JPH03130082A - ワクチン用ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明はワクチンの調製、さらに詳しくは、組換型ＤＮ
Ａ技術によるワクチン用インフルエンザウィルス・ポリ
ペプチドの調製に関する。

発明の背景 インフルエンザウィルス感染は、時々、世界的規模でヒ
ト、ウマおよびニワトリに急性呼吸器疾患を引き起こす
。インフルエンザウィルスはオルソミクンウイルスであ
り、それ自体は直径８０〜１２０ｎｍのピリオンを包含
し、２つの異なる糖タンパク質スパイクを有する。３つ
の型Ａ、ＢおよびＣがヒトに感染する。時おりＢ型感染
の流行もめるが、Ａ型ウィルスが、近午のヒトにおける
流行の大部分の原因である。Ｃ型ウィルスもまたブタか
ら単離されているが、既知のブタ、ウマおよびニワトリ
ウィルスは大抵の場合Ａ型である。

Ａ型ウィルスは血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダ
ーゼ（ＮＡ）表面糖タンパク質の抗原特性に基づいて亜
型に分けられる。Ａ型の中で、亜型Ｈ１（ブタインフル
エンザ）、Ｈ２（アジアインフルエンサ）およびＨ３（
香港インフルエンザ）がヒト感染において優勢である。

ＨＡＤよびＮＡタンパク質中の抗原決定因子に影響を及
ぼすおよそｌ午間隔での遺伝的変動のために、通常の死
菌または弱毒ウィルスを用いて、「万能の」インフルエ
ンザウィルス・ワクチン、すなわち、株非特異性ワクチ
ンを調製することは不可能であった。最近、異なる株を
交差することにより調製しｔ；再配列ウィルスから、か
かる万能、または不可能ワクチンを調製する試みがなさ
れている。ごく最近において、かかる試みは、主として
ＨＡタンパク質に焦点を合わせた組換型ＤＮＡ技法を包
含している。

報告されている発達技術 ウィンターら（Ｗｉｎｔｅｒ　ｅｔ　ａ１、）は、ネイ
チャー　（Ｎａｔｕｒｅ）、２９２巻、７２〜７５頁（
１９８１）において、トリプシン様酵素により、プロセ
ッシングの間に認識されると思われる単一アルギニン残
基（３２７）により分離された１７残基の疎水性シグナ
ルペプチド、ＨＡＩサブユニット（３２６残基長）およ
びＨＡ２サブユニット（２２２残基長）からなるＡ／Ｐ
Ｒ／８／３４株（ＨＩＮＩ）のＨＡのＤＮＡコーディン
グ配列を報告している。木様のＨＡＩおよびＨＡ２サブ
ユニットのアミノ酸およびヌクレオチド配列の相同％を
、亜型Ｈ２、Ｈ３およびＨ７の代表様のそれらと比較し
た。

バエズら（Ｂａｅｚ　ｅｔ　ａ１、）は、ニュークレイ
ツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃ１、Ａｃ１ｄｓ　Ｒ
ｅｓ、）、８巻、５８４５〜５８５７頁（１９８０）に
おいて、Ａ／ＰＲ／８／３４株の非構造（ＮＳ）タンパ
ク質のＤＮＡコーディング配列を報告している。

ヤングら（Ｙｏｕｎｇ　ｅｔ　ａ１、）は、ジ・オリジ
ン・オブ・パンデミツク・インフルエンザ・バイラシー
ズ（Ｔｈｅ　Ｏｒｉｇｉｎ　ｏｆ　Ｐａｎｄｅｍｉｃ　
Ｉ　ｎｆｌｕｅｎｚａ’Ｊ　１ｒｕｓｅｓ）、１９８３
、ダブル・ジー・レイパー編、エルスヴイール・サイエ
ンス・パブリッシング・カンパニー（ｅｄｉｔ、ｂｙ　
Ｗ、Ｇ、Ｌａｖｅｒ、Ｅ　１ｓａｖｉｅｒＳｃｉｅｎｃ
ｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、）およびプロシーデ
インダス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイ
エンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ１、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）　
ＵＳＡ、　８０巻、６１０５〜６１０９頁（１９８３）
において、イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）のＡ／Ｐ　Ｒ／
８／３４株からの８個のＲＮＡセグメント全てのｃＤＮ
Ａのクローニング、およびイー・コリのＮＳＩタンパク
質の高レベル発現を報告している。

エムテイジら（Ｅｍｔａｇｅ　ａｔ　ａ１、）は、米国
特許第４３５７４２１号において、インフルエンザウィ
ルスＨＡ遺伝子のコーディング配列のクローニングおよ
び発現を開示し、ＨＡポリペプチドがワクチン目的で投
与できる抗原であることを開示している。

ザ・モービディティ・アンド・モータリティ・ウィーク
リー・レポート（Ｔｈｅ　Ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ　ａｎｄ
Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ　Ｗｅｅｋｌｙ　Ｒｅｐｏｒｔ）、
３３巻、■９号、２５３〜２６１頁には、ＨＡタンパク
質金含有ヒトワクチン投与量および投与方法を含む最も
最近のインフルエンザウィルスの予防および抑制計画が
評論されている。

デービスら（Ｄａｖｉｓ　ｅｔ　ａ１、）は、ジーン（
Ｇ　ｅｎｅ）、２１巻、２７３〜２８４頁（１９８３）
において、ＨＡ由米ポリペプチドに対するマウスの免疫
応答を報告している。

さらにいくつかの文献が、Ａ／Ｐ　Ｒ／８／３４および
他の株のＨＡ１ＮＳ８よび他のインフルエンザウィルス
遺伝子のクローニングおよび発現を報告している。かか
る文献のいくつかは以下に引用されている。

図面の記載 第１図は、Ｃ１３タンパク質のコーディング領域のヌク
レオチド配列およびそのアミノ酸配列である。枠で囲ん
だ領域は、ＮＳＩのＣ−末端アミノ酸８１　（メチオニ
ン）と無傷のＨＡ２サブユニット（アミノ酸１〜２２２
）のＮ−末端アミノ酸ｌ（グリシン）を連結する配列を
示す。

第２図は、Ｄタンパク質のコーディング領域のヌクレオ
チド配列およびそのアミノ酸配列である。

枠で囲んだ領域は、ＮＳＩのＣ−末端アミノ酸８１　（
メチオニン）と切形のＨＡ２サブユニットのＮ−末端ア
ミノ酸６５（アラニン）の間のリンカ−配列を示す。ｒ
ＡＪタンパク質、「Ｃ」タンパク質および「ΔＤ」タン
パク質における切形のＨＡ２サブユニットのＮ−末端ア
ミノ酸に、各々、対応するＨＡ２のアミノ酸位６９（グ
ルタミン酸）、８１（アスパラギン）および１５０（グ
ルタミン酸）もまた示されている。

第３図は、Ｃ１３ショートタンパク質のコーディング領
域のヌクレオチド配列およびそのアミノ酸配列である。

枠で囲んだ領域は、ＮＳＩのＣ−末端アミノ酸４２（セ
リン）と無傷のＨＡ２サブユニットのＮ−末端アミノ酸
ｌ　（グリシン）を連結する配列を示す。ＮＳＩのアミ
ノ酸１３（システィン）はセリンにより置換されている
。

第４図は、Ｄショートタンパク質のコーディング領域の
ヌクレオチド配列およびそのアミノ酸配列である。枠で
囲んだ領域はＮＳＩのＣ−末端アミノ酸４２（セリン）
と切形のＨＡ２サブユニットのＮ−末端アミノ酸６６（
バリン）の間のリンカ−配列を示す。ＮＳＩのアミノ酸
１３（システィン）はセリンにより置換されている。

発明の要約 −つの態様において、本発明は、ＨＡタンパク質のＨＡ
２サブユニットの免疫原決定因子を有する、ＨＡタンパ
ク質以外のポリペプチドからなるインフルエンザウィル
スによる感染に対して動物における防御を刺激するワク
チンである。

もう一つ別の態様において、本発明は、ＨＡ２サブユニ
ットの免疫原決定因子からなり、本発明のワクチンに使
用できる。ＨＡタンパク質以外のポリペプチドである。

さらにもう一つの態様において、本発明は：細胞溶解産
物を、約６〜約８．５の範囲のｐＨにて、最初の洗浄処
理に付し、宿主細胞の汚染物を選択的に溶解させ、それ
により可溶性フラクションと不溶性フラクションを形成
させ、該不溶性フラクションはポリペプチドを含有して
おり：可溶性フラクションを不溶性７ラクンヨンから分
離し； 不溶性７ラクシヨンを、約９〜約ＩＩの範囲のｐＨにて
、第２の洗浄処理に付し、宿主細胞汚染物を選択的に溶
解させ、それにより可溶性フラクションと不溶性フラク
ションを形成させ、該不溶性フラクションはポリペプチ
ドを含有しており；可溶性フラクションを不溶性フラク
ションから分離し； 不溶性フラクションをカオトロビズム剤に付し、それに
よってポリペプチドを溶解させ；可溶性フラクションを
不溶性フラクションから分離し、該可溶性フラクション
はポリペプチドを含有しており； 還元剤を可溶性７ラクシヨンに加え：および可溶性フラ
クションをイオン交換クロマトグラフィーに付し、ポリ
ペプチドを含有する溶出液を回収し、該溶出液は実質的
に混入している宿主細胞核酸、内毒素およびポリペプチ
ドがないことを特徴とする組換型宿主細胞培養の細胞溶
解産物からの本発明のポリペプチドを精製する方法に関
する。

他の態様において、本発明は、コーディング配列のみ、
またはＤＮＡクローニングまたは発現ベクターのような
より大きな分子への取り込みを含め、本発明のワクチン
用ポリペプチドのコーディング配列を含むＤＮＡ分子、
およびかかるＤＮＡ分子で形質転換した敬生物または細
胞である。

発明の詳説 しばしば、免疫原決定因子は、免疫防御応答を刺激しな
い。これは、大部分、宿主の身体防御系についての決定
因子が適当な配置で存在していないためであると考えら
れる。

以下に開示するように、ＨＡタンパク質のＨＡ２サブユ
ニットの免疫原決定因子（１つまたはそれ以上の隣接し
た、または分離したハプテンからなっていてもよい）は
、驚くべきことに、もとの亜型中の種々の株に対して、
細胞毒性Ｔ細胞応答を誘発する。したがって、ＨＡ２免
疫原決定因子は、免疫原配置にて存在する場合、株特異
的であるよりもむしろ、亜型特異的である防御的免疫応
答を誘発することができる。例えば、ＨＡ２サブユニッ
トに免疫原配置をとらせることによって、ＨＡ２決定因
子を、免疫原決定因子に対して免疫応答をさせる第２の
ポリペプチドに融合したＨＡ２サブユニット、すなわち
、実質的にＨＡタンパク質の無傷のＨＡ２サブユニット
からなるワクチン用ポリペプチド中に存在させることが
できる。

好ましくは、ＨＡ２免疫原決定因子に対してそのような
免疫応答をさせるポリペプチドは、原核生物または真核
生物の組換型宿主により高レベルで発現される、実質的
に無傷のＨＡ２サブユニットのＮ−末端に融合したアミ
ノ酸配列からなる。

特に好ましくは、インフルエンザウィルス・タンパク質
由来のポリペプチドである。ＨＡタンパク質に対する免
疫防御応答は株特異的であると考えられるｔ二め、ワク
チン用ポリペプチドは、ＨＡタンパク質ではない。

イー・コリに８けるＨＡ免疫原決定因子を有するそのよ
うなワクチン用ポリペプチドの発現については、ＨＡ２
決定因子に対して免疫応答をさせるポリペプチドは、Ｎ
ＳＩインフルエンザウィルス・タンパク質のＮ末端であ
ることが好ましい。

その代表的かつ好ましい具体例は、本明細書にてＣ１３
と称するタンパク質である。第１図に示されているよう
に、Ｃ１３タンパク質は、アスパルテート−ロイシンを
コードするリンカ−配列を介して、ＨＡタンパク質のＨ
ＡＩサブユニットのアミノ酸３２６（セリン）、ＨＡ２
からＨＡＩを分離するＨＡのアミノ酸３２７（アルギニ
ン）、オよび無傷のＨへ２サブユニツト（アミノＭｌ〜
２２２）からなるペプチドに融合したＮＳＩタンパク質
の最初のａ１個のアミノ酸を有する（ＨＡアミノ酸は、
ウィンターら、ネイチャー、２９２ニア２（１９８１）
から番号付けた）。

もう一つＥｌｌの具体例において、ワクチン用ポリペプ
チドは、「Ｃ１３シヨート」と称されるタンパク質であ
る。第３図に示すように、Ｃ１３シヨートは、メチオニ
ン−アスパルテート−ロイシンをコードするリンカ−配
列を介して、ＨＡタンパク質のＨＡＩサブユニットのア
ミノ酸３２６（セリン）、ＨＡ２からＨＡＩを分離する
ＨＡのアミノ酸３２７（アルギニン）、および無傷のＨ
Ａ２サブユニット（アミノＭｌ〜２２２）からなるペプ
チドに融合した、（アミノ酸１３（システィン）がセリ
ンにより置換されていることを除いては）ＮＳＩタンパ
ク質の最初の４２個のアミノ酸からなる。

その単離および精製が比較的容易であるため、Ｄタンパ
ク質であることがさらに好ましい。第２図に示すように
、Ｄタンパク質は、グルタミン−イソロイシン−プロリ
ンをコードするりン力−配列を介して、切形のＨＡ２サ
ブユニット（アミノ１１６５〜２２２）のＮ−末端アミ
ノ酸６５に融合したＮＳ１の最初の８１個のアミノ酸か
らなる。

Ｄタンパク質のＤＮＡコーディング配列は、ＨＡ２コー
ディング配列を、Ｐｖｕｌｌで制限し、合成オリゴヌク
レオチドリンカーを介して、Ｎｃｏ１部位のＣ−末端領
域をＮＳＩコーディング配列におけるアミ７０８１と８
２の間に結ぶことにより調製される。

他の具体例において、ワクチン用ポリペプチドは、Ｄタ
ンパク質誘導体、すなわち、ＮＳＩの最初の８１個のア
ミノ酸が、グルタミンーイソロインンーブロリンをコー
ドするリンカ−配列を介して、各々、切形のＨＡ２サブ
ユニット（アミノ酸６９〜２２２）のＮ−末端アミノ酸
６９（Ａタンパク質）および切形のＨＡ２サブユニット
（アミノ酸８１〜２２２）のＮ−末端アミノ酸８１（Ｃ
タンパクりに融合しているＩ’ＡＪタンパク質および「
Ｃ」タンパク質からなる。第３のＤタンパク質誘導体は
、グルタミン−イソロイシン−プロリン−バリンをコー
ドするリンカ−配列を介して、切形のＨＡ２サブユニッ
ト（アミノ酸１５０〜２２２）のＮ−末端アミノ酸１５
０に融合したＮＳ１の最初の８１個のアミノ酸からなる
ΔＤタンバり質である。

