KR0170033B1

KR0170033B1 - 독감백신용 재조합 독감 바이러스

Info

Publication number: KR0170033B1
Application number: KR1019950035523A
Authority: KR
Inventors: 이광희; 성백린; 김종설
Original assignee: 김용구; 주식회사한일합섬
Priority date: 1995-10-14
Filing date: 1995-10-14
Publication date: 1999-02-01
Also published as: KR970020118A

Abstract

본 발명은 독감 바이러스의 뉴라미니다제 게놈의 3' 말단부위의 염기를 변이시킨 재조합 독감바이러스 및 그의 제조방법 그리고 독감백신으로서의 용도에 관한 것이다.

Description

독감 백신용 재조합 독감 바이러스

제1도는 독감 바이러스 RNA 게놈의 팬 핸들(pan handle) 구조를 나타낸다.

제2도는 역유전학적인 방법에 의한 재조합 바이러스의 제조과정을 나타낸다.

재3도는 HTWN-U4 바이러스의 변이된 염기서열을 확인한 염기서열 분석 사진이다.

: 야생형 NA ;: 재조합 NA

제4도는 본 발명에서 실시한 RNase 보호 분석방법(RNase protection assay)의 모식도이다.

제5도는 독감 바이러스의 vRNA, mRNA, cRNA의 구조적 차이점을 나타낸 것이다.

제6도는 RNase 보호분석한 결과의 사진이다.

제7도는 vRNA, mRNA, cRNA의 발현 양상을 나타낸 도표이다.

제8도는 WSN 야생형과 HTWN-U4 변이 바이러스의 뉴라미니다제 활성을 조사한 그래프이다.

본 발명은 독감바이러스 게놈의 염기서열 일부를 변이시켜 면역원성을 증대시킨 독감백신용 재조합 독감 바이러스 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

다시말하면, 본 발명은 독감 바이러스의 표면항원인 뉴라미니다제 게놈의 3' 말단부위의 염기서열을 변이시킨 독감백신용 재조합 독감바이러스 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

독감은 전 세계적으로 가장 많은 지역에서 발생하며 어떤지역에서는 거의 매년 발병하여 경제, 사회, 교육적으로 많은 피해를 주는 질환이다. 독감 바이러스는 A, B, C형이 있으며, 그중 가장 빈번하고 광범위하게 피해를 주는 것은 A형으로, 젊고 건강한 성인에서는 비교적 짧고 약하게 증상이 나타나지만 어린이 및 노약자에게는 치명적 질환이 될 수 있다. 독감자체는 치사율이 비교적 적은 질환이지만, 어린아이에게는 후두염이나 폐렴등의 합병증을 유발시켜 치사율을 증가시키며 심폐질환을 가지고 있는 노인들에게는 폐렴등을 유발시켜 사망에 이르게 하기도 한다.(Barker and Mullooly 의 1980 Am. J. Epidemiol. 112 : 798 ; Barker and Mullooly의 1982 Arch. Intern. Med. 142 : 85 ; Kim 등의 1979 Am. J. Epidemiol. 109 : 464).

이와같은 독감은 발병율이 높으며, 범세계적으로 그 피해가 심각함에도 불구하고, 독감 예방에 사용되는 독감백신은 그 사용이 가장 기피되고 있는 백신중의 하나이다.

이는 독감바이러스의 변이가 심하여 면역효과가 불완전하고 지속기간이 짧아서 그때마다 새로운 변이주에 대한 백신을 제조하여야 한다는 문제가 있고, 또한 독감 예방을 위해 현재 사용되고 있는 독감백신은 사백신(killed vaccine)이기 때문에 주사제로 투여하므로 환자들이 기피하는 경향이 있으며, 바이러스를 죽여서 불활성화 시킨 후 정제과정을 거치게 되므로 생산단가가 높기 때문이다.

항체중 IgA는 바이러스의 침입 경로인 기관지 점막에서 분비되는 분비항체(secreted ontibody)로서 호흡기 계통 바이러스에 대한 저항에 가장 중요한 항체이며, 독감백신은 이러한 IgA을 많이 유도시킬 수록 백신으로서 효과가 좋은 것이다.

