no caso de uma vacina de combinação, podem ser liofilizados para re-hidratação subsequente com uma solução salina ou outras soluções f isiológ icas.

protocolo de dosagem e administração pode ser optimizado de acordo com a prática de vacinação padrão. Tipicamente, a vacina será administrada por via intramuscular, embora outras vias de administração possam ser utilzadas, tal como a adiministração oral, intra-ocular , intradérmica e intranasal. Baseado no que é conhecido àcerca de outras vacinas polipeptidicas, espera-se que uma dosagem única útil para humanos adultos médios se encontre na gama entre 1 e 1 000 microgramas, preferivelmente entre 5 e 150 microgramas, o mais preferivelmente entre 10 e 100 microgramas. A vacina pode ser administrada inicialmente no fim do Verão ou inicio do Outono e pode ser re-administrada duas a seis semanas mais tarde, se desejável, ou periódicamente à medida que a imunidade declina, por exemplo, de dois em dois anos até de cinco em cinco anos.

Os exemplos seguintes são ilustrativos e não limitativos do i nvent o.

Exemplo 1. Plasmideo pM30 plasmídeo pAPR701 é um vector de clonação derivado do

803 · ·

SKB CASE 14224-3

-16pBR322 o qual transporta regiões codificadoras paras as proteinas do vírus da gripe Ml e M2 (A/PR/8/34). ê descrito por Young e co1ab.. em The Oriqin of Pandemlc Influenza Viruses. 1983. editado por W.G.Laver, Elsevler Science Publishing Co.

O plasmídeo pAPR801 é um vector de clonação derivado do pBR322 que transporta a região de codificação para NS1 (A/PR/8/ /34). έ descrito por Young e colab., citado acima.

plasmídeo pASl é um vector de expressão derivado do pBR322 que contém o promotor P^, um sitio de utilização de N (para atenuar os efeitos da polaridade transcricional na presença da proteina N) e o sitio de ligação do ribissoma II incluindo o codão de iniciação da tradução II imedíatamente seguido por um sitio BamHI. é descrito por Rosenberg e colab., Methods Enzymol . , volume 101, págs 123-138 (1983) .

plasmídeo pASldeltaEH foi preparado por delecção de uma região EcoRI-Hlnd III não essencial com origem no pBR322 do pASl . Um fragamento de Bam HI de 1236 pares de bases do pAPR801, contendo a região de codificação para NS1 em 861 pares de bases com origem virai e 375 pares de bases com origem no pBR322, foi inserido no sitio BamHI do pASldeltaEH. 0 plasmídeo resultante, pASldelta-EH/801 expressa a NS1 autêntica (230 aminoácidos). Este plasmídeo tem um sitio Nco I entre os codões para os aminoácidos 81 e 82 e um sitio Nru I 3'em relação às sequências de NS. 0 sitio Bam HI entre os aminoácidos 1 e 2 é conservado.

Foi obtido um fragamento de 571 pares de bases, transportando uma sequência de codificação para os 50 aminoácidos do terminal C da proteina Ml, por restrinção do pAPR701 com Nco I e EcoRV. Este fragamento foi inserido entre os sitios Nco I e Nru I em pASldeltaEH/801 subsequente à delecção desse fragmento do plasmídeo. 0 plasmídeo resultante, pM30, codifica para uma proteina de fusão a qual é constituída pelos primeiros 81 aminoácidos de NS1 fundidos aos últimos 50 aminoácidos de Ml. Os sítios Ncol e BamHI são conservados

Θ03

SKB CASE 14224-3

-17Exemplo 2. Plasmídeo C13 plasmídeo pJ2102 é um vector de clonação derivado do pBR322 que transporta uma região de codificação para a proteína HA inteira (A/PR/8/34). é descrito Exemplo 1.

O plasmídeo pBglII é um vec que transporta um ligante de Bgl

O pJ2102 foi cortado com Mn gados a todas as extremidades e < ser ido em pBglII. A junção 5' no foi sequenciada como se segue:

2 por Young e colab., citado no or de clonação derivado do pBR322 I no sitio NruI em pBR322.

I. Os ligantes de BglII foram lifragmento contendo a HA2 foi lnplasmídeo resultante, pBglII/HA2,

5' AGATCTG TCCAGA

GGT 3 *

A região 1 é derivada do ligante de BglII e codifica para aspartato e leucina. A região 2 é derivada da HA1 e codifica para serina (aminoàcido 326 da HA1) e arginina (aminoàcido 327 da HA separando a HA1 da HA2). A região 3 é derivada da HA2 e codifica para todos os aminoácidos da subunidade HA2.

A junção 3' foi sequenciada como se segue:

4 5 6

ATATGCATC

TGA

GATTAGAATTTCA

CAGATCT

A região 4 é o codão de paragem da HA2. relação às sequências não codificadoras de 6 é derivada do ligante de Bgl II.

A região 5 está 3' em origem virai. A região

Um fragmento de 691 pares de bases transportando a sequência de codificação para HA2 foi obtido por restrinção do pBglII/HA2 com BglII. O fragmento foi completado com ADN polimerase I (Klenow) e ligado ao pASldeltaEH/801 que tinha sido cortado com Nco I e completado de modo semelhante (Klenow) . 0 plasmídeo resultante é

803

SKB CASE 14224-3

-18pC13. A Junção de extremidade romba NS1-HA2 foi sequenciada como se segue:

12 3

5' AAAATGACCATG GATCTG TCCAGA GGT 3'

A região 7 é derivada do gene NS1. As regiões 1, 2 e 3 são definidas acima.

Exemplo 3. Produção da Proteina C13

A estirpe hospedeira de E. Coli N5151, um lisogénio lambda defectivo sensível à temperatura (cI857) foi transformado com pC13. Os transformantes foram cultivados a 32qC até à fase semi-log (A₂₆₀ = 0,6) em caldo LB suplementado com 100 microgramas/ml de ampicilina. As culturas foram então transferidas para 42qC para inactivar o Ic e, desse modo, induzir a sintese da proteina C13. Após 2 horas a 42qC, as bactérias foram recolhidas por centrifugação (3500 rpm, 20 min.) e a pelota bacteriana foi congelada a -20qC.

A pelota foi descongelada e ressuspensa em tampão A (Tris-HC1 50mH, pH 8,0, EDTA 2mM, ditiotreitol lmM, glicerol a 5% (vol/vol)). Foi adicionada lisozima até uma concentração final de 0,2 mg/ml, e a mistura foi incubada em gelo durante 20 minutos. A mistura foi então tratada num misturador Waring a alta velocidade, em seis choques •'Bursts de 15 segundos cada. A suspensão foi então tratada com ultra-sons (“sonicated’¹) um minuto com um aparelho de tratamento com ultra-sons e sonda Bronson. A mistura foi, em seguida, centrifugada (15 000 rpm, 30 minutos).

A pelota foi ressuspensa em tampão A por tratamento com ultra-sons X4 choques de 15 segundos). A mistura foi então tornada 0,1% em desoxlcolato e agitada durante uma hora a 4qC. A mistura foi centrifugada (15 000 rpm, 30 minutos) e a proteina foi transformada em pelotas . 0 tratamento com desoxicolato foi

803

SKB CASE 14224-3

-19repetido e a pelota resultante foi então ressuspensa em tampão A por tratamento com ultra-sons. A suspensão foi então tornada 1% em Trinton X-100 e agitada durante uma hora a 4qC . A mistura foi novamente centrifugada (15 000 rpm, 30 minutos) e a pelota proteica foi recolhida. A proteina foi ressuspensa por tratamento com ultra-sons e a proteina foi solubilizada com ureia (concentração final de 4M) . Esta solução foi centrifugada para remover todo o material particulado (15 000 rpm, 30 minutos), e o sobrenadante foi recolhido e dialisado contra três mudanças de um litro de Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, EDTA lmM, para remover todo o material particulado (15 000 rpm, 30 minutos) e o sobrenadante que continha a proteina C13, foi recolhido e utilizado para os ensaios. 0 rendimento da proteina C13 é de cerca de 10% da proteína celular total, como determinado por SDS-PAGE.

Exemplo 4. Plasmídeo pD plasmideo pASl^EH/801 (descrito acima no Exemplo 1) foi cortado com Bg1II, preenchido na extremidade com ADN polimerase I (ADN poli; Klenow) e fechado por ligação, eliminando, desse modo, o sítio Bg111 . 0 plasmídeo pBgl resultante foi digerido com Neol, preenchido na extremidade com ADN poli (Klenow) e ligado a um ligante de Bg111 . 0 plasmídeo resultante, pB^ contém um sítio Bg1II dentro da região codificadora para NS1. 0 plasmídeo pB4 foi digerido com BglII e ligado a uma ligante de ADN sintético de sequência:

5'- GATCCCGGGTGACTGACTGA - 3‘

3'- GGCCCACTGACTGACTCTAG - 5' plasmídeo resultante, pB4+, permite a inserção de fragmentos de ADN dentro do ligante a seguir a região codificadora para os primeiros 81 aminoácidos da NS1, seguidos pelos codões de terminação em todas as tés estruturas de leitura. 0 plasmídeo pB4+ foi digerido com Xma I (cortes dentro do ligante) preenchido na extremidade (Klenow) e ligado a um fragmento preenchido na extremidade PvuII/Hind III de 520 pares de bases derivado da

803

SKB CASE 14224-3

-20região codificadora para HA2. 0 plasmídeo resultante, pD, codifica para uma proteína constituída pelos primeiros 81 aminoácidos de NSl, por très aminoácidos derivados do ligante de ADN sintético (g1n-ile-pro) , seguidos pelos aminoácidos 65-222 da HA2, tal como mostrado na figura 2.

Exemplo 5. Plasmídeo pC 13 curto plasmídeo pASlôEH801 (descrito no exemplo 1) foi cortado com Ncol e Sall e ligado a um ADN sintético codificando para TGFa humano como um fragemnto Ncol/Sall. 0 plasmídeo resultante, pNSl_o.TGFa, codifica para uma proteína constituida pelos primeiros 81 aminoácidos da NSl e pela sequência de TGFa madura. 0 plasmídeo pMSl_o,TGFa foi cortado com HindIII e Ncol a fim de libertar um fragmento de 218 pares de bases que codifica para os aminoácidos 8 a 81 da NSl. Um ADN sintético que codifica para 03 primeiros 42 aminoácidos 8a 42 da NSl (com excepção do aminoàcido #13 da sequência de NSl ter sido alterado de císteina para serina), como um fragmento de HindIII/Ncol, foi então ligado ao plasmídeo. 0 plasmídeo resultante pNSl^TGFa, codifica para uma proteína constituida pelos primeiros 42 aminoácidos da NSl e pela sequência de TGFa madura. 0 plasmídeo pNSl^TGFa foi então digerido com Ncol e ligado a um fragmento Ncol de 704 pares de bases, que codifica para a região HA2, derivada do pC13. O plasmídeo resultante, pC13 curto codifica para uma proteína C13 curta, constituida pelos primeiros 42 aminoácidos NSl (com a excepção do aminoàcido #13 alterado de císteina para serina) por três aminoácidos codificados por um ligante de ADN sintético (met-asp-leu), aminoàcido (326) do terminal carboxi da HA1 (ser) por um residuo de arginina (327) separando as subunidades HA1 e HA2, e pela subunidade HA2 inteira tal como representado na figura 3.

