HU196131B - Process for preparing polypeptide vaccine - Google Patents
Process for preparing polypeptide vaccine Download PDFInfo
- Publication number
- HU196131B HU196131B HU853286A HU328685A HU196131B HU 196131 B HU196131 B HU 196131B HU 853286 A HU853286 A HU 853286A HU 328685 A HU328685 A HU 328685A HU 196131 B HU196131 B HU 196131B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- protein
- polypeptide
- influenza virus
- vaccine
- dna
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 34
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 32
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 32
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 27
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims abstract description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 claims abstract description 8
- 230000004224 protection Effects 0.000 claims abstract description 7
- 101710128560 Initiator protein NS1 Proteins 0.000 claims description 22
- 101710144127 Non-structural protein 1 Proteins 0.000 claims description 22
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 12
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 4
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 claims description 3
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 claims 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 abstract description 10
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 21
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 21
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 21
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 21
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 19
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 18
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 14
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 13
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 12
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 12
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 11
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 11
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 11
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 10
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 10
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 10
- 230000004044 response Effects 0.000 description 10
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 10
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 5
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 5
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 3
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 3
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 3
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 101100245267 Caenorhabditis elegans pas-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101000739160 Homo sapiens Secretoglobin family 3A member 1 Proteins 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 102100037268 Secretoglobin family 3A member 1 Human genes 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 229940009976 deoxycholate Drugs 0.000 description 2
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 108700010900 influenza virus proteins Proteins 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 101100137171 Drosophila melanogaster PolI gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000926206 Homo sapiens Putative glutathione hydrolase 3 proenzyme Proteins 0.000 description 1
- 229940124873 Influenza virus vaccine Drugs 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 229910003177 MnII Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 101150033828 NS1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 102100034060 Putative glutathione hydrolase 3 proenzyme Human genes 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010052915 acetyl-arginyl-arginyl-methionyl-tyrosyl-arginyl-arginyl-isoleucyl-tyrosyl-arginyl-argininamide Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011217 control strategy Methods 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- -1 delta 7 delta 13 Proteins 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000002480 immunoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 201000010740 swine influenza Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
A találmány tárgya eljárás olyan E. coli előállítására, amely állatokban influenzavírus fertőzés elleni védelem kiváltására alkalmas fehérje termelésére képes, valamint eljárás a fehérje és az ezt tartalmazó vakcina előállítására.
Az influenzavírus fertőzés akut légúti betegségeket okoz emberekben, sertésben, lovakban és szárnyasokban, néha járványos méretekben. Az influenzavírusok ortomixovírusok és mint ilyenek, 80-120 nanométer átmérőjű, beburkolt virionokkal rendelkeznek, két különböző glükoprotein „tüské”-vel. Három típus, A, B és C fertőzi az embereket. Az A típusú vírus felelős a humán járványok többségéért a modern történelemben, bár vannak elszórt kitörései a B típusú fertőzéseknek is. Az ismert sertés, ló és szárnyas vírusoknak mjnd van A típusuk.
Az A típusú vírusok hemagglutinin (HA) és neuramidináz (NA) felületi glikoproteinjeikre alapozott antigén-tulajdonságaik alapján három altípusra oszlanak. Az A típuson belül a Hl altípus (sertés-influenza), H2 (ázsiai influenza) és H3 (honkongi influenza) a túlnyomóak az emberi fertőzésekben.
A genetikai szóródás (drift) következtében, amely mintegy éves intervallumokban hat a HA és NA fehérjékben levő antigén determinánsokra, nem volt eddig lehetséges „univerzális” influenza vírus vakcinát készíteni a hagyományos elölt vagy legyengített vírusokat alkalmazva, vagyis olyan vakcinát, amely nem törzs-fajlagos. Mostanában kísérleteket folytatnak ilyen univerzális, vagy fél-univerzális vakcinák készítésére különböző törzsek keresztezésével készített több tulajdonságú törzsekből. A legutóbbi időkben az ilyen kísérletek magukban foglalják a rekombináns DNS technikákat is, ezek a kísérletek elsősorban a Hl fehérjére irányulnak.
Winter és munkatársai [Natúré, 292, 72—75 (1981)] beszámolnak egy A/PR/8/34 törzs (HlNI) HA-ját kódoló DNS szekvenciáról. Ennek a törzsnek a HA1 és HA2 alegységei aminosav- és nukleotid szekvenciáinak százalékos homológiáját összehasonlítják a H2, H3 és H7 alegységeket tartalmazó reprezentatív törzseinek nukleotid- és aminosav-szekvenciáival.
Baez és munkatársai [Nucl. Acids Rés. 8, 5845— -5857 (1980)] beszámolnak az A/PR/8/34 törzs nem-strukturális (NS) fehérjéjét kódoló DNS szekvenciáról.
Young és munkatársai az A/PR/8/34 törzsből eredő, mind a nyolc RNS szegmensből származó cDNS klónozásáról számolnak be E. coli-ban, valamint az NS1 fehérje magasszíntű kifejeződéséről számolnak be E coli-ban [az Origin of Pandemic Influenza Viruses (A járványos influenza-vírusok eredete) című kiadványban (1983), szerkesztő: W. G. Laver, kiadó: Elsevier Publishing Co., valamint Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80 6105-6109 (1983)].
Enrtage és munkatársai a 4.357.421. lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban bemutatja egy Hl influenza vírus gén kódoló szekvencia klónozását és kifejlődését, és bemutatja, hogy a HA polipeptid egy olyan antigén, amelyet vakcinaként be lehet adni.
A Morbidity and Mortality Weekly Report 33(‘9) 253—261, cikke összefoglalja a legújabb megelőzési és ellenőrzési stratégiát az influenza vírusokhoz, beleértve a dózis- és beadagolást előírásokat a HA fehéijét tartalmazó humán vakcinákhoz.