사백신을 투여하는 경우에는 사백신은 주사로 혈관으로 투여되기 때문에 항체중 IgM 및 IgG등의 순환항체는 많이 생산되나 IgA와 같은 분비항체는 적정 수준으로 분비되지 않는다.

이에 비하여 생백신은 비강으로 투여되므로 직접 기관지 점막을 자극하여 자연적인 독감에 감염되었을 경우와 동일한 형태의 면역이 유도되어 분비항체인 IgA가 적정수준으로 분비되므로 백신의 효과를 최대로 증진시킬 수 있다.

또한 살아있는 바이러스 자체를 직접 사용하므로 사백신의 경우와 같이 바이러스를 불활성화 시키는 과정에서 야기되는 항원의 변형에 의한 면역효과의 감소가 없고, 면역의 지속기간이 길고, 항원 단백질의 분리정제 과정이 필요치 않으므로 생산 공정이 간단하여 생산단가를 절감시킬 수 있다.

상기와 같은 장점을 가지는 생백신을 제조하기 위하여 종래에는 자연적으로 일어나는 돌연변이체 중 약독화된 바이러스를 선택해서 사용하는 방법이 이용되어 왔다.

자연돌연변이에 의한 약독화 바이러스를 제조하는 방법에는 다음과 같은 방법이 있다.

다른 동물에서는 잘 자라지만 사람에게서는 생장이 억제된 숙주 변이주(host-range mutant)를 선별하고, 체온인 37℃에서 생장이 억제되는 온도감수성 변이주(temperature sensitive mutant)를 선별한다.

이것을 동물 세포주나 수정란에서 25℃의 저온으로 계속 계대 배양하여 체온(37℃)에서는 생장이 억제되고 저온에서는 생장이 좋은 바이러스를 선별한다(Snyder M.H.등의 1986 J. Infect. Dis. 154; 709; Clement, M.L. 등의 1984 Lancet i; 705; Cox등의 1988 Virology 167: 554).

그런데 독감바이러스는 RNA바이러스이기 때문에 에피토프부분에 변이가 광범위하게 일어날 수 있어서 백신을 만들기 위해서는 이에 따른 다양한 변이주를 제조하여야 하나, 자연적 돌연변이를 이용하는 방법으로는 다양한 변이주를 제공하는데 한계가 있다.

이에 역유전학적 방법을 이용하여 인공적으로 유전자를 변이시켜 약독화된 다양한 바이러스를 제공하는 방법이 연구되었다. 역유전학적 방법은 게놈에 돌연변이를 유발시키고 이것이 생물체의 표현형(phenotype)에 미치는 영향을 보는 방법이다.

즉 시험관내에서 독감 바이러스 유전자에 원하는 돌연변이를 일으킨 후 이 유전자를 트랜스펙션(transfection) 시켜 약독화된 변이 독감바이러스를 만드는 것이다(Enami 등의 P.N.A.S. 87: 3802, 1990).

독감바이러스의 음성게놈(negative sense genome)자체는 감염성(infectivity)이 없으며, 독감바이러스 특이적인 RNA의존성 중합요소(influenza virus specific RNA polymerase)와의 RNP복합체 형태로만 감염성이 있는데, 최근에야 RNP복합체를 만드는 기술과 트랜스펙션(transfection)방법이 개발되었고, 비로소 역유전학적 방법에 의해 새로운 표현형을 갖는 독감바이러스의 생산이 가능하게 되었다.

RNP는 리보뉴클레오단백질(ribonucleoprotein)로서 RNA, 중합효소인 PB2, PB1, PA 그리고 NP(nucleprotein)으로 이루어진 복합체로서, 역유전학적 방법에서는 이들 효소의 질이 성공을 좌우하는데 활성이 뛰어난 것은 독감바이러스의 효소를 마이로코컬 뉴클레아제(micrococcal nuclease)로 처리하여 만드는 방법이 가장 좋다(Seong, B.L. 그리고 G.G. Brownlee의 1992 Virology 186, 247-260).