Exemplo 6. Plasmídeo pD curto

803

SKB CASE 14224-3

-210 plasmídeo pMG27N, um derivado do pASl (Mol . Cell Bio. 5,

1015-1024 (1985)) foi cortado com BamHI e Saci, e ligado a um fragamento de BamHI/Ncol que codifica para os primeiros 81 aminoácidos da NS1 a partir do pASl Δ EH801 e um fragamento de NcoI/SacI de ADN sintético de sequência seguinte.:

5'-CATGGATCATATGTTAACAGATATCAAGGCCTGACTGACTGAGAGCT-3 ‘

3‘- CTAGTATACAATTGTCTATAGTTCCGGACTGACTGACTC -5’ plasmideo resultante, pMGl , permite a inserção de fragmentos de ADN a seguir aos primeiros 81 aminoácidos da NS1 em qualquer das três estruturas de leitura dentro do fragmento ligante sintético, seguidos por codões de terminação em todas as três estruturas de leitura. Para derivar um vector semelhante que contém a região codificadora para os primeiros 42 aminoácidos da NS1 em vez dos primeiros 81 aminoácidos da NS1, o pMGl foi digerido com BamHI/Ncol e ligado ao fragemto BamHI/Ncol que codifica para os aminoácidos 2a 42 da NS1 de pNSl^ TGFa. 0 plasmideo resultante, denominado pMG42A, foi então modificado a fim de conter um ligante sintético alternativo a seguir à sequência de NSl^ ^{com uma} série diferente de sitios de enzima de restrição para inserir fragmentos de ADN estranhos nas três estruturas de leitura a seguir NSl^· Este ligante tem a sequência seguinte:

5‘-CATGGATCATATGTTAACAAGTACTCGATATCAATGAGTGACTGAAGCT-3 '

3‘- CTAGTATACAATTGTTCATGAGCTATAGTTACTCACTGACT -5' plasmídeo resultante, pMG42B foi então digerido com EcoRV que corta dentro do ligante sintético e Xhol. Foi, em seguida, ligado com um fragmento de PvuII/SalI derivado de pMS2 para produzir o plasmídeo pD curto. Este plasmideo codifica para uma proteina, D curta, a qual é constituída pelos primeiros 42 aminoácidos da' NS1 (com a excepção do aminoácido #13 alterado de císteina para serina) por 10 aminoácidos derivados do ligante sintético ( met-asp-his-met-leu-thr-ser-thr-arg-ser ) e pelos

803

SKB CASE 14224-3

-22aminoácidos 66-222 da subunidade HA2, tal como representado na figura 4 .

Exemplo 7. Plasmídeo pC13(H69-222) plasmídeo pB4+ (descrito no exemplo 4) foi cortado com Xmal, preenchido na extremidade (Klenow), e um fragmento de EcoRI/HindIII de 508 pares de bases, preenchido na extremidade, derivado da região codificadora para HA2 foi ligado a ele. 0 plasmídeo resultante pC13 (H69-222) codifica para a proteina A constituída pelos primeiros 81 aminoãcidos NSI, pelos três aminoácidos derivados do ligante de ADN sintético (gln-ile-pro), e pelos aminoãcidos 69-222 da subunidade HA2.

Exemplo 8. Plasmídeo pC13 (H81-222)

O plasmídeo pB4+ (descrito no exemplo 4) foi cortado com Smal e ligado a um fragmento AhalII/HindIII de 474 pares de bases, preenchido na extremidade, derivado da região codificadora para HA2. O plasmídeo resultante, pC13 (H81-222), codifica para a proteina C constituida pelos primeiros 81 aminoãcidos da NSI, por três aminoãcidos derivados do ligante ADN sintético (gln-ile-pro) e pelos aminoãcidos 81-222 da subunidade HA2.

Exemplo 9. Plasmídeo pC13 (HA 150-222) plasmídeo pJ2102 (descrito no exemplo 2), foi cortado com HindIII a fim de libertar ADNc da HA. Este fragamento de 1784 pares de bases foi isolado e ligado em pUC8, o qual tinha sido cortado com HindIII. 0 plasmídeo resultante, pMS2, foi então cortado com BSml , tratado com nuclease de feijão do tipo so]a (mungbean) e, em seguida digerido com Sall. Um fragmento 280 pares de bases contendo a região codificadora do terminal C da HA2 foi então isolado. Este fragmento foi ligado ao plasmídeo pB4+ o qual tinha sido cortado com Xmal, preenchidos na extremidade

803

SKB CASE 14224-3

-23(Klenow) e, em seguida cortado com Sall. 0 plasmideo resultante pC13 (H150-222) , codifica para uma proteína AD constituída pelos primeiros 81 aminoácidos da NS1, por quatro aminoácidos codificados pelo ligante de ADN sintético (g1n-ile-pro-val) , seguidos pelos aminoácidos 150-222 da subunidade HA2.

Exemplo 10. Plasmideo pal3 plasmideo pC13 foi cortado com EcoRI a fim de libertar um fragmento de 1163 pares de bases e foi fechado por ligação para produzir o plasmideo pô 13. Esta manipulação resulta na perda da região codificadora para os 152 aminoácidos do terminal C da HA2. Consequentemente, a proteina de fusão ^13 produzida a partir deste plasmideo contém os primeiros 81 aminoácidos da NS1 , dois aminoácidos codificados por um ligante de ADN sintético (asp-leu) um aminoácido do terminal carboxi da HA1 (ser), um resíduo de arginina (327) separando a HA1 da HA2, os primeiros 70 aminoácidos da HA2, seguidos por oito aminoácidos derivados da sequência do pBR322 (ser-cys-leu-thr-ala-tyr-his-arg) .

Exemplo 11. Plasmideo pC13(H65-196)aMSH plasmideo pMS2 ( descrito no exemplo 9) foi digerido com BstXI e Sall, e ligado a um ligante sintético que codifica para a hormona estimulante dos α-melanócitos (aMSH) . 0 plasmideo resultante, pMS2aMSH, foi digerido com EcoRI (dentro da região codificadora para HA2) e Sal I (no terminal carboxi da sequência codificadora para aMSH) , libertando um fragmento de 431 pares de bases, o qual foi isolado e ligado ao plasmideo pD que tinha sido digerido com EcoRI e Sall. 0 plasmideo resultante, pC13(H65-196)aMSH, codifica para uma proteina M hibrida constituida pelos primeiros 81 aminoácidos da NS1, por très aminoácidos derivados do ligante de ADN sintético (gln-ile-pro), pelo aminoácidos 65-196 da subunidade HA2, por duas glicinas, seguidas por aMSH (ser-tyr-ser-met-g1u-h is-phe-arg-trp-gly-lys-pro-val) .

803

SKB CASE 14224-3

-24Exemplo 12. Plasmídeo pC13(H65-196)Δ MSH plasmídeo pC13 (H65-196)aMSH foi digerido com NCOI , preenchido na extremidade Klenow e ligado a um ligante de paragem de tradução de 12 pares de bases de sequência:

5‘-CTAGTTAACTAG-3 '

3'-GATCAATTGATC-5¹

O plasmídeo resultante pC13(H65-196) Δ. MSH , codifica para a proteína úM constituída pelos primeiros 81 aminoácidos da NS1, por três aminoácidos derivados do ligante de ADN sintético (gin-ile-pro) , pelos aminoácidos 65-196 da subunidade HA2, por gly-gly pelos primeiros 4 aminoácidos de aMSH (ser-tyr-ser-met) , seguidos pelos três aminoácidos derivados do ligante de terminação (leu-val-asn).

Exemplo 13. Plasmídeo pC13(H65-200) plasmídeo pMS2 (descrito no exemplo 9) foi digerido com BstXI e Sall, e ligado a um ligante sintético tendo a sequência:

5¹ CTGGTGCTTTTGTAG 3 '

3' AAGTGACCACGAAAACATCAGCT 5'

O plasmideo resultante, pMS2 - solto (anchorless), foi digerido com EcoRI (dentro da região codificadora para HA2) e Sall, libertando um fragmento de 331 pares de bases, o qual foi isolado e ligado ao plasmídeo pD que tinha sido digerido com EcoRI e Sall. 0 plasmídeo resultante, pC13(H65-200) , codifica para uma proteína ΔΜ+ híbrida, constituída pelos primeiros 81 aminoácidos da NS1, por três aminoácidos derivados do ligante de ADN sintético (gln-ile-pro) (descrito acima no exemplo 4) pelos aminoácidos 65-196 da subunidade HA2, seguidos por leu-val-leu-leu derivado do ligante sintético descrito imediatamente acima, o qual

803

SKB CASE 14224-3

-25reconstitui os aminoácidos correspondentes aos aminoácidos 197-200 da subunidade HA2.

Exemplo 14. Purificação da proteina D

Após a indução da sintese da proteina D por uma estirpe hospedeira de E. Coli as células bacterianas foram recolhidas por centrifugação e a pelota resultante foi congelada a - 70çC. A pelota foi descongelada e ressuspensa em tampão de lise A (Tris SOmM, EDTA 2mM, ditiotreitol (DTT) 0,lmM, glicerol a 5%, a pH 8), pela adição de 10 ml de tampão de lise A por cada grama de massa celular, e descongelada à temperatura ambiente. A suspensão resultante foi adicionada uma solução de lisozima concentrada para originar uma concentração final de, pelo menos, cerca de 0,2 mg/ml de lisozima. A suspensão foi agitada à temperatura ambiente durante cerca de 1 a 1,5 horas, e foi então lisada num homogenei zador Massachuset ts)

Manton Gaulin (APV Gaulin, Inc., ,3

Everet t, suspensão foi adicionado (68947x10 Pa) em dois passos. A esta Trinton X-100 até uma concentração final de 1% e foi adicionado desoxicolato até uma concentração final de 0,1%. A suspensão foi agitada à temperatura ambiente durante 1 hora e centrifugada a 25 000 xg durante cerca de 1 hora. 0 sobrenadante foi rejeitado e a pelota contendo a proteína foi suspensa em tampão de glicina (gly-NaOH 50mM + EDTA 2mM + glicerol a 5%) (pH 10,5), 10 ml de tampão /grama da massa celular inicial, utilizando um homogeneizador Turrax, até todos os grumos terem desaparecido. A esta suspensão foi adicionado Trinton X-100 até uma concentração final de 1%, levando o volume final até 10 ml para cada 1 grama da massa celular inicial. A suspensão foi agitada a 4qC durante 1 hora, centrifugada (25 000 x g, 1 hora) e o sobrenadante rejeitado. A pelota contendo a proteína D foi dissolvida em ureia 8M + Tris SOmM (pH 8,0), à temperatura ambiente, durante la 2 horas, e.

em seguida, durante toda a noite a 4qC, seguida por centrifugação (25 000 x g, 1 hora) para remover os contaminantes insolúveis. A proteína D permaneceu no sobrenadante. Ao sobrenadante foi adicio69 803

SKB CASE 14224-3

-26nado DTT até uma concentração final SOmM, e a solução foi agitada durante cerca de 1 hora à temperatura ambiente. A solução agitada foi então carregada numa coluna DEAE Fast Flow Sepharose equilibrada com uma solução de ureia 8M e Tris SOmM (pH 8). Uma taxa de carga máxima de 4mg de proteína/ml de gel e um minimo de comprimento da coluna de 22 cm foi mantido neste passo. A proteína D foi eluida com um gradiente de NaCl de 0 a 0,3M (sobre cinco ou mais volumes de coluna) em ureia 8M, Tris SOmM (pH 8). A proteína D purificada eluiu num pico largo centrado em redor de NaCl O,1M. As fracções contendo a proteína foram dialisadas numa solução de Tris 20mM e EDTA 2mM a pH 8.

rendimento da proteína D foi de cerca de 23% da proteína celular total, tal como determinado por análise densitométrica por laser de geles de SDS-PAGE redutores.

As proteínas C13 , C13 curta, D curta. A, C e/\ D, são purificáveis de forma semelhante pelo método purificação da proteina D.

aqui descrito para a

Exemplo 15. Purificação Adicional da Proteina D

Após a eluição das fracções contendo a proteina D a partir da coluna DEAE Fast Flow Sepharose descrita no exemplo 14, acima, as fracções foram concentradas 15 vezes (3,8 litros para 255 ml) num aparelho de fluxo tangencial Minisette (Pharmacia) equipado com 2 uma membrana Omega 10 de 500 cm e canal de blindagem, operado a 1,03x10^-1,4xlO^Pa de pressão transmembrana a um caudal cruzado de 1 000 ml por minuto. Ao concentrado foi adicionado um excesso 10 vezes de dodecil sulfato de sódio (SDS) (Sigma Chemical Co. , St. Louis, M0. E.U.A.), isto é, 10 mg de SDS por mg de proteina, e ditiotreitol (DTT) (Sigma Chemical Co.) até uma concentração final de 50mM. A solução foi agitada à temperatura ambiente durante noventa minutos e, em seguida, carregada (16 cm por hora) para uma coluna de Superose 12 de 2 800 ml (Pharmacia) equilibrada com um tampão (pH 8,0) contendo Tris-Glicina 25mM e SDS a 1%.