Davis és munkatársai [Gene, 21,273-284 (1983)] beszámolnak a HA-eredetű polipeptidekre adott immunválaszról egerekben.
További irodalmi helyek is számolnak be az A/PR/8/34 és más törzsek HA, NS és más influenza vírus génjeinek klónozásáról és kifejeződéséről. Ilyen irodalmi helyek közül néhányat az alábbiakban még idézni fogunk.
Az alábbiakban röviden összefoglaljuk a találmány lényegét.
A találmány egy részről egy olyan vakcina előállításával foglalkozik, amely a védekezést stimulálja állatokban influenzavírusok által okozott fertőzések ellen, ez a vakcina egy HA fehérjétől eltérő polipeptidet tartalmaz, amely rendelkezőt a HA fehéije HA2 alegységének egy immunogén determinánsával.
A találmány más részről egy polipeptid előállításával foglalkozik, amely a HA fehérjétől eltérő, és amely tartalmazza a HA2 alegység immunogén determinánsát, és amelyet a találmány szerint előállított vakcinában alkalmazni lehet,A találmány ilyen irányú megközelítésének egyik előnyös megvalósulása a Cl3nak nevezett fehéije előállítása.
A találmány megint más részről egy DNS molekula előállításával foglalkozik, amely a jelen találmány szerinti, vakcina-alapanyagként szolgáló polipeptidhez tarozó kódoló szekvenciát tartalmazza, ide beleértve az egyedülálló kódoló szekvenciát, vagy ugyanezt nagyobb molekulába beleépítve, pl. egy DNS klónozó vagy kifejeződő vektorba. A találmány keretébe tartozik azoknak a mikroorganizmusoknak vagy sejteknek az előállítása, amelyek ilyen DNS molekulákkal vannak transzformálva.
A továbbiakban részletesen ismertetjük a találmányt.
Az immunogén determinánsok gyakran nem stimulálnak immunprotektív választ. Ez, úgy hisszük, nagyrészt annak tulajdonítható, hogy a determináns a gazdaszervezet védekező rendszerében nem megfelelő konfigurációban van jelen.
Amint az alábbiakban majd bemutatjuk és teljes mértékben leírjuk, a HA fehéije HA2 alegységének immunogén determinánsa (amely tartalmazhat egy vagy több összefüggő vagy elkülönült haptént), meglepő módon, egy citotoxikus T sejt választ indukál különböző törzsek ellen az eredeti altípuson belül, így a HA2 immunogén determináns kiválthat védő immunválaszt, ha ez olyan immunogén konfigurációban van jelen, amely altípus-fajlagos és nem törzsfajlagos, így pl. a HA2 determinánst HA2 alegységet tartalmazó vakcina-polipeptidként lehet bevezetni, ahol lényegében a HA fehéije teljes HA2 alegysége egy második polipeptidhez van kapcsolva, amely lehetővé teszi az immunválaszt az immunogén determinánsba, a HA2 alegységet megfelelő konfigurációjúvá alakítva.
Előnyösen az a polipeptid, amely lehetővé teszi az ilyen immunválaszt a HA2 immunogén determinánsra, olyan aminosav-szekvenciát tartalmaz, amelyet egy rekombináns prokarióta vagy eukarióta gazdaszervezet magas szinten fejez ki, hozzákapcsolva lényegében a teljes HA2 alegység N-terminálisához. Különösen előnyös egy olyan polipeptid, amely egy influenza virus fehérjéből származik. Ez a vakcina-alapanyagul szolgáló polipeptid nem a HA fehérje, mivel az immunprotektfv válasz a HA fehérje ellen törzsfajlagosnak látszik.
Az ilyen, HA2 immunogén determinánst hordozó vakcina-polipeptid kifejeződésénél E. coli-ban előnyös, ha az a polipeptid, amely lehetővé tesz egy immun-választ a HA2 determinánsra, az NS1 influenza vírus fehéije N-terminálisa. Ennek egyik tényleges és előnyös kiviteli formája az a fehéije, amelyet itt CI3nak nevezünk. A C13 fehéije az NS1 fehéije első 81 aminosavához HA1 eredetű szerinen és argininen át hozzákapcsolva a teljes HA2 alegységgel rendelkezik.
A találmány szerinti vakcina-polipeptidet kémiai szintézis útján elő lehet állítani. Előnyös azonban az ismert rekombináns technikákkal előállítani, a polipeptidet kódoló szekvenciát hordozó DNS fregmens klónozásával és kifejeződésével E coli gazda-mikroorganizmuson belül. E. coli gazdaszervezetet nagy mennyiségű kívánt fehéije biztonságos és olcsó előállítására lehet alkalmazni.
A HA2-t, NSl-et és az influenza-vírus más fehérjéit kódoló szekvenciákat szintetikusan lehet előállítani, vagy vírus DNS-ből lehet kialakítani ismert technikákkal, vagy a rendelkezésre álló cDNS-tartalmú plazmidokból lehet előállítani. így pl. a fentebb idézett irodalmi hivatkozásokon kívül egy HA-t kódoló DNS szekvenciát az A/Japan/305/57 törzsből klónoztak, és szekvencia-analízisnek vetettek alá Gething és munkatársai, amint erről beszámoltak a következő irodalmi helyen: Natúré, 87, 201—306 (1980). Az A/NT/60/68 törzshöz tartozó HA kódoló szekvenciát klónoztak Sleigh és munkatársai, valamint Both és munkatársai, amint erről mindkét munkacsoport beszámolt a Developments in Cell Biology című kiadványban (kiadó: Elsevier Science Publishing Co. 1980), a 69—79., illetve 81—89. oldalon. Az A/WSN/33 törzshöz tartozó HA kódoló szekvenciát klónoztak Davis és munkatársai, valamint Hiti és munkatársai, amint erről a következő irodalmi helyeken beszámoltak: Gene, 10, 205—218 (1980), illetve Virology, 111, 113—124 (1981). Szárnyas pestis vírushoz tartozó HA kódoló szekvenciát klónoztak Porter és munkatársai, valamint emtage és munkatársai, amint erről mindkét munkacsoport beszámolt a Developments in Cell Biology című kiadványban (lásd fentebb), a 39—49., illetve 157—168. oldalon. Influenzavírusok, beleértve egyéb törzseket, altípusokat és típusokat, rendelkezésre állnak klinikai mintákból és a köz számára nyitott deponáló helyekről, ilyen pl. az American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, Amerikai Egyesült Államok.