독감바이러스는 8개의 분리된 RNA 게놈을 가지고 있으며 현재의 역유전학적인 방법으로는 이들 8개의 게놈을 마음대로 바꿀수는 없으며, 이용이 가능한 대표적인 게놈이 표면 당단백질의 하나인 뉴라미니다제(Neuraminidase, 이하 NA라고 약칭함)이다(Enami 등의 1990 P.N.A.S. 87 : 3802). 뉴라미니다제(NA)를 역유전학적인 방법으로 이용하는 원리는 다음과 같다.

WSN-HK 바이러스는 8개의 RNA게놈중 NA 유전자는 A/HK/8/68 바이러스에서 유래되었고 나머지 7개의 게놈은 WSN 바이러스에서 유래된 재조합 바이러스로써, WSN 바이러스는 프로테아제(protease) 없이도 MDBK(Madin Darby Bovine Kidney) 세포주에서 플라그를 형성할 수 있으나, 재조합된 WSN-HK 바이러스는 MDBK 동물세포주에서 프로테아제 존재하에서만 플라그(plaque)를 형성할 수 있다.

시험관 내에서 WSN 바이러스의 NA 유전자(cDNA)에 인위적인 변이를 유발시킨후 한 튜브에 마이크로코컬 뉴클레아제를 처리한 독감바이러스 핵단백질(PB1, PB2, pA, NP)을 넣고 T₃또는 T₇RNA 폴리머라아제로 전사시켜 RNA와 RNP로부터 RNP복합체를 만든다.

MDBK 세포주에 DEAE-dextran 방법으로 RNP 복합체를 트랜스펙션시킨 다음 WSN-HK 바이러스를 헬퍼(helper)로써 감염시켜 일정시간 배양한 후에 상등액을 취해 프로테아제가 없는 배지에서 배양하여, 콜로니를 선택하여 WSN의 NA 유전자가 WSN-HK의 NA 유전자와 교체된 재조합 바이러스를 얻는다.

독감 바이러스의 백신을 제조함에 있어서 문제가 되는 것은 독감 바이러스는 RNA 바이러스로서 DNA 바이러스와는 달리 RNA 바이러스는 변이가 심하다는 것이다.

독감 바이러스의 단백질중 헤마글루티닌(Hemagglutinin; 이하 HA라고 약칭함)과 뉴라미니다아제(NA)가 표면 항원으로 작용하는데 이들은 주로 점 돌연변이(point mutatin)의 누적에 의해서 항원에 변화를 일으켜 새로이 발병하게 된다.

약독화 바이러스는 어떠한 방법으로 제조 되었는지 그 특성을 안정적으로 유지하는 것이 중요하다. 그러나 상기와 같이 RNA 바이러스의 특성인 변이가 쉽게 일어난다는 점 때문에 안정한 상태를 유지하는 약독화 바이러스를 얻기는 쉽지가 않다. 이에 본 발명자들은 8개의 게놈전체에 약독화에 관련된 변이가 많이 축적되어 있을 수록 야생형으로 회복될 수 있는 확률이 작아지게 될 것이며, 이와같이 여러가지 변이를 일으키는데에는 역유전학적인 방법이 많은 도움을 줄 것이라는 점에 착안하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 역유전학적인 방법으로 독감바이러스의 뉴라미니다제 유전자의 3' 비암호 보존부위에 여러가지 변이를 유발시켜 표현형이 달라진 바이러스 및 이들의 제조방법에 관한 것이다.

독감 A형 바이러스 뉴라미니다제의 게놈은 3'의 끝 12개의 염기서열과 5'의 끝 13개의 염기서열이 보존되어 있고, 이들은 상보적인 서열로 팬 핸들(pan handle) 구조를 갖고 있다.(Desselberger 등의 1980 Gene 8:315; Robertson의 1979 N.A.R. 6 : 3745 ; Skehel and Hay의 1978 N. A. R 5:1207)(제1도 참조).

3' 끝의 보존된 12개의 염기서열은이다.