803

SKB CASE 14224-3

-27A proteina foi eluída isocraticamente com o tampão de equilíbrio da coluna. As fracções de pureza adequada, tal como determinada por SDS-PAGE e análise de Western Blot, foram reunidas.

As fracções reunidas descritas acima foram concentradas num aparelho de fluxo tangencial Minisette descrito acima. As fracções concentradas foi adicionado um excesso de dez vezes de SDS (10 mg de SDS por mg de proteina) e DTT até uma concentração final de 50mM. A solução resultante foi agitada durante 90 minutos à temperatura ambiente. A solução foi então carregada (16 cm por hora) para uma coluna de Superose 12 de 2800 ml e submetida à cromatografia sob as mesmas condições que as descritas imediatamente acima. As fracções eluídas foram analisadas por SDS-PAGE e análise de Western Blot quanto à pureza. As fracções de pureza adequadas foram reunidas.

Para remover o SDS das fracções reunidas, as fracções foram primeiro concentradas num aparelho de agitação de células Omega 10 (Pharmacia) . A amostra concentrada foi então carregada (25cm por hora) para uma coluna de cromatografia fina Sephadex G25 de 1443 ml (Pharmacia) (4,4 x95 cm), previamente equilibrada com um tampão (pH 8) contendo Tris 50mM e ureia 8M. A coluna foi eluida isocraticamente ao mesmo caudal com o tampão de equilíbrio. As fracções foram recolhidas analisadas quanto aos níveis de proteína e SDS e, em seguida, reunidas para maximizar a recuperação da proteina livre de contaminação pelo SDS.

Após a remoção do SDS, a proteína purificada (aproximadamente 90% pura e virtualmente isenta de endotoxina) foi dialisada contra um tampão (pH 8) contendo Tris 20mM e EDTA lmM. Após a diálise, a amostra foi filtrada de forma estéril e armazenada a 4qC. Para liofilizar a proteina, a amostra foi dialisada contra bicarbonato de sódio 20mM, congelada num banho de etanol-gelo seco e, em seguida liofilizada. A proteína liofilizada foi então reconstituída com um tampão (pH 8) contendo Tris 20mM e EDTA lmM.

Exemplo 16. Ensaio de célula T

803

SKB CASE 14224-3

-28A capacidade da proteína C13 para induzir uma resposta de célula T citotóxica num ensaio 1n vitro foi comparada com aquela de outras proteinas também de origem no A/PR/8/34. As outras proteinas são aqui identificadas como:

C7

Delta 7

C36

Delta 13

NSl

NS2

M30 (HA completa) (HAl e 80 Resíduos do terminal N de HA2) (HA2) (80 resíduos do terminal N de NS1 e 80 resíduos do terminal N de HA2) (NSl) (NS2) (NS1 e M) (ver Exemplo 1)

As moléculas compreendendo a sequência codificadora para cada uma destas proteinas foram derivadas· como descrito por Young e colab., em The Oriqln of Pandemlc Influenza Vlruses. 1983, edit. por W.G. Laver, Elsevier Science Publishing Co., e foram expressas no pASldeltaEH substancialmente como descrito acima. Excepto para NSl, as proteinas foram produzidas substancialmente como descrito no exemplo 3. Após ressuspensão da pelota bacteriana, tratamento com lisozíma, tratamento com ultra-sons e centrifugação, a proteína NSl estava contida no sobrenadante e não na pelota. A recuperação da NSl foi concluída tal como descrito abaixo.

sobrenadante foi levado a 100 mM de MgCl₂ e agitado durante uma hora a 4qC. A solução foi então centrifugada (15 000 rpm, 30 minutos) para transformar em pelotas a NSl. A pelota foi ressuspensa em tampão A (descrito no exemplo 3), e novamente levada a lOOmM de MgCl₂ para reprecipitar a proteína NSl. Após uma nova centrifugação, a pelota dializada

EDTA foi ressuspensa em tampão A e contra três mudanças de um litro de Tris-HCl lOmM, pH 7,5 lmM. A solução foi então novamente centrifugada para remover o material em partículas e o sobrenadante contendo a proteína foi recolhido e utilizado para ensaios.

todo

NSl ensaio de células T citotóxicas foi levado a cabo substan69 803

SKB CASE 14224-3

-29cialmente como se segue. Células esplénicas foram isoladas de ratinhos imunes e não imunes ao vírus, e cultivadas i n vitro. As células foram subdivididas e expostas a vários antigéníos durante 90 minutos, in vitro. Os antigéníos foram então removidos por lavagens repetidas de células e as células foram então cultivadas durante 5 dias para permitir a expansão das populações estimuladas. As células estimuladas, isto è, as células efectoras, foram misturadas com células alvo P815 (mastocitoma de ratinho) infectaquais tinha sido o das e não-infectadas pelo virus, cada uma das pré-carregada com ⁵¹Cr. A libertação significativa de ^^JCr para de células ci totóxicas meio de cultura indicava a presença secundárias (2° CTL), as quais tinham, sido produzidas pela estimulação i n vitro com o antigénio. A especificidade de Killing (morte) foi examinada de dois modos: 1) células alvo infectadas com virus diferentes foram testadas quanto a Killing; e 2) células esplénicas foram isoladas de ratinhos que tinham sido imunizados com virus diferentes. A linearidade do ensaio também foi examinada utilizando proporções de células alvo: células efectoras diferentes e utilizando diferentes quantidades de antigénio, tal como indicado na tabela seguinte, a qual mostra resultados ilustrativos. Os resultados registados abaixo indicam proporções de células efectoras: células alvo que foram de 30:1 (30) e de 10:1 (10).

⁵¹,

51.

Os valores nas tabelas são expressos com a percentagem de ‘Cr libertado para o meio comparado com a quantidade total de Cr nas células tal como determinada por solubi1ização em detergente das células. Os resultados positivos significativos estão destacados por rectângulos. Os vírus usados no ensaio foram:

A/PR/8/34 (H1N1)

A/Port Chalmers/1/74 (H3N2)

A/Brasi1/1/78 (H2N1) (PR8) (A/PC) (A/BZ)

A/Singapura/1/57 (H2N2) (A/Sing)

- ·. 69 Θ03

SKB CASE 14224-3

TABELA 1 ESTIMULAÇÃO DA RESPOSTA DE 2°CTL POR POLIPÉPTIDOS DERIVADOS DE E.COLI
Antigènio utilizado para a 2a estimulação	1 30	PR8-P815 10	Não infectadas-P815
30	10
PR8	36,0	27,2	0,2	-5.2
C13 24Pg/ml	10,7	10,7	0,5	-4,4
12Pg/ml	10,6	8.1	0,5	-3,6
6pg/ml	9,5	4,4	1 ,4	-4,1
NS 24Mg/ral	0,4	2,8	-4,0	-2,7
2 12pg/ml	-1 ,8	-1 ,5	0,2	-4,1
6>*g/ral	-0,5	-2,0	-0,3	-5,2
M30 24Mg/ral	-1 ,0	-3,9	-1 ,6	-3,3
12pg/ml	-1,8	• -1 ,2	-1,9	1,1
ópg/ral	5,7	-1 ,5	-3,6	-6,2
Nenhum	-2,7	-4,1	-4,7	-4,0
ESTIMULAÇÃO DA RESPOSTA	TABELA 2 DE 2°CTL POR POLIPÉPTIDOS DERIVADOS	DE E.COLI*
Antigènio utilizado para a 2a estimulação	PR8-P815	Não infectadas-P815
	30	10	30	10
PR8**	60,5	37,4	6,7	2,6
NSi	-5,2	-8,7	4,3	0,0
C13	15,0	-1,1	0,5	-0,5
Δ13	-8,6	-10,1	-1,3	0,0
Δ7	-3,2	-7,4	2,9	-0,9
Nenhum	-5,4	-2,0	1,9	3,2

* As células esplénicas obtidas a partir de ratinhos imunes ao PR8 foram estimuladas in vitro com antigénios (5pg/ml) ** Células esplénicas singénicas infectadas com PR8

803 '

SKB CASE 14224-3

-31TABELA 3

ESPECIFICIDADE VIRAL DE CTL ESTIMULADOS PELO POLIPÉPTIDO Cl3

Efector ,o*

PR8-P815

10

A/PC-P815

10

Não infβει adas-P8 15

10

PR8 PR8

A/PC

C13 24pg/ml

12Hg/ral

6Mg/ml

80.5		59,4
77,9		76,1
33,2		14.8
11 ,0		3,9
8,0		1 ,2

72,8		55,8
74,2		59.3

-0,4 -0,7

2,4 2,4

2,3 2,3

4.2 0,2

2.3 2,1

1,7 1,3

4.4 -1,4

0.8 0,4

A/PC PR8	96,0		72,9		74.3		57,5	9,8	1 ,8
A/PC	92,3		75,6		85,1		80,0	10,2	3,8
C13 24pg/ml	6,7	1,0	4,3	-5,0	2.6	0,2
12pg/ral	4.6	-1 ,2	1,2	-3,7	2,4	-0,3
6pg/ml	5,2	1,5	-0,2	-6,3	3,1	-1 ,5

* As células esplénicas foram Isoladas a partir de ratinhos que tinham sido pré-lmunlzados com o virus Indicado.

803

SKB CASE 14224-3

-32TABELA 4

ESPECIFICIDADE VIRAL DE CTL ESTIMULADOS PELO POLIPÉPTIDO C13

Efector 1° 2°	A/PR/8(H1N1)	A/B2	A/SING	A/PC	Não infec-
30	10	30	10	30	10	30	10	30	10
PRB PR8	76,5	77,0	82,8	75,5	30,6	17,8	92,8	79,0	8.4	3,0
C13 48pg/ml	60,9	42,6	65,5	41 ,3	5,8	0,0	5,7	7,5	4,1	3,0
24>*g/ral	70,1	46,5	63,5	46,2	9,5	5,6	9,2	9,3	8,8	0,6
12A*g/ral	50,7	24,0	45,0	18,4	2,0	4,4	10,3	8,5	2,0	1,1
Nenhum PR8	10,6	-0.8	14,0	16,3	15,3	6,7	13,2	5,6	2,0	1 .5
C13 48Pg/ral	-0,8	-0,6	8,4	3,6	4,6	3,7	2.5	2,3	2,3	-2,9
24Pg/ml	0,7	0,3	7,6	7.3	5,2	6,7	4,8	4,6	5,1	-2,0
12Pg/ml	1 ,8	-0,9	10,9	2,9	3,6	2,5	4,9	2,9	5,1	8,3

Θ03

SKB CASE 14224-3

-33Tal como indicado nas tabelas precedentes, a C13 induz uma resposta de células T citotóxicas secundárias utilizando células esplénicas imunes de ratinhos previamente infectados com doses subletais de virus de PR8. Todos os outros derivados peptídicos que foram estudados, incluindo NS1, delta 7, delta 13, M30, NS2 e C36, falharam na indução da referida resposta, assim como algumas construções de hemaglutinina. A resposta ao péptido C13 é dependente da dose, e niveis de 6 microgramas por ml até 24 microgramas por ml induziram respostas de células T citotóxicas secundárias.

A especificidade, virai das respostas observadas é surpreendente pelo facto de C13 ter estimulado células esplénicas imunes de ratinhos previamente infectados com o vírus H1N1, mas não ter estimulado as células esplénicas imunes em ratinhos previamente infectados com o vírus H3N2 (A/PC). Isto é diferente das respostas de linfócitos T citotóxicos de reacçâo cruzada quanto ao subtipo observadas quando da estimulação das mesmas células esplénicas com o virus vivo devido, pelo menos em parte, ao antigénios internos de reacçâo cruzada. Além disso a estimulação por C13 apresenta reacçâo cruzada entre estirpe de virus no subtipo H1N1 ; as células esplénicas imunes ao PR8 estimuladas por 03 i n vitro foram capazes de reconhecer e matar células alvo infectadas com PR8 (estirpe H1N1 de 1934) , assim como células alvo infectadas com o A/Brasil (estirpe H1N1 de 1978) numa gama de dosagens desde 12 microgramas até 48 microgramas e com um alto grau de actividade citotóxica.