さらにもう一つ別の具体例において、ワクチン用ポリペ
プチドは、「Ｄショート」と称されるタンパク質である
。第４図に示すように、Ｄショートは、メチオニン−ア
スパルテート−ヒスチジン−メチオニン−ロイシン−ス
レオニン−セリン−スレオニン−アルギニン−セリンを
コードするリンカ−配列を介して、切形のＨＡ２サブユ
ニット（アミノ酸６６〜２２２）のＮ−末端アミノ酸６
６に融合した、（アミノ酸１３（システィン）がセリン
により置換されていることを除いては）ＮＳＩタンパク
質の最初の４２個のアミノ酸からなる。

本発明のワクチン用ポリペプチドは、化学的合皮技術に
より調製できる。しかしながら、それらは宿主微生物ま
たは細胞内にて、該ポリペプチドのコーディング配列を
有するＤＮＡフラグメントをクローニングおよび発現す
ることにより、公知の組換型ＤＮＡ技法で調製すること
が好ましい。

多量の所望のタンパク質を安全かつ安価に産生するため
に用いることができるため、好ましい宿主はイー・コリ
である。

インフルエンザウィルスのＨＡ２、ＮＳ　ｌ＃Ｊ：び他
のウィルス性タンパク質のコーディング配列は、合皮的
に調製可能であり、または公知の技術によりウィルスＲ
ＮＡから、または入手可能なｃＤＮＡ含有プラスミドか
ら誘導することができる。例えば、前記の文献に加えて
、ゲシングら（Ｇｅｔｈｉｎｇ　ａｔ　ａｔ、）は、ネ
イチャー、２８７巻、３０１〜３０６頁（１９８０）に
８いて、Ａ／ジャパン／３０５１５７株からのＨＡのＤ
ＮＡコーディング配列をクローンし、配列したことを報
告しており：スリーら（Ｓ　ｌｅｉｇｈ　ｅｔ　ａ１、
）およびボウスら（Ｂｏｖｈ　ｅｔ　ａ１、）は、共に
、ディベロツプメンツ・イン・セル・バイオロジー（Ｄ
　ｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ　１ｎＣｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ）　、エルスヴイール・サイエンス・パブリッシン
グ・カンパニー、６９〜７９頁および８１〜８９頁、１
９８０において、Ａ／ＮＴ／６０／６８株のＨＡココ−
ィング配列をクローンしたことを報告しており：デービ
スら（Ｄ　ａｖｉｓｅｔ　ａ１、）は、ジーン（Ｇ　ｅ
ｎｅ）、１０巻、２０５〜２１８頁（１９８０）におい
て、Ｂよびヒチら（Ｈ４ｔｊ　ｅｔ　ａ１、）は、パイ
ロロジ−（Ｖ　ｉｒｏｌｏｇｙ）、１１１巻、１１３〜
１２４頁（１９８１）ｌこおいて、Ａ／ＷＳＮ／３３株
のＨＡココ−ィング配列をクローンしたことを報告して
いる。ポーターら（Ｐｏｒｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ→および
エムティジら（Ｅ　ｍｔａｇｅｅｔ　ａ１、）は、共に
、前記のディベロップメンツ・イン・セル・バイオロジ
ー、３９〜４９頁８よび１５７〜１６８真において、ニ
ワトリのベストウィルスのＨＡココ−ィング配列をクロ
ーンしたことを報告している。また、他の株、亜型およ
び型を含むインフルエンザウィルスは、臨床試料および
米国、メリーランド州、ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌ
ｅ。

Ｍａｒｙｌａｎｄ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、）のアメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクシ３ンのような公的寄託機関
から入手可能である。

例えば、イー・コリ、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、
ストレプトミセス（Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）　％
サツカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）　、哺
乳動物および昆虫のＮＪ胞を含む種々の微生物およびｍ
胞ｌこおいて、ワクチン用ポリペプチドをクローニング
８よび発現する系が知られており、私的および公的研究
所および寄託機関、および商業的販売者から入手可能で
ある。

本発明の方法は、組換型宿主細胞培養から誘導された、
細胞源の発熱性、タンパク様および核酸汚染物を含有す
る細胞溶解産物を、遠心分離およびクロマトグラフィー
を包含する一連の溶解および分離操作に付し、実質的に
汚染物のない所望のポリペプチドを得ることを包含する
。

組換型宿主は、以下に記載するように調製する。

かかる組換型細胞を、酸素の存在下、標準的発酵技法に
より、炭素、窒素および無機物の同化可能な供給源を含
有する滋養培地中にて培養する。組換型ポリペプチドを
発現するのに十分な時間、発酵させた後、遠心分離また
は濾過により細胞を収集する。ついで、得られた細胞ペ
ーストを再懸濁させ、溶解作用に付す。

細胞溶解は、湿った細胞ベレット重量に基づき約１００
〜３００　ｇ／Ｑの細胞濃度での細胞ベレットの緩衝懸
濁液（ｐＨ６およびｐＨ８，５の間、好ましくはｐＨ８
）に、リゾチームまたは他の溶解もしくは浸透剤を添加
することにより達成することができる。生産規模の操作
における細胞ペレットの重量は、精製し！二個々のポリ
ペプチドに依存し、８００〜３０００ｇの範囲とするこ
とができる。適当な溶解緩衝液は、約８．０のｐＨを有
するトリス（５０ｍＭ）　、ＥＤＴＡ　（２ｍＭ）　、
ジチオスレイトール（ＤＴＴＫＯ，１ｍＭ）　、および
グリセロール（５％）である。細胞溶解はまた、リゾチ
ームの不在下、機械的または超音波破壊の手段により行
なってもよい。申し分のない結果が、ガラリン・ホモジ
ナイザー（Ｇａｕｌｉｎ　ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）（
マサチューセッツ州、工ヴエレット、ＡＰＶガウリン・
インコーホレイティラド）（Ａ　Ｐ　Ｖ　Ｇａｕｌｉｎ
。

Ｉ　ｎｃ、　、　Ｅ　ｖｅｒｅｔｔ　、　Ｍａｓｓａｃ
ｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて得られた。所望により、化学
的、機械的および／または超音波溶解手段を組み合わせ
て用いてもよい。

ついで、細胞溶解した懸濁液を、約６８よび８゜５の間
のｐＨ１好ましくはｐＨ８にて、洗浄剤、例えば、デオ
キシコール酸塩、例えばナトリウム塩・モノ水和物（約
０．１％）のようなイオン性洗浄剤で処理し、所望の組
換型ポリペプチドが、細胞残骸（膜およびタンパク質）
および／またはタンパク質を変質させることなく細胞形
質膜を溶かす、トリトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ
−１００Ｘコネテイカツト州、ニュー・ハベン、インタ
ーナショナル・バイオチクノロシーズ・インコーホレイ
ティラド（Ｉ　ｎＬｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂ　ｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、　Ｉ　ｎｃ、、ＮｅｗＨａｖ
ｅｎ　Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）のような非イオン性洗
浄剤に結合することを妨げる。細胞溶解した懸濁液を、
例えば、１００〜５００ｍ１２／分の流速で、ベックマ
ン（Ｂ　ｅｃｋｍａｎ）　Ｊ　ＣＦ−Ｇ回転機を用い約
２５０００Ｘｇにて連続遠心分離を行なうことにより清
浄化し、溶解した宿主細胞の汚染物を含有する上澄液を
捨て、ポリペプチドを含有する不溶性フラクションをさ
らに精製に付す。

さらに別の宿主細胞汚染物を除去するため、該細胞溶解
産物を付加的な洗浄処理に付してもよい。

例えば、ポリペプチドを含有するペレットを、約９．５
〜約１１の範囲のｐＨでの適当な緩衝液に再懸濁させる
ことができる。特に有用な緩衝液は、ｐＨ９，５〜１１
．好ましくはｐＨＩ　Ｏ〜ｌ０１５、最も好ましくはｐ
Ｈ１０，５でのグリシン−ＮａＯＨ（５０ｍＭ）、ＥＤ
ＴＡ（２ｍＭ）およびグリセロール（５％）である。ホ
モジナイザーを用い、再懸濁を促進させてもよい。低ｐ
Ｈの前の洗浄処理工程にて、初期に溶解することなくポ
リペプチドと複合した宿主細胞膜を溶解させるため、ト
リトンＸ−１００のような非イオン性洗浄剤を該懸濁液
に加えてもよい。該懸濁液を遠心分離（２５０００Ｘｇ
）により清浄化し、溶解した宿主細胞汚染物を含有する
上澄液を捨て、ポリペプチドを含有するペレット状の不
溶性フラクションをさらに別の処理に付す。

洗浄剤で処理した後、組換型ポリペプチドを含有するペ
レットを、適当なカオトロピズム剤、例えば、尿素まＩ
；はグアニジン塩酸塩、好ましくは尿素で処理する。カ
オトロビズム剤として尿素ヲ用いる場合、組換型ポリペ
プチドを含有するペレットを尿素緩衝液、例えば、ｐＨ
７，５〜９、好ましくはｐＨ８にて、５０ｍＭトリスの
８Ｍ尿素に溶かす。不溶性の宿主細胞汚染物を、遠心分
離、例えば、２５０００Ｘｇにより除去する。溶解した
ポリペプチドは上澄液中に残る。

記載されている方法における細胞溶解産物の部分的精製
は、最初、該細胞溶解産物中にある宿主細胞汚染物の量
を有意に減少させる。

残りの宿主細胞汚染物、特に核酸および内毒素を、部分
的に精製しｌ；ポリペプチドからさらに分離することは
、適当なマトリックスに結合したジエチルアミノエチル
（ＤＥＡＥ）　、第４級アミノエチル（ＱＡＥ）および
ポリエチレンイミン（ＰＥｌ）のようなアニオン交換基
を有する微粒子カラム充填剤を用いるイオン交換クロマ
トグラフィーにより実施することができる。イオン交換
体は、精製ずべきポリペプチドが通過するのに十分に多
孔性であり、開口性のマトリックスを提供しなければな
らない。核酸、内毒素および低分子量の宿主細胞混入タ
ンパク質を、ポリペプチドを含有する部分的に精製した
細胞溶解産物から有意に減少させることは、アニオン交
換担体、例えば、組換型タンパク質を溶解させるのと同
じ緩衝液、例えば、ｐＨ８での８Ｍ尿素、５０ＩＩＩＭ
トリスで平衡にしｆ：、ＤＥＡＥ・ファースト・７０−
・セファロース・カラム（ＤＥＡＥ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏ
ｗ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅｃｏｌｕｍｎ）上にて達成され
る。

還元剤、例えば、ジチオスレイトールまたは２メルカプ
トエタノールを緩衝溶液に添加することにより、イオン
交換クロマトグラフィーによる宿主細胞タンパク質およ
び低分子量切断産生物の除去が促進される。

ペプチド含有溶液をイオン交換担体と接触させ、ついで
そこから溶出させる。溶出は、実質的に核酸および混入
している宿主細胞タンパク質がなく、所望の免疫原ポリ
ペプチドを含有するフラクションを得る適当な緩衝溶液
を用いて実施することができる。ここで溶出液として用
いられる緩衝溶液は、生物学的物質のイオン交換クロマ
トグラフィーにおいて広く用いられるものである。アニ
オン交換担体からのグラジェント溶出、例えば、５倍以
上のカラム容量にわたり、０．０〜０．５ＭＮａＣＱグ
ラジェント、好ましくは、０．０−０゜３Ｍ　ＮａＣＱ
グラジェントを用いることが、本発明のポリペプチドで
は有利である。宿主細胞汚染物および所望のポリペプチ
ドはイオン交換マトリックス上に吸着され、所望のポリ
ペプチドは該汚染物とは別々の７ラクシヨンにて特異的
に脱着される。タンパク質含有溶出液を、連続的に数回
、同一のイオン交換カラムを、または種々の充填剤を有
する別のカラムを通してもよい。

すぐ前に記載したアニオン交換クロマトグラフィー（例
えＩｆ、ＤＥＡＥ・７アースト・フロー・セファロース
）から回収された精製細胞溶解産物から、核酸、低分子
量の宿主細胞混入タンパク質、および、特に内毒素をさ
らに有意に減少させることは、該溶解産物を、還元状況
下（還元剤、例えば、ジチオスレイトールの添加により
達成される）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）のよ
うな強変性剤で処理することにより実施することができ
る。

変性剤が問題のタンパク質の展開をもたらし、還元状況
が該タンパク質のジスルフィド結合を破壊し、より一層
の展開を可能とすることが理論付けられ、それにより溶
解している宿主細胞汚染物がタンパク質と共に凝集する
と考えられる。サイズ排除クロマトグラフィー、例えば
、バイオ−ゲル八およびパイオーゲルＰＣ（米国、カリ
フォルニア州、リッチモンド、パイオーラッド（Ｂｉｏ
−Ｒａｄ。

Ｒｉｃｔ＋ｍｏｎｄＳＣＡ　　ＵＳＡ）　　；スペロー
ス１２（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ　ｌ　２）　Ｎセファデック
ス（Ｓ　ｅｐｈａｄｅｘ）、セファクリル−ＨＲ（Ｓ　
ｅｐｈａｃｒｙｌ−ＨＲ）　、セファロース（Ｓ　ｅｐ
ｈａｒｏｓｅ）およびスーパーデックス（Ｓ　ｕｐｅｒ
ｄｅｘ）　　（ファーマシア）　　（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）、特に好ましくは、スペローズ１２（ファーマシア
）クロマトグラフィーにより、かように処理された細胞
溶解産物のクロマトグラフィーは、それと共に前に凝集
した宿主細胞汚染物を除去することにより、実質的にさ
らに純粋なタンパク質含有フラクシゴンの溶出をもたら
す。宿主細胞汚染物のより一層の減少は、精製した細胞
溶解産物を、強変性剤および還ｄ、つづいてサイズ排除
り・＝トゲラフイーでの処理を繰り返す゛ことにより行
なうことができる。

精製した細胞溶解産物から前記の変性剤を除去するため
に、サイズ排除クロマトグラフィーから回収したタンパ
ク質含有７ラクシヨンを、加えてサイズ排除クロマトグ
ラフィーに付してもよい。

変性剤、特に変性剤がＳＤＳである場合に該変性剤を除
去するには、「脱塩カラムＪとして当業者に知られてい
るクロマトグラフィーカラム、例えば、Ｇ５０または好
ましくはＧ２５セフアデツクス（ファーマシア）のファ
イン・クロマトグラフィーカラムを用いることが有利で
あることが判明した。変性剤除去は、カオトロピズム剤
、例えば、尿素の存在下にて行なわれた場合に、特に効
果的である。例として、ＳＤＳ含有フラクションを、８
Ｍ尿素含有緩衝溶液で予め平衡にしだ脱塩カラムに適用
し、その後かかるフラクションを平衡緩衝液で溶出する
ことが、ＳＤＳによる混入のないタンパク質の回収を最
大限にするにおいて、特に効果的であることが見いださ
れｔ；。