상기 보존서열중 3'말단에서 4번째 염기는 PA, PB₁, PB₂등의 폴리머라아제 등은 C의 염기서열을 가지며 바이러스의 종에 따라 약간씩 변이가 있지만 나머지는 U의 서열을 갖는다. 본 발명에서 사용한 WSN 바이러스는 3' 말단에서 4번째 염기가 C이다.

12개의 염기서열만으로도 시험관 내에서 전사에 필요한 프로모터(promoter)로써의 기능이 충분하며, 이들 12개의 서열에 여러가지 다른 서열로 대치시켜 시험한 결과 3' 말단에서 9, 10, 11번째의 염기에 변화를 주었을 때에는 활성이 거의 안나타나고, 3' 말단에서 3, 4, 5번 염기에 변이를 주었을 때에는 활성이 증가한다는 것이 밝혀졌다.(Seong, B.L 그리고 Brownlee의 1992 J. Gen. Virol 73:3115)

본 발명에서는 상기의 결과에 근거하여, 3' 끝부분의 12개 보존 서열중 3'말단에서 3, 4, 5번째와 8, 9번째의 염기서열에 촛점을 맞추어 이들 염기에 다양한 변화를 주어 재조합 바이러스를 제조하였다.

해당 부위에 각각 변이를 유발시켜 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)를 합성한 후 PCR을 통해 변이된 뉴라미니다제 유전자를 만들어 pUC19 벡터에 클로닝하였다.

플라스미드를 시험관내에서 T₃RNA 폴리머라아제로 전사시켜 완전한 길이의 바이러스 RNA를 얻고, RNP 분획을 얻어서 RNP 복합체를 만들어 MDBK 세포주에 DEAE-dextran 방법으로 트랜스펙션 시키고 WSN-HK을 헬퍼(helper)로서 사용하여 감염시킨 후 트립신이 없는 아가 배지에서 플라그를 형성시킨다(제2도 참조).

얻어진 플라그를 3번이상 플라그 에세이를 반복하여 순수한 단일 클론 바이러스를 얻는다.

상기와 같은 방법으로 얻은 바이러스 MDBK 세포주에 배양하여 RNA를 추출한 후, poly(A) 중합효소를 이용하여 3'에 A 뉴클레오타이드를 붙인 다음 cDNA를 만들어 염기서열을 분석하여 변이여부를 확인한다(제3도 참조).

한편 치환된 염기서열이 바이러스의 복제와 전사에 어떤 영향을 주는지를 알아보기 위해 RNase 보호분석을 실시하고(제4도 참조)(제6도 참조)(제7도 참조), 실제로 뉴라미니다제 단백질이 어느 정도 합성되어 바이러스 막에 존재하는지를 알아보기 위해 뉴라미니다제 활성을 조사한다(제8도 참조).

[실시예 1]

[뉴라미니다제 vRNA의 3' 프로모터에 변이의 유도]

다음과 같이 프라이머를 합성하여 변이를 유도하였다.

뉴라미니다제 유전자의 전사(transcription)에 이용된 프로모터는 T₃프로모터를 사용했으며 3'끝의 염기서열이 정확하게 합성되도록 Ksp632I 제한요소 인식부위를 넣었고 전체 유전자의 클로닝에는 EcoRI과 HindIII 제한요소를 사용하혔다.

상기와 같이 고안한 프라이머로 PCR을 통해 변이된 NA 유전자를 만들어 pUC19 벡터의 EcoRI, HindIII 제한요소를 이용하여 클로닝하였다. 얻어진 모든 클론들을 염기서열 분석을 통해 확인하였다.

[실시예 2]

[RNP 복합체(RNP complex)의 제조]

다음의 방법으로 역유전학 방법에 따라 RNP 복합체(Ribo nucleoprotein complex) 형성에 필요한 독감 바이러스 효소를 제조하였다. X-31 바이러스(A/HK/68과 A/PR/8/34의 재조합 바이러스)를 디스럽션(disruption) 완충액(100mM Tris-HCl : pH 7.4, 100mM NaCl, 5mM MgCl₂, 1mM DTT, 5% 글리세롤, 1% NP40)에서 30분간 방치하여 바이러스막을 분해하였다. 이렇게 얻어진 바이러스 라이세이트(Viruas lysate)를 1% NP40를 제외한 상기의 완충액에 70%, 50%, 30%의 불연속 글리세롤 농도구배상에서 원심분리하여 바닥으로부터 각각의 분획을 얻었다. 각 분획중 일부를 SDS-PAGE 전기영동법으로 전개한후, 단백질을 쿠마시 블루(Coomasie blue)의 염색으로 확인하여 RNP가 풍부한 분획을 모았다.