Baseado em dados substanciais mostrando que os linfócitos T citotóxicos parecem contribuir para o restabelecimento de uma infecção com o virus da gripe em sistemas de ratinhos e que as respostas desses linfócitos podem ser detectadas quer em humanos quer em ratinhos imunes (ver, Ennis e colab., Microbiology - 1984, págs. 427-430, Amer. Soc. Microbiology) , a capacidade da proteína C13 para induzir a referida resposta de células T citotóxicas cruzada entre estirpes indica a sua utilidade, e a utilidade da determinante imunogénica de HA2, para induzir uma resposta imune a qual resistirá à infecção pelo vírus da gripe; a resposta é semi69 803

SKB CASE 14224-3 —34—

-unlversal dado que é especifica de subtipo mas não de estirpe.

Exemplo 17. Ensaio de Célula T-C13 e Estudos de Protecção

Este exemplo descreve três éstudos nos quais ratinhos BALB/c foram imunizados com a proteína C13 demonstrando que a imunização induz protecção contra infecção da gripe por meio da indução de CTL.

Primeiro Estudo; Especificidade Virai de Células Esplénicas Imunes à C13

Neste primeiro estudo, a ratinhos BALB/c machos de quatro semanas foram administrados 300 Mg de proteína C13, intraperitonealmente, e as doses foram repetidas 3, 4 e 5 semanas mais tarde.

(Experiências anteriores tinham indicado que o adjuvante completo de Freund não aumentava significatívamente o nivel de actividade dos CTL Induzida pela proteína C13) . Uma semana apôs a quarta imunização, células esplénicas dos ratinhos foram isoladas e cultivadas para estimulação 1n vitro com o virus. Ratinhos não-ímunizados (controlos) foram infectados, íntranasalmente com 100 unidades formadoras de placa (PFU) de virus A/PR/8, quatro semanas antes da remoção de células esplénicas para estimulação secundária in vitro. Ensaios de CTL foram realizados substancialmente como 7 descrito no exemplo 4, acima. Resumidamente, 3x10 células esplénicas de ratinhos imunizados ou de controlo foram cultivadas com 3x10^ células esplénicas normais singénicas, as quais tinham sido infectadas com os virus A/PR/8 ou A/PC a uma multiplicidade de infecção de 10 PFU por célula. Apôs cinco dias de cultura, estas células foram utilizadas como células efectoras. Para células alvo, 2x10 células P815 foram incubadas com os virus A/PR/8

A/PC a uma multiplicidade de infecção

Cr, e 1x10 de 10 PFU por célula, células alvo marcadas ou na com presença de 250 mCí de ⁵ⁱCr foram incubadas com as células efectoras, nas proporções indicadas, numa microplaca de 96 cavidades de fundo redondo duran51, te 4 horas. Os fluidos sobrenadantes foram recolhidos e o

Cr foi

803

SKB CASE 14224-3

-35medido. A percentagem de lise específica foi determinada como se segue: percentagem de lise específica = (libertação experimental libertação mínima) x 100 / (libertação máxima - libertação mínima) , onde a lise espontânea foi determinada por incubação das células P815 em meio, e a libertação máxima por incubação das células P815 em solução de Renex 30 a 10% ( Ruger Chem. Co., NJ). As proporções E:T (Efector: Alvo) variaram desde 3:1 (3) até 200:1 (200) tal como registado e amostras quadruplicadas foram testadas para cada proporção E:T. Os resultados são apresentados na tabela 5, abaixo.

Tabela 5: Especificidade Virai de Células Esplénicas Imunes á C13 Estimuladas pelos Virus A/PR/8 (H1N1) ou A/PC (H3N2)

Est imulação

Percentagem de Lise Especifica

(in	vivo)	(i n vitro)	A/PR/8	(H1N1)	A/PC	(H3N2)	Não
1°-	4°	5°	200	60 20	200	60 20	i nfectadas 200 60 20

cl3	A/PR/8	30	13	5	1	0	2	-3	-3	-3
	A/PC	-1	3	3	0	-1	0	1	0	3
	Nenhuma	2	0	-1	0	-1	-2	-4	-3	-3
Nenhuma	A/PR/8	0	-2	-1	-1	-1	-1	-4	— 4	-3
	A/PC	-1	-1	0	1	1	0	-1	-3	-1
	Nenhuma	0	0	2	-1	0	2	-4	-4	-2

803

SKB CASE 14224-3

-36Tabela 5: Especificidade Virai de Células Esplénicas Imunes à C13 Estimuladas pelos Virus A/PR/8 (H1N1) ou A/PC (H3N2) (cont .)

Estimulação Percentagem de Lise Específica (in vivo) (in vitro) A/PR/8 (H1N1) A/PC (H3N2)

Não i nfectadas

1°	2°	25 Θ	3	25	8 3	25	8	3
A/PR/8	A/PR/8	65 32	11	59	31 20	4	6	0
	A/PC	32 10	8	34	16 8	-3	-4	-1
	Nenhuma	-1 -2	-3	0	-1 -1	-3	-4	-3
A	tabela 5	mostra que	as células	esplénicas	de	ratinhos
imunizados com C13	que foram	est imulados	por células	esp1én i cas
norma i s	si ngénicas	i nfectadas	com o	virus	A/PR/8, in	vitro,	eram
capazes	de lisar	células alvo	infectadas	com A/PR/8	, embora	num
grau mais baixo do	que as células efectoras imunes a	A/PR/8	est i-
mu 1adas	por células esplénicas normais infectadas com	A/PR/8, e
que elas não lisaram as células alvo	não	i nfectadas	com o	virus

A/PC (H3N2) ou células alvo não infectadas. Nenhuma actividade CTC detectável foi encontrada em células esplénicas imunes à proteina C13 após estimulação pelo vírus A/PC (H3N2) . As células esplénicas de ratinhos não imunes também não apresentaram actividade CTC em nenhumas células alvo após estimulação com vírus in vitro.

Sequndo Estudo: Títulos Virais Pulmonares de Ratinhos Imunizados com C13

No segundo estudo, os titulos virais pulmonares de ratinhos imunizados com a proteína C13 e de ratinhos não imunes foram

803

SKB CASE 14224-3

-37examinados após desafio com os virus A/PR/8 (H1N1) ou A/PC (H3N2) .

Uma semana após a quarta imunização (tal como na tabela 5). os ratinhos foram desafiados, intranasalmente, sob anestesia com 4 éter, com o vírus A/PR/8 ou A/PC a uma dose de 5x10 PFU. Quatro dias mais tarde, os pulmões foram recolhidos assepticamente para medição do título virai pulmonar. Os pulmões recolhidos foram homogeneizados manualmente em 1,5 ml de PBS, e em seguida por centrifugação (2 000 x g durante 15 minutos a 4qC). Os sobrenadantes foramm congelados até serem titulados quanto ao vírus. Células de rim canino de Madin Darby (MDCK) foram mantidas em Meio Essencial Mínimo de Eagle (MEM) contendo 100 Mg/ml de penicilina, 100 Mg/ml estreptomicina e 200 Mg/ml de L-glutamina, suplementado com 10% de soro bovino fetal inactivado pelo calor, e foram semea4 das (25 x 10 células em lmg de MEM) em placas de cultura de tecidos de 24 cavidades. Os sobrenadantes dos pulmões foram descongelados e diluidos de forma seriada, em PBS contendo 0,1% de albumina bovina. Após aspiração do meio das cavidades, adicionaram-se 10 Ml da solução de vírus diluída cada cavidade e incubaram-se a 37q durante 1 hora com agitação ocasional. Cada cavidade recebeu, em seguida, lml de meio de ágar contendo MEM, 0,1% de D-glucose, 0,01% de DEAE-Dextrano, 1% de vitaminas (16-004-49; Flow Laboratories, McClean, VA, E.U.A, 10 Mg/mg de tripsina e 1% de ágar. Após 2 dias de incubação em 5% de C0,, a 37qC , 1 ml de vermelho neutro a 10% em PBS foi deitado sobre ágar em cada cavidade. As placas foram contadas após 10 horas de incubação. Os resultados são expressos como log^ médio de PFU/ml de amostras duplicadas, na tabela 6 abaixo.

Tabela 6: Titulo Virai Pulmonar de Ratinhos Imunizados por C13 Imunização Receptores

Desafio Virai Título Virai cl3

Nenhum

A/PR/8/ (H1N1) A/PR/8

3,8 ± 0,9* 5,4 ± 0,2* _{/

803

SKB CASE 14224-3

-38Tabela 6: Título Virai Pulmonar de Ratinhos Imunizados por C13 (cont .)

Imunização Receptores

Desafio Virai

Título Virai cl3 A/PC (H3N2) 5,4 ± 0,2 Nenhum A/PC 5,0 ± 0,3 *P<0,005, determinado pelo teste de t de Student

A tabela 6 mostra que os ratinhos imunizados com C13 tinham títulos virais pulmonares do vírus A/PR/8 significativamente menores quando comparados com os titulos virais em ratinhos não imunizados. Não havia diferença significativa nos títulos virais pulmonares entre os ratinhos imunizados com C13 e os ratinhos não imunes após desafio com o vírus A/PC (H3N2) .

Após uma infecção de desafio letal com o A/PR/8, sete de cada oito ratinhos imunizados com C13 sobreviveram para além do dia 60 (último dia de observação) , mas todos os ratinhos não imunes estavam mortos até ao dia 7. Esta protecção induzida pelo proteína C13 reflecte a especificidade da lise pelas células esplénicas, imunes a C13 estimuladas pelo virus, de células alvo infectadas com, A/PR/8 in vitro, e a limitação específica da replicação do vírus A/PR/8 nos pulmões de ratinhos que tinham sido imunizados pela proteina C13.

Terceiro Estudo

A/TAIWAN/1/86

Ratinhos Imunizados por C13 Desafiados com

No terceiro estudo, também foi examinada a protecção de ratinhos imunes à proteína C13 contra uma estirpe de vírus do subtipo Hl isolada recentemente, A/TAIWAN/1/86 (H1N1). Uma dose adicional de 200 pg de proteina C13 foi administrada 3 semanas após a quarta imunização (tabela 5). Uma semana mais tarde, os ratinhos foram

803

SKB CASE 14224-3

-39desafiados, intranasalmente, com a estirpe do virus A/Taiwan/1/86 U.S. Food anestesia (A/TW/1/86) ( obtida a partir de Office of Biologics ,5 and Drug Administration), a uma dose de 1x10 PFU, sob com éter. Antes do desafio, foi obtido soro de ratinhos imunizados pela proteína C13 para titulação do anticorpo neutralizante. Quatro dias após a infecção, os pulmões dos ratinhos foram removidos para titulações virais, tais como descritas para a tabela 6. 0 anticorpo neutralizante contra o vírus A/PR/8 foi determinado por um ensaio de placa de células MDCK. Os soros reunidos diluídos seriadamente foram pré-incubados com 20 PFU de virus a 37qC durante 1 h , e foram titulados relativamente ao vírus, como para a tabela 6. Calcularam-se títulos de anticorpo neutralizante de 50% da placa. Os soros reunidos dos ratinhos que tinham sido infectados intranasalmente seis semanas antes com 100 PFU do virus A/PR/8 foram incluídos como controlo positivo. Os resultados estão registados na tabela 7, abaixo.