前記のように混入しているポリペプチド、内毒素および
核酸の除去処理を行なった後に、細胞溶解産物には実質
的に残りの宿主細胞汚染物がなくなる。

高純度の医薬グレード産生物を得るのにかかる他の操作
が必須であるわけではないが、種々の他の操作を本発明
の方法に関連して用いることができる。かかる操作は、
前記の処理工程の間、前または後に用いることができる
。一つのかかる最適工程は、シアフィルトレージョン（
ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）である。

「シアフィルトレージョン」なる語は、本明細書では、
その分野において認識されている意味にて用いられ、多
くの緩衝液交換を行なうに極めて効果的である連続透析
形をいう。シアフィルトレージョンは、セルロース膜ま
たは限外フィルターを通して実施することが好ましい。

適当な膜／フィルターは、約１０００分子量（ＭＷ）か
らのカットオフを有するもの、ないし直径２．４μｍま
での孔径を有するものである。シアフィルトレージョン
に適用できる多くの異なる系は、ｌＯＫ・アミコン・デ
ュアル・スパイラル・カートリッジ系（ｌＯＫ　Ａｍ１
ｃｏｎ　ｄｕａｌ　５ｐｉｒａｌ　ｃａｒｔｒｉｄｇｅ
　ｓｙｓｔｅｍ）のように、商業上入手可能である。本
発明の方法においては、約８のｐＨでの２０ｍＭトリス
緩衝液を用いるシアフィルトレージョンを、ポリペプチ
ドの精製およびその後の濃縮において効果的に用いるこ
とができる。

本発明のワクチンは、■またはそれ以上の本発明のワク
チン用ポリペプチドと、担体または希釈剤とからなる。

例えば、かかるワクチンは、実質的に、いくつかの亜型
の各々からの無傷のＨＡ２サブユニットからなることが
でき、各々は、生理食塩水または他の生理溶液中で、高
度に保存されたＮＳＩタンパク質のＮ末端アミノ酸に融
合している。水酸化アルミニウムのようなアジュバント
の使用も好ましい。好ましいワクチンは、３つのワクチ
ン用ポリペプチドからなり、各々は実質的に、Ｃ１３タ
ンパク質の場合と同様、いずれかのＮＳＩタンパク質の
最初の８１個のアミノ酸の周囲に融合したＨ１１Ｈ２８
よびＨ３亜型の１つからの無傷のＨＡ２サブユニットか
らなっている。

また、多価ワクチンが、サブユニットまたはポリペプチ
ド抗原または死菌ウィルスもしくは菌体のようなインフ
ルエンザウィルスまたは他の病原体に由来する追加免疫
原と結合した本発明の１つまたはそれ以上のポリペプチ
ドから調製でき、インフルエンザならびに他の侵入生物
またはウィルスに対する防御を刺激しうるワクチンを産
生ずる。

かかるワクチンの処方技術はよく知られている。

例えば、ワクチン用ポリペプチド、および複合ワクチン
の場合の他の免疫原は凍結乾燥し、後に生理食塩水また
は他の生理溶液中に再水和することができる。

投与量および投与プロトコルは、標準的なワクチン接種
法に従って最適化できる。経口、眼球内、皮肉および鼻
腔的投与のような他の投与経路を用いてもよいが、典型
的には、該ワクチンを筋肉内に投与する。他のポリペプ
チドワクチンについての公知事実に基づき、平均成人に
対する有効な１回の投与量は１〜１０００μｇ５好まし
くは５〜１５０μｇ１最も好ましくは１０−１００μｇ
であると考えられる。該ワクチンは、最初は、晩夏また
は初秋に投与でき、所望により、２〜６週間後、または
免疫が弱まる毎に定期的に、例えば、２〜５年毎に再投
与することができる。

次に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。

実施例１ プラスミドｐＭ３０ プラスミドｐＡＰＲ７０１は、Ｍ’ｌおよびＭ２イン７
ルエンザウイルス ／８／３４）のコーディング領域を有するｐＢＲ３２２
由来のクローニング・ベクターである。そのことは、ヤ
ングら（Ｙｏｕｎｇ　ｅｔ　ａｌ．）が、ジ・オリジン
・オブ・パンデミツク・インフルエンザ・バイランーズ
（Ｔｈｅ　Ｏｒｉｇｉｎ　ｏｆ　Ｐａｎｄｅｍｉｃ　　
Ｉ　ｎｆｌｕｅｎｚａＶ　ｉｒｕｓｅｓ）、１９８３、
ダブル・ジー・レイバー（Ｗ．Ｇ．Ｌａｖｅｒ）編、エ
ルスヴイール・サイエンス・パブリッシング・カンパニ
・−（Ｅ　１ｓｅｖｉｅｒＳｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉ
ｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、）において記載している。

プラスミドｐＡＰＲ８０１は、ＮＳＩコーディング領域
（Ａ／Ｐ　Ｒ／８／３４　）を有するｐＢＲ３２２由来
のクローニング・ベクターである。ヤングらが、前掲に
おいて記載している。

プラスミドｐＡＳ　ｌは、ＰＬプロモーター、Ｎ利用部
位（Ｎタンパク質の存在下、転写極性効果を緩和するた
め）および直接ＢａｍＨ１部位に続＜ｃＴｌ翻訳開始コ
ドンを含むｃｍリポソーム結合部位を含むｐＢＲ３２２
由来の発現ベクターである。ローゼンバーグら（Ｒｏｓ
ｅｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａ１、）が、メソノズ・イン・エ
ンザイモロジ−（ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏ１、）、
１０１巻、１２３〜１３８頁（１９８３）において記載
している。

プラスミドｐＡＳ　ｌΔＥＨは、ｐＡＳ　ｌからｐＢＲ
３２２復製開始点の非必須ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩ［Ｉ
領域を欠失させることにより調製した。

ウィルス複製開始点の８６１塩基対およびｐＢＲ３２２
復製開始点の３７５塩基対におけるＮＳＩコーディング
領域を含んでいるｐＡＰＲ８０１の１２３６塩基対Ｂａ
ｍ　ＨＩ７ラグメントを、ｐＡＳＩΔＥＨのＢａｍＨ１
部位に挿入した。得られたプラスミド、ｐＡＳ　ｌΔＥ
Ｈ／８０１は標品のＮ５Ｉ（２３０アミノ酸）を発現す
る。このプラスミドは、アミノｆｆ２８１および８２の
コドンの間にＮｃｏ１部位、およびＮＳ配列に対するＮ
ｒｕ１部位３″を有している。アミノ酸ｌおよび２の間
のＢａｍ８１部位は保持されている。

Ｍ１タンパク質のＣ末端の５０個のアミノ酸のコーディ
ング配列を有する５７１塩基対ソラグメントは、ｐＡＰ
Ｒ７０１をＮｃｏｌおよびＥｃ。

ＲＶで制限することにより得た。このフラグメントを、
該プラスミドからそのフラグメントの欠失後のｐＡｓ　
ｌΔＥＨ／８０１に８けるＮｃｏｌおよびＮｒｕ　Ｉ部
位の間に挿入した。得られたプラスミド、ｐＭ３０は、
Ｍｌの最後の５０個のアミノ酸に融合したＮＳＩの最初
の８１個のアミノ酸である融合タンパク質をコードする
。ＮｃｏｒおよびＢａｍ８１部位は保持されている。

実施例２ プラスミドｐＣ１３ プラスミドｐＪＺ１０２は、無傷のＨＡタンパク質（Ａ
／ｐＲ／８／３４）のコーディング領域を有するｐＢＲ
３２２由来のクローニング・ベクターである。実施例１
で引用したヤングらにより記載されている。

プラスミドｐＢｇｌＩ［は、ｐＢＲ３２２のＮｒｕ１部
位にて８ｇｌｌｌリンカ−を有するｐＢＲ３２２由来の
クローニング・ベクターである。

ｐＪＺ１０２をＭｎ１Ｉで切断した。Ｂｇｌ■リンカ−
を全末端に結び、ＨＡ２含有７ラグメントをｐＢｇ　ｌ
　ＩＩに挿入した。得られたプラスミド、ｐＢｇ　ｌ　
ｆｆ／ＨＡ２における５゛末端は、次のように配列して
いる。

１　　　　　　　　２　　　　　　　　３５’　　　Ａ
ＧＡＴＣＴＧ　　　τＣＣＡＧＡ　　　ＧＧＴ　　　　
　　　３領域Ｉは８ｇｌｌｌリンカ−に由来し、アスパ
ルテートおよびロイシンをコードする。領域２はＨＡＩ
に由来し、セゾン（Ｉ（Ａ＋アミノ酸３２６）およびア
ルギニン（ＨＡＩをＨＡ２から分離するＨＡアミノ酸３
２７）をコードする。領域３はＨＡ２に由来し、ＨＡ２
サブユニットのすべてのアミノ酸をフードする。

３′末端は次のように配列している。

領域４はＨＡ２停止コドンである。領域５はウィルス複
製開始点の３″非コ一デイング配列である。

領域６はＢｇｌ■リンカ−に由来している。

ＨＡ２コーディング配列を有する６９１塩基対フラグメ
ントは、ｐＢｇｌｌＩ／ＨＡ２をＢｇｌｌ［で制限する
ことにより得られた。該フラグメントをＤＮＡポリメラ
ーゼＩ（クレノー）　（Ｋ　Ｉｅｎｏｗ）で末端をふさ
ぎ（ｅｎｄ（１ｌｌｅｄ）、ＮｃｏＩで切断され、同様
に末端をふさいだ（クレノー）ｐＡＳＩΔＥｌ／８０１
に結んだ。得られたプラスミドはｐＣｉ３である。Ｎ５
Ｉ−ＨＡ２、平滑末端部は、次のように配列している。

７　　　　　　１　　　　２３ ５°　ＡＡＡＡＴＧＡＣＣＡＴＧ　ＧＡＴＣＴＧ　ＴＣ
ＣＡＧＡ　ＧＧＴ　　　　３’領域７はＮＳＩ選伝千（
こ由来している。領域１１２および３は前記と同じであ
る。

イー・コリ宿主株Ｎ５１５１である温度感受性欠損Ａ溶
！（ｃＩ８５７）を、ｐＣ１３で形質転換した。形質転
換体を、アンピシリン１００μｇ／−を補足したＬＢダ
ブロス中３２℃にて中央対数期（Ａ！６゜−０，６）ま
で増殖させた。ついで、培養物を４２℃に移し、ｃＴを
不活性化し、かくしてＣ１３タンパク質の合成を誘発し
た。４２℃にて２時間後、菌体を遠心分離（３５００ｒ
ｐｍ。

２０分間）により収集し、菌体ペレットを一２０℃にて
凍結させた。

該ペレットを解凍し、緩衝液Ａ（５０ｍＭ）リス−ＨＣ
Ｑ１ｐＨ８，０、：２ｎＭ　ＥＤＴＡ、１ｍＭジチオス
レイトール、５％（ｖ／ｖ）グリセロール）に再懸濁さ
せた。リゾチームを最終濃度がＯ１２ｍｇ／−になるま
で加え、混合物を氷上にて２０分間インキュベーション
した。ついで、該混合物をワーリング・ブレンダー（Ｗ
ａｒｉｎｇ　ｂｌｅｎｄｅｒ）中、高速にて１５秒間ず
つ６回バーストして処理した。

ついで、該懸濁液を、ブランソン・グローブ・ンニファ
イア−（Ｂｒａｎｓｏｎ　ｐｒｏｂｅ　５ｏｎｉｆｉｅ
ｒ）を用いて、１分間超音波処理した。ついで、該混合
物を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、３０分間）に付し！
；。

超音波処理（４Ｘ１５秒間バースト）を行なうことによ
り、該ペレットを緩衝液Ａに再懸濁させた。ついで混合
物を０．１％デオキンコール酸塩とし、４°Ｃにて１時
間撹拌した。混合物を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、３
０分間）に付し、タンパク質をペレット化した。デオキ
／コール酸塩処理を繰り返し、ついで、得られたペレッ
トを超音波処理により緩衝液Ａに再懸濁させた。ついで
、該懸濁液を１％トリトンＸ−１００とし、４℃にて１
時間撹拌した。該混合物を再度遠心分離（１５０００ｒ
ｐｍ、３０分間）に付し、タンパク質ベレットを収集し
た。タンパク質を超音波処理により再懸濁させ、該タン
パク質を尿素で溶解させた（＃、終濃度４Ｍ）。この溶
液を遠心分離に付し、いずれの粒状物質をも除去しく１
５０００ｒｐｍ、３０分間）、上澄液を収集し、ｌＱの
１０ｍＭトリス−ＨＣＱ％ｐＨ７，５，１ｍＭ　ＥＤＴ
Ａに対して３回透析し、尿素を除去した。タンパク質溶
液を再度遠心分離に付し、いずれの粒状物質をも除去し
く１５０００ｒｐｍ、３０分間）、Ｃ１３タンパク質を
含有する上澄液を収集し、検定用に用いた。Ｃ１３タン
パク質の収率は、５ＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した場合
、全細胞タンパク質の約ｌＯ％である。

実施例４ プラスミドｐＤ プラスミドｐＡＳ　ｌΔＥＨ／８０１（前記実施例１に
記載されている）を、Ｂｇｌｌ！で切断し、ＤＮＡポリ
メラーゼＩ　（ＤＮＡｐｏ　ｌ　Ｉ　；クレノー）で末
端をふさぎ、連結して閉じ、かくしてＢｇＩｎ部位を除
去した。得られたプラスミドｐ１３ｇ　＋−をＮｃｏｌ
で消化し、ＤＮＡｐｏ　ｌ　Ｉ（クレノー）で末端をふ
さぎ、Ｂｇｌｌ＋リンカ−に結んだ。得られたプラスミ
ドのｐＢ４は、ＮＳ１コーデイング領域内にＢｇ１１１
部位を有している。プラスミドｐＢ４をＢｇｌｌ［で消
化し、配列が： で示される合成ＤＮＡリンカ−に結んだ。

得られたプラスミド、ｐＢ４＋は、すべての３つの解読
フレームにおける終止コドンに続＜ＮＳｌの最初の８１
１１１のアミノ酸のコーディング領域の後のりンカー内
でのＤＮＡ７ラグメントの挿入を可能とする。ｐＢ４＋
をＸｍａｌで消化しくリンカ−内で切断）、末端をふさ
ぎ（クレノー）、ＨＡ２コーディング領域に由来する５
２０塩基対ＰｖｕＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩの末端をふさい
だフラグメントに結んだ。得られたプラスミドのｐＤは
、第２図に示すように、ＮＳＩの最初の８１個のアミノ
酸、合成りＮＡリンカ−に由来する３個のアミノ酸（ｇ
　ｌ　ｎ−ｉ　ｌ　ｅ−ｐ　ｒｏ）　、つづいてＨＡ２
のアミノ酸６５〜２２２からなるタンパク質をコードす
る。