A vakcina-polipeptidek klónozásához és kifejeződéséhez szolgáló rendszerek különböző mikroorganizmusokban és sejtekben, pl. E. coli-ban, Bacillus-ban, Streptomyces-ben, Saccharomyces-ben, emlősés rovarsejtekben ismertek és rendelkezésre állnak magán- és állami laboratóriumokban és letéti helyeken, és kereskedelmi eladóknál.
A találmány szerinti vakcina tartalmaz egy vagy több találmány szerinti vakcina-polipeptidet, és egy hozzá tartozó hordozót vagy hígítót. így pl. egy ilyen vakcina tartalmazhatja lényegében a teljes HA2 alegységet a különböző altípusok mindegyikéből, mindegyiket az NS1 fehéije N-terminális aminosavaihoz fuzionálva, ezek nagy mértékben konzervált állapotban vannak normál fiziológiás sóoldatban vagy más fiziológiás oldatban. Adjuváns, pl. alumínium-hidroxid, hasznosnak bizonyulhat. Egy előnyös vakcina magában foglalhat három vakcina-polipeptidet, amelyek mindegyike tartalmazza lényegében a teljes HÁ2 alegységet a Hl, H2 és H3 altípusok egyikéből, bármilyen NS1 fehéije első 80 aminosavához fuzionálva, mint a C13 fehéije esetében. Egy másik módszer szerint polivalens vakcinát lehet készíteni a találmány szerinti egy vagy több polipeptidből, kombinálva influenza vírusból vagy más patogénekből származó további immunogénekkel, mint pl. alegység- vagy polipeptid antigének vagy elölt vírusok vagy baktériumok, így olyan vakcinát állítva elő, amely védelmet stimulálhat influenza vírus ellen, valamint más támadó organizmusok vagy vírusok ellen. Az ilyen vakcinák kiszerelési technikái ismertek. így pl. a vakcina-polipeptidet, és más immunogéneket kombinált vakcinák esetében, liofilezni lehet ezt követő rehidrálás céljaira fiziológiás sóoldatban vagy más fiziológiás oldatban.
Az adagolási és beadási műveleteket a standard vakcinálási gyakorlattal összhangban lehet optimalizálni. Tipikusan a vakcinát intramuszkulárisan adjuk be, bár a beadás más útjait is lehet alkalmazni, mint pl. orális, szemen belüli vagy orron belüli beadást. Arra alapozva, amelyet más polipeptid vakcinákról ismerünk, várható, hogy egy hasznos egyszeri adagolás felnőtt embernek 1,5-150 mikrogramm, előnyösen 10-10 mikrogramm közti tartományban van. A vakcinát kezdetben késő nyáron vagy kora ősszel lehet beadni, és újabb adagot lehet beadni 2-6 héttel később, ha szükséges, vagy időszakonként is lehet beadni, mint immunitás-szintentartót, pl. minden 2—5 évben.
Az itt következő példák csak a bemutatás célját szolgálják, és nem céljuk a találmány oltalmi körének korlátozása.
1. példa pM30 plazmid
A pAPR701 plazmid egy pBR322 eredetű klónozó vektor, amely hordozza az Ml és M2 influenza vírus fehéijék kódoló területeit (A/PR/8/34). Ezt Young és munkatársai írták le a „The Origin of Pandemic Influenza Viruses” (A járványos influenzavírusok eredete) című kiadványban (szerkesztő: W. G. Laver, kiadó: Elsevier Science Publishing Co. 1983.).
A pAPR 801 plazmud pBR322 eredetű klónozó vektor, amely az NS1 kódoló területet (A/PR/8/34) hordozza. Ezt Young és munkatársai írták le a fentebb idézett munkájukban.
A pASl plazmid pBR322-eredetű kifejeződő vektor, amely tartalmazza a PL promotort, egy N hasznosító helyet (hogy csökkentse az átírási polaritási hatásokat az N fehéije jelenlétében) és a CII riboszóma kötőhelyet, beleértve a cll transzlációs iniciációs kodont, amelyet közvetlenül egy BamHI hely követ. Ezt Rosenberg és társai írták le: Methods Enzymol. 101,123-138(1983).
A pASldeltaEH plazmidot a pBR322 origó egy nem esszenciális EcoRI-HindlII területének kiiktatásával nyeljük pASl-ből. A pAPR 801 1236 bázis-, páros BamHI fragmensét, amely tartalmazza az NS1 kódoló területet a vírus eredetű 861 bázispáron be-3i lül, és a pBR 322 375 bázispáqát, beiktatjuk a pASldeltaEH BamHI helyére. Az így létrejött plazmid, a pASldeItaEH/801 autentikus NSl-et fejez ki (230 aminosav). Énnek a plazmidnak van egy Ncol helye a 81. és 82. aminosavakhoz szolgáló kodonok között, és egy Nrul helye az NS szekvenciáktól 3’ felé. A BamHI hely az 1. és 2. aminosavak között megmarad.
Egy Ml fehéije C-terminális 50 aminosavához tartozó kódoló szekvenciát hordozó 571 bázispáros fragmenst nyerünk olyan módon, hogy elhasítjuk a pAPR701-et Ncol-el és EcoR5-el. Ezt a fragmenst beiktatjuk az Ncol és Nrul helyek közé a pASldelta-ΕΗ/801-ben, a nevezett fragmensnek a plazmidból való kiiktatását követően. Az így létrejött plazmid, a pM30, egy fúziós fehérjét kódol, amely az NS1 első 81 aminosavából áll az Ml utolsó 50 aminosavához fúzionálva. Az Ncol és BamHI helyek megmaradnak.