Tabela 7:Título Virai Pulmonar de Ratinhos Imunizados por C13

Receptores

I muni zação

Desafio Virai Título Virai

Titulo de Ac Neutrali zante

C13	A/TW/1/86	(H1N1) 2,5 ± 0,9*	<4
Nenhuma	A/TW/1/86	(H1N1) 4,1 ± 0,3*	<4
A/PR/8	N.D.	N.D.	256
*P<0,005 ,	determi nado	pelo teste do t de Student

Os resultados apresentados na tabela 7 demonstram que os ratinhos imunizados pela proteina C13 tinham títulos virais pulmonares A/Taiwan/1/86 significativamente menores após o desafio do que aqueles apresentados pelos ratinhos não imunes; contudo, nem os

803

SKB CASE 14224-3

-40ratinhos imunizados pela proteina C13 nem os ratinhos de controlo não imunes tinham anticorpos neutralizantes do soro contra o vírus A/PR/8. Isto era esperado dado que a subunidade HA2 não contém sítios que induzam anticorpos neutralizantes. Em contraste os ratinhos primed com vírus A/PR/8, que serviam de amostra como controlos positivos, apresentavam níveis altos de títulos de anticorpo neutralizante. Estes resultados sugerem que a imunização com a proteína C13 induziu protecção contra as estirpes de vírus do subtipo Hl de 1934 e 1986 através da indução de respostas de CTL, e não pela indução do anticorpo neutra 1izante. Estes resultados demonstram que a imunização com uma proteina de fusão que contém a subunidade HA2 do vírus da gripe A (A/PR/8) induzem protecção contra a estirpe de virus da gripe A isolada com um intervalo de 50 anos as quais apresentam grande diversidade nas especificidades do anticorpo de hemaglutinina.

Exemplo 18. Especificidade pelo Virus da Gripe de CTL Estimulados pela Proteina D

Para determinar a especificidade pelo vírus de CTL estimulados pela proteina D ao nível clonal, células esplénicas imunes ao virus estimuladas pela proteína D foram cultivadas durante oito semanas em presença de células esplénicas singénicas irradiadas em fluido sobrenadante a 10% de células esplénicas de ratazana estimuladas por Con A. Uma diluição limitativa desta linha de CTL estimulada pela proteína D foi efectuada para desenvolver clones de CTL, todos como mais completamente descritos abaixo.

A proteína D foi produzida em E. Coli recombinante substancialmente da forma descrita para a proteina C13 no exemplo 3, acima. Resumidamente, após a lise das bactérias, realizaram-se duas extracções com desoxicolato a 0,1% e uma extracção com Triton X-100 a 1%, a fim de remover as proteinas de E. Coli contaminantes, e a proteína D foi solubilizada com ureia 4M a 4qC durante 30 minutos. A ureia foi então removida por diálise a 4qC. A proteína preparada foi armazenada em Tris-HCl 50mM, pH 8,0, EDTA ImM.

;-F

803

SKB CASE 14224-3

-41Ratinhos BALB/c macho de 4-5 semanas de idade foram imunizados com 100 PFU do virus, intranasalmente, sob anestesia com éter. Os baços dos ratinhos Imunizados com A/PR/8 foram removidos 3 ou mais semanas após a imunização para estimulação 1n vitro.

A interleucina-2 de ratazana (IL2) foi preparada substancialmente como descrito por Townsend e colab., J. Exp. Med. 160:552 (1984). Resumidamente, células esplénicas de ratazanas Lewís com 2 7 meses de idade foram ajustadas a 2x10 1infócitos/ml sem lisar os glóbulos vermelhos e foram incubadas com Con A (Sigma Tipo III) (Sigma Chemical Co., St. Louis. M0) a uma concentração de 20pg/ml a 37qC durante 2 h. As células esplénicas foram lavadas 3 vezes com PBS e cultivadas a 5xl0⁶ células/ml em RPMI 1640 suplementado com 10% de soro de bovino fetal (FBS) , a 37qC durante 48 h. 0 fluido sobrenadante foi recolhido e congelado a -80qC após ter sido passado através de um filtro de 0,45Pm.

Os CTL secundários foram preparados substancialmente como descrito nos exemplo 16 e 17. Para estimular as células esplénicas imunes ao virus, com proteina D, as células esplénicas foram cultivadas com proteina D a uma concentração de 50 pg/ml durante 1 h, e foram então lavadas duas vezes com meio. Após cinco dias de cultura foram utilizadas como células efectoras em ensaios de CTL.

Os clones de CTL foram estabelecidos como se segue. Os CTL secundários viáveis em cultura volumosa foram separados sobre

Flcoll-Paque (Pharmacia, Píscataway, NJ). Células esplénicas singénicas, irradiadas com raios gama (2 000 rad) de ratinhos BALB/c não imunes foram pulsadas com proteína D (100 pg/ml) durante 1 4 hora a 37qC. As células viáveis recuperadas (20x10 células/ml) foram cultivadas com células esplénicas irradiadas com raios gama, 4 pulsadas com proteina D (300x10 células/ml) em lOml de meio na presença de IL2 de ratazana em bruto a 10% (vol/vol) e 2-mercaptoetanol (2ME) 5x 10 °M. Este procedimento efectuado semanalmente para estimular uma linha CTL. Após 8 semanas de cultura desta linha CTL, uma diluição limitativa foi levada a cabo para desenvolver clones de CTL substancíalmente como descrito por Braciale,

803

SKB CASE 14224-3

-42e colab., J. Exp. Med. 153:910 (1981). Resumidamente, o meio utilizado neste procedimento foi RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS, antibióticos (lOOU/ml de penicilina e 100pg/ml de estreptomicina), 2-mercaptoetanol (2ME) 5x10 ^M e IL2 de ratazana induzida com Con A a 10%. As células viáveis responsivas (0,5, 1, 2, 4, 8 e 16 células/cavidade) foram cultivadas em cavidades, de placas de microtitulação de 96 cavidades, de fundo plano, (Costar, Cambridge, MA) com lxlO⁶ células esplénicas singénicas de BALB/c irradiadas e pulsadas com proteína D em 0,2 ml de meio. As células estimuladoras foram adicionadas de 7 em 7 dias. A medida que os clones cresciam, elas eram expandidas em recipientes maiores tais como placas de cultura de tecidos de 24 cavidades (Costar), placas de cultura de 6 cavidades (Falcon, Oxnard, CA) ou frascos de cul2 tura de tecidos de 25cm (Corning, Corning, NY) .

As células P815 foram utilizadas como células alvo em de libertação de ⁵¹Cr, os quais foram executados como descrito acima nos Exemplos 16 e 17.

ensaιos substanc ialmente

Dois clones, denominados H-6 e B-7, foram estabelecidos a partir da cultura de células esplénicas. Imunes ao virus, estimuladas pela proteína D descrita acima; o clone H-6 cresceu a partir de uma cavidade na qual tinham sido semeadas duas células responsivas e o clone B-7 cresceu a partir de uma cavidade na qual tinham sido semeadas 4 células. Os fenótípos de superficie da célula destes clones são Thy 1,2⁺ e Lyt 2⁺. Estes clones de CTL são d restringidos pelo haplotipo H-2 , dado (H-2^d) P815 infectadas MC57G infectadas com infectadas com o A/PR/8 que eles lisam as células com o A/PR/8, mas não as células as células

A/PR/8 ou (H-2^k) (H-2^b)

BW5174

Tal como mostrado na Tabela 8 abaixo, estes clones de CTL exibem actividade citotóxica com reacção cruzada contra células alvo infectadas com estirpes de virus do subtlpo H1N1 (A/PR/8 e A/BZ) e do subtlpo H2N2 (A/JAP); contudo, eles não lisam células alvo infectadas com o virus do subtlpo H3N2 (A/PC) ou com o virus da gripe Β (B/HK) . Assim, estes clones demonstram lise, com reac69 Θ03

SKB CASE 14224-3

-43ção cruzada, de células alvo infectadas com vírus dos subtipos Hl ou H2. Isto é diferente da especificidade dos CTL secundários observada em culturas volumosas, onde a Killing predominante é detectada em células alvo infectadas com vírus do subtipo Hl e é observada pouca ou nenhuma lise em células alvo infectadas com estirpes do virus do subtipo H2♦ A referida resposta cruzada de subtipo foi Inesperada dado que ela índica que a vacina do invento pode conferir protecção não só contra todas as estirpes dentro de um subtipo, mas também cruzada a, pelo menos, alguns subtipos.

Tabela 8. Especificidade Virai dos Clones de CTL In Vitro Percentagem de libertação de ⁵¹Cr especifica a partir de células alvo

Clone de Proporção

P815 (H-2 )

		A/PR8 (H1N1)	A/BZ (H1N1)	A/JAP (H2N2)	A/PC B/HK Não in-
(H3N2)	fectadas
	1 ,0	56	49	53	10 3	-3
H-63
	0,5	38	33	35	2 3	1
	1 ,0	65	68	42	0 2	0
b
B-7
	0,5	47	56	30	-1 0	-1
a , o clone	H-6 expressa os	antigénios de	superfície:	94% de Thy
1 ,2 , 86% de	Lyt2 e	5% de L3T4.
b , o clone	B-7 expressa os	antigénios de	superfície:	97% de Thy
1,2, 95% de	Lyt2 e	0% de L3T4.

Função efectora In vivo do Clone de CT1 H-6

S7

Ff' _ s' ' •''wuawcCSB

Θ03

SKB CASE 14224-3

-440 clone de CTL H-6 foi em seguida, de forma adoptiva, transferido para ratinhos. As células (2x10^) suspensas em 0,5ml de RPMI 1640 foram transferidas, por via intravenosa, para ratinhos por meio da veia da cauda, 6 horas antes do desafio virai. Os pulmões dos ratinhos infectados foram removidos 3 dias mais tarde e foram homogeneizados para determinar os títulos virais por formação de placas, substancialmente como descrito na Exemplo 17 acima.

A tabela 9 seguinte, mostra que essa transferência adoptiva deste clone de CTL reduziu significativamente os títulos virais nos pulmões de ratinhos infectados com estirpes de virus dos subtipos Hl (A/PR/8) e H2 (A/JAP), mas não os dos ratinhos infectados com o vírus do subtipo H3 (A/PC) ou com o vírus da gripe tipo B. Estes resultados indicam que este clone de CTL, que tinha sido estimulado pela proteína D e é específico para a subunidade HA2 dos vírus Hl e H2, conferiu protecção i n vivo. Isto confirma o valor previsivo da actividade CTL in vitro do clone contra células alvo infectadas com os vírus Hl e H2.

Estudo da Inibição do Alvo Frio

Para garantir que a especificidade da proteína D pelo antigénio é equivalente à da C13, foram efectuadas experiências de inibição do alvo frio utilizando o clone de CTL B-7 estimulado pela proteina D. A lise das células alvo infectadas pelo A/PR/8 foi inibida por células alvo frias revestidas por proteínas C13 e D, assim como por células alvo frias infectadas com o virus A/PR/8. A inibição da lise das células alvo marcadas com ⁵ⁱCr e revestidas por proteina C13 foi observada com células alvo frias revestidas por proteína C13 ou D e infectadas com o vírus A/PR/8. Em ambos os casos, nem as células alvo frias infectadas com A/PC nem as células alvo frias não infectadas competiram com as células alvo marcadas com ⁵¹Cr. Estes resultados indicam que a proteína D tem a mesma espe- cificidade antigénica que a proteina C13.

803

SKB CASE 14224-3

-45Tabela 9

Especificidade Virai da Redução de Vírus Pulmonar In Vivo pelo Clone de CTL H-6

Clone de CTL H-6 Receptores

Transferido^a Desafio Virai Título Virai nos Pulmões^b

+	A/PR/8 A/PR/8	(H1N1)	5 ,0 6,9	+ +	1 ,0 0 ,ic
+	A/JAP	(H2N2)	2 ,6	+	0,3
-	A/JAP		3 ,7	±	0,4d
+	A/PC	(H3N2)	4 ,2	+	0,3
—	A/PC		4,1	±	0,1
+	B/HK		4,2	+	0,4
-	B/HK		4,7	±	0,5

a^ x 10⁶ células foram transferidas 6 horas antes do deasfio virai .

b₃ dias após o desafio virai, os pulmões foram recolhidos e os títulos virais foram examinados por ensaio de placa em células

MDCK _Q5 determinado pelo teste do T de Student.

d determinado pelo teste do T de Student.

p <0,02 ^r

Exemplo 19. Péptldos Adicionais

Péptldos recombinantes adicionais à proteina D foram produzidos em E. Coli recombinante e testados nos ensaios de CTL, substanclalmente como descrito acima. Estes péptldos estão registados na tabela 10 abaixo. A Tabela 10 também regista o número do primeiro e último aminoácidos da HA2 no antigénio e se o antigénio

803

SKB CASE 14224-3

-46foi positivo ( + ) ou negativo (-) nos ensaios de célula T. As proteinas C13 e D estão registadas para referência. Os aminoácidos são designados por simbolos de uma letra. Biochemistry 2a Ed., A. L. Lehninger (1977).