実施例５ プラスミドｐＣ１３ショート プラスミドｐＡＳ　１ΔＥＨ８０１（実施例１にて記載
）を、ＮｃｏＩおよび５ａｌｒで切断し、Ｎｃｏｌ／５
ａｌＩ７ラグメントのようなヒトＴＧＦαをコード化す
る合皮ＤＮＡに結んだ。得られたプラスミド、ｐ　ＮＳ
　Ｉ　ａ＋ＴＧＦαは、ＮＳＩの最初の８１個のアミノ
酸と成熟（ｍａｔｕｒｅ）　ＴＧＦａ配列からなるタン
パク質をコード化する。プラスミドＩ）　ＮＳ　ｌ　ｓ
＋ＴＧＦ　ａをＨｉｎｄｌｌ＋およびＮｃｏＩで切断し
、ＮＳＩのアミノ酸８〜８１をコード化する２１８塩基
対７ラグメントを遊離させた。ついで、ＨｉｎｄｌＩ［
／Ｎｃｏｌフラグメントのような（ＮＳＩ配列のアミノ
酸番号１３がシスティンからセリンに変わっていること
を除いては）ＮＳＩの最初の４２個のアミノ酸の８〜４
２をコード化する合ＪｆｆｉＤＮＡを、該プラスミドに
結んだ。得られたプラスミドであるｐＮＳｌａｔＴＧＦ
σは、ＮＳＩの最初の４２個のアミノ酸および成熟ＴＧ
Ｆσ配列からなるタンパク質をコード化する。ついで、
プラスミドｐ　Ｎ　Ｓ　ｌ　＊□ＴＧＦαをＮｃｏＩで
消化し、ｐＣ１３由来のＨＡ２領域をコード化する７０
４塩基対ＮｃｏＩフラグメントに結んだ。得られたプラ
スミドのｒｐＣ１３ショートｊは、第３図に示すように
、（アミノ酸番号１３がシスティンからセリンに変わっ
ていることを除いては）ＮＳＩの最初の４２個のアミノ
酸、台底ＤＮＡリンカ−によりコード化された３個のア
ミノ酸（ｍｅｔ−ａｓｐ−１ｅｕ）、ＨＡＩのカルボキ
シ末端からのアミノ酸（３２６Ｘｓ　ｅ　ｒ）、ＨＡＩ
およびＨＡ２サブユニットを分離するアルギニン残基（
３２７）および無傷のＨＡ２サブユニットからなるタン
パク質ｒＣ１３シヨート」をコード化する。

実施例６ プラスミドｐＤショート プラスミドｐＭＧ２７Ｎ、ｐＡｓｌ誘導体（モレキュラ
ー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏ１．Ｃｅ１
ｌ　　Ｂ　ｉｏ、）、５．１０１５−１０２４（１９８
５））を、ＢａｍＨＩおよび５ａｃｌで切断し、ｐＡＳ
　ＩＡＥＨ８０１からＮＳＩの最初の８１個のアミノ酸
をフード化するＢａｍＨＩ／ＮｃｏＩフラグメントおよ
び以下の配列を有する合成ＤＮＡＮｃｏｌ／５ａｃｌフ
ラグメントに結んだ。

得られたプラスミドのｐＭＧｌは、３つのすべての解読
フレームにおける終止コドンに続く合皮リンカーフラグ
メント内の３つのいずれかの解読フレームにおけるＮＳ
Ｉの最初の８１個のアミノ酸の後のＤＮＡ７ラグメント
の挿入を可能とする。

ＮＳＩの最初の８１個のアミノ酸よりもむしろＮＳｌの
最初の４２個のアミノ酸のコーディング領域を有する類
似のベクターを誘導するため、ｐＭＧｌを、ＢａｍＨＩ
およびＮｃｏｒで消化し、ｐＮＳＩ、２ＴＧＦσからＮ
ＳＩのアミノ酸２〜４２をフード化するＢａｍＨＩ／Ｎ
ｃｏＩ７ラグメントに結んだ。ついで、得られたＩ）Ｍ
Ｇ４２Ａと称されるプラスミドを、Ｎ５１４２配列後、
一連の種々の制限酵素部αで選択的合成リンカ−を有す
るように修飾し、異種のＤＮＡ７ラグメントをＮ５１１
２の後の３つの解読フレームに挿入した。このリンカ−
は以下の配列を有する： ついで、得られｔニブラスミド、ｐＭＧ４２Ｂを、合皮
リンカー内で切断するＥｃｏＲＶおよびｘｈＯ■で消化
した。ついで、それを９ＭＳ２に由来するＰｖｕｌ［／
５ａｉｌフラグメントで結び、プラスミド「ｐＤショー
ト」を得た。このプラスミドはタンパク質、　「Ｄショ
ート」をコード化し、それは、第４図に示すように（ア
ミノ酸番号１３が７ステインからセリンに変わっている
ことを除いては）ＮＳＩの最初の４２個のアミノ酸、合
皮リンカー由来の１０個のアミノ酸（ｍｅｔ−ａｓｐ−
ｈｉｓ−ｍｅｔ−１ｅｕ−ｔｈｒ−ｓｅｔ−ｔｈｒ−ａ
ｒｇ−ｓｅｒ）およびＨＡ２サブユニノトのアミノ酸６
６〜２２２からなる。

実施例７ プラスミドｐＣ１３（Ｈ６９〜２２２）プラスミドｐＢ
４＋　（実施例４において記載）をＸｍａｌで切断し、
末端をふさぎ（クレノー）、ＨＡ２コーディング領域に
由来する５０８塩基対ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩ［Ｉの末
端をふさいだフラグメントをそれに結んだ。得られたプ
ラスミドｐＣ１３（８６９〜２２２＞は、ＮＳＩの最初
の８１個のアミノ酸、合成りＮＡリンカ−由来の３個の
アミノ酸（ｇｌｎ−ｉ　Ｉｅ−ｐｒｏ）およびＨＡ２サ
ブユニットのアミノ酸６９〜２２２からなるｒＡＪ　タ
ンパク質をコードする。

プラスミドｐＢ４＋　（実施例４において記載）をＳｍ
ａ　ｒで切断し、ＨＡ２コーディング領域に由来の４７
４塩基対ＡｈａＩ［ｌ／ＨｉｎｄＩ［Ｉの末端をふさい
だフラグメントに結んだ。得られたプラスミド、ｐＣｉ
３（Ｈ８１〜２２２）は、ＮＳＩの最初の８１個のアミ
ノ酸、合成ＤＮＡリンカー由来の３個のアミノ酸（ｇｌ
ｎ−ｉ　１ｅ−ｐｒｏ）およびＨＡ２サブユニットのア
ミノ酸８１〜２２２からなる「Ｃ」タンパク質をコード
する。

実施例９ プラスミドｐＣ１３（ＨＡ１５０〜２２２）プラスミド
ｐＪＺ１０２　（実施例２において記載）を、Ｈｉｎｄ
Ｉ［［で切断し、ＨＡ　　ｃＤＮＡを遊離させた。この
１７８４塩基対７ラグメントを単離し、Ｈｉｎｄｌｌ［
で切断されたｐＵＣ８に結んだ。ついで、得られたプラ
スミド、ｐＭＳ２をＢｓｍ１で切断し、ついでヤエナリ
（ｍｕｎｇｂｅａｎ）ヌクレアーゼ処理した５ａｌＩを
消化した。ついで、ＨＡ２のＣ−末端コーディング領域
を含む２８０塩基対フラグメントを単離した。このフラ
グメントを、ＸｍａＩで切断し、末端をふさぎ（クレノ
ー）、ついで５ａｌＩで切断したｐＢ４＋プラスミドに
結んだ。得られＩ；プラスミド、ＰＣｌ３（Ｈ６９〜２
２２）は、ＮＳＩの最初の８１個のアミノ酸、合成ＤＮ
Ａリンカ−によりコード化された４個のアミノ酸（ｇｌ
ｎ−ｉ　Ｉｅ−ｐｒｏ−ｖａｌ）、つづいてＨＡ２サブ
ユニットのアミノ酸１５０〜２２２からなる「ΔＤＪタ
ンパクｉをコードする。

プラスミドｐＣ１３をＥｃｏＲＩで切断し、ｌ】６３塩
基対の７ラグメントを遊離させ、連結して閉じ、プラス
ミドｐΔ１３を得た。この操作は、ＨＡ２のＣ−末端１
５２アミノ酸のコーディング領域の喪失をもたらす、、
結果的に、このプラスミドから得られた融合タンパク質
「Δ１３Ｊは、ＮＳｌの最初の８１個のアミノ酸、合成
ＤＮＡリンカ−によりコード化された２個のアミノ酸（
ａｓｐ−Ｉｅｕ）、ＨＡＩのカルボキシ末端からの１個
のアミノ酸（ｓ　ｅ　ｒ）、ＨＡ２からＨＡＩを分離す
るアルギニン残基（３２７）、ＨＡ２の最初の７０個の
アミノ酸、つづいてｐＢＲ３２２配列に由来する８個の
アミノ酸（ｓｅｒ−ｃｙｓ−１ｅｕ−ｔｈｒ−ａ　ｌ　
ａ−ｔ　ｙ　ｒ−ｈ　ｉ　ｓ−ａ　ｒｇ）を有する。

実施例１１ プラスミドｐＭＳ２（実施例９に記載）をＢｓｔＸＩお
よび５ａｌｌで消化し、α−色素胞刺激ホルモン（αＭ
ＳＨ）をコード化する合成リンカ−に結んだ。得られた
プラスミド、ｐＭＳ２σＭＳＨを、ＥｃｏＲＩ　（ＨＡ
２コーディング領域内）および５ａｌＩ（σＭＳＨコー
ディング配列のカルボキシ末端）で消化し、４３１塩基
対ソラグメントを遊離させ、それを単離し、ＥｃｏＲＩ
および５ａｉｌで消化されたプラスミドｐＤに結んだ。

得られたプラスミドのｐＣｉ３（８６５〜１９６）σＭ
ＳＨは、ＮＳＩの最初の８１個のアミノ酸、合成ＤＮＡ
リンカー由来の３個のアミノ酸（ｇｌｎ　−ｉ　Ｉ　ｅ
−ｐ　ｒｏ）　、ＨＡ２サブユニットのアミノ酸６５〜
１９６．２個のグリシン、つづいてαＭｓＨ（ｓｅｔ−
ｔｙｒ−ｓｅｒ−ｍｅｔ−ｇＩｕ−ｈｉｓ−ｐｈｅ−ａ
ｒｇ−ｔｒｐ−ｇｌｙ−Ｉｙｓ−ｐｒｏ−ｖａｌ）から
なるハイブリッドタンパク質ｒＭＪをコード化する。

実施例１２ プラスミドｐＣ１３（Ｈ６５〜１９６）ΔＭＳＨプラス
ミドｐＣ１３（Ｈ６５〜１９６）σＭＳＨをＮｃｏｌで
消化し、末端をふさぎ（クレノー）、次の配列の１２塩
基対の翻訳停止リンカ−に結んだ。

得られ！ニブラスミド、ｐＣ１３（Ｈ６５〜１９６）Δ
ＭＳ）（は、ＮＳＩの最初の８１個のアミノ酸、合成Ｄ
ＮＡりンカー由来の３個のアミノ酸（ｇＩｎ−ｉ　Ｉｅ
−ｐｒｏ）、ＨＡ２サブユニットのアミノ酸６５〜１９
６、ｇ　ｌ　Ｙ　　ｇ　ｌ　Ｙ　ｓ　　σＭＳＨの最初
の４個のアミノｔ！２（ｓｓｒ−ｔｙｒ−ｓｅ　ｒ−ｍ
ｅ　ｔ）　、つづいて終止リンカ−に由来する３個のア
ミノ酸（ｌｅｕ−ｖａ　１−ａｓｎ）からなる「ΔＭ」
タンパク質をコード化する。

実施例１３ プラスミドｐＣｉ３（Ｈ６５〜２００）プラスミドｐＭ
Ｓ２（実施例９において記載）を、Ｂｓ　ｔＸＩおよび
５ａｉ１で消化し、以下の配列を有する合成リンカ−に
結んだ。

得られたプラスミド、９ＭＳ２−アンカーレス（ａｎｃ
ｈｏｒｌｅｓｓ）を、ＥｃｏＲＩ　（ＨＡ２コーディン
グ領域内）および５ａｌｌで消化し、３３１塩基対フラ
グメントを遊離させ、それを単離し、ＥｃｏＲｒおよび
５ａｉｌで消化されたプラスミドｐＤに結んだ。得られ
たプラスミドのｐＣ１３（８６５〜２００）は、ＮＳＩ
の最初の８１個のアミノ酸、合成りＮＡリンカ−に由来
する３個のアミノ酸（ｇｌｎ−ｉ　Ｉｅ−ｐｒｏ）（前
記実施例４において記載）、ＨＡ２サブユニットのアミ
ノ酸６５〜１９６、つづいてＨＡ２サブユニットのアミ
ノ酸１９７〜２００に対応するアミノ酸を修復する直前
に記載の合成リンカ−に由来するＩｅｕ−ｖａ　ｌ−１
ｅｕ−１ｅｕからなるハイブリッドタンパク質「ΔＭ＋
Ｊをフード化する。

実施例１４ Ｄタンパク質の精製 イー・コリ宿主株によりＤタンパク質の合成（誘発した
後、菌体細胞を遠心分離により収集し、得られたペレッ
トを一７０℃に冷凍した。細胞ペーストＩｇに対して溶
菌緩衝液Ａｌ０−を加え、室温にて解氷することにより
、ペレットを解氷し、溶菌緩衝液Ａ（ｐＨ８にて、５０
ｍＭ）リス、２ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１ｍＭジチオスレ
イトール・（ＤＴＴ）、５％グリセロール）に再懸濁さ
せた。得られた懸濁液に濃縮リゾチーム溶液を加え、少
なくとも約０　、２　ｍｇ／−のりゾチームの最終濃度
を（号た。該懸濁液を室温にて約１時間〜１．５時間撹
拌し、ついで２バスのマントン・ガラリン・ホモジナイ
ザー（Ｍａｎｔｏｎ　Ｇａｕｌｉｎ　ｈｏｍｏｇｅｎｉ
ｚｅｒ）　　（マサチューセ７ツ州、エバレフト、ＡＰ
Ｖガウリン・インコーホレイティラド（Ａ　Ｐ　Ｖ　Ｇ
ａｕｌｉｎ、　　ｌ　ｎｃ、。