1ml의 분획용액에 CaCl₂완충액을 넣어서 10mM CaCl₂로 조절하고 마이크로코컬 뉴클레아제(micrococcal nuclease)를 1,000U 가하고 잘 섞은후 25℃에서 5시간 동안 방치하였다. 그후 100mM EGTA용액을 30㎕ 가하여 최종농도를 3mM로 조절한후 사용할 때까지 -20℃에 보관하였다.

실시예 1에서 클로닝한 각각의 클론들을 Ksp632I 제한효소로 처리하여 페놀/클로로포름으로 추출하고 에탄올로 침전시켜 말린후 증류수로 녹여 다음 반응에 사용하였다. 트랜스펙션에 사용한 RNP복합체는 다음과 같이 만들었다. Ksp632I으로 처리한 플라스미드 5㎍, 10 × T₃중합요소 반응 완충액 10㎕, 20mM rNTP 혼합물 5㎕, RNase저해제(HPRI) 2㎕, T₃RNA 폴리머라아제 50U, 마이크로로컬 뉴클레아제를 처리한 RNP 30㎕에 적당량의 증류수를 첨가하여 100㎕로 맞춘 다음 37℃에서 15분, 30℃에서 15분간 방치하여 RNP복합체를 얻었다. 여기에 800㎕의 PBS를 첨가하여 다음의 트랜스펙션에 사용한다.

[실시예 3]

[재조합 바이러스의 제조]

먼저 35mm 6웰 플레이트(6 well plate)에서 MDBK 세포주를 70-80%융합상태(confluent)로 키운후, 배지를 제거하고, PBS로 두번 세척한 다음 WSN-HK 바이러스를 농도별로 희석하여 500㎕를 취해 상온에서 30분간 감염시켰다.

바이러스용액을 제거하고 혈청이 없는 배지를 2ml첨가한후 1시간동안 방치하고, 다시 배지를 제거하고 여기에 1ml의 DEAE-텍스트란(DEAE 텍스트란 300㎍/ml, 0.5% DMSO의 PBS 용액, 젤라틴 0.1mg/ml)을 가하고 30분간 처리한 후 용액을 제거하였다.

실시예 2에서 만들어진 RNP복합체를 100㎕ 취하여 세포에 처리하고, 15분간 상온에서 방치한후 37℃로 옮겨 30분간 보관하였다.

용액을 제거한 후 혈청이 없는 배지 2ml을 첨가하여 37℃에서 18시간동안 보관하고, 18시간후 2ml의 바이러스 용액을 취하여 그중에서 1/4을 취해 플라그 에세이에 사용하였다. 6웰 플레이트에서 MDBK 세포주를 완전 융합상태까지 키운후 트랜스펙션한 후에 500㎕의 용액을 취하여 각 웰에 가하여 30분간 상온에 방치하여 감염시켰다.

용액을 제거하고 2% seaplaque 저온용융겔과 2×DMEM배지를 절반씩 섞어 3ml씩 취해 각각의 웰에 넣고 굳힌후 37℃에서 플라그가 형성될 때까지 보통 2-3일간 CO₂항온기에서 방치하였다. 이로써 얻어진 플라그를 피펫으로 취하여 3번이상 플라그 에세이를 반복하여 순수한 단일클론 바이러스를 얻었다.

상기와 같은 방법으로, 4번의 C가 U로 치환한 변이체만 유일하게 얻을수 있었으며 이 바이러스를 HTWN-U4라 명명하고, 1995년 9월 27일에 한국과학기술원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 기탁하였다.(수탁번호 KCTC 0191BP).