2. példa pC13 plazmid
A pJZ 102 plazmid egy pBR322 eredetű klónozó vektor, amely teljes HA fehérjét (A/PR/8/34) kódoló területet hordozza: Ezt Young és munkatársai írták le, amint ezt az 1. példában már idéztük.
A pBglII plazmid egy pBR322 eredetű klónozó vektor, amely egy BglII linkért hordoz a pBR322-ben levő Nrul helynél.
A pJZ 102-t Mnll-el hasítjuk. BglII kapcsolókat ligálunk mindkét véghez, és a HA2-t tartalmazó fragmenst ligácíóval iktatjuk be a pBglII-be. Az 5’ csatlakozás az így létrejött pBglII/HA2 plazmidban a következő szekvenciával rendelkezik:
2 3
5’ AGATCTG TCCAGA GGT---3’
Az 1. terület a BglII kapcsolatból származik és aszparagint, valamin leucint kódol. A 2. terület HA1ből származik és szerint, valamint arginint kódol. A
3. terület HA2-ből származik, és a HA2 alegység öszszes aminosavát kódolja.
A 3’ csatlakozás szekvenciája a következő:
4 5 6
5'—ATATGCATC TGA GATTAGAATTTCA CAGATCT
A 4. terület a HA2 stop kódon. Az 5. terület a vírus eredetű nem kódoló szekvencia. A 6. terület a BglII linkerből származik.
A HA2 kódoló szekvenciát hordozó 691 bázispáros fragmenst nyerünk a pBGlII/HA2 hasításával BglII-vel. A frangmens végeit betöltjük DNS polimeráz I/DNApolI/Klenow-frangmens segítségével, és pASldeltaEH/801-be ligáljuk, amelyet előzőleg Ncol-el hasítottunk és hasonló módon Klenow-fragmenssel a végeit kitöltöttük. Az így létrejött plazmid a pCI3. Az NS1-HA2 tompa vépű elágazás szekvenciája a következő:
12 3
5' AAAATGACCATG GATCTG TCCAGA GGT 3’
A 7: terület az NS1 génből származik. Az 1., 2. és
3. területek meghatározása a fenti.
3. példa
A C13 fehérje előállítása
E. Coli N5151 gazdaszervezetet, amely egy hőmérséklet érzékeny lambda-lizogén (cI857), pC13-al transzformáljuk. A transzformánsokat 32 C hőmérsékleten növesztjük a közép-log fázisig (A260= 0,6) LB tápközegben, amely 100 jug/ml amgicillinnel van kiegészítve. A tenyészeteket ezután 42 C hőmérsékletre állítjuk be, hogy a cl-t inaktiváljuk, és így inkdukáljuk a Cl3 fehérje szintézisét. 2 óra múlva 42 °C hőmérsékleten a baktériumokat centrifugálással összegyűjtjük (3500 fordulat/perc, 20 perc) és a bakteriális üledéket —20 °C hőmérsékleten fagyasztjuk.
Az üledéket felengedtetjük és újra szuszpendáljuk. A pufferban (50 mmól/íiter trisz -HC1, pH 8,0; 2 mmól/liter EDTA, 1 mmól/liter ditiotreitol, 5% térf./térf./glicerin). Lizozimot adunk hozzá 0,2 mg/ml végső koncentrációban, és a keveréket jégen inkubáljuk 20 percen át. A keveréket azután Waring blender keverőben kezeljük nagy sebességgel, hatszor 15 másodperces lökéseket alkalmazva. A szuszpenziót azután 1 percig ultrahanggal kezeljük Branson-szonda ultrahangos készülékkel. A keveréket ezután centrifugáljuk (15000 ford/perc, 30 perc).
Az üledéket újra szuszpendáljuk A pufferban ultrahangos kezelés közben (4 x 15 másodperces lökések). A keveréket azután 0,1%-osra állítjuk be dezoxikolátra, és egy óra hosszat kevertetjük 4 °C hőmérsékleten. A keveréket centrifugáljuk (15000 ford/perc, 30 perc), és a fehérjét üledékbe visszük. A dezoxikolátos kezelést megismételjük és az így létrejött üledéket újra szuszpendáljuk A pufferben, ultrahangos kezelés közben. A szuszpenziót 1%-ossá tesszük Triton X-100-ra, és egy óra hosszat kevertetjük 4 °C hőmérsékleten. A keveréket újra centrifugáljuk (15000 ford/perc, 30 perc), és a fehéqe-üledéket összegyűjtjük. A fehérjét ultrahangos kezeléssel újra szuszpendáljuk és a fehérjét karbamid-oldattal (4 mól/liter végső koncentráció) szolubilizáljuk. Ezt az oldatot centrifugáljuk', hogy eltávolítsunk mindenféle darabos anyagot (15000 ford/perc, 30 perc), és a felülúszót összegyűjtjük és dializáljuk háromszor 10 mmól/liter trisz-HCl-t és 1 mmól/liter EDTA-t tartalmazó oldattal (pH 7,5) szemben, hogy a karbamidot eltávolítsuk. A fehérje-oldatot ismét centrifugáljuk, hogy eltávolítsunk minden darabos anyagot (15000 ford/perc, 30 perc), és a felülúszót, amely a C13 fehérjét tartalmazza, összegyűjtjük és a vizsgálatokhoz használjuk fel..
4. példa T sejt mérés . A C13 fehérjének azt a képességét, hogy citotoxikus T sejt választ indukál in vitro mérésben, összehasonlítjuk más, szintén A/PR/8/34 eredetű fehérjék képességével. A többi fehérjéket a következőképpen azonosítjuk:
C7 teljes HA)
Delta 7 (Hal és HA2-nek 80 N terminális
Delta 13 Az NS1 -nek 80 N-terminális gyöké és
196.131 a HA2 80 N-terminális gyöke)
NS1 (NS1)
NS2 (NS2)
M30 (NS1 és M) (lásd 1. példa).