Ｅｖｅｒｅｔｔ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）　　（
１００００ｐ　ｓ　ｉ　）上にて細胞溶解させた。この
懸濁液にトリトンＸ−１００を最終濃度が１％になるま
で添加し、デオキシコール酸塩を０．１％の最終濃度ま
で添加しＩ；。該懸濁液を室温にて１時間撹拌し、２５
０００Ｘｇにて約１時間遠心分離に付した。上澄液を捨
て、タンパク質を含有するペレットを、トーラックスφ
ホモジナイザー（Ｔｕｒｒａｘ　ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅ
ｒ）を用いてすべての塊りがなくなるまで、グリシン緩
衝液（５０ｍＭ　ｇｌｙ−ＮａＯＨ＋２ｍＭ　ＥＤＴＡ
＋５％グリセロール）（ｐＨ１ｏ、５）に、最初の細胞
ペースト１ｇに付き１０−緩衝液にて懸濁させた。この
懸濁液にトリトンＸ−１００を最終濃度が１％になるま
で加え、最初の細胞ペースト１ｇについて最終容量ｌＯ
−にした。懸濁液を４℃にて１時間撹拌し、遠心分離（
２５０００ｘｇ。

１時間）に付し、上澄液を捨てた。Ｄタンパク質含有ベ
レットを、室温にて１〜２時間、ついで４℃にて一夜、
８Ｍ尿素＋５０ｎ＋Ｍ）リスＣｐＨ８。

０）に溶かし、つづいて遠心分離（２５０００ｘｇ、１
時間）に付し、不溶性の汚染物を除去した。

Ｄタンパク質は上澄液中に残っていた。該上澄液にＤＴ
Ｔを最終濃度が５０ｍＭになるまで加え、該溶液を室温
にて約１時間撹拌した。ついで該撹拌溶液を、８Ｍ尿素
および５０ｍＭ）リス（ｐＨ８）の溶液で平衡にしたＤ
ＥＡＥ・ファースト・フロー・セファロース・カラム上
に負荷した。この工程においては、最大負荷比率４ｍｇ
タンパク質／艷ゲルと最小２２（！Ｉｔカラム長を維持
した。Ｄタンパク質を、８Ｍ尿素、５０ｍＭトリス（ｐ
Ｈ８）中の０〜０．３ＭのＮａＣＱグラジェント（５倍
以上のカラム容量ｌこわたって）で溶出した。精製した
Ｄタンパク質は、Ｏ，１ＭＮａＣＱを中心とするブロー
ドなピークにおいて溶出した。該タンパクを含有するフ
ラクションを、ｐＨ８にて２０ｍＭトリスおよび２ｍＭ
ＥＤＴＡの溶液に透析しｌ；。

Ｄタンパク質の収率は、５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルのレーザ
ー比重分析により測定した場合、全細胞タンパク質の約
２３％であった。

Ｃ１３、Ｃ１３シヨート、Ｄショート、Ａ、Ｃ１および
ΔＤ１タンパク質は、Ｄタンパク質の精製についてここ
に記載している方法によって同様に精製することができ
る。

実施例１５ Ｄタンパク質のさらなる精製 実施例１４における前記のＤＥＡＥ・ファースト・フロ
ー・セファロース・カラムからＤタンパク質含有７ラク
シヨンを溶出した後、該７ラクシヨンを、５００ａｎ”
オメガＩＯ膜およびスクリーン・チャネルを備えたミニ
セット・接線フロー装置（Ｍｉｎｉｓｅｔｔｅ　ｔａｎ
ｇｅｎｔｉａｌ　ｆｌｏｗ　ａｐｐａｒａｔｕｓ）（フ
ァーマシア）を用い、１平方インチ当たり１５〜２０ポ
ンドの膜内外圧で、１０００＋ｎ１２／分の交差流速に
て操作し、１５＠　Ｃ３，８Ｑを２５５−に）濃縮した
。該濃縮物に１０倍過剰量のドデシル硫酸ナトリウム（
ＳＤＳ）（米国、ミズリー州、セント・ルイス、シグマ
・ケミカル−・カンパニ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ　Ｃｏ、、ＳＬ、Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ，Ｕ。

Ｓ、Ａ、）、すなわち、１ｍｇのタンパク質に対して１
０ｍｇのＳＤＳ、およびジチオツレイトール（ＤＴＴ）
（シグマ・ケミカル−・カンパニー）ｔ−５０ｍＭの最
終濃度まで添加した。該溶液を室温にて９０分間撹拌し
、ついで２５ｍＭトリス−グリシンおよび１％ＳＤＳを
含有する緩衝液（ｐＨ８，０）で平衡にした２８００ｍ
１２スペコース（Ｓ　ｏｐｅｒｏｓｅ）１２カラム（フ
ァーマシア）上に負荷した（１６■／＃閾）。タンパク
質をカラム平衡緩衝液でインクラティカルに溶出した。

５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタン・プロット（Ｗｅｓ
ｔｅｒｎ　Ｂ　１ｏｔ）分析により測定した際の十分に
純粋な７ラクシヨンをプールしｌ；。

前記のプールし！；７ラクシヨンを前記のミニセント・
接線フロー装置にて濃縮した。該濃縮７ラクシヨンＩこ
１０倍過剰量のＳＤＳ　（ｌ　ＯｒｎｇＳＤＳ／１ｍｇ
タンパク質）およびＤＴＴを５０ｍＭの最終濃度まで加
えｌ；。得られｌ；溶液を室温にて９０分間撹拌した。

ついで、該溶液を、２８００−スベロース１２カラム上
に負荷しく１６ａｎ／時間）、すぐ前における記載と同
一の条件下にてクロマトグラフィーに付しＩ；。溶出し
たフラクションを、５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタン
・プロット分析により、純度について分析した。十分に
純粋なフラクションをプールした。

該プールしたフラクションからＳＤＳを除去するため、
第１に、該７ラクンヨンを、オメガ１０撹拌細胞装ｆｉ
ｌ　（Ｏｍｅｇａ　ｌ　Ｑ　５ｔｉｒｒｅｄ　ｃｅｌｌ
ａｐｐａｒａｔｕｓ）　　（ファーマシア）にて濃縮し
！二。ついで、濃縮しＩ；試料を５０ｍＭトリスおよび
８Ｍ尿素を含有する緩衝液（ｐＨ８＞で予め平衡にした
１４４３−のＧ２５セフアｆツクス・ファイン・クロマ
トグラフィー・カラム（７フーマシアＸ４゜４Ｘ９５ｃ
＋＊１こ負荷した（２５ａｎ／時間）。該カラムを、平
衡緩衝液で同一の流速にてインクラティカルに溶出した
。フラクションを収集し、タンパク質およびＳＤＳレベ
ルについて検定し、ついでＳＤＳ汚染のないタンパク質
の回収を最大にするようにプールしｌ；。

ＳＤＳ除去後、精製したタンパク質（約り０％純度およ
び実質的に内毒素不合）を、２０ｍＭトリスおよび１ｍ
ＭＥＤＴＡを含有する緩衝液（ｐＨ８）に対して透析し
た。透析後、試料を滅菌濾過し、４°Ｃにて貯蔵した。

タンパク質を冷凍乾燥するため、該試料を２０ｍＭ炭酸
水素ナトリウムに対して透析し、ドライアイスーエタノ
ール浴にて凍結させ、ついで冷凍乾燥した。ついで、冷
凍乾燥したタンパク質を、２０ｍＭトリスおよびＩｍＭ
ＥＤＴＡを含有する緩衝液（ｐＨ８）で再構成した。

実施例１６ Ｔ細胞検定 ｉｎ　ｖｉＬｒｏ検定において、細胞毒性Ｔ細胞応答を
誘発するＣ１３タンパク質の能力を、Ａ／Ｐ　Ｒ／８／
３４起源の他のタンパク質のそれと比較した。他のタン
パク質は本明細書において以下のように称する： Ｃ７（完全ＨＡ） デルタ７　　　（ＨＡＩおよびＨＡ２の８ＯＮ末端残基
） （ＨＡ２） （ＮＳＩの８ＯＮ末端残基およびＨ Ａ２の８ＯＮ末端残基） （ＮＳＩ） （ＮＳ２） （ＮＳ１およびＭ）（実施例１参照） ３６ Ｓ２ ＮＳＩ デルタ１３ ３０ これらの各コーディング配列を有する分子は、ヤングら
が、ジ・オリジン・オブ・パンデミツク・インフルエン
ザ・バイラシーズ（Ｔｈｅ　Ｏｒｉｇｉｎ　ｏｆＰａｎ
ｄｅｍｉｃ　Ｉ　ｎＮｕｅｎｚａ　Ｖｉｒｕｓｅｓ）、
１９８３、ダブル・ジー・レイパー編、エルスヴイール
・サイエンス・パブリッシング・カンパニーにおいて記
載しているように誘導され、実質的に前記のようにｐＡ
Ｓ　ＩＡＥＨにおいて発現した。ＮＳＩを除いて、タン
パク質は実質的に実施例３において記載されているよう
に産生じた。菌体ペレットの再懸濁、リゾチーム処理、
超音波処理および遠心分離をした後、ＮＳＩタンパク質
はペレット中よりもむしろ上澄液中に含まれる。ＮＳＩ
の回収は以下に記載するようにして完了した。

上澄液を１００ｍＭ　ＭｇＣＱｚで処理し、４℃にて１
時間撹拌した。ついで、溶液を遠心分離（１５０００ｒ
ｐｍ、３０分間）に付し、ＮＳｌをベレット化しｔ；。

該ペレットを緩衝液Ａ（実施例３において記載）中に再
懸濁させ、再度１００ｍＭＭｇＣＱ、で処理し、ＮＳＩ
タンパク質を再沈澱させた。再遠心分離後、ペレットを
緩衝液Ａ中に再懸濁させ、ＩＱのｌｏｍＭ）リス−ＨＣ
Ｑ、ｐＨ７゜５、ＩｍＭＥＤＴＡに対して３回透析した
。ついで、該溶液を再度遠心分離に付し、いずれの粒状
物質をも除去し、ＮＳＩタンパク質含有上澄液を収集し
、検定に用いた。

細胞毒性Ｔ細胞検定は、実質的に以下のように実施した
。肺臓細胞を、ウィルス免疫または非免疫マウスから単
離し、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにて培養した。細胞を細かく分
けて、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにて９０分間、種々の抗原に暴
露した。ついで、細胞を繰り返し洗浄することによって
抗原を除去し、ついで、細胞を５日間培養し、刺激され
た個体数を増大させた。

刺激させた細胞、すなわち、エフェクター細胞を、予め
Ｓ　ＩＣｒで負荷したウィルス感染または非感染Ｐ８１
５（マウスの肥満細胞種）標的細胞と混合した。′１Ｃ
「の培地への有意な放出は、２次細胞毒性Ｔ細胞（２°
ＣＴＬ）が存在していることを示しており、それらは抗
原でのｉｎ　ｖｉｔｒｏ刺激により生じる。殺細胞の特
異性を２つの方法にて調べた：ｌ）種々のウィルスで感
染した標的細胞を、殺細胞について試験した；および２
）種々のウィルスで免疫されたマウスから、肺臓細胞を
単離した。また、該検定の直線性を、以下の表に示すよ
うに、種々の標的：エフェクター細胞比を用い、および
種々の抗原量を用いて調べた。例示的な結果が該表に示
されている。以下に挙げた結果は、エフェクター：標的
細胞比が３０：１（ｒ３０Ｊ）および１０　：　１（ｒ
ｌＯｊ　）であったことを示す。

表中の値は、細胞の洗浄剤可溶化で測定した細胞におけ
る５ｌ（ｒの全量と比較した場合の培地中に放出された
ｓＩＣ「の比率として表される。有意な陽性の結果が枠
で囲まれている。該検定に用いｌニウイルスは： Ａ／ＰＲ／８／３４（ＨＩＮＩ）　　　　（ｒＰＲ８Ｊ
）Ａ／ポート・カルマース／ｌ／７４（Ｈ３Ｎ２）（ｒ
Ａ／ＰＣＪ） Ａ／ブラジル／ｌ／７８（Ｈ２Ｎｌ）（ｒＡ／ＢＺＪ）
Ａ／ンンガポール／１１５７（８２Ｎ２）（ｒＡ／Ｓ　
ｉｎｇＪ） 前記の表に示されているように、致死量以下のＰＲ８ウ
ィルスで予め感染させたマウスからの免疫細繊細胞を用
いた場合、Ｃ１０は２次細胞毒性Ｔ細胞応答を誘発する
。ＮＳＩ、Δ７、Δ１３、Ｍ２Ｏ、ＮＳ２およびＣ３６
を含め、試験したすべての他のペプチド誘導体は、ある
種の血球凝集素構成物が有するような応答を誘発しない
。Ｃ１３ペプチドに対する応答は投与量に依存し、６μ
ｇ／−〜２４μｇ／−のレベルが２次細胞毒性Ｔ細胞応
答を誘発した。

観察された応答のウィルス特異性は、Ｃ１３がＨＩＮ＋
ウィルスで予め感染させたマウスからの免疫細繊細胞を
刺激するが、Ｈ３Ｎ２ウィルス（Ａ／Ｐ　Ｃ）で予め感
染させたマウスにおける免疫細繊細胞を刺激しないとい
うことを示している。これは、少なくとも部分的に、交
差反応性内部抗原によって、生きているウィルスで同一
の肺臓細胞を刺激した場合に観察される亜型交差反応性
細胞毒性Ｔリンパ球応答と異なる。加えて、Ｃ１３によ
る刺激はＨＩＮＩ亜型におけるウィルス株の間で交差反
応性であり、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにてＣ１３により刺激さ
れたＰＲ８免疫牌臓細胞は、ＰＨ１（１９３４かものＨ
ＩＮＩ株）で感染させた標的細胞ならびに１２μｇ〜４
８μｇの投与量範囲にわたり、高度の細胞毒性活性にて
Ａ／ブラジル（１９７８からのＨＩＮＩ株）で感染させ
た標的細胞を認識し、死滅させることができる。

細胞毒性Ｔリンパ球がマウス系のインフルエンザウィル
ス感染からの回復に寄与することは明らかであり、かか
るリンパ球応答を免疫マウスおよびヒトの両方において
認めることができる［エニスら（Ｅｎｎｉｓ　ｅｔ　ａ
１、）　、マイクロバイオロジー（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｙ）　　ｌ　９８４．４２７〜４３０頁、アメリカ
ン・ソサイエティ・オブ・マイクロバイオロジー（Ａｍ
ｅｒ、Ｓｏｃ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）参照］とい
うことを示している実質的なデーターに基づき、かかる
株交差細胞毒性Ｔ細胞応答を誘発するＣ１３タンパク質
の能力は、それ自体の有用性およびインフルエンザウィ
ルス感染に抵抗する免疫応答を誘発するＨＡ２免疫原決
定因子の有用性を示しており、該応答は亜型特異的であ
り、株特異的でないという点で半万能である。