Tabela 10. Proteína D, C13 e Derivados

Act ividade

Proteína CTL

C13	NS1(1-81) d l s r HA2(1-222)	4-
D		NS1(1-81)~0_I-P_HA2(65-222)	4-
C13	curta	NS1(1-42)Μ-°-L-S-R~HA2(1-222)	4-
D	curta	NS1(1-42)-M_D-H-M-L-T-S-T-R-S-HA2(66-222)	4-
A		NS1 (1-81)-0-I_P-HA2(69-222)	4-
C		NS1(1-81)-0-I-p-HA2(81-222)	+
âD		^^1-81)-^^^-^(150-222)	4·
Ô 13		NS1(1-8!)-D L S R-HA2(1-70)-S
		C-L-T-A-Y-H-R	-
M		^^1-81)-0-^^2(65-196)-^-
		S-Y-S-M-E-H-F-R-W-G-K-P-V	-
Λ M		^^1-81)-0-^^2(65-196)-0-0-
		S-Y-S-M-L-V-N

Exemplo 20. Indução In Vivo de CTL Antivirals

No exemplo seguinte, a proteina D, a proteina delta Me a proteína delta M⁺ (descritas acima nos exemplos 4, 12 e 13, respect lvamente) foram testadas quanto à sua capacidade para Induzir linfócitos T cltotóxlcos antivirals ln vivo. Ratinhos ((Balb/c x C57 BL/6)F^) foram Imunizados com proteina D, proteina delta M ou proteina delta M em adjuvante completo de Freund (CFA). A proteina D foi purificada de acordo com o exemplo 15 (pureza em redor dos 90%). A proteina delta M e a proteina delta M⁺ foram purifica69 803

SKB CASE 14224-3

-47daa, cada uma delas, de acordo com o método descrito para a purificação da proteína C13 no exemplo 3, acima (pureza em redor dos 50%) .

Para cada antigénio testado, os ratinhos foram divididos em très grupos (três ratinhos por grupo), recebendo o primeiro grupo 10 pg da proteína total, o segundo grupo 50 Mg da proteína total e um grupo de controlo recebendo apenas o CFA. Cada ratinho recebeu duas injecções uma na base da cauda (0,1 ml) e uma na almofada da pata traseira (0,1 ml). Uma semana após as injecções, os gânglios linfáticos em redor dos sítios das injecções foram removidos de cada ratinho. Os gânglios de todos os ratinhos de um mesmo grupo foram reunidos. Suspensões de células cénicas foram preparadas por passagem dos gânglios linfáticos através de uma rede de aço inoxidável. As células resultantes foram lavadas duas vezes e ressuspensas em meio completo (RPMI 1640 + 10% de soro de vitelo fetal, glutamina 2mM, tampão Hepes lOmM, 2-mercaptoetanol 5x10 ^M , penicilina e estreptomicina).

As células imunes dos gânglios linfáticos (6xl0⁶ células) foram estimuladas com 10^ células esplénicas normais infectadas com A/PR/8 (como descrito abaixo), durante 5 dias a 37qC em CO^ a 6%. As culturas foram erigidas em placas de 24 cavidades, com o volume total de 2 ml por cavidade. As células cultivadas (“células efectoras CTL·) foram então recolhidas lavadas duas vezes, e ressuspensas em meio completo nas concentrações apropriadas para o ensaio de CTL (libertação de crómio) descrito abaixo.

Para preparar as células estimuladoras infectadas com o vírus, removeram-se assepticamente baços de ratinhos (Balb/cxC57BL/ /ôlF^ e cardadas através de uma rede de aço inoxidável a fim de preparar suspensões de célula única. Os glóbulos vermelhos foram lisados por choque hipotónico. As células foram lavadas duas vezes e ressuspensas em meio completo a 6x10^ células por ml. As células foram infectadas com o virus A/PR/8/34 (cerca de 20 unidades formadoras de placa (PFU) por célula), durante uma hora a 37qC em 5% de CO^ com agitação suave em intervalos de 15 minutos.(Os vírus da gripe A/PR/8/34 (H1N1) e B/Lee/40 foram cultivados em ovos de ga69 803

SKB CASE 14224-3 s <

-48linha embrionados de 9 dias, durante 48 horas. 0 fluido alantóico dos ovos infectados foi recolhido, reunido, e armazenado em alíquotas a -70qC). As células foram então lavadas duas vezes e ajustadas para 1x10^ células/ml em meio completo. Foi adicionado 1 ml da suspensão de células infectadas às cavidades contendo 6xl0⁶ células imunes de gânglio linfático.

Os ensaios de CTL foram executados como se segue. As células

P815 (uma linha de mastocitoma derivada de ratinhos DBA, mantida em cultura em suspensão em Meio Essencial Minimo de Eagle (MEM) suplementado com 10% de soro fetal de vitelo e glutamina 2mM) em fase log de crescimento foram utilizadas como células alvo no ensaio de libertação de crómio. As células P815 foram marcadas com 51 7

Na₂CrO₄ ( Cr) (300pCí por 10 células), na ausência de soro durante 30 minutos a 37qC, 6% de CC^. 0 virus (cerca de 10 PFU por célula) foi então adicionado e a incubação continuou durante mais uma hora. As células foram então lavadas duas vezes, ressuspensas em meio completo (l-2xl0⁶ células por ml), e re-incubadas durante

3,5 horas a 37qC. Após lavagem das células, duas vezes, elas foram 5 ajustadas até 1x10 células por ml e 0,1 ml das mesmas foram adicionadas a microcavidades de fundo redondo (placas de 96 cavidades) contendo 0,lml de células efectoras CTL, de modo que as proporções finais de células efectoras para células alvo foram de 50:1, 25:1, 12,5:1, e 6,25:1 (todas erigidas em cavidades triplicadas) . As placas foram centrifugadas durante 5 minutos a 600rpm e, em seguida, incubadas durante 4 horas a 37qC, em 5% de CO . A ² quantidade de Cr libertado foi medida por amostragens de 0,1 ml de sobrenadante de cada cultura para contagem num contador gama (Beckman Instruments Gamma 8 000).

A percentagem de citotoxicidade foi calculada pela fórmula: (E-C/T-C)xlOO, onde E = contagem por minuto libertadas em presença de células efectoras, C = contagem por minuto libertadas por células alvo incubadas com 0,1 ml de meio completo ( libertação expontânea ) e T = número total de contagem por minuto por cavidade. Para o númesr · $·'

803

SKB CASE 14224-3

-49ro total de contagens por minuto» 0,1 ml de células alvo foram incubadas durante 3,5 horas, com 0,1 ml de dodecil sulfato de sódio a 1% e o conteúdo da cavidade foi misturado antes da amostragem de 0,1 ml .

Na condução do ensaio de proliferação as células dos gánglios linfáticos imunes (0,2 ml) foram adicionadas a cavidades de fundo plano de uma placa de mlcrotitulação de 96 cavidades a 4xl0⁵ células por cavidade. As células foram estimuladas com l0>*g por ml de proteina D (pureza de 90%), durante 72 horas a 37qC em 6% de ^C02· (As preparações armazenadas da proteina D foram apropriadamente diluídas com dextrose a 5% em ãgua antes da adição de 25 p1 por 3 cavidade). As cavidades foram então pulsadas com timidina Η (1 MCi) durante as últimas seis horas de cultura e em seguida, recolhidas em filtros com um colector de células automático (Scatron) para contagem de cintilações.

Os resultados são apresentados na Tabela 11, abaixo.

Tabela 11. Indução de CTL In Vivo % de Lise Especifica*

(Proteína			A/PR8			B/Lee
In Vivo)	Dose	12:1	25 :1	50 : 1	12:1	25 :1	50 : 1
D	10	29	35	36	7	8	8
	50	22	30	38	4	5	8
úh	10	7	19	24	6	10	13
	50	19	25	33	3	11	19
flH+	10	25	38	51	1	<1	4
	50	48	52	54	6	5	3
CFA		1	12	16	7	6	5

803

SKB CASE 14224-3

-50*representa a percentagem de citotoxicidade contra o alvo infectado pelo virus menos a percentagem de citotoxicidade contra o alvo não infectado. As respostas são positivas quando a percentagem de lise especifica é maior ou igual a duas vezes aquela observada em células de ratinhos imunizados apenas com CFA.

Os dados mostram que a proteina delta M⁺ induz efectivamente uma resposta de linfócitos T cltotóxlcos especifica para o tipo A em ambas as doses (10 pg e 50 pg) testadas. A proteina delta M induz uma resposta de CTL positiva com a dose mais elevada (50 pg) embora a actividade dos CTL não fosse apenas dirigida contra os alvos infectados com o tipo A dado que os alvos infectados com o tipo B também foram mortos. Dado que os CTL dirigidos contra proteinas recombinantes da gripe semelhantes (Kuwano e colab., 1988. J. Immunol. 140:1264-1268) ou contra virus (Yap e colab., 1978. Nature 273:238-239) podem, de forma adoptiva, transferir a imunidade portectora num modelo de ratinho e, além disso, dado que se crê que joguem um papel na clearance víral do virus da gripe humano (McMichael e colab., 1983. N. Engl. J. Med. 309:13-17) , qualquer destas duas proteinas e candidata a uma vacina da gripe humana.

As células de ratinhos imunizados com qualquer uma das proteínas D, delta M ou delta M⁺ foram também testadas quanto à resposta prol 1feratlva a 10 pg/ml de proteína D in vitro. A resposta de todos os grupos foi fortemente positiva (P<0,001 pelo teste do T de Student de cauda dupla versus a resposta no grupo de controlo do CFA). A proliferação ln vitro em resposta ãs proteinas derivadas da gripe é uma propriedade estabelecida dos clones de células auxiliadoras as quais podem aumentar ou suportar a produção de anticorpo especifico contra a gripe pelas células B (Scherle e Gerhard, 1986. J. Exp. Med. 164:1114-1128) . Dado que a produção de anticorpos neutralizantes pode ser facilitada por células T auxiliadoras in vivo (Scherle e Gerhard, 1986, acima, e 1988, PNAS 4446-4450; Tite e colab., 1988 J. Immunol 141:3980-3987), as proteínas que induzem as células com actividade potencial de célula T

803

SKB CASE 14224-3

-51auxiliadora são também consideradas candidatas a imunogénios para vacina humana.

invento e as suas concretizações preferidas são aqui amplamente descritos. Contudo, o invento não está limitado às concretizações especificamente descritas. Antes, ele engloba todas as modificações e variações que se situem dentro do âmbito das reivindicações seguintes.