Ezek mindegyikéhez tartozó kódoló szekvenciákat tartalmazó molekulák úgy származnak, ahogyan ezt Young és munkatársai leírták az „Origin of Pandemic Influenza Viruses” (A járványos influenza vírusok eredete) című kiadványban (szerkesztő: W. G. Laver, kiadó Elsevier Science Publishing Co.), és pASldeltaEH-ban fejeződnek ki, lényegében úgy, ahogy fentebb leírtuk, azzal a különbséggel, hogy a bakteriális üledék újra szuszpendálását, a lizozimos kezelést, ultrahangos kezelést és centrifugálást követően az NS1 fehéijét a felülúszó tartalmazza.
A felülúszót MgCl2-re 100 mmól/literessé tesszük és egy órán át kevertetjük 4°C hőmérsékleten. Az oldatot ezután centrifugáljuk (15000 ford/perc, 30 perc), hogy az NSl-et üledékbe vigyük. Az üledéket újra szuszpendáljuk A pufferban és ismét 100 mmól/ /literre állítjuk be MgCl-re, hogy újra kicsapjuk az NS1 fehéijét. Újabb centrifugálást követően az üledéket megint szuszpendáljuk a pufferban és háromszor dializáljuk 1—1 liter oldat ellen, amely 10 mmól/liter trisz-HCl-t és 1 mmól/liter Edta-t tartalmaz. Az oldatot ezután újra centrifugáljuk, hogy minden szilárd anyagot eltávoIrtsunk, és az NS1 fehérjét tartalmazó felülúszót összegyűjtjük és méréshez használjuk.
A citotoxikus T sejt vizsgálatát lényegében a következőképpen végezzük. Lépsejteket izolálunk vírus-immunizált és nem-immunizált egerekből és ín vitro tenyésztjük. A sejteket csoportokra osztjuk és különböző antigéneknek tesszük ki 90 percig in vitro. Az antigéneket ezután eltávolítjuk a sejtek ismételt mosásával, és a sejteket ezután 5 napig tenyésztjük, hogy lehetővé tegyük a stimulált populációk kiterjedését. A stimulált sejteket, vagyis effektor sejteket, vírussal fertőzött és nem fertőzött P815 célsejtekkel keveijük, amelyeket előkezeltünk 51Cr-el. Az 51Cr szignifikáns kibocsátása a tenyésztő tápközegbe jelzi a n szekunder citotoxikus T sejtek (2° CTL) jelenlétét, ' U amelyek az antigénnel történt in vitro stimulálás során jöttek létre. Az elölés fajlagosságát két úton vizsgáljuk: (1) különböző antigénekkel fertőzött célsejteket vizsgálunk elölésre, és (2) lépsejteket izolálunk egerekből, amelyeket előzőleg különböző vírusokkal jg immunizáltunk. A vizsgálat linearitását is vizsgáljuk, különböző célsejt: effektor sejt hányadosokat alkalmazva, és különböző mennyiségű antigéneket alkalmazva, amint ezeket a következő táblázatokban jelezzük, amelyek bemutatás céljaira szolgáló eredményeket tartalmazzák. Az eredmények listája az alábbiak20 bán két effektor: célsejt hányadost (30:1 és 10:1) mutat be.
A táblázatokban levő eredmények a tápközegbe kibocsátott 51 Cr százalékában vannak kifejezve, összehasonlítva az összes sejtben levő 51 Cr menynyiségével, amint ezt a sejtek detergens szolubilizá25 lásával meghatározzuk. A szignifikánsan pozitív eredményeket bekeretezve adjuk meg. A alkalmazott vírusok a következők:
A/PR/8/34 (HIN1)
A/Port Chalmers/174 (H3N2) or A/Brazil/178 (H2N1)
A/Singapore/157 (H2N2) vizsgálatokhoz („PR8”) („A/PC) („A/B2”) (,Λ/Sing”)
1, Táblázat
2° CT1 válasz stimulálása E. coh eredetű polipeptidek által
A 2° stimuláláshoz | PR8 | - P815 | Nem fertőzött | -P815 |
használt antigén | 30 | 10 | 30 | 10 |
PR8 | 36,0 | 27,2 | 0,2 | - 5,2 |
C13 24 ug/ml | 10,7 | 10,7 | 0,5 | -4,4 |
12 pg/ml | 10,6 | 8,1 | 0,5 | -3,6 |
6 Ug/ml | 9,5 | 4,4 | 1,4 | -4,1 |
NS2 24 ug/ml | 0,4 | 2,8 | -4,0 | -2,7 |
12 ug/ml | 1,8 | . - 1,5 | 0,2 | -4,1 |
6 Ug/ml | 0,5 | - 0,2 | -0,3 | -5,2 |
N30 24 ug/ml | 1,0 | 3,9 | - 1,6 | - 3,3 |
12 ug/ml | 1,8 | - 1,2 | -1,9 | 1,1 |
6 ug/ml | 5,7 | - 1,5 | -3,6 | -6,2 |