実施例１７ Ｃ１３Ｔ細胞検定および防御研究 この実施例は、ＢＡＬＢ／ｃマウスをＣ１３タンパク質
で免疫化し、該免疫化がＣＴＬの誘発を介してインフル
エンザ感染に対する防御を誘発することを示す３研究に
ついて記載する。

第１の研究：Ｃ１３免疫牌臓細胞のウィルス持久圧 第１の研究においては、４週齢の雄のＢＡＬＢ／Ｃマウ
スにＣ１３タンパク質３００１１ｇを腹腔内投与し、３
．４および５週間後に投与を繰り返した。（先行実験は
、７０インド完全アジユバントが、Ｃ１３タンパク質誘
発ＣＴＬ活性のレベルを有意に増加させなかったことを
示した）。４番目の免疫化の１週間後、マウスの肺臓細
胞を摘出し、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいてウィルスでの刺
激用に培養した。非免疫化マウス（対照）を、ｉｎ　ｖ
ｉｔｒ。

における２次刺激用の肺臓細胞摘出の４週間前に、１０
０ブラツク形戒単位（Ｐ　Ｆ　Ｕ）のＡ／ＰＲ／８ウィ
ルスで鼻腔内的に感染させた。ＣＴＬ検定は実質的に前
記実施例４に記載されているように行なった。簡単には
、免疫化マウスまたは対照マウスからの３ＸＩＯ’個の
肺臓細胞を、細胞当たりｌ０ＰＦＵの感染多重度にてＡ
／ＰＲ／８またはＡ／ＰＣウィルスに感染させた３Ｘ１
０’ｆｌＨの同系の正常な肺臓細胞と共に培養した。５
日間培養した後、これらの細胞を二７エクター細胞とし
て用いた。標的細胞については、２Ｘ１０’（ＩＩのＰ
８１５細胞を、２５０μＣｉのＳ　Ｉ　Ｃ、の存在下、
■細胞当たりｌ０ＰＦＵの感染多重度にてＡ／ＰＲ／８
またはＡ／ＰＣウィルスと共にインキュベーションし、
ｌＸｌ０’個の６１Ｃ「−標識標的細胞を４時間、９６
−ウェルの丸底マイクロプレート中、指示された割合で
エフェクター細胞と共にインキュベーションした。上澄
液を採収し、”Ｃｒを測定した。特異的細胞溶解パーセ
ントは以下のように測定した： 特異的細胞溶解パーセント−（実験放出−最小放出）Ｘ
１００／（最大放出−最小放出）；自然発生放出はＰ８
１５細胞を培地中にてインキュベーションすることによ
り決定し、最大放出はＰ８１５細胞を１０％レネックス
（Ｒｅｎｅｘ）　３０溶液にュージャージー州、ラガー
・ケミカル・カンパニー（Ｒｕｇｅｒ　ＣｈｅＩｌ１、
Ｃｏ、、　Ｎ　Ｊ　）　）にてインキュベーションする
ことにより決定した。ＥＡＴ（エフェクター／標的）比
は、示されているように３、　ｌ　（ｒ３Ｊ）〜２００
　：　ｌ　（ｒ２００Ｊ）にて変化し、各ＥＡＴ比につ
いて４回の試料を試験した。

結果を以下の第５表に示す。

第５表は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいてＡ／ＰＲ／８ウィ
ルス感染の正常な同系の肺臓細胞により刺激されたＣ１
３免疫マウスの肺臓細胞が、Ａ／ＰＲ／８感染の正常な
肺臓細胞により刺激されたＡ／ＰＲ／８免疫エフェクタ
ー細胞より低度であるが、Ａ／ＰＲ／８惑染標的細胞を
溶解させることができ、Ａ／ＰＣ（Ｈ３Ｎ２）ウィルス
感染の標的細胞または非感染標的細胞を溶解させないこ
とを示す。Ａ／ＰＣ（Ｈ３Ｎ２）ウィルスによる刺激後
、Ｃ１３タンパク質免疫牌臓細胞においては、ＣＴＬ活
性が認められないことが判明した。非免疫マウスの肺臓
細胞もまた、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるウィルスでの刺
激後、いずれの標的細胞についてもＣＴＬ活性を示さな
かった。

第２の研究＝０１３免疫化マウスの肺つィルス堡 第２の研究においては、Ａ／ＰＲ／８　（ＨＩ　Ｎｌ）
またはＡ／ＰＣ（Ｈ３Ｎ２）ウィルスによる攻撃後、Ｃ
１３タンパク質免疫化マウスおよび非免疫マウスの肺ウ
ィルス価（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ　ｖｉｒｕｓｔｉｔａｒ
）を試験した。（第５表における）４番目の免疫化の１
週間後、マウスを、エーテル麻酔下、５ＸＩＯ’ＰＦＵ
の投与量にてＡ／ＰＲ／３またはＡ／ＰＣウィルスで鼻
腔内的に攻撃した。４日後、肺ウィルス価の測定のため
、肺を無菌的に採収した。採収した肺を、ＰＢ３１．５
−中、手作業により、つづいて遠心分離（２０００ｇ、
４℃にて１５分間）により均質化した。該上澄液をウィ
ルスについて滴定するまで凍結させた。マディン・ダー
ビ（（Ｍａｄｉｎ　Ｄａｒｂｙ）のイヌの腎臓（ＭＤＣ
Ｋ）細胞を、１０％熱−不活性化胎児ウシ血清を補足し
た１００μｇ／−ペニシリン、ｌＯＯμｇ／−ストレプ
トマイシンおよび２００μｇ／＋ｎｆ２Ｌ−グルタミン
を含有するイーグル最小必須培地（Ｍ　Ｅ　Ｍ）に保持
し、２４ウエルの組織培養プレートに接種したＣＭＥＭ
１ｍｇ中、２５ＸＩＯ’個の細胞）。練上澄液を解凍し
、つづけて０．Ｌ％ウシアルブミン含有ＰＢＳ中にて希
釈した。ウェルから培地を吸引により取り出した後、希
釈したウィルス溶液１００μＱを各ウェルに加え、３７
０Ｃにて１時間、随時撹拌しながらインキュベーション
した。ついで、各ウェルに、ＭＥＭ、０．１％Ｄ−グル
コース、０．Ｏ１％ＤＥＡＥ−デキストラン、１％ビタ
ミン（１６−００４−４９：米国、バージニア州、マツ
ククレーン、フロー・ラボラドリース（Ｆ　ｌｏｗ　Ｌ
　ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＭｃＣ１ｅａｎ、　Ｖ　Ａ
　。

ＵＳＡ）、ＩＯμｇ／−トリプシンおよび１％寒天を含
有する寒天培地ｌ−を付与した。５％ＣＯ２中、３７℃
にて２日間インキュベーションした後、ＰＢＳのｌＯ％
ニュートラルレッドｌ−を、各ウェルの寒天にかぶせｔ
；。１０時間インキュベーションした後、プラークを計
数した。結果を、以下の第６表において、２つの試料の
平均ｌｏｇ、。ＰＦＵ／−として表わす。

第６表：Ｃ１３免疫化マウスの肺つィルス価免疫　　　
　　　　　　　受容体 ウィルス攻撃　　ウィルス価 Ｃｌ　３　　　　　　Ａ／ＰＲ／８（ＨＩＮＩ）　　　
　３．８±０．９＊非免疫化　　　Ａ／ＰＲ／８　　　
　　５．４±０．２＊Ｃｌ　３　　　　　Ａ／ＰＣ（Ｈ
３Ｎ２）　　　　５．４±０．２非免疫化　　　Ａ／Ｐ
Ｃ５，０±０．３＊：Ｐ＜０．００５、スチューデント
ｔ−テストにより測定した 第６表は、Ｃ１３免疫化マウスが、非免疫化マウスのウ
ィルス価と比較した場合に、有意に低いＡ／ＰＲ／８ウ
ィルスの肺ウィルス価を有することを示す。Ａ／ＰＣ（
Ｈ３Ｎ２）ウィルス攻撃後、Ｃ１３免疫化マウスと非免
疫マウスの間には、肺ウィルス価において有意な差異は
ない。

Ａ／ＰＲ／ａ一致死攻撃感染後、Ｃ１３−免疫化マウス
８匹のうち７匹は６０日（観察の最後の日）以上生存し
ているが、非免疫マウスはすべて７日までに死んだ。こ
のＣ１３タンパク質によって誘発される防御は、ｉｎ　
ｖｉＬｒｏにおけるＡ／ＰＲ／８−感染標的細胞のウィ
ルス刺激Ｃ１３免疫牌臓細胞による細胞溶解の特異性、
およびＣ１３タンパク質により免疫化されたマウスの肺
におけるＡ／ＰＲ／８ウィルス複製の特異的制限をもた
らす。

第３の研究においては、また、最近単離されｌ；Ｈ１亜
型ウィルス株であるＡ／タイワン／ｌ／８６（ＨＩＮＩ
）に対するＣ１３タンパク質−免疫マウスの防御につい
て試験した。４番目の免疫化（第５表）の３週間後、さ
らに２００μｇ用量のＣ１３タンパク質を投与した。１
週間後、マウスを、エーテル麻酔下、１ＸｌＯｓＰＦＵ
の用量にて、Ａ／タイワン／Ｉ／８６　（Ａ／ＴＷ／ｌ
／８６）ウィルス株（米国食品医薬品局、生物学課（ｔ
ｈｅ　０ｆｆｉｃｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）から
入手）で鼻腔内的に攻撃した。攻撃前、中和抗体の滴定
用にＣ１３タンパク質免疫化マウスから血清を入手した
。第６表に記載されているように、感染の４日後、ウィ
ルス滴定用にマウスの肺を摘出した。ＭＤＣＫ細胞にお
けるプラーク検定により、Ａ／ＰＲ／８ウィルスに対す
る中和抗体数を測定した。

一連の希釈したプール血清を、予め３７℃にて１時間、
２０ＰＦＵのウィルスでインキュベーションし、第６表
のようにウィルスについて滴定した。

５０％プラーク−中和抗体価を算定した。６週間前、鼻
腔内にて１００ＰＦＵのＡ／ＰＲ／８ウィルスに感染さ
せたマウスのプール血清は、陽性対照に含まれる。結果
を以下の第７表において報告する。

第７表：Ｃ１３免疫化マウスの肺ウィルス価Ｃｌ　３　
　　Ａ／ＴＶ／ｌ／８６　　　２．５±０．９＊　　　
＜４（ＨＩＮＩ） 非免疫化Ａ／ＴＶ／ｌ／８６　　４．１±０．３＊　　
　＜４Ａ／ＰＲ／８　　　　Ｎ、Ｄ、　　　　　　　Ｎ
、Ｄ、　　　　　　２５６＊　：　ｐ＜ｏ、ｏｏｓ、ス
チューデントｔ−テストにより測定 第７表において示されている結果は、Ｃ１３タンパク質
免疫化マウスが、攻撃後、非免疫マウスが有するよりも
有意に小さなＡ／タイワン／ｌ／８６の肺ウィルス価を
有するが、Ｃ１３タンパク質免疫化マウスも非免疫マウ
スのどちらもＡ／ＰＲ／８ウィルスに対して血清中和抗
体を有していないことを示している。これは、ＨＡ２サ
ブユツトが中和抗体を誘発する部位を有していないため
と思われる。反対に、陽性対照としてのＡ／ＰＲ／８ウ
ィルス注入マウスは、高レベルの中和抗体価を示した。

これらの結果は、Ｃ１３タンパク質での免疫化が、中和
抗体の誘発によるのではなく、ＣＴＬ応答の誘発を介し
て、１９３４８よび１９８６からのＨ１亜型のウィルス
株に対する防御を誘発することを示唆している。これら
の結果は、インフルエンザＡ（Ａ／ＰＲ／８）ウィルス
のＨＡ２サブユニットを含む融合タンパク質での免疫化
が、５０年間にわたって孤立していたインフルエンザウ
ィルス株に対となずな防御を誘発し、赤血球凝集抗体特
異性において多くの多様性を有することを示している。

実施例１８ Ｄタンパク質刺激ＣＴＬのインフルエンザウィルスの特
異性 クローンレベルでのＤタンパク質刺激ＣＴＬのウィルス
特異性を検定するため、Ｄタンパク質刺激のウィルス免
疫細繊細胞を、照射同系牌臓細胞の存在下、ＣｏｎＡ刺
激ラットの肺臓細胞からのｌＯ％上澄液中にて８週間培
養した。このＤタンパク質刺激ＣＴＬ系統の限定希釈（
ｌｉｍｉｔｉｎｇｄｉｌｕｔｉｏｎ）が、以下、十分に
記載するようにＣＴＬクローンを発現させた。

Ｄタンパク質は、実質的に、前記実施例３におけるＣ１
３タンパク質について記載されている方法で、組換型イ
ー・コリにて産生じた。簡単には、菌体の溶解後、００
１％デオキシコール酸塩抽出を２回および１％トリトン
ｘ−ｉｏｏ抽出を１回行ない、混入しているイー・コリ
のタンパク質を除去し、Ｄタンパク質を、４℃にて３０
分間、４Ｍ尿素を用いて溶解させた。ついで、該尿素′
６：４℃での透析により除去した。調製したタンパク質
を、５ＱｍＭ）リス−ＨＣＩ２、ｐＨ８，０，１ｍＭＥ
ＤＴＡ中に貯蔵した。

４〜５週齢の雄のＢＡＬＢ／Ｃマウスを、エーテル麻酔
下、Ｉ　ＯＯＰＦＵのウィルスで鼻腔内的に免疫化した
。Ａ／ＰＲ／８で免疫化したマウスの肺臓を、ｉｎ　ｖ
ｉｔｒｏ刺激の免疫化の３週間後またはそれ以上後に摘
出した。

ラットのインターロイキン−２（ＩＬ２）を、実質的に
、タウンセンドら（Ｔｏｖｎｓｅｎｄ　ｅＬ　ａ１、）
、ジャーナル・オブ・エクスベリメンタル・メディスン
（Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、）、１６０：５５２　（１９８
４）における記載に従い調製した。簡単には、２月齢の
ルイス（Ｌ　ｅｖｉｓ）ラットからの肺臓細胞を、赤血
球を溶解させることなく％　　２ＸＩＯ’リンパ球／−
に調整し、３７°Ｃにて２時間、２０μｇ／−の濃度で
のＣｏｎＡ（シグマ型ＩＩ［）　　（ミズリー州、セン
ト・ルイス、シグマ・ケミカル・カンパニー）と共にイ
ンキュベーションした。肺臓細胞をＰＢＳで３回洗浄し
、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を補足したＲＰＭｒ１
６４０中、３７°Ｃにて４８時間、５×ｌＯ″細胞／−
にて培養した。上澄液を採収し、０．４５μｍフィルタ
ーを通した後、−８０℃にて凍結した。