803

SKB CASE 14224-3

Claims (22)

1. REIVINDICAÇÕES la ~ Processo para a preparação de uma vacina para estimular a protecção, em animais, contra a infecção pelo virus da gripe, processo caracterizado por compreender associar um polipéptido, tendo uma determinante imunogénica numa região limitada pelo aminoácido 64 e pelo aminoácido 222 da subunidade HA2 da proteina HA do virus da gripe, fundido a um polipéptido que obriga os referidos aminoácidos a assumir uma configuração imunogénica, com um veículo ou diluente e opcionalmente com um adjuvante estando o polipéptido, opcionalmente, liofilizado contendo uma dose simples da vacina cerca de 1 a 1000 microgramas do polipéptido.
2. 2a - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a determinante imunogénica estar na região limitada por qualquer dos aminoácidos 65-200, 65-222, 66-222, 69-222, 81-222 e 150-222 da subunidade HA2 da proteina hemaglutinina do virus da gripe.
3. 3a - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o polipéptido que obriga os aminoácidos a assumir uma configuração imunogénica compreender os aminoácidos 1-81 da proteína 1 não estrutural do vírus da gripe.
4. 4a - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o polipéptido que obriga os referidos aminoácidos a assumir uma configuração imunogénica compreender os aminoácidos 1-42 da proteína 1 não estrutural do virus da gripe.
5. 5q - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por a referida sequência de aminoácidos da subunidade HA2 ser derivada de qualquer dos subtipos Hl, H2 ou H3 do vírus da gripe tipo A.
6. 6a - Processo para a preparação de um polipéptido, caracterizado por se clonar, através de técnicas de ADN recombinante, e se expressar, num microorganlsmo ou outra célula hospedeira, um fragmento de ADN que codifica um polipéptido híbrido compreendendo um pêptido correspondente a uma determinante imunogénica dentro da «3

   69 803

   SKB CASE 14224-3

   -53região limitada pelos aminoácidos 64-222 da subunidade HA2 da proteína hemaglutinina do vírus da gripe e um polipéptido que obriga a referida determinante imunogénica a assumir uma configuração i munogéni ca.
7. 7 a - Processo para a preparação de um polipéptido, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a determinante imunogénica estar na região limitada por qualquer dos aminoácidos 65-200, 65-222, 66-222, 69-222, 81-222 e 150-222 da subunidade da proteína hemaglutinina do vírus da gripe.
8. 8a - Processo para a preparação de um polipéptido de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o polipéptido que obriga os referidos aminoácidos a assumir uma configuração imunogénica ser qualquer dos aminoácidos 1-42 e 1-81 da proteína não estrutural do virus da gripe.

   por
9. 9a - Processo de acordo com a a determinante imunogénica ser reivi nd icação 1, transportada pela caracterizado proteína C13.

   por
10. 10a - Processo de acordo com a a determinante imunogénica ser reivindicação 1, transportada pela caracter i zado proteína D.
11. 11a - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a determinante imunogénica ser transportada pela proteína curta C13.
12. 12a - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a determinante imunogénica ser transportada pela proteína curta D.
13. 13a - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a determinante imunogénica ser transportada pela proteína ôM.
14. 14a - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a determinante imunogénica ser transportada pela proteína ΔΜ+.
15. 15a - Processo de purificação de um polipéptido diferente de uma proteína HA, a qual compreende uma determinante imunogénica da subunidade HA2, caracterizado por compreender:

    submeter o

    1isado celular a um primeiro tratamento detergen-

    69 803

    SKB CASE 14224-3

    -54te a um pH na gama entre cerca de 6 a cerca de 8,5, para solubi lizar selectivamente os contaminantes das células hospedeiras e formar assim uma fracção solúvel e uma fracção insolúvel contendo, a fracção insolúvel, o polipéptido;

    separar a fracção solúvel da fracção insolúvel;

    submeter a fracção insolúvel a um segundo tratamento detergente, a um pH na gama entre cerca de 9 e cerca de 11 para solubilizar, selectivamente, contaminantes das células hospedeiras e formar assim uma fracção solúvel e uma fracção insolúvel, contendo, a fracção insolúvel, o polipéptido;

    separar a fracção solúvel da fracção insolúvel;

    submeter a fracção insolúvel à acção de um agente caotrópico, solubi1izando assim o polipéptido;

    separar a fracção solúvel da fracção insolúvel, contendo, a fracção solúvel, o polipéptido;

    adicionar um agente redutor à fracção solúvel; e submeter a e recuperar rido eluído dotoxinas e fracção solúvel a cromatografia de permuta iónica o eluído contendo o polipéptido, estando o refesubstancialmente isento de ácidos nucleicos, enpolipéptidos da célula hospedeira, contaminantes.
16. 16a - Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por o polipéptido compreender um primeiro polipéptido tendo a determinante imunogénica da subunidade HA2 fundida com um segundo polipéptido.
17. 17a - Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por o primeiro polipéptido ter uma determinante imunogénica da subunidade HA2 da proteína HA, de um ou mais dos subtipos Hl, H2 e H3 do virus da gripe tipo A, fundida com um segundo polipéptido que obriga a determinante HA2 a assumir uma configuração imunogénica.
18. 18a - Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por o segundo polipéptido compreender os aminoácidos do terminal N

    69 803

    SKB CASE 14224-3

    -55da proteína NS1.
19. 19a - Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por o segundo polipéptido compreender os aminoácidos 1 a 81 de NS1 .
20. 20a - Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por o segundo polipéptido compreender os aminoácidos 1 a 42 de NS1 .
21. 21a - Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por o primeiro polipéptido compreender qualquer um dos péptidos constituido pelos aminoácidos 1 a 222 da subunidade HA2, aminoácidos 65 a 200 da subunidade HÀ2, aminoácido 65 a 222 da subunidade HA2, aminoácidos 66 a 222 da subunidade HA2, aminoácidos 69 a 222 da subunidade HA2, aminoácidos 81 a 222 da subunidade HA2 e aminoácidos 150 a 222 da subunidade HA2.
22. 22a - Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por a determinante imunogénica ser transportada por qualquer uma de entre as proteína C13, proteína D, proteína A, proteína C, proteína D, proteína curta D, proteína curta C13, proteina M e proteína M+.

    Lisboa

    3i.

    Pela SMITHKLINE BEECHAM CORPORATION

    E FRANCIS A. ENNIS

    0 Agente Oficial

    ATCCATCCAAACACTCTCTCAAGCTTTCACCTACATTCCTTTCTTTMCATCTCCCCAAA

    TACCTACCTTTCTftACACACrrCCAAACTCCATCTAACGAAACAAACCCTACACCCCTrr /

    Ma lAapftoAinTItrVaXSafSarPhaGXnVaXAapCy afAa LauTrpMXaValAcgLyi CCACTTCCACACCAACAACTAMTGATCCCCCATTCCTTCATCCCCTTCCCCGACATCAC

    CCTCAACffrCTCCTTCTTCATCCACTACCSCCTAAeGAACTACCCCAACCCCCTCTACTC

    ArçVaXAXaAapCXnCXuLawCXyAapAXarro*haLauAapA<qLauAcqAcgAa pCX n

    AAATCCCTAACA£CAAÚCCCCACCACTCTrCCTC7CCACATCCACACACCCACACCTCCr

    TTTACCfiArrCTCCTTCCCCeTCCTCACAACCACACCTCTACCTCTCTCCCTCTCCACCA

    LyaAarLauArvCXyArqCXySaiThrLawCXyLauAapIXaCXuTItrAXaThrArqAl·

    CCAAAfiCACATACTCCACCSCATTCTCAAACAAâAATCCCATCACCCACrrAAAATCACC ------.---- -----------------« ....------*--------£X yí.yaCXn I XaVa XCX uAr q I XaLauLy aGXuCXuXar AapCXuAXaLauLy »m« c. Th r

    ATC xatctc TCCACA —♦AH-t kXTCTATTTCCA^CArrCCCCCrrTTATTCAACCCCCATCCACT TAC 9t Mac. TTACAC tapLai ACÇTCT KU Ut &arAxç CCXCATAAJUZCTCGGTXACGCCCAAAATAACTTCCCCCTACCTGA / «XyLauthaCXyAXalXaAXaClyfha 1XaGXuCXyCX yTr plhx

    GGAATCATACATGGATGCT ACCGTTATCATCATCACAATCAAC ACCCATCACCCT AT&CA

    CCTTACTATCT ACCT AC CATGCC AAT ACTACTACTCrTACTTCTCCCTACTCCCAT ACCT CXyMat IXaAapCXyTEpTyrCXyTy r UXaHXaCXnAanCXuCXnCXy&arGXyTy r Al a ccccTACTTrTrícCTCTcrrrrACCCTAATTCCccTAATCTrrcrrcCAcrrCACACAA

    AX«AapCXnX.yaSarThaCXnAanAX<XXaAanCXyIXaThxAanLyaVaXAtnSarVa1 ATCCA£AAAATCAACATTCAATTCACACCTeTeCCTAAACAATTCAACAAATTACAAAAA

    TAGCTCrrrrACTTCTAACTrAAGTCTCCACACcçATTrcnAACTTcrrrAA-tcTT-rrr XXaCXuLyaMatAanlXaCXnthaThr AXaVaXCXyLyaCXufhaAanLyeLauCXuLya ACCATCCAAAATTTAAATAAAAAACrr&ATCATGCATTTCTCCACATTTCCACATATAÀ .

    a----.-.------------------------------------------- ----------TCCTACCTTTTAAArrrATTTTTTCAACTACTACCTAAACÀCCrCTAAACCTCTATArr* U9Het£iuAaaL«uA«<iLyaI.ya ValAapAapCly* KaLauAapIlaTrpThrTy r Am

    GCACAAnVrTACTTCTACTCCAAAATCAAAGCACTCTCÚArrrCCATCACTCXXATCTC

    CCTCTTAACA-ATCAAGATCACCTTTTACTTrCCTCJUiKCCTAAAGCTXCTCACTTTACAC AlaGiMLauLauValLauX^atACluJLanCluArgThrLauXapfhatfiaKapXar Aan 1 AAâAATCTCTATCAâAAACTAXAAACCCAATTAXACAATAATCCCAAAâXAJkTCCCAAAT ri’CrrA**AUATAi.T'UTTTCATTTTTCCCTTAATTTCrTATTACCCTTTCnrTACCCTTTA

    LyaAanLauTy rClwLyaVaXLyaSar ClnLauLyaAaAAanAlaLyaClu X laC 1 y Aan

    GCATCTTTTCACTTCTACCACAACTCTCACAATCXATCCATCCAAACTCTAACAAATGCC

    CCT ACAKAACTCAKGATGCTCTTCKGACTCTTACTTKCGTàCCTTTCKCATTCTTT AC c c

    ÇXyCyeritaClu*h«TyrNl»l,yaCyaA«pAanClwCy»MatCluSarValArQAanCly

    KCTTATGATTATCCCKAATATTCACAACKCTCAAACTTCAACACCCKAAAGCTA^ATCCk

    TGAATACTAATACCCTTTAT AACTCTTCTCACTTTCAACTTCTCCCTTTTCCKTCT ACCT

    TfcrTyrAepTyrfcoLyaTyrSarCXwCXuSarLyeLauÀaKÀr^CXaLyaValAapCXy

    CTCAAATTGCAATCAATGCíiíiÀTCTATCAfiATTCTCGCÍiATCTACTCAACTCTCGCCACT · — — — — — — — — — ♦ — — — « « — — . - 4 — —

    CACTTT AACCTTACTT ACCCCTAGATAGTCT AACACCCCTAGATCAGTTCAC ACCCCTCA

    VaXX.yaLauCXuieíKalCXyIXeTyrCXnJ XaLauAXal XaTyrAarThrVaXAXaiar TCACTCCTCCTTTTCCTCTCCCTGCCCCCAATCACrrrCrCCATCTCTTCTAATGCATCT ACTGACCACCAAAACCACACGCACCCCCCTTACTCAAACACCTACACAACATTACCTACA »arLauWaXLauLauWeXía<LauCXyAXaIXaíar»haT*pMatCyaíerAanCXySar

    TTCCACTCCACAATATCCATCTCA

    AACGTCACCTCTTATACÇTACACT LauCXnCyaAxçIXaCyafíaCae 3HUHU.úrO£ &c£c»hAH CoRJOWTli» e fQ.A/VCO A.

    FIGURAI .:} JV j

    £.

    —►MSI

    ATMATCCAAACACTCTCTCAACCTTTCACGTAGATTCCTTTCTTTGGCATCTCCCCAAA

    TACCTAGCTTTCTCACACAGTTCGAAACTCCATCTAACCAAAGAAACCCTACACCCGTTT

    UatAapProAanThrVaISarSarPhaCInVaIAapCyaPhaLauTrpHiaValArgLya

    CCACTTCCAGACCAACAACTACCTCATGCCCCATrCCTTCATCGCCTTCGCCGACATCAC

    CCTCAACCTCTCCTTCTTCATCCACTACCCCGTAAGCAACTACCCCAACCCCCTCTACTC ArgVaIA IaAapGInGIuLauGIyAapAIaProPhaLauAapArgLauArgArgAapGIn AAAKCCTAACACCAACCGCCACCACTCTTCCTCTCGACATCGACACACCCACACCTCCT tttacccattctccttccccctcctcacaaccacacctctacctctgtccctctccacca

    LyaSarLauArgCIyArgCIySarThrLauCIyLeuAapIIaGIuThrAIaThrArgAI a CCAAaCCACATACTCCACCCCATTCTCAAAGAACAATCCCATCAGGCACTTAAAATCACC

    CCTTTCCTCTATCACCTCGCCTAAGACTTTCTTCTTACCCTACTCCGTCAATTTTACTCG

    GIyLyaCI η11«VaIGIuArglIaLauLyaCIuGIuSarAapGIuAIaLauLyaUatThr .HA A

    TCTGGGTAAAGAATTCAACAAATTACAAAAAAGCATGCAAAATTTA atc:acatccc<

    cfcZi

    TAC CTCTAGCCC:cacacccatttcttaacttctttaatcttttttcctaccttttaaat ιί/^Àtr

    9!