Semmi - | 2,7 | - 4,1 | -4,7 | -4,0 |
196.131
2. Táblázat
2° CT1 válasz stimulálása E. coli eredetű polipeptidek által*
A 2° stimulánshoz | PR8 - | P815 | Népi fertőzött | -P815 |
használt antigén | 30 | 10 | 30 | 10 |
PR8** | I 60.5 | ZÜÖ | 6,7 | 2,6 |
NSj ' | - 5,2 | - 8,7 | 4,3 | 0,0 |
C13 | OIíU | - 1,1 | 0,5 | -0,5 |
Δ13 | - 8,6 | - 10,1 | - 1,3 | 0,0 |
Δ7 | - 3,2 | - 7,4 | 2,9 | -0,9 |
Semmi | - 5,4 | - 2,0 | 1,9 | 3,2 |
*PR8-al immunizált egerekből kivett lépsejteket stimulálunk in vitro az antigénekkel (5 Mg/ml) **PR8-al fertőzött szingenetikus lépsejtek
3. Táblázat
C13 polipeptiddel stimulált CT1 vfrus-fajlagossága
Effektor | PR8 | - P815 | A/PC | - P815 | Nem -P815 fertőzött |
1°* 2° | 30 | 10 | 30 | 10 | 30 10 |
PR8 PR8
A/PC
C13 24 Mg/ml 12 Mg/ml
Mg/ml
A/PC PR8
A/PC
CÍ3 24 Mg/ml 12 Mg/ml 6 Mg/ml
W | 72,8 | |
77.9 | tffi- 3,9 1,2 72.9 | -24,2, |
_1LO_ SJL 96.0 | 0,4 2,4 2,3 74,3 1 | |
92.3 1 75.6 | 85,1 i | |
6,7 1,0 4,6 - 1,2 5,2 1,5 - | 4,3 1,2 - 0,2 |
155,8 | 4,1 | 0,2 |
2,3 | 2,1 | |
- 0,7 | 1,7 | 1,3 |
- 2,4 | 4,4 | -1,4 |
2,3 | 0,8 | 0,4 |
57.5 | 9,8 | 1,8 |
80,0 | 10,2 | 3,8 |
- 5,0 | 2,6 | 0,2 |
- 3,7 | 2,4 | -0,3 |
- 6,3 | 3,1 | -1,5 |
*A lépsejteket olyan egerekből izoláljuk, amelyeket előzőleg immunizáltunk a jelzett vírusokkal.
4. Táblázat
A C13 polipeptid által stimulált Te vírus-fajlagossága
Effektor A/PR/8/H1N1 A/BZ A/SING AjPC Nem fertőzött
1° | 2° | 30 | 10 | 30 | 10 | 30 | 10 | 30 | 10 | 30 | 10 | |
PR8 | PR8 | 76,5 | 77,0 | 82,8 | 75,5 | . 30,6 | 17,8 | 92,8 | 79,01 | 8,4 | 3,0 | |
C13 | 48 Mg/ml | 60,9 | 42,6 | 65,5 | 41,3 | 5,8 ’ | ö'Ö ' | 5,7 | 7,5 | 4,1 | 3,0 | |
' 24 Mg/ml | 70,1 | 46,5 | 63,5 | 46,2 | 9,5 | 5,6 | 9,2 | 9,3 | 8,8 | 0,6 | ||
12 Mg/ml | 50,7 | 24,0 | 45,0 | 18,4 | 2,0 | 4,4 | 10,3 | 8,5 | 2,0 | 1,1 | ||
Semmi | PR8 | 10,6 | - 0,8 | 14,0 | 16,3 | 15,3 | 6,7 | 13,2 | 5,6 | 2,0 | 1,5 | |
C13 | 48 Mg/ml - | 0,8 | - 0,6' | 8,4 | 3,6 | 4,6 | 3,7 | 2,5 | 2,3 | 2,3 | -2,9 | |
24 Mg/ml | 0,7 | 0,3 | 7,6 | 7,3 | ' 5,2 | 6,7 | 4,8 | 4,6 | 5,1- | - 2,0 | ||
12 Mg/ml | 1,8 | - 0,9 | 10,9 | 2,9 | 3,6 | 2,5 | 4,9 | 2,9 | 5,1 | 8,3 |
196.131
Amint a fentebbi táblázatokban jeleztük a Cl3 egy szekunder citotoxikus T sejt választ indukál immunizált lépsejteket alkalmazva olyan egerekből, 5 amelyeket korábban szubletális dózisú PR8 vírussal fertőztünk. Az összes többi peptid-származék, amelyet tanulmányoztunk, beleértve az NS1, delta 7, delta 13, M30, NS2 és C36 peptid-származékokat, nem indukálnak ilyen választ, mivel adott hemaggluti- 1 _ nin-szerkezettel rendelkeznek. A C13 pepiidre adott válasz dózis-függő és az 5- jug/ml-tői a 24 pg/ml-ig terjedő szint indukál szekunder citotoxikus T sejt választ.
A megfigyelt válaszok vírus-fajlagossága feltűnő annyiban, hogy a Cl3 stimulálja az előzőleg H1N1 vi- -j g russal fertőzött egerekből származó immunizált lépsejteket, de nem stimulálja az előzőleg H3N2 vírussal (A/PC) fertőzött egerekből származó lépsejteket.
Ez nem hasonló az altípus kereszt-reaktív citotoxikus T limfocita válaszokhoz, amelyeket akkor figyelhetünk meg, amikor azonos lépsejteket stimulálunk élő 20 vírussal, legalábbis részben a kereszt-reaktív belső antigének következtében. Ezen kívül a Cl 3 által történő stimulálás kereszt-reaktív a HINl alcsoportban levő vírus-törzsek között, a C13 által stimulált PR8-immunizált lépsejtek képesek felismerni és elpusztítani a PR8-al (H1N1 törzs 1934-ből) fertőzött 25 célsejteket éppen úgy, mint az A/Brazillal (Hl NI törzs 1978-ból) fertőzött célsejteket 12 pg és 48 pg közti dózistartományban és nagy mértékű citotoxikus aktivitásnál.