[실시예 4]

[재조합 바이러스의 염기서열의 확인]

실시예 3에서 얻은 HTWN-U4 바이러스가 유도한대로 변이된 변이체인지를 확인하기 위해 다음과 같이 염기서열을 확인하였다.

MDBK 세포주에서 바이러스를 배양하여 200,000g에서 30분간 완성 분리하여 바이러스 펠렛(pellet)을 얻는다. 펠렛을 500㎕의 PBS로 녹인 후 10% NP40 50㎕와 40U의 RNase 저해제를 넣고 10분간 상온에 방치한다. 여기에 2X SET(0.3M NaCl, 0.1M Tris pH7.4, 20mM EDTA 0.5ml, 10%SDS 0.1ml, 프로테이나제 K(10mg/ml) 20㎕등을 넣고 완전히 섞은 후 45℃에서 2시간 동안 방치하였다.

페놀/클로로포름을 1ml 가하고 2번 추출하여 에탄올로 침전 후 건조시켜 50㎕의 TE로 녹여 다음 반응에 사용하였다. 확인하고자 하는 부분이 게놈의 3' 끝부분이어서 다음과 같이 고안하여 염기서열을 확인하였다.

상기에서 추출한 바이러스 RNA 1㎕, poly(A) 중합요소 완충액[(50mM Tris-HCl (pH 7.9), 0.25M NaCl, 10mM MgCl₂, 2.5mM MnCl₂, 0.5mg/ml BSA, 0.25mM ATP], RNase 저해제 40U, poly(A) 중합요소 1U를 완전히 섞어 37℃에서 15분간 반응시켰다.

페놀/클로로포름으로 2번 추출한 다음 에탄올로 침전시켜 건조한 후 증류수로 녹여 다음의 cDNA 합성에 사용하였다.

A 뉴클레오타이드를 붙인 RNA용액 11㎕와 1㎕의 프라이머(0.1㎕)을 섞어 70℃에서 10분간 방치한후 5X 첫단계 사슬완충액 [0.25M Tris-HCl (pH 8.3), 0.375M KCl, 15mM MgCl₂]4㎕, 5mM dNTP 혼합액 2㎕, 0.1M DTT 1㎕, M-MLV 역전사효소 1㎕(40U)를 넣고 상온에서 10분간, 37℃에서 50분간 반응시켜 cDNA를 합성하였다.

cDNA를 주형으로 하여 상기의 프라이머 ①과 ②로써 PCR을 한후 EcoRI, HindIII 제한요소로 잘라 pUC19 벡터에 클로닝하여 염기서열을 결정하였다(제3도).

[실시예 5]

[재조합 바이러스의 RNA의 발현양상 조사]

숙주세포내에서 변이된 바이러스의 vRNA, mRNA, cRNA등의 발현양상이 야생형과 어떻게 달라지는지 알아보기 위해 RNase 보호분석방법을 실시하여 각각의 RNA가 시간별로 어떻게 발현되는지를 비교하였다.

독감바이러스가 숙주세포에 들어가면 vRNA를 주형으로 mRNA와 cRNA가 합성된다. cRNA는 vRNA와 완전한 상보적인 염기서열을 가지나 mRNA는 5'에 숙주 mRNA에서 유래된 cap-프라이머가 존재하고 vRNA 주형의 끝에서 약 20여 뉴클레오타이드 전에 폴리아데닐레이션(polyadenylation)에 의해 A뉴클레오타이드가 붙게된다(제5도 참조). RNase S1 또는 RNase T1등은 DNA나 RNA의 단일가닥으로 존재하는 부위를 제거하는 기능이 있다. 따라서, mRNA와 cRNA를 제4도에서 보는 바와 같이 구분하는 것이 가능하다. vRNA를 정량하는데 필요한 프로브(probe)는 234뉴클레타이드이며, mRNA와 cRNA에 필요한 프로브는 244 뉴클레오타이드이다. 제4도에서 프로브의 3'쪽에 비상보적인 서열을 만든 이유는 RNase 보호후 완전히 잘려지지 않은 프로브와의 혼동을 피하기 위해 30-40개의 서열을 임의로 넣었다. 방사성 동위원소로 표지된 프로브를 얻을 목적으로 234, 244 두 서열을 PCR로써 만들어 pUC19 벡터에 클로닝하였다.