２次ＣＴＬは、実質的に、実施例１６および１７におけ
る記載に従って調製した。ウィルス免疫−肺臓細胞をＤ
タンパク質で刺激するため、肺臓細胞を、５０μｇ／−
の濃度でのＤタンパク質と共に１時間培養し、ついで培
地で２回洗浄した。

培養５日後、それらをＣＴＬ検定のエフェクター細胞と
して用いた。

ＣＴＬクローンは以下のように定着させた。バルク培養
における生存２次ＣＴＬを、フイコールパキ：ｘ　−（
Ｆ　１ｃｏｌｌ　−Ｐ　ａｑｕｅ）　（ファーマシア、
ニューシャーシー州、ビス力タウエイ）にて分離した。

非免疫Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスからの同系のγ照
射（２００Ｑｒａｄ）肺臓細胞を、３７°Ｃにて１時間
、Ｄタンパク質（１００μｇ　／　ｍ＋２）で刺激した
。生存している再生細胞（２０ＸｌＯ’細胞／ｍ４）を
、１０％（ｖ／ｖ）粗ラットＩＬ２および５ＸＩＯ−’
Ｍの２−メルカプトエタノール（２ＭＥ）の存在下の培
地１０ｍ１２中、Ｄタンパク質刺激γ照射牌臓細胞（３
００ＸｌＯ’細胞／ｒｎＱ）と共に培養した。この操作
を週単位で実施し、ＣＴＬ株を刺激した。このＣＴＬ株
の培養の８週間後、実質的に、ブラシャルら（Ｂｒａｃ
ｉａｌｅ　ａｔ　ａ１、）、ジャーナル・オブ・エクス
ペリメンタル・メディスン、１５３：９１０　（１９８
１）による記載に従って、限定希釈を行ない、ＣＴＬク
ローンを発生させた。簡単には、この操作にて用いた培
地は、ｌＯ％ＦＢＳ１抗生物質（１００Ｕ／−ペニシリ
ンおよび１１００ｐ／−ストレプトマイシン）、５ＸＩ
Ｏ−’Ｍの２−メルカプトエタノール（２ＭＥ）および
１０％ＣｏｎＡ誘発ラットｌＬ２を補足したＲＰＭＩ１
６４０である。生存キラー細胞（０゜５．１．２．４．
８および１６細胞／ウエル）を、９６−ウェルの平面底
のマイクロタイタ・プレート（マサチューセッツ州、ケ
ンブリッジ、コスタ−（Ｃｏｓｔａｒ）　）のウェルに
おいて、培地０．２−の＋　ｘ　ｉ　ｏ’個の同系のＤ
タンパク質刺激照射ＢＡＬ　Ｂ　／　ｃ肺臓細胞と共に
培養した。ステイミュレータ−細胞を７日毎に加えた。

クローンは増殖するにつれて、２４ウ工ル組織培養グレ
ート（コスタ−）、６ウエル培養プレート（カリ７オル
ニア州、オックスナード、ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）
　）または２５ｃｍ’組織培養７ラスコにューヨーク州
、コーニング、コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）　）のよ
うなより大きな容器にて発展する。

＄　１（、−放出検定においては、Ｐ８１５細胞を標的
細胞として用い、実質的に、前記の実施例１６および■
７に記載されているように実施した。

Ｈ−６およびＢ−７と称する２つのクローンは、前記の
Ｄタンパク質−刺激ウイルスー免疫牌臓細胞の培養から
定着させた；クローンＨ−６は２つのキラー細胞が接種
されたウェルにて増殖し、Ｂ−７は４細胞が接種された
ウェルにて増殖した。これらクローンの細胞表面表現形
は、Ｔｈ　ｙ１、２”およびＬｙｔ２＋である。これら
のＣＴＬクローンはＡ／ＰＲ，’８感染Ｐ８１５（Ｈ−
２つ細胞を溶解するが、Ａ／ＰＲ／８惑染ＭＣ５７Ｇ細
胞（Ｈ−２’）またＩｉＡ／ＰＲ／８感染ＢＷ５１７４
細胞（Ｈ−２’）を溶解しないため、それらはＨ−２４
ハブロタイブにより限定される。

以下の第８表に示すように、これらのＣＴＬクローンは
、ＨＩＮＩ　　（Ａ／ＰＲ／８およびＡ／ＢＺ）亜型お
よびＨ２Ｎ２　（Ａ／ＪＡＦ）亜型のウィルス株により
感染された標的細胞に対して交差反応性細胞毒性活性を
示すが、Ｈ３Ｎ２（Ａ／ＰＣ）亜型ウィルスまたはイン
フルエンザＢ　（Ｂ／ＨＫ）ウィルスにより感染された
標的細胞を溶解しない。すなわち、これらのクローンは
、ＨｌまたはＨ２亜型ウィルスにより感染された標的細
胞の交差反応性細胞溶解を示す。これは、優勢死滅がＨ
１亜型のウィルスで感染された標的細胞にて認められ、
はとんどまたはまったく細胞溶解がＨ２亜型のウィルス
株により感染された標的細胞にて観察されない、バルク
培養において観察された２次ＣＴＬの特異性とは異なる
。本発明のワクチンは、亜型内のすべての株に対してだ
けでなく、少なくともある種の亜型を横切って防御を付
与しうろことを示しているため、かかる交差亜型応答は
予期しえなかった。

Ｈ−６ＣＴＬクローンのｉｎ　ｖｉｖｏ　エフェクタ婁
吸 ついで、Ｈ−６ＣＴＬクローンをマウスに養子免疫伝達
した。ＲＰＭＩ　１６４０　（０，５ｍｆ２）に懸濁さ
せた細胞（２Ｘ１０’）を、ウィルス攻撃の６時間前、
足部静脈を介して、静脈内的にマウスに移入した。３日
後、感染させたマウスの肺を取り出し、均質化し、実質
的に前記の実施例１７に記載されているようにプラーク
形成性によりウィルス価を測定した。

以下、第９表は、このＣＴＬクローンの養子免疫伝達が
、Ｈ３（Ａ／ＰＣ）亜型またはＢ型インフルエンザウィ
ルスで感染されＩ；マウスの肺におけるウィルス価を有
意に減少させないが、Ｈｌ（Ａ／ＰＲ／８）およびＨ２
（Ａ／ＪＡＦ）亜型のウィルス株により感染されたマウ
スのウィルス価を有意に減少させることを示す。これら
の結果は、Ｄタンパク質により刺激され、かつＨｌおよ
びＨ２ウィルスのＨ２サブユニットについて特異的であ
るＣＴＬクローンが、ｉｎ　ｖｉｖｏにおいて防御を付
与することを示す。これにより、ＨｌまＩ；はＨ２ウィ
ルスにより感染された標的細胞に対する該クローンのｉ
ｎ　ｖｉｔｒｏにおけるＣＴＬ活性の予測価が確認され
た。

寒冷標的抑制研究 Ｄタンパク質の抗原特異性がＣ１０のそれに等しいこと
を確かめるために、寒冷標的抑制実験を、Ｄタンパク貫
刺＃Ｂ−７ＣＴＬりσ−ンを用いて実施した。Ａ／ＰＲ
／８惑染標的細胞の細胞溶解は、Ｃ１３およびＤタンパ
ク質をコートした寒冷標的細胞の両方により、ならびに
Ａ／ＰＲ／８ウィルス感染寒冷標的細胞により抑制され
た。Ｃ１３タンパク質をコートした”Ｃｒ−標識標的細
胞の細胞溶解の抑制は、寒冷Ａ／ＰＲ／８ウィルス感染
Ｃ１３またはＤタンパク質をコートした標的細胞につい
ても観察された。両方のケースにおいて、Ａ／ＰＣ−感
染寒冷標的および非感染寒冷標的細胞のいずれも、”Ｃ
ｒ標識標的細胞と拮抗しなかった。これらの結果は、Ｄ
タンパク質がＣ１３タンパク質と同じ抗原特異性を有す
ることを示している。

第　　　９　　　表 ＣＴＬクローンＨ−６によるｉｎ　ｖｉｖｏにおける肺
ウィルス減少のウィルス特異性移入された ＣＴＬり口　　　　　　　受容体 一ンＨ−６“　ウィルス攻撃　肺のウィルス価ｂ＋　　
　　　Ａ／ＰＲ／８　　５．０±１．０（ＨＩＮＩ） Ａ／ＰＲ／８　　６．９±０．１″ ＋　　　　　Ａ／ＪＡＦ　　　　２．６±０．３（Ｈ２
Ｎ　２） Ａ／ＪＡＦ　　　　３．７±０．４６ ＋　　　　　Ａ／ＰＣ４，２±０．３ （Ｈ３Ｎ　２） Ａ／ＰＣ４，１±０．１ ＋　　　　　Ｂ／ＨＫ　　　　　４．２±０．４８／Ｈ
Ｋ　　　　　４．７±０．５ ａ：２Ｘｌｏ’細胞をウィルス攻撃の６時間前に移入し
た。

ｂ：ウィルス攻撃の３日後、肺を摘出し、ウィルス価を
ＭＤＣＫａｌｌ胞におけるプラーク検定により試験した
。

ｃ：Ｐ＜０．０５はスチューデント（−テストにより測
定した。

ｄ：Ｐ＜０．０２はスチューデントｔ−テストにより測
定した。

実施例１９　付加ペプチド Ｄタンパク質に付加的な組換型ペプチドを組換型イー・
コリにおいて産生じ、実質的に前記のようにＣＴＬ検定
において試験した。これらのペプチドを以下の第１０表
に列挙する。第１Ｏ表はまた、抗原における最初と最後
のＨＡ２アミノ酸の番号を記載しており、Ｔ細胞検定に
おいて抗原は陽性（＋）であるか、または陰性（−）で
あるかのいずれかである。Ｃ１３およびＤタンパク質を
参考のために記載する。アミノ酸は１文字の記号で示さ
れている。

バイオケミストリー（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｓＬｒｙ）　
２版、エイ・エル・レニンガ−（Ａ、Ｌ、Ｌｅｈｎｉｇ
ｅｒ）　　（１９７７）。

第１０表　Ｃ１３、Ｄタンパク質および誘導体タンパ　
　　　　　　　　　　　　　　ＣＴＬり質　　　　　　
　　　　　　　　　　　活性ＣＩ　３　　　Ｎ５Ｉ（１
〜８１）−Ｄ−Ｌ−５−Ｒ−ＨＡ２（１〜２２２）　　
＋Ｄ　　　　　Ｎ５Ｉ（１〜８１）−Ｑ−１−Ｐ−ＨＡ
２（１〜２２２）　　　＋Ｃｌ　３　　　Ｎ５Ｉ（１〜
４２）−Ｍ−Ｄ−Ｌ−５−Ｒ−ＩＡＩ　　　　＋ショー
ト　　　　　　　　　　　（６５〜２２２）Ｄショート
Ｎ５ｌ（１〜４２）−Ｍ−Ｄ−Ｈ−ｈｌ−Ｌ−Ｔ−５−
Ｔ−＋Ｒ−３−ＨＡ２（６６〜２２２） Ａ　　　　　Ｎ５Ｉ（１〜８１）−Ｑ−１−Ｐ−ＨＡ２
（６９〜２２２）　　＋ＣＮ５Ｉ（１〜８１）−Ｑ−１
−Ｐ−ＨＡ２（８１〜２２２）　　＋ＡＤ　　　　Ｎ５
Ｉ（１−８１）−Ｑ−１−Ｐ−Ｖ−ＨＡ２（１５０−２
２２）＋Δ１３　　　Ｎ５Ｉ（１〜８１）−Ｄ−Ｌ−５
−［？−ＨＡ２（１〜７０）−Ｓ−Ｃ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ｙ
−Ｈ−Ｒ Ｍ　　　　　Ｎ５Ｉ（１〜８１）−Ｑ−１−Ｐ−ＨＡ２
（６５〜１９６）Ｇ−Ｇ−Ｓ−Ｙ−５−Ｍ−Ｅ−Ｈ−Ｆ
−Ｒ−Ｗ−Ｇ−に−Ｐ−ＶΔＭ　　　　Ｎ５Ｉ（１〜８
１）−Ｑ−１−Ｐ−ＨＡ２（６５〜１９６）−Ｇ−Ｇ−
５−Ｙ−３−Ｍ−Ｌ−Ｖ−Ｎ 以下の実施例においては、Ｄタンパク質、ΔＭタンパク
質およびΔＭ＋タンパク質（各々、前記の実施例４．１
２および１３において記載）を、ｉｎ　ｖｉｖｏにおけ
る抗ウィルス細胞毒性Ｔ−リンパ球を誘発するその能力
について試験した。

マウス（（Ｂａｌｂ／ｃ　ｘ　Ｃ５７ＢＬ／６）Ｆ＋）
を、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）中、Ｄタン
パク質、ΔＭタンパク質およびΔＭ＋タンパク質で免疫
化した。Ｄタンパク質は実施例１５に従って精製した（
純度約９０％）。ΔＭタンパク質およびΔＭ＋タンパク
質は、各々、前記の実施例３におけるＣ１３タンパク質
の精製についての記載に従って精製した（純度約５０％
）。

各抗原の試験については、マウスを３群（１群当たり３
匹のマウス）に分け、第１群には合計ｌＯμｇのタンパ
ク質を投与し、第２群には合計５０μｇのタンパク質を
投与し、対照群にはＣＦＡのみを投与しＩ；。各マウス
は２回注射、１回は足部の基部（０，１ｍＱ）にて、１
回は後足肉址（０゜１＋ｎｆｌ）に投与した。注射の１
週間後、注入部位の回りのリンパ節を各マウスから摘出
した。群におけるすべてのマウスからの節をプールした
。リンパ節ヲステンレススチールメッシュに通すことに
より、単一細胞の懸濁液を調製した。得られた細胞を２
回洗浄し、完全培地（ＲＰＭ１１６４０＋１０％胎児ウ
シ血清、２ｍＭグルタミン、ｌｏｍＭＨｅｐｅｓ緩衝液
５Ｘ１０−５Ｍ２−メルカプトエタノール、ペニシリン
およびストレプトマイシン）中に再懸濁させた。

免疫リンパ節細胞（６Ｘ１０’細胞）を、６％ＣＯ，中
、３７℃にて５日間、Ｉ　Ｏ’個ノＡ／Ｐ　Ｒ／８感染
の正常肺臓細胞（以下に記載）で刺激した。ウェル当た
り合計容量２ｍｆ２の２４−ウェル・プレートにて培養
を始めた。ついで、培養細胞（「ＣＴＬエフェクター細
胞」）を採収し、２回洗浄し、後記のＣＴＬ　（クロミ
ウム放出）検定用に、適当な濃度の完全培地に再懸濁さ
せた。