A lényegesebb adatokra alapozva kimutatjuk, «« hogy a citotoxikus T limfociták, úgy tűnik, hozzájárulnak az influenza vírus fertőzésből való kigyógyuláshoz egér-rendszerekben, és ilyen limfocita válaszokat ki lehet mutatni mind immunizált egerekben, mind emberekben [lásd Ennís és munkatársai: Microbiology, 427—430 (1984), Amer. Soc. Micro- 35 biology)], a Cl3 fehérjének az a képessége, hogy ilyen citotoxikus T sejt választ indukál több törzsnél is, jelzi hasznosságát, és a HA2 immunogén determináns hasznosságát, hogy olyan immunválaszt indukáljon, amely ellenállhat az influenza-vírus fertőzésnek, a válasz félig univerzális annyiban, hogy az 40 altípus-fajlagos, de nem törzs-fajlagos.
A találmányt és előnyös kiviteli módjait a fentiekben feltártuk. A találmány azonban nem korlátozódik csak az itt feltárt speciális kiviteli módokra. Ez felöleli az Összes változatot és módosulatot, amely az itt következő igénypontok keretén belül van.
Claims (6)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás olyan E. coli előállítására, amely állatokban influenzavírus fertőzés elleni védelem fokozására alkalmas polipeptid termelésére képes, azzal jellemezve, hogyi) két DNS szekvenciát ligálunk, amelyek közül az első az influenzavírus HA fehérjéje HA2 alegységének egészére vagy egy részére vonatkozó szekvenciát kódol, de nem kódolja a teljes HA fehérjét, míg a második DNS szekvencia az NS1 fehérje N-terminális aminsavait kódolja, majd ii) a DNS szekvenciát ligálással beiktatjuk egy DNS vektorba, majd iii) a kapott vektort E. coli gazda-mikroorganizmusba transzformáljuk.
- 2. Az 1, igénypont i) lépése szerinti eljárás, a zzal jellemezve, hogy másodikként olyan DNS szekvenciát alkalmazunk, amely az NS1 fehérje 80 N-terminális aminosavát kódolja, és a két DNS szekvenciát úgy ligáljuk, hogy az általuk kódolt polipeptid N-terminálisa az NS1 szekvencia szerinti.
- 3. A 2, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemez v e, hogy a HA2 alegységet vagy részletét az A típusú influenzavírus Hl, H2 vagy H3 altípusából származtatjuk.
- 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vektorként PC13 pjazmiddal transzformálunk.
- 5. Eljárás állatok influenzavírus fertőzéssel szembeni védekezését fokozó polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1—4. igénypontok bármelyike szerint kapott E. coli transzformánst megfelelő tápközegben tenyésztjük és a kapott polipeptidet a tápközegből elkülönítjük.
- 6. Eljárás állatok influenzavírus fertőzéssel szembeni védekezését fokozó vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy az 5. igénypont szerint előállított polipeptidet segédanyaggal keverjük össze.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US64573284A | 1984-08-30 | 1984-08-30 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HUT39362A HUT39362A (en) | 1986-09-29 |
HU196131B true HU196131B (en) | 1988-10-28 |
Family
ID=24590246
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU853286A HU196131B (en) | 1984-08-30 | 1985-08-29 | Process for preparing polypeptide vaccine |
Country Status (20)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0176493B1 (hu) |
JP (1) | JPS6169731A (hu) |
KR (1) | KR860001882A (hu) |
AR (1) | AR241713A1 (hu) |
AT (1) | ATE63462T1 (hu) |
AU (1) | AU592954B2 (hu) |
DE (1) | DE3582843D1 (hu) |
DK (1) | DK389085A (hu) |
ES (1) | ES8800358A1 (hu) |
FI (1) | FI85811C (hu) |
GR (1) | GR852079B (hu) |
HU (1) | HU196131B (hu) |
IE (1) | IE58488B1 (hu) |
IL (1) | IL76236A0 (hu) |
NO (1) | NO169819C (hu) |
NZ (1) | NZ213249A (hu) |
PH (1) | PH27147A (hu) |
PT (1) | PT81061B (hu) |
ZA (1) | ZA856467B (hu) |
ZW (1) | ZW13485A1 (hu) |
Families Citing this family (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4803072A (en) * | 1986-09-10 | 1989-02-07 | Smithkline Beckman Corporation | Immunomodulation |
NZ219515A (en) | 1987-02-10 | 1989-09-27 | Wellcome Found | Fusion proteins comprising influenza virus ha and a nonnatural antigenic epitope |
ZA896625B (en) * | 1988-08-31 | 1990-09-26 | Smithkline Beecham Corp | Vaccinal polypeptides |
AU640348B2 (en) * | 1988-08-31 | 1993-08-26 | Smithkline Beecham Corporation | Vaccinal Polypeptides |
DK425789A (da) * | 1988-08-31 | 1990-03-01 | Smithkline Beecham Corp | Vaccinale polypeptider |
US5766601A (en) * | 1990-08-08 | 1998-06-16 | University Of Massachusetts Medical Center | Cross-reactive influenza a immunization |
EP0542895B1 (en) * | 1990-08-08 | 1996-11-20 | University Of Massachusetts Medical Center | Cross-reactive influenza a immunization |
WO1994022917A1 (en) * | 1993-04-05 | 1994-10-13 | University Of Massachusetts Medical Center | Cross-reactive influenza a immunization |
HU228467B1 (en) | 1998-02-05 | 2013-03-28 | Smithkline Beecham Biolog | Tumor-associated antigen derivatives from the mage family, and nucleic acid sequences encoding them, used for the preparation of fusion proteins and of compositions for vaccination |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4357421A (en) | 1979-04-02 | 1982-11-02 | G. D. Searle & Co. | Synthetic gene coding for influenza hemagglutinin |