전체적인 과정은 다음과 같다.

13개의 지름 6cm 배양용 플레이트에 MDBK세포주를 융합된 상태(confluent)까지 배양한 후, 배지를 제거하고 PBS완충액으로 2번 세척한 다음 moi가 1이 되도록 준비한 바이러스를 13개의 플레이트에 동시에 감염시켰다. 30분간 감염시간을 주고 PBS로 3번 세척하고 DMEM배지를 5ml 넣고 37℃로 옮겨 1시간 간격으로 한 플레이트 씩 꺼내어 RNA를 추출하였다.(RNA 추출은 Ambion사 제품의 Totally RNA^TM키트를 사용하였다).

추출한 RNA는 분광광도계(spectrophotometer)로 정량하여 다음 반응에 사용하였다.

방사성 동위원소로 표지된 프로브는 다음의 방법으로 제조하였다.

총 20㎕의 반응액중 10x 전사용완충액 2㎕, RNasin 1㎕, ATP, GTP, UTP(각각 2.5mM), 100uM CTP, [α-³²P] CTP(50μ Ci at 10mCi/ml) 5㎕, T₃RNA 중합요소 1㎕, 주형DNA 5㎕(1㎕)등을 잘섞어 37℃에서 60분간 반응시켰다. RNase를 제거한 DNase I 1U를 넣고 37℃에서 15분간 처리하여 주형DNA를 제거하였다.

위 반응액에 반응액과 동일량의 겔로딩완충액(80%포름아마이드,0.1% 크실렌시아놀 0.1% 브로모페놀 블루, 2mM EDTA)을 넣고 90℃에서 3분간 처리하여 아크릴아마이드겔(5% 폴리아크릴아마이드, 8M 우레아)에서 전개하였다. 전개한 겔을 X-ray필름으로 10분간 노출시켜 합성된 프로브 밴드를 면도칼로 도려내어 용출완충액(0.5M 암모늄 아세테이트, 1mM EDTA, 0.2% SDS)에 넣어 37℃에서 2시간 동안 방치하였다. 완충액을 취해 0.5M이 되도록 암모늄 아세테이트를 넣고 에탄올로 침전시켜 다음 반응에 사용하였다.

세포에서 추출한 10㎕의 RNA에 5 x 10⁵cpm의 프로브 RNA를 넣었다. 각각의 튜브에 2㎕(10㎕)의 효모RNA와 20㎕의 하이브리다이제이션 완충액(80% 이온을 제거한 포름아미드, 100mM 구연산 나트륨 pH6.4, 300mM 초산나트륨 pH 6.4 1mM EDTA)를 넣어 섞은후 90℃에서 3분간 열처리하여 45℃항온수조에서 12-15시간동안 반응시켰다. RNase T1을 RNA 분해완충액으로 50U/ml가 되도록 희석하고, 상기의 반응액에 200㎕의 RNase T1용액을 넣고 37℃에서 30분간 반응시켰다 300㎕의 RNase 불활성화/침전 혼합액을 넣고 -20℃에서 15분이상 방치하여 침전시켰다. 원심분리하여 얻은 침전물을 8㎕의 겔 완충액(80% 포름아미드, 0.1% 크실렌 시아놀, 0.1% 브로모페놀 블루, 2mM EDTA)으로 녹여 90%에서 3분간 열처리 하였다(RNase 보호분석 실험은 Ambron사 제품의 RPAII^TM키트를 사용하였다).

이상으로 얻은 반응액을 폴리아크릴아마이드겔(5% polyacrylamide, 8M 우레아)에서 50℃가 유지되도록 하여 전기영동하였고, 전개가 끝난후 크로마토그라피 종이에 겔을 옮겨서 겔 건조기로 건조시켰다.

-80℃에서 X-ray필름으로 30-40시간동안 노출시켜 현상후 필름을 분석하였다(제6도 참조)(제7도 참조).

제6도에서 WSN 바이러스 야생형에 비해 HTWN-U4바이러스의 mRNA가 상대적으로 많이 오랫동안 지속됨을 보여주었다.