ウィルス感染のステイミュレータ−細胞を調製するため
、細織を（Ｂａｌｂ／ｃ　ｘ　　Ｃ５７Ｂ　Ｌ／　６）
Ｆ１マウスから摘出し、ステンレススチールメツシュを
介して梳き、単一細胞の懸濁液を調製した。

赤血球を低張性シｓｔり（ｈｙｐｏｔｏｎｉｃ　５ｈｏ
ｃｋ）により溶解させた。細胞を２回洗浄し、６ＸｌＯ
・細胞／ｄでの完全培地に再懸濁させた。細胞を、５％
ＣＯ２下、３７°Ｃにて１時間、１５分間の間隔でゆっ
くりと振盪しながらＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスで感染
させた（細胞当たり約２０ブラツク形成単位（ＰＦＵ）
）。（Ａ／Ｐ　Ｒ／８／３４（ＨＩＮＩ）およびＢ　／
　Ｌ　ｅ　ｅ　／　４０インフルエンザウイルスを、９
日齢の胚含有の鶏卵にて４８時間増殖させた。感染弁か
らの尿膜絞液を採収し、プールし、−７０℃にて一部貯
蔵しＩ；。）ついで、細胞を２回洗浄し、完全培地中、
ｌＸｌ０＆細胞／−に調整した。感染した細胞懸濁液ｌ
−を、６×ＩＯ′免疫リンパ節細胞を含有するウェルに
添加した。

ＣＴＬ検定は以下のように実施した。クロミウム放出検
定における標的細胞として、　ｌｏｇ増殖段階のＰ８１
５細胞（１０％胎児ウシ血清および２ｍＭグルタミンを
補足したイーグル最小必須培地（ＭＥＭ）の懸濁培養に
維持した、ＤＢＡマウスに由来する肥満細胞腫系統）を
用いた。Ｐ８１５を、血清不在下、６％ＣＯよ、３７°
Ｃにて３０分間、Ｎａ、ＣｒＯ，（Ｃｒ’つ　（１０’
細胞当たり３００μＣｉ）で標識化した。ついで、ウィ
ルス（細胞当Ｉこり約１０ＰＦＵ）を加え、インキュベ
ーションをさらに１時間続けた。ついで、細胞を２回洗
浄し、完全培地（ｌ〜２ＸＩＯ’細胞／−）に再懸濁さ
せ、３７℃にて３．５時間再インキュベーションした。

核細胞を２回洗浄した後、それらをｌＸｌ０’細胞／ｍ
１２に調整し、そのＯ，ｌ−を、標的細胞に対するエフ
ェクターの最終比が５０：ｌ。

２５：１．１２．５：ｌおよび６．２５：ｌであるよう
にＯ，１ｍ１２ＣＴＬエフエクター細胞を含有する丸底
マイクロウェル（９６ウエルプレート）に加えた（すべ
て３つのウェルにて開始した）。該プレートを６００　
ｒｐｍにて５分間遠心分離に付し、ついで５％ｃｏ！、
：３７℃にて４時間インキュベーションした。放出され
た６　１　Ｇ　、の量は、上澄形の各培養０．１−をサ
ンプリングし、γカウンター（ベックマン計器ガンマ８
０００）にて計数することにより測定した。

細胞毒性％は、式： ％式％ ［式中、Ｅはエフェクター細胞の存在下、１分間当たり
に放出された数、Ｃは０．１−の完全培地でインキュベ
ーションされた標的細胞により１分間当たりに放出され
た数（自然発生放出）、およびＴはＩウェルに付き、１
分間当たりの総数１により計数した。１分間当たりの総
数としては、０．１−標的細胞を、Ｏ，１ｍｆｌの１％
ドデシル硫酸ナトリウムで３．５時間インキュベーショ
ンし、ウェルの内容物を０、ｌ−サンプリングする前に
混合した。

増殖検定を行なうについては、免疫リンパ節（０，２ｒ
Ｍｌ）からの細胞を、ｌウェル当Ｉ；す４ＸＩＯＳ細胞
にて９６ウエルのマイクロタイタ・プレートの平坦底の
ウェルに添加した。該細胞を、６％ＣＯ，，３７°Ｃに
て７２時間、Ｄタンパク質（９０％純度）１０℃ｇ／−
で刺激した。（ｌウェル当たり２５μα添加する前に、
Ｄタンパク質のストック調製物を、適宜、水中５％デキ
ストロースで希釈した。）ついで、該ウェルを、最後の
６時間の培養の間　３Ｈチミジン（ｌｕｃｉ）で刺ｆｆ
ｉし、シンチレーション・カウンティング用の自動細胞
採収器（スカトロンＸ　Ｓ　ｃａｔｒｏｎ）のフィルタ
ー上で収集した。

結果を以下の第１１表に示す。

該データーは、Ｍ十タンパク質が、試験した両方の用量
（１０μｇと５０μｇ）にて、効果的にＡ型持異的細胞
毒性Ｔ−リンパ球応答を誘発することを示している。Δ
Ｍタンパク質は高用量（５０μｇ）で陽性ＣＴＬ応答を
誘発したが、ＣＴＬ活性は、Ｂ型感染標的が死滅したの
と同様、Ａ型感染標的に対しても全く向けられなかった
。類似の組換型インフルエンザ・タンパク質（クワノら
（Ｋｕｖａｎｏ　ｅｔ　ａ１、）、１９８８、ジャーナ
ル・オブ・イムノロジー（Ｊ　、　Ｉ　ｍｍｕｎｏ１、
）、１４０　：１２６４〜１２６８）に対して、または
ウィルス（ヤップら（Ｙａｐ　ｅｔ　ａ１、）、１９７
８、ネイチャー、２７３　：　２３８〜２３９）に対し
て向けられたＣＴＬｓは、マウスのモデルにおいて防御
的免疫性を養子移入することができ、さらにはヒト・イ
ンフルエンザウィルスのウィルス清掃において役割を果
たす（マック・ミカエルら（ＭｃＭｉｃｈａｅｌｅｔ　
ａ１、）、１９８３、ニュー・イングランド・ジャーナ
ル・オブ・メディスン（Ｎ、Ｅｎｇ１、　Ｊ　、Ｍｅｄ
−）と考えられるため、これら２つのタンパク質のいず
れかはヒトインフルエンザ・ワクチンの候補である。

Ｄタンパク質、ΔＭまたはΔＭ＋のいずれかで免疫化し
たマウスからの細胞をまた、ｉｎ　ｖｉｔｒ。

において、Ｄタンパク質１０μｇ／−に対する増殖応答
について試験した。すべての群の応答は高度に陽性であ
った（スチューデントｔ−テストの両側検定ｖｓ、ＣＦ
Ａ対照詳Ｉこ対する応答によりｐ＜０．００１）。イン
フルエンザ誘導タンパク質に応じてのｉｎ　ｖｉｔｒｏ
における増殖は、Ｂ型細胞によるインフルエンザ特異的
抗体産生を増大させ、または支持することのできるＴヘ
ルパー細胞クローンの確立された特性である（シエリル
およびゲルハード（Ｓ　ｃｈｅｒｌｅおよびＧ　ｅｒｈ
ａｒｄ）、１９８６、ジャーナル・オブ・エクスベリメ
ンタル・メディスン（Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、）　、１６
４　：　１１１４〜ｌ　１２８）。中和抗体の産生は、
ｉｎ　ｖｉｖｏにおいて、ヘルパーＴ細胞により促進す
ることができるため（シェリルおよびゲルハード、１９
８６．前掲、および１９８８、ＰＮＡＳ４４４６〜４４
５０ｉチテら（Ｔｉｔｅ　ｅｔ　ａ１、）、１９８８、
ジャーナル・オプ・イムノロジー、１４１：３９８０〜
３９８７）、強力なＴヘルパー細胞活性で細胞を誘発す
るタンパク質はまた、ヒトワクチン免疫原の候補である
と考えられる。

本発明およびその好ましい具体例を開示したが、本発明
はこれらに限定されるものではなく、本発明の範囲内の
全ての修飾も包含する。

【図面の簡単な説明】

第１図は、Ｃ１３タンパク質のコーディング領域のヌク
レオチド配列およびそのアミノ酸配列であり、第２図は
、Ｄタンパク質のコーディング領域のヌクレオチド配列
およびそのアミノ酸配列であり、第３図は、Ｃ１３ショ
ートタンパク質のコーディング領域のヌクレオチド配列
およびそのアミノ酸配列であり、第４図は、Ｄショート
タンパク質のコーディング領域のヌクレオチド配列およ
びそのアミノ酸配列である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）ＨＡタンパク質のＨＡ２サブユニットの免疫原決
   定因子を有する、ＨＡタンパク質以外のポリペプチドか
   らなることを特徴とするインフルエンザウイルスによる
   感染に対して動物の防御を刺激するワクチン。 （２）ＨＡ２サブユニットの免疫原決定因子を有する第
   １のポリペプチドが、第２のポリペプチドに融合する請
   求項（１）記載のワクチン。 （３）第１のポリペプチドが、ＨＡ２サブユニットに免
   疫原配置をとらせる第２のポリペプチドに融合したＡ型
   インフルエンザウイルスの１つまたはそれ以上のＨ１、
   Ｈ２およびＨ３亜型のＨＡタンパク質のＨＡ２サブユニ
   ットの免疫原決定因子を有する請求項（２）記載のワク
   チン。 （４）第２のポリペプチドがＮＳ１タンパク質のＮ末端
   アミノ酸からなる請求項（３）記載のワクチン。 （５）第２のポリペプチドがＮＳ１のアミノ酸１〜８１
   からなる請求項（３）記載のワクチン。 （６）第２のポリペプチドがＮＳ１のアミノ酸１〜４２
   からなる請求項（３）記載のワクチン。 （７）第１のポリペプチドが、ＨＡ２サブユニットのア
   ミノ酸１〜２２２；ＨＡ２サブユニットのアミノ酸６５
   〜２００；ＨＡ２サブユニットのアミノ酸６５〜２２２
   ；ＨＡ２サブユニットのアミノ酸６６〜２２２；ＨＡ２
   サブユニットの６９〜２２２；ＨＡ２サブユニットのア
   ミノ酸８１〜２２２；またはＨＡ２サブユニットのアミ
   ノ酸１５０〜２２２を有するいずれかのペプチドからな
   る請求項（５）または請求項（６）記載のワクチン。 （８）免疫原決定因子がＣ１３タンパク質、Ｄタンパク
   質、Ａタンパク質、Ｃタンパク質、ΔＤタンパク質、Ｄ
   ショートタンパク質、Ｃ１３ショートタンパク質、ΔＭ
   タンパク質およびΔＭ＋タンパク質のいずれかに担持さ
   れる請求項（１）記載のワクチン。 （９）免疫原決定因子がＣ１３タンパク質に担持される
   請求項（１）記載のワクチン。 （１０）免疫原決定因子がＤタンパク質に担持される請
   求項（１）記載のワクチン。 （１１）免疫原決定因子がＣ１３ショートタンパク質に
   担持される請求項（１）記載のワクチン。 （１２）免疫原決定因子がＤショートタンパク質に担持
   される請求項（１）記載のワクチン。 （１３）免疫原決定因子がΔＭタンパク質に担持される
   請求項（１）記載のワクチン。 （１４）免疫原決定因子がΔＭ＋タンパク質に担持され
   る請求項（１）記載のワクチン。（１５）ＨＡ２サブユ
   ニットの免疫原決定因子からなるＨＡタンパク質以外の
   ポリペプチド。 （１６）第２のポリペプチドに融合したＨＡ２サブユニ
   ットの免疫原決定因子を有する第１のポリペプチドから
   なる請求項（１５）記載のポリペプチド。 （１７）第１のポリペプチドが、ＨＡ２決定因子に免疫
   原配置をとらせる第２のポリペプチドに融合したＡ型イ
   ンフルエンザウイルスの１つまたはそれ以上のＨ１、Ｈ
   ２およびＨ３亜型のＨＡタンパク質のＨＡ２サブユニッ
   トの免疫原決定因子を有する請求項（１６）記載のポリ
   ペプチド。 （１８）第２のポリペプチドがＮＳ１タンパク質のＮ末
   端アミノ酸からなる請求項（１７）記載のポリペプチド
   。 （１９）第２のポリペプチドがＮＳ１のアミノ酸１〜８
   １からなる請求項（１７）記載のポリペプチド。 （２０）第２のポリペプチドがＮＳ１のアミノ酸１〜４
   ２からなる請求項（１５）記載のポリペプチド。 （２１）第１のポリペプチドが、ＨＡ２サブユニットの
   アミノ酸１〜２２２；ＨＡ２サブユニットのアミノ酸６
   ５〜２００；ＨＡ２サブユニットのアミノ酸６５〜２２
   ２；ＨＡ２サブユニットのアミノ酸６６〜２２２；ＨＡ
   ２サブユニットの６９〜２２２；ＨＡ２サブユニットの
   アミノ酸８１〜２２２；およびＨＡ２サブユニットのア
   ミノ酸１５０〜２２２からなるいずれかのペプチドを有
   する請求項（１５）記載のポリペプチド。 （２２）免疫原決定因子がＣ１３タンパク質、Ｄタンパ
   ク質、Ａタンパク質、Ｃタンパク質、ΔＤタンパク質、
   Ｄショートタンパク質、Ｃ１３ショートタンパク質、Δ
   Ｍタンパク質およびΔＭ＋タンパク質のいずれかに担持
   される請求項（１５）記載のポリペプチド。（２３）Ｃ
   １３タンパク質。 （２４）Ｄタンパク質。 （２５）Ｃ１３ショートタンパク質。 （２６）Ｄショートタンパク質。 （２７）ΔＭタンパク質。 （２８）ΔＭ＋タンパク質。 （２９）請求項（１６）、（１７）、（１８）、（１９
   ）、（２０）、（２１）、（２２）、（２３）、（２４
   ）、（２５）、（２６）、（２７）および（２８）記載
   のいずれかのポリペプチドのコーディング配列を有する
   ＤＮＡ分子。 （３０）プラスミドｐＣ１３。 （３１）プラスミドｐＤ。 （３２）プラスミドｐＣ１３ショート。 （３３）プラスミドｐＤショート。 （３４）プラスミドｐＢ４＋。 （３５）プラスミドｐＣ１３（Ｈ６５〜１９６）ΔＭＳ
   Ｈ。 （３６）プラスミドｐＣ１３（Ｈ６５〜２５００）。 （３７）請求項（２９）記載のＤＮＡ分子で形質転換さ
   れた微生物または細胞。 （３８）請求項（２９）記載のＤＮＡ分子で形質転換さ
   れたイー・コリ。