    UatCInlIaProMaValGIyLyaCI uPhaAanLyaLauC I uLy aArgUatC IuAanLau aataaaaaacttcatcatgcatttctcgacatttccacatataatccagaattcttactt

    TTATTTTTTCAACTACTACCTAAACACCTCTAAACCTGTATATTACGTCTTAACAATCAA βι

    AanLyaLyaVaIAapAapCI yPhaLauAapIIaTrpThrTyrAanAIaCIuLauLauVaI CTACTCCAAAATCAAACCACTCTGCATTTCCATCACTCAAATGTCAAGAATCTGTATCAC

    CATCACCTTTTACTTTCCTGAGACCTAAAGCTAÇTCAGTTTACACTTCTTAGACATACTC

    LauLauGIuAanCIuArgThrLauAapPhaH!aAapSarAanVaILyaAantauTyrC I u aaactaaaaagccaattaaacaataatcccaaacaaatcccaaatccatcttttcacttc

    TTTCATTTTTCCCTTAATTTCTTATTACCGTTTCTTTACCCTTTACCTACAAAACTCAAO

    LysValLyaSarGInLauLyaAanAanAlaLyaCluIlaClyAanGlyCyaPhaCluPha

    TACCACAACTGTCACAATGAATCCATCGAAACTGTAACAAATCCCACTTATCATTATCCC atcctcttcacactcttacttacctacctttcacattctttaccctcaatactaatÂccg ✓Λ»

    TyrHi aLyaCyaAapAanCIuCyaMatCIuSarVaIArgAanGIyThrTyrAapTyrPro AAATATTCACAACACTCAAACTTCAACAGCCAAAACCTACATCCACTCAAATTCCAATCA

    TTTATAAGTCTTCTCACTTTCAACTTGTCCCTTTTCCATCTACCTCACTTTAACCTTACT LyaTyrSarGIuGIuSarLyaLauAanArgGIuLyaVaIAapCIyVaILyaLauCIuSar ATCGCCATCTATCAGATTCTCGCCATCTACTCAACTCTCCCCACTTCACTCCTGCTTTTG

    TACCCCTACATACTCTAACACCCCTAGATCACTTGACAGCCGTCAAGTGACCACCAAAAC MatOlyXlaTyrGInllaLauAIallaTyrSarThrVaΙΑ I«SarSarLauVaILauLau CTCTCCCTGGCCCCAATCAGTTTCTCCATCTCTTCTAATCGATCTTTCCACTCCACAATA CACACGGACCCCCGTTACTCAAACACCTACACAACATTACCTACAAACGTCACCTCTTAT VaISarLauGlyAIallaSarPhaTrpMatCysSarAanClySarLeuGInCyaArgl I a

    TCCATCTCA

    .........

    ACGTACACT iU

    CyaXIaEnd 3cvchah e

    Fn,m)Oí> A. FIG0RA.2

    -» tól

    ATCCAKCAAACACTGTCTCAACCTTTCACCTACATTCCTTTCTTTCCCATGTCCGCA «StA;·-.

    TACCTAGCTTTCTGACACACTTCCAAACTCCATCTAACCAAACAAACCCTACAGCGfffg MatAapProAanThrVaISarSarPhaCInVaIAapSarFhaLauTrpHi aVaIArgLya CGAGTTCCACACCAACAACTAGCTCATGCCCCATTCCTTCATCGGCTTCCCCCACATCAC cctcaacctctccttcttcatccactacgcgctaacgaactagccgaaccgcctctactc

    ArgVaIAIa AapCt nCIuLauCIyAapAIaProPhaLauAapArgLauArgArgAa pCln AAATCCÍTCCÃTCTdTCCACÃEcTCTATTTCCACCCATTCCCCCTTTTATTGAAGGCGGA TTTACqrACCTACAQkCCTCICCACATAAACCTCCCTAACCCCCAAAATAACTTCCCCCT ’_sg IyLauPhaGIyAIa11aAIaGIyPhelIeCIuC17CIy

    TGCACTCCAATGATACATCCATCCTACCCTTATCATCATCACAATCAACACCCATCACCC

    ACCTCACCTTACTATCTACCTACCATCCCAATACTACTACTCTTACTTCTCCCTACTCCC

    TrpThrCIyMatlIaAspCIyTrpTyrCIyTyrHiaHiaGInAanGIuCInCIySarCIy TATCCACCCCATCAAAAAAGCACACAAAATCCCATTAACCGCATTACAAACAACCTCAAC ATACCTCCCCTACTTTTTTCCTCTCTTTTACCGTAArTCCCCTAATCTTTCTTCCACTTC

    TyrAlaAlaAapGIntyaSarThrCInAanAlailaAanClyIlaThrAanLyaVaIAa TCTCTTATCCACAAAATCAACATTCAATTCACACCTCTCCCTAAAGAATTCAACAAATTA

    ACACAATACCTCTTTTACTTCTAACTTAAGTCTCCACACCCATTTCTTAACTTCTTTAAT SarVaIIIaCIuLyaMatAanlIaGInPhaThrAIaVaICIyLyaGIuPhaAanLyaLau CAAAAAACCATCCAAAATTTAAATAAAAAACTTCATCATCCATTTCTCCACATTTCCACA

    CTTTTTTCCTACCTTTTAAATTTATTTTTTCAACTACTACCTAAACACCTCTAAACCTCT Cl uLyaArgMatGIuAsnLauAanLysLyaVaIAapAapClyPhaLauAapIlaTrpThr TATAATCCACAATTCTTACTTCTACTCCàAAATCAAACCACTCTCCATTTCCATCACTCA

    ATATTACCTCTTAACAATCAACATCACCTTTTACTTTCCTCACACCTAAACCTACTCACT TyrAanAIaCIuLauL.auVaILauLauCIuAanCIuArgThrLauAapPhaHiaAapSar AATCTCAACAATCTCTATCACAAACTAAAAACCCAATTAAACAATAATCCCAAACAAATC TTACACTTCTTACACATACTCTTTCATTTTTCCCTTAATTTCTTATTACCCTTTCTTTaG AanVaILyaAanLauTyrCIuLysVaILyaSarCInLauLyaAanAanAIaLyaGIulla CCAAATCCATCTTTTGACTTCTACCACAACTGTCACAATGAATCCATCGAAACTGTAACA φ---------.---------.------— cctttacctacaaaactcaacatcctcttcacactcttacttacctacctttcacattct

    CIyAanGIyCyaPhaCIuPhaTyrH i aLyaCyaAapAanCIuCy aUatCluSarValArg

    AATCCCACTTATCATTATCCCAAATATTCACAACACTCAAACTTCAACAGCCAAAACCTA ♦ ———

    TTACCCTCAATACTAATAGGC7TTATAAGTCTTCTCACTTTCAACTTCTCCCTTTTCCAT

    AanCIyThrTyrAapTyrProLyaTyrSarduGIuSarLyaLauAanArgCIuLyaVaI

    CATCCAGTCAAATTCCAATCAATCCGCATCTATCACATTCTCCCCATCTACTCAACTGTC

    CTACCTCACTTTAACCTTACTTACCCCTACATACTCTAAGACCCCTACATCAGTTGACAC

    AapClyVaILyaLauCIuSarUatCIyIlaTyrCInllaLauAlailaTyrSar u.rVtl cccacttcactcctccttttcctctccctccccccaatcactttctcgatctcttctaat

    CCGTCAACTGACCACGAAAACCAGACGGACCCCCCTTAGTCAAAGACCTACACAACATTa

    AIaSarSarLawVaILauLawVaISarLauCIyAIallaSarPhaTrpMatCyaSarAan

    CCATCTTTCCACTCCACAATATCCATCTCA cctacaaacctcacctcttatacctacact xu

    ClySarLauCInCyaArgltaCyal(a£n4 A·

    FIGURA3

    -♦•Κι

    ATGCATCCAAACACTCTCTCAACCTrTCACCtACATTCCmCTrtCCCATCTCCCCAAA

    TACCTAGCTnGTGACACACTTCGAAACtCCATCTAAGCAAAGAAACCCTACAGCCGTTT

    I

    MatAap*roAanThrValSarSax*haClnValAapAar*Aal«uTxpax«ValAigLy*

    CCACTTCCACACCAACAACTACGTGATCCCCCATTCCTTCATCGGCTTCGCCGACATCAC

    AAATCC ATGCATCATATGTTAACAACTACTCl

    ...

    CATCT TTGGGTA

    ArqValAlaAapClo£luL«uGlyAapAla*rorhaL«uAApAxqLauAx9Ax%A,pCln ►HAâ

    TAAAGAATTCAACAAATTA rrTAC(fiACCT*CTAT*CAATKTTCAT6*6CT«c4»cccArrrcTiMsrTGrrr*AT fA Λλ4</· 44

    Ly «ia çlatAagliaHatLaujntxSaxJlKAfsJgjQfa IGlyLy «Glut haAa nL y · La u CAAAAAAGGATGCAAAATRAAATAAAAAACTTGATCATGCATTTCTCGACATTrGCACA

    CI m 1 ICCTACC! rTTAAATTTAT»THCAACTACTACCTAAACACCTCTAAACCTCT

    GluLyaAiqMatClaAanL«uAa&I.ysLyaVaLAapAapClythal«uAapX XaTxpThr TATAATGGACAATTGTTAGTTCTACTCCAAAATCAAAGCACTCTGCATTTCCATCACTCA

    ATATT ACCTCTTAACAATCAACATGACCTTTTACTTTCCTCACACCTAAAGGTACTCACT TysAaaAiaCluLauLauValLauLaueiuAanCluArfTluLauÀap* haliaAapSar AATCTCAACAATCTGTATGAGAAAGTAAAAAGCCAATTAAACAATAATGCCAAACAAATC ttacacttcttacacatactctttcatttttcgcttaatttcttattacgctttctttag

    AsnValLyaAanlaaTyrGluLy*ValLyat«rGlnLauX.ysAanAanAlaLyaCluXla

    CGAAATGCATCTTTTGACTTCTACCACAACTCTCACAATCAATCCATCCAAACTCTAAGA

    CCTTTACCTACAAAACTCAACATGCTCTTCACACTCTTACTTACCTACCTTTCACATTCT

    GXyAanCXyCyatlMGlu* haTyraiaLysCyaAapAanGluCysMatCluSarValArq AATGCCACTTATGATTATCCCAAATATTCAGAACACTCAAACTTGAAC ACGCAAAAGCT λ

    TTACCCTCAATACTAATAGGCTTTATAACTCTTCTCACTTTCAACTTCTCCCTTTTCCAT

    AsnClyThrTyrAapTyxPtoLyaTyrSacCXuCluSarLyaL«uAanAt'qCl.uLysVal

    GATGCAGTGAAATTGCAATCAATGGGGATCTATCACATTCTGGCGATCTACTCAACTGTC

    CTACCrCACTTTAACCTTAeTTACCCCTACATACTCTAAGACCGCTACATCACTTCACAG

    MpGlyV«lLyaLauClu*arHatClyZla?yrClallaL<auJUaXlaTyrSarThrVal

    GCCACTTCACTGGTGCTTTTGCTCTCCCTGGGGCCAATCACTTTCTGCATCTGTTCTAAT

    CGCTCAAGTGACCACSAAAACXACAGGGACCCCCCTTAGTCAAACACCTACACAACATTA

    AXa4arSaxL«wValLauI^uValSarLauGlyAZaXla4«cthaTrpMatCysSar Aan

    GCATCTTTGCACTGCACAATATGCATCTCA --------«-CCTACAAACCTCACCTCTTATACCTACACT

    JLAJL

    CXySarLauClaCyaArqXXaCyalXaCnd

    OKtTkAicuioí eeecH-M coaPoiwW eFoA/OCiO AFIGURA4