[실시예 6]

[뉴라미니다제의 활성조사]

mRNA의 높은 발현이 바이러스 입자를 구성하는데 어떤 영향을 주는지를 알아보기 위해 다음과 같이 뉴라미니다제 활성을 조사하였다.

480HAU의 바이러스 50㎕를 0.15M 식염수로 에펜돌프튜브(eppendorf tube)에서 2배연속 희석하였다. 각각의 튜브에 50㎕의 식염수와 100㎕의 fetuin(pH5.9)을 넣고 35℃에서 18시간동안 반응시켰다.

에펜돌프 튜브의 용액을 각각 시험(6mm x 10cm)으로 옮겨 20℃항온수조에서 100㎕의 퍼이오데이트(periodate reagent)를 넣고 20분간 방치하였다. 1ml의 아르세나이트(arsenite regent)를 넣고 황색이 없어질 때까지 용액을 잘 섞어준 후 2.5ml의 티오바르비탈산(throbarbituric acid)을 넣고 끓는 물에서 15분간 발색시켰다. 튜브를 상온까지 식힌 후 4ml의 부탄을 넣고 잘 섞어 700rpm으로 5분간 원심분리하여 색깔이 부탄올층으로 추출된 액을 얻어 549nm의 파장에서 분광광도계로 측정하였다(제8도 참조).

제8도에서 보는 바와 같이 HTWN-U4의 변이 바이러스는 동일한 HA 역가에서 2배정도의 높은 활성을 보이는 것으로 보아 바이러스의 막에 야생형보다 더많은 NA당단백질이 존재하는 것을 알 수 있었다.

상기한 실시예에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 재조합바이러스는 독감 바이러스 유전자의 뉴라미니다제 3'말단 보존서열을 변이시켜 제조한 재조합 독감바이러스로서 야생형에 비해 mRNA가 상대적으로 많이 지속되므로 바이러스가 많이 생성되며 또한 생성되는 바이러스 표면에 더 많은 NA 당단백질이 있으므로 항체를 많이 생성 시킨다.

따라서 본 발명의 재조합바이러스는 항체 생성능이 좋을 뿐만 아니라, 생백신으로 비강분사할 수도 있으며, 면역의 지속기간이 길고, 항원 단백질의 분리정제 과정이 필요치 않으므로 생간공정이 간단하여 생산단가를 절감시킬 수 있다.

본 발명의 재조합 바이러스는 약제학적으로 허용되는 담체를 사용하여 공지된 방법으로 액제, 현탁제, 주사제, 분무제, 정제, 캡슐제등으로 사용될 수 있다.

투여는 보통 피하주사, 근육주사등을 이용하되 생백신으로 하는 경우에는 비강분사로 투여할 수 있다.

투여량은 10⁶∼ 18⁸TCID₅₀(Tissue Culture Infectious Dose) 정도로 투여가 가능하다.

Claims

독감 바이러스 뉴라미니다제 유전자의 3'-UCGUUUUCGUCC의 말단 보존 서열에서 염기의 치환변이가 일어난 것을 특징으로 하는 재조합 독감 바이러스.
제1항에 있어서, 상기 보존서열중 3' 말단에서 3, 4, 5번째와 8, 9번째 염기에서 치환변이가 일어난 것으로 특징으로 하는 재조합 독감 바이러스
제 2항에 있어서, 3' 말단에서 4번째 염기인 C(cytosine)이 U(uracil)로 치환된 것을 특징으로 하는 재조합 독감 바이러스 HTWN-U4(수탁번호 KCTC 1091BP).
독감 바이러스 뉴라미니다제 유전자의 3'-UCGUUUUCGUCC의 말단 보존서열에서 염기의 치환변이를 일으켜 얻은 재조합 RNA 분자와 마이크로코걸 뉴클리아제를 처리한 RNP(리보뉴클레오단백질; Ribonucleoprotein)로 구성되는 RNP 복합체로 숙주세포를 트랜스펙션시킨후 RNA 바이러스 모균주로 감염시켜 제1항의 재조합 독감바이러스를 제조하는 방법.