IL61904A (en) * | 1981-01-13 | 1985-07-31 | Yeda Res & Dev | Synthetic vaccine against influenza virus infections comprising a synthetic peptide and process for producing same |
ZA836080B (en) * | 1982-08-23 | 1984-04-25 | Scripps Clinic Res | Broad spectrum influenza antisera |
CA1340372C (en) * | 1984-07-09 | 1999-02-02 | John D. Clements | Production of e. coli lt-b enterotoxin subunit |
-
1985
- 1985-08-08 AR AR85301435A patent/AR241713A1/es active
- 1985-08-20 ZW ZW134/85A patent/ZW13485A1/xx unknown
- 1985-08-26 ZA ZA856467A patent/ZA856467B/xx unknown
- 1985-08-26 PH PH32694A patent/PH27147A/en unknown
- 1985-08-27 AU AU46685/85A patent/AU592954B2/en not_active Ceased
- 1985-08-27 DK DK389085A patent/DK389085A/da not_active Application Discontinuation
- 1985-08-27 NZ NZ213249A patent/NZ213249A/xx unknown
- 1985-08-27 IE IE210385A patent/IE58488B1/en not_active IP Right Cessation
- 1985-08-28 EP EP85870120A patent/EP0176493B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-08-28 IL IL76236A patent/IL76236A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1985-08-28 GR GR852079A patent/GR852079B/el unknown
- 1985-08-28 AT AT85870120T patent/ATE63462T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-08-28 DE DE8585870120T patent/DE3582843D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1985-08-29 FI FI853320A patent/FI85811C/fi not_active IP Right Cessation
- 1985-08-29 HU HU853286A patent/HU196131B/hu not_active IP Right Cessation
- 1985-08-29 ES ES546530A patent/ES8800358A1/es not_active Expired
- 1985-08-29 NO NO853400A patent/NO169819C/no unknown
- 1985-08-30 KR KR1019850006284A patent/KR860001882A/ko not_active Application Discontinuation
- 1985-08-30 JP JP60193013A patent/JPS6169731A/ja active Pending
- 1985-08-30 PT PT81061A patent/PT81061B/pt not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU4668585A (en) | 1986-03-06 |
IE58488B1 (en) | 1993-09-22 |
FI853320L (fi) | 1986-03-01 |
FI85811C (fi) | 1992-06-10 |
ZA856467B (en) | 1986-07-30 |
DK389085D0 (da) | 1985-08-27 |
GR852079B (hu) | 1985-12-23 |
NO169819B (no) | 1992-05-04 |
HUT39362A (en) | 1986-09-29 |
EP0176493B1 (en) | 1991-05-15 |
NO169819C (no) | 1992-08-12 |
FI85811B (fi) | 1992-02-28 |
DK389085A (da) | 1986-03-01 |
ATE63462T1 (de) | 1991-06-15 |
IL76236A0 (en) | 1986-01-31 |
AU592954B2 (en) | 1990-02-01 |
KR860001882A (ko) | 1986-03-24 |
ES8800358A1 (es) | 1987-11-01 |
PH27147A (en) | 1993-04-02 |
ZW13485A1 (en) | 1985-11-20 |
IE852103L (en) | 1986-02-28 |
PT81061B (pt) | 1987-11-11 |
DE3582843D1 (de) | 1991-06-20 |
PT81061A (en) | 1985-09-01 |
AR241713A1 (es) | 1992-11-30 |
EP0176493A1 (en) | 1986-04-02 |
NZ213249A (en) | 1989-03-29 |
ES546530A0 (es) | 1987-11-01 |
FI853320A0 (fi) | 1985-08-29 |
JPS6169731A (ja) | 1986-04-10 |
NO853400L (no) | 1986-03-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Jegerlehner et al. | A molecular assembly system that renders antigens of choice highly repetitive for induction of protective B cell responses | |
Sui et al. | Cross-protection against influenza virus infection by intranasal administration of M2-based vaccine with chitosan as an adjuvant | |
US6793928B1 (en) | Vaccines with an LTB adjuvant | |
CN113186173B (zh) | 一种基于减毒流感病毒载体的新型冠状病毒肺炎疫苗 | |
US6558673B1 (en) | Complexes of immunogens derived from RSV surface glycoprotein G covalently coupled to a support molecule | |
Ramirez et al. | A virus-like particle vaccine candidate for influenza A virus based on multiple conserved antigens presented on hepatitis B tandem core particles | |
US10400013B2 (en) | Fusion polypeptide for immuno-enhancement and method for enhancing stimulation of immune response using the same | |
CN115998856A (zh) | 一种新冠流感免疫原性组合物及其制备方法和应用 | |
HU196131B (en) | Process for preparing polypeptide vaccine | |
WO1993015763A1 (en) | Vaccinal polypeptides | |
EP0366238A2 (en) | Influenza vaccinal polypeptides | |
KR20150036685A (ko) | 약독화된 돼지 인플루엔자 백신 및 이의 제조 방법 및 용도 | |
WO2022085648A1 (ja) | 融合タンパク質及びワクチン | |
KR20120131725A (ko) | 고병원성 조류인플루엔자 a h5n1 바이러스 유사입자 및 이를 이용한 가금용 백신 | |
AU640348B2 (en) | Vaccinal Polypeptides | |
Hajam et al. | Intranasally administered polyethylenimine adjuvanted influenza M2 ectodomain induces partial protection against H9N2 influenza A virus infection in chickens | |
WO1994006468A1 (en) | Recombinant influenza virus vaccine compositions | |
CN113248576A (zh) | 一种针对冠状病毒的核酸疫苗及其制备方法 | |
US11826421B2 (en) | Bacteriophage-based vaccines and engineered bacteriophage | |
RU2757013C2 (ru) | Рекомбинантная противогриппозная вакцина с широким спектром защиты и способ ее получения | |
JP2005170945A (ja) | インフルエンザ血球凝集素多価ワクチンの製造方法 | |
RU2451027C2 (ru) | Рекомбинантная вакцина против вируса "свиного" гриппа h1n1 и спсоб ее получения | |
Ben-Yedidia et al. | Synthetic peptide-based vaccines against influenza | |
Ben-Yedidia | A peptide-based vaccine against influenza | |
JPH03130082A (ja) | ワクチン用ポリペプチド |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
HU90 | Patent valid on 900628 | ||
HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |