FI84916C

FI84916C - Foerfarande foer framstaellning av eventuellt glukosylerade proteiner med proteinasinhibitoraktivitet.

Info

Publication number: FI84916C
Application number: FI860540A
Authority: FI
Inventors: Hermann Ragg
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1985-02-08
Filing date: 1986-02-06
Publication date: 1992-02-10
Also published as: US4849349A; DE3521226A1; DK61486D0; DE3673436D1; FI860540A; ES554102A0; ES551695A0; GR860360B; KR860006484A; ES8702493A1; ES8704544A1; EP0190652A1; IE860350L; DK61486A; PT81978A; KR940003690B1; FI84916B; IE58869B1; PT81978B; EP0190652B1

Description

1 84916

Menetelmä mahdollisesti glykosyloitujen proteinaasi-inhi-biittoriaktiivisuutta omaavien proteiinien valmistamiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää mahdollisesti gly-5 kosyloitujen proteinaasi-inhibiittoriaktiivisuutta omaa vien proteiinien valmistamiseksi. Julkaisussa kuvataan geeniperheen, joka on tähän asti tunnettu proteinaasin inhibiittoreja antitrombiini III:a, c^-proteinaasi-inhi-biittoria (Oj-antitrypsiiniä), antikymotrypsiiniä, kontio rapsiinia, a2-antiplasmiinia samoin kuin angiotensiiniä vastaavien geenien kautta, uutta jäsentä. Löydetty geeni koodaa proteiinia, jolla on aminohapposekvenssi I (liite). Sen koodaavassa säikeessä on 2081 nukleotidia, joista 636 sijaitsee lopetuskodonin TAG jälkeen (DNA-sekvenssi I). 15 Kuvassa esitetään "nontranslated region" (alue, jolle ei tehdä luentaa) valkoisena pylväänä ja rakennegeeni varjostettuna. DNA-sekvenssi I sisältää ennen N-terminaalista aminohappoa (glysiini) vastaavaa kodonia vielä kaksi nukleotidia, jotka oletettavasti koodaavat esijakson viimeis-20 tä aminohappoa [vertaamalla proteinaasi-inhibiittoreihin AT BM ja hepariinikofaktoriin II voidaan päätellä, että glysiini on "valmiin" uuden proteinaasi-inhibiittorin N-terminaalinen aminohappo: I. Witt et ai., Trombosis Research 32 (1983) 513 - 518; M.J. Griffith et ai., J. Biol.

: : 25 Chem. 260 (1985) 2218 - 2225].

Aminohapposekvenssi I tarjoaa alan ammattimiehelle mahdollisuuden, valitsemalla oligopeptidejä tästä aminohapposekvenssistä I, valmistaa tunnetulla tavalla vasta-aineita, pakata ne vasta-ainepylvääseen ja eristää tämän 30 pylvään avulla kokonainen proteiini biologisesta materi aalista.

Toisaalta on mahdollista tuottaa proteiinia geenin tai cDNA-sekvenssin I avulla sopivissa isäntäorganismeis-sa.

35 On lisäksi mahdollista johtaa aminohapposekvenssis tä I muunnettuja geenejä tai geenin osia, jotka johtavat 2 84916 muunnettuihin proteiineihin, joissa on yksittäisten aminohappojen vaihtumisia, deleetioita tai lisäyksiä. Synteettisiä geenejä rakennettaessa voidaan myös lisätä uusia restriktioentsyymien tunnistuskohtia, jotka tekevät mah-5 dolliseksi aminohapposekvenssin lisämuutokset. Muodostet taessa synteettisiä geenejä voidaan ottaa huomioon myös se, että mikrobi-isäntäorganismit suosivat osittain eri kodoneja kuin korkeammat organismit.

Uudella proteiinilla on sekä DNA:n että myös amino-10 happosekvenssin suhteen yhtäläisyyksiä edellä mainittujen proteinaasi-inhibiittorien kanssa. Siksi tämä geeni soveltuu myös proteinaasi-inhibiittorien kanssa analogisten tuotteiden valmistukseen korvaamalla uuden geenin "aktiivinen keskus" tunnettujen proteinaasi-inhibiittorien ak-15 tiivisilla keskuksilla. Uuden geenin aktiivinen keskus koostuu nukleotidijaksosta CTG TCC, joka vastaa aminohappoja Leu-Ser (aminohapposekvenssin I aminohapot 444 ja 445).

Rakennettaessa tällä tavalla tunnettujen protei-20 naasi-inhibiittorien analogeja, voidaan myös yhdistää "ra-kennuspalikkaperiaatteella", osageeni I, joka vastaa aktiivista keskusta edeltävää nukleotidijaksoa, osageeniin II, joka vastaa aktiivista keskusta seuraavaa nukleotidijaksoa, sijoittamalla näiden väliin geenifragmentti, joka 25 vastaa sopivaa aktiivista keskusta. Tämän menettelyn yhteydessä voidaan käyttää hyväksi seuraavia DNA-sekvenssin I restriktioentsyymitunnistuskohtia:

Sau34 I (iGATC, asemat 1271 - 1274), Acc I (GT iAT AC, asemat 1356 - 1361) tai Tag I (TiCGA, asemat 30 CG

1246 - 1249 ja 1357 - 1360).

Ihmisen c^-antitrypsiinin modifioiminen on jo tunnettua [S. Rosenberg et ai.. Nature 312 (1984) 77 - 80, vertaa: A. Maelicke, Nachr. Chem. Tech. Lab 32 (1984) 35 1070: M. Courtney et ai., Nature 313 (1985) 149 - 151], jolloin kulloinkin muutettiin aktiivinen keskus, mutta I: 3 84 91 6 jätettiin aktiivista keskusta edeltävät ja seuraavat aminohapposekvenssit modifioimatta. Keksinnön mukaisesti saadaan sitä vastoin uusia tuotteita, joiden aktiivista keskusta edeltävät ja seuraavat aminohapposekvenssit vas-5 taavat uutta proteinaasi-inhibiittoria ja mahdollisesti sen modifikaatioita, mutta jotka sisältävät toisen pro-teinaasi-inhibiittorin aktiivisen keskuksen. Keksintö tekee siten mahdolliseksi sellaisten proteiinien, joilla kaikilla on käytännöllisesti katsoen samanlainen tertiaa-10 rirakenne, monipuolisen muuttamisen. Niiden biologiseen aktiivisuuteen vaikutetaan aktiivisen keskuksen kautta.

Uudella proteiinilla ja sen analogeilla on protei-naasia inhiboiva, erityisesti trombiinia inhiboiva vaikutus, ja ne vaikuttavat veren hyytymiseen. Niitä voidaan 15 siksi käyttää lääkkeenä päivittäisen annoksen ollessa noin 0,1 - 100 mg. Koska proteiinit tunnetusti hajoavat mahassa, täytyy uudet proteiinit antaa sellaisena lääke-muotona, jossa hajoaminen vältetään, esimerkiksi mahanesteitä kestävinä kapseleina tai parenteraalisesti.

20 Keksinnön mukaiselle menetelmälle mahdollisesti glykosyloitujen proteinaasi-inhibiittoriaktiivisuutta omaavien proteiinien valmistamiseksi on tunnusomaista, että viedään cDNA, joka koodaa proteiinia, jolla on liitteessä esitetty aminohapposekvenssi I, ilmentymissyteemiin 25 ja saatetaan se ilmentymään siellä.

cDNA-sekvenssi I saatiin etsimällä se ihmisen maksa-cDNA -pankista synteettisesti valmistetun DNA-sek-venssi II:n oligonukleotidin 5'GGGTTGGCTACTCTGCCCATGAAGA 3' avulla. Tämä nukleotidijakso valittiin tunnetun CDNA-30 sekvenssin, joka vastaa proteinaasi-inhibiittorien karbok-syylipään lähellä olevaa aluetta, perusteella. Osoittautui, että se on pitkälti komplementaarinen koodaavalle jaksolle, joka vastaa aminohapposekvenssin I aminohappoja 469 - 477.

35 Menetelmät oligonukleotidien syntetisoimiseksi, hybridisaatioiden tekemiseksi ja geenin valmistamiseksi 4 84916 ovat yleisesti tunnettuja, samoin menetelmä geneettisen informaation viemiseksi isäntäsoluihin ja koodatun poly-peptidin tuottamiseksi prokaryoottisissa ja eukaryootti-sissa ilmentymissysteemeissä. Prokaryoottiset systeemit 5 tuottavat proteiinin glykosyloitumattomana, kun taas euka-ryoottiset systeemit voivat tuottaa glykosyloitunutta proteiinia. N-glykosyloituminen voi tapahtua aminohapposekvenssin I aminohapoissa 30, 169 ja 368.

DNA-sekvenssin I muuttamista valaistaan jäljempänä 10 esimerkillä, joka koskee toisen aktiivisen keskuksen tuomista molekyyliin. Tätä varten pilkotaan DNA-sekvenssi I osittain endonukleaaseilla Sau3A I ja Accl ja lyhyt DNA-fragmentti korvataan synteettisesti valmistetulla geeni-fragmentilla, joka koodaa seuraavia aktiivisia keskuksia; 15

Aminohapposekvenssi Proteinaasi-inhibiittorivaikutus

Arg-Ser kuten antitrombiini III (ihmisen)

Met-Ser kuten c^-antitrypsiini (ihmisen) 20 Val-Ser kuten dj-antitrypsiini

Lys-Ala kuten hiiren kontrapsiini

Tyr-Ser kuten hiiren c^-antitrypsiini

Leu-Met kuten a2-antiplasmiini 25 [R. Hill et ai., Nature 311 (1984) 175 - 177; M. Courtney et ai., mainittu viite; J.Travis et ai., Behring, Inst. Mitt. 73 (1983) 56 - 65.]

Uusi geeni soveltuu siten lähtömateriaaliksi uusien proteiinien, joilla on proteinaasia inhiboiva vaikutus, 30 valmistukseen. Myös näitä uusia yhdisteitä voidaan tunnettuja, samalla tai samantapaisella tavalla vaikuttavia pro-teinaasi-inhibiittoreita vastaavalla tavalla käyttää lääkeaineina.

Myös näitä uusia tunnettujen proteinaasi-inhibiit-35 torien analogeja voidaan muuttaa edelleen muuntamalla geeniä tunnetulla tavalla, jolloin saadaan proteiineja, joi- li 5 84916 den aminohappoketjussa on tapahtunut aminohappojen vaihtumisia, deleetoita tai lisäyksiä.

Seuraavissa esimerkeissä valaistaan lähemmin keksinnön eri puolia. Prosenttisuudet ovat painoprosentteja, 5 ellei toisin mainita.

Esimerkki 1 RNA:n eristäminen

Pakastettu ihmisen maksasta otettu kudosnäytema-teriaali jauhettiin hienoksi nestetypen alla huhmarissa. 10 Jauhetta homogenisoitiin 70°C:seen esilämmitetyn 4 M guani-diumtiosyanaattikantaliuoksen [J. Chirgwin et ai., Biochemistry 18 (1979) 5294 - 5299] kanssa sekoittimella minuutin ajan. Seosta sentrifugoitiin 10°C:ssa 10 min (Sorvall-roottori HB-4, 800 min'1). Supernatantit otettiin talteen, 15 lisättiin 0,5 g cesiumkloridia/ml supernatanttia, ja seosta lämmitettiin muutamia minuutteja 60°C:ssa. Saatu liuos laitettiin sitten ultrasentrifugiputkiin, jotka sisälsivät neljäsosan tilavuudestaan liuosta, joka sisälsi 5,7 mol/1 cesiumkloridia, 12,5 mmol/1 etyleenidiamiinitetraetikkaha-20 pon (EDTA, pH 7,5) natriumsuolaa ja 12,5 mol/1 natriumsit-raattia (pH 7,0). Putkia sentrifugoitiin 20°C:ssa 17 tuntia (Beckman SW-28-roottori, 21 000 min*1). Supernatantit poistettiin imemällä, ja sakka suspendoitiin TES-puskuriin (50 mol/1 Tris-HCl, 10 mmol/1 EDTA ja 0,2 % (w/v) natriumdode-- - 25 kyylisulfaattia (SDS), pH 7,4) lämmittäen ja uutettiin kerran yhtä suurella tilavuudella kloroformin ja n-butano-lin seosta (tilavuussuhde 4:1). Sentrifugoinnin jälkeen vesifaasiin lisättiin kymmenesosa tilavuudestaan 3 M nat-riumasetaattiliuosta (pH 5,2), ja saostettiin etanolilla. 30 Kun seos oli seisonut vähintään kaksi tuntia -20°C:ssa, se sentrifugoitiin 0°C:ssa 20 min kierrosnopeudella 12 000 min’1, ja sakka pestiin 80-%:isella etanolilla. Kuivattu sakka liuotettiin 0,1 M natriumasetaattiluokseen (pH 7,0) ja saostettiin uudelleen etanolin avulla. Sakka sentrifu-35 goitiin, pestiin ja kuivattiin edellä kuvatulla tavalla. Kun se oli liuotettu uudelleen puskuriliuokseen (0,1 mol/1 6 84916 natriumasetaattia, pH 5,2, 10 mmol/1 Tris-HCl, pH 7,4 1 mmol/1 EDTA ja 0,2 % (w/v) SDS), uutettiin liuos kahdesti yhtä suurella tilavuudella fenolia, joka oli tasapainotettu lisäämällä 1 mol/1 Tris-HCl, pH 8,0 ja 0,2 % (w/v) hyd-5 roksikinoliinia, ja sentrifugoitiin. Seosta uutettiin yhtä suurella tilavuudella kloroformia, sentrifugoitiin ja ve-sifaasiin lisättiin yhtä suuri tilavuus urean (8 mol/1) ja litiumkloridin (4 mol/1) liuosta, ja annettiin seistä yön yli 0°C:ssa. Seosta sentrifugoitiin 20 min 0°C:ssa (rootto-10 ri SS 34, 10 000 min'1) ja sakka siirrettiin TES-puskuriin, siihen lisättiin kymmenesosa tilavuudesta 3 M natriumase-taattiliuosta (pH 5,6) ja saostettiin etanolilla. Sakka sentrifugoitiin, pestiin ja kuivattiin edellä kuvatulla tavalla ja siirrettiin lopuksi puskuriliuokseen (50 mmol/1 15 Tris-HCl, 1 mmol/1 EDTA, 0,1 % (w/v) SDS, pH 7,5). Seokseen lisättiin yhtä suuri tilavuus 1 M NaCl-liuosta, ja poly(A)-RNA eristettiin kromatografioimalla kahdesti oli-go-(dt)-selluloosalla. Poly(A)-RNA saostettiin natriumase-taattiliuoksen lisäämisen jälkeen etanolilla ja liuotet-20 tiin lopuksi puskuriliuokseen (1 mmol/1 Tric-HCl, 0,1 mmol/1 EDTA, pH 7,0) pitoisuudeksi 1 pg/μΐ.

Esimerkki 2 cDNA:n synteesi, kloonaus ja seulonta

Seosta, joka sisälsi 10 pg poly(A)-RNA:ta 10 pl:ssa 25 edellä mainittua puskuria, lämmitettiin 3 min 70°C:ssa, jäähdytettiin nopeasti jäävedellä ja käytettiin cDNA-syn-teesiin. Ensimmäisen säikeen synteesi 100 μ1:η lopputila-vuudessa tehtiin M. Wickensin et ai [J. Biol. Chem. 253 (1978) 2483 - 2495] menetelmällä käyttäen 32P-leimattua 30 tymidiinitrifosfaattia ja lisäksi RNaasi-inhibiittoria RNAsiini (100 yksikköä/erä; Biotec). Toisen säikeen synteesissä käytettiin E. colin DNA-polymeraasin Klenowfrag-menttia (100 yksikköä/200 μΐ reaktioseosta) ja annettiin reaktion edetä 4 tuntia 15°C:ssa ja lopuksi 2 tuntia 35 20°C:ssa. Reaktio pysäytettiin uuttamalla seos fenolin ja kloroformin seoksella (tilavuussuhde 1:1). Vesifaasi frak- li 7 84916 tioitiin sentrifugoinnin jälkeen käyttämällä 5 ml:n pylvästä, joka sisälsi 20 M NaCl-liuoksella tasapainotettua "SEPHADEX G-100, cDNArta sisältävät fraktiot yhdistettiin, lisättiin natriumasetaattia ja saostettiin yön yli etano-5 lilla. "Hiusneula"-rakenteiden poistamiseksi dsDNA:ta käsiteltiin 30 min 37°C:ssa 90 yksiköllä nukleaasi S1:ä (P-L Biochemicals) 250 μΐ: a kohden reaktioseosta [Maniatis et ai., Molecular Cloning, a Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, 1982] Reaktio pysäytettiin uuttamalla seok-10 sella, joka sisälsi yhtä suuren tilavuuden fenolia ja kloroformia; ja saostettiin DNA natriumasetaatin lisäämisen jälkeen etanolilla. dsDNA:n päät käsiteltiin tunnetulla tavalla Klenow-polymeraasilla [Maniatis et ai., ibid.], reaktio pysäytettiin uuttamalla fenolin ja kloroformin 15 seoksella (tilavuussuhde 1:1), ja DNA saostettiin natriumasetaatin lisäämisen jälkeen etanolilla. E. coli HB 101:n transformoimiseksi pilkottiin plasmidi pUC13 (BRL, Catalogue & Reference Guide, 1983, s. 89) tavanomaisin menetelmin restriktioendonukleaasilla Sma I ja käsiteltiin alka-20 lisella fosfaasilla. Saatu ds.cDNA liuotettiin ilman lisä-käsittelyä puskuriin (1 mmol/1 Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 mmol/1 EDTA) ja sille tehtiin ligaatio Sma I:lla pilkotun ja fosfatoidun vektorin pUC13 kanssa.

E. coli HB 101:n transformointi tehtiin kirjalli-25 suudessa kuvatuin menetelmin [Maniatis et ai., ibid.]. Ampisilliiniresistentit pesäkkeet kerättiin nitrosellu-loosasuodattimille. Replikalevyt käsiteltiin kloramfeni-kolilla (150 pg/ml) ja pesäkkeet hajotettiin. DNA kiinnitettiin nitroselluloosasuodattimeen tunnetulla tavalla 30 [Maniatis et ai., ibid.].

In situ -hydridisointia varten pestiin 52 nitro-selluloosasuodatinta, joista kukin sisälsi 300 - 400 pesäkettä, 2 tuntia 42°C:ssa "esipesuliuoksessa" [Maniatis et ai., ibid., s. 326] ja esihydridisoitiin sitten 26 suo-35 datinta kerrallaan 6 tuntia 42°C:ssa 150 ml:ssa seuraavaa seosta: e 84916 0,9 mol/1 NaCl 0,18 mol/1 Tris-HCl, pH 8,0, 6 mmol/1 EDTA, 5-kertaisesti väkevöityä Denhardt-liuosta 5 0,2 % (w/v) SDS.

200 pg/ml pilkottua ja denaturoitua vasikan kateen- korva -DNA:ta (Sigma) 200 pg/ml hiiva-RNA:ta (Sigma) 0,5 % (v/v) ionitonta tensidiä (Nonidet P-40, Sig-10 ma)

Hydridisointi DNA-sekvenssi II -koettimen kanssa (10 cpm/ml) tehtiin samaa puskuria käyttäen (16 tuntia 42°C:ssa). Suodattimia pestiin sitten 2 x 10 min huoneen lämpötilassa (0,9 mol/1 NaCl, 0,09 mol/1 natriumsitraat-15 tia, pH 7,0) ja sitten 2-29 min 33°C:ssa samassa puskurissa. Sen jälkeen suodattimet kuivattiin ja kuvattiin röntgenfilmille - 70°C:ssa.

Koetin, jossa oli DNA-sekvenssi II, syntetisoitiin fosfotriesterimenetelmällä. Oligonukleotidi leimattiin 20 hybridisaatiota varten 5'-päästään 32P:lla.

Tutkittaessa tuotteita eristettiin yhdistelmäplas-midi (pL 10/2), joka hybridisoitui hyvin voimakkaasti DNA-sekvenssi II-oligonukleotidin kanssa ja käsitti noin 1500 emäsparia ihmisen DNA:ta. cDNA-insertin nukleotidisekvens-25 si määritettiin Maxamin ja Gilbertin menetelmällä [Methods in Enzymology 65 (1980) 499 - 560] DNA-sekvenssin I nukleotideiksi 518 - 2081.

Kloonin pL 10/2 5'-pidennyksen aikaansaamiseksi tehtiin uusi cDNA-synteesi esimerkin 1 mukaisesti saadun 30 poly(A)-RNA:n avulla.

Fosfotriesterimenetelmällä syntetisoitiin oligonukleotidi, jolla on DNA-sekvenssi III: 3' AGCTTCGCGTTGACTGTGGGGCCC (III), joka vastaa DNA-sek-venssin I koodaamattoman säikeen nukleotideja 1051 - 1064. 35 500 pmol oligonukleotidia III, jonka oli annettu reagoida polynukleotidikinaasin ja Y-32P-leimatun ATP:n I; 9 84916 kanssa, ja 10 pg esimerkin 1 mukaista poly(A)-RNA:ta lämmitettiin 52 pl:ssa puskuria (1 mmol/1 Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 mmol/1 EDTA, 0,5 mol/1 KC1) 3 min 70°C:ssa ja jäähdytettiin sitten 30 min aikana 43°C:seen. cDNA syntetisoitiin 5 Gublerin ja Hoffmannin menetelmällä [Gene 25 (1983) 263 -269] käyttäen oligonukleotidia III alukkeena. Kaksisäi-keisen cDNA:n päät käsiteltiin T4-DNA-polymeraasilla (PL-Biochemicals) Toolen et ai. menetelmällä [Nature 312 (1984) 342 - 347].

10 Polynukleotidikinaasilla ja Y-32P-leimatulla ATP:lla käsiteltyjen Hind III -liittäjien, joilla oli kaava IV: 5' pGCAAGCTTGC 3' (IV), (BRL) lisäämisen ja Hind III:11a pilkkomisen jälkeen cDNA ligatoitiin vektoriin pAT 153 [A.J. Twigg ja D. Sherratt, Nature 283 (1980) 216 - 218], 15 joka oli ennalta käsitelty Hind III:11a ja vasikansuoli-fosfaatilla (Boehringer Mannheim). E. coli HB 101:n trans-formointi, amplifikointi kloramfenikolin avulla ja pesäkkeiden hajotus tehtiin edellä kuvatun mukaisesti.

In situ - pesäkehybridisaatio tehtiin edellä kuva-20 tun mukaisesti käyttämällä hybridisaatiokoettimena 788 emäsparin DNA-fragmenttia, joka oli restriktioentsyymin Acc I avulla irrotettu plasmidista pL 10/2 ja leimattu nick-translaatiomenetelmällä [Maniatis et ai., mainitussa viitteessä] siten, että ominaisradioaktiivisuus oli vähin-: - 25 tään 108 cpm/pg. Suodatinta pestiin 15 min kerrallaan seu raavasti: huoneen lämpötilassa 6 x SSC:ssä 42°C:ssa 2 x SSC:ssä 50°C:ssa 1 x SSC:ssä 30 50°C:ssa 0,1 x SSC:ssä 1 x SSC = 0,15 mol/1 NaCl, 15 mmol/1 natriumsitraattia, pH 7,0.

Kloonien tutkimisen yhteydessä identifioitiin 2 35 voimakkaasti hybridisoituvaa kloonia. Toinen klooni (pH 14) sisälsi insertin, joka käsitti noin 1060 emäsparia 10 8491 6 ihmis-DNA:ta. Tämän cDNA-insertin nukleotidisekvenssi määritettiin Maxamin ja Gilbertin menetelmällä [mainitussa viitteessä].

Vertaamalla kloonien pH 14 ja pL 10/2 cDNA-sek-5 venssejä todettiin, että pH 14 sisältää pL 10/2:n 5'-terminaalisen pidennyksen jatkona noin 480 emäsparin päällekkäiselle jaksolle (kuva). pH 14 sisältää DNA-sekvenssin I nukleotidit 1 - 1062.

Esimerkki 3 10 cDNA:n ilmentäminen

Plasmidi pH 14 pilkottiin Hind 111:11a ja osittain BamHI:llä ja 841 emäsparin Hind III - BamHI-fragmentti eristettiin elektroforeesin jälkeen l,4-%:isella garoosi-geelillä (Low Gel Temperature Agarose, BIO-RAD).

15 Plasmidi pL 10/2 pilkottiin Hind III:11a ja BAmHIrllä ja 4 ke:n Hind III - BamHI-fragmentti ligatoi-tiin plasmidin pH 14 841 emäsparin fragmentin kanssa. Tämä rakenne (plasmidi pHLS2) koodaa proteinaasi-inhibiittoria, joka on pidentynyt N-päästään 9 aminohapolla. Tämä ilmen- 20 tymisplasmidi tekee mahdolliseksi E. colin transformoinnin ja isopropyyli-B-D-tiogalaktopyranosidilla tehdyn induktion jälkeen pidentyneen proteinaasi-inhibiittorin syntetisoinnin lac-promoottori-operaattori-järjestelmän ohjauksessa.

25 11 8491 6 O to 3 O C iH L. —I bO o c t- >» 0) Li —I CO O) CO £-.-1,-1 cu >J j cu c5 > W > < ru o o o. to o. t- 0) C Φ 0) to to CM to —I C0 φ —II-1 —I XT —I >1

<X<C0WC3MCuCC,-J

CÖ O Φ 3 —I bO 0,4-5 o t- C

—i-=rx: φ cO Li to φ to sz —ι «icuj>*s<s:*iE-'0

Li oot- C. t- to >3 to 3 0)

OJ n VO 5) φ φ >3 pH >j 0) —I

CO<EhCOCOJOJJi-i C cO 003 to 3 4-5 φ to £- rH >H CO CO Φ >3 Φ φ sz >3 >3 lö O Ot.O>3rH CO to to 3 iH t, tO Φ O —I CO —I —I Li φ

«Ϊ Cl, <C CO -H O > < CC < J

t- 3 O O toobo C- 3 0) O

x: co to ri n l sz a> o to

E-t rJ < < CC—1C E-ι rJ P-i C

3 3 3 —I Φ £- o £- φ 3 c —t Φ —I eo x: >3 ·=τ φ —ϊ φ co

O rj O > D- ^ h to M _3 C

>3 0 3 Φ 3 3 Φ O t- C —I

Ή t- —I —I φ Φ —I νχ> φ CO CO

C3 CU O M |J rJ H H to < > >3-U> >3 O C Π >3 to O to i- <H O —I to —I CO —I —I 00 —I Φ

O S O C o c o CC—IX CO

to c, 3 φ 3 φ —I —I φ O hO

>3 o «H —t φ .c CO CO —I o c- •J CO O M 3-0 0-i > > H C\l < 03 3 0 ί-φ^03£-3 —· <—I o £- >3—1—1 E- —l XC φ

C5JCUE-'M<CUC)E-,iJ

3 O C Φ O C Φ co 3 Li L.

φ m to —i to to xc —ι —i x: xc J<vh<<(u<£cjE-'E-' C to O O O >3 to φ to Φ L.

<H >3int- to —ι >3—1 —ι —ι >3 C5>JE-i<OrOMXME-l O, C 0.00. ¢0 cO φ Li 3 >3 to to to t- 10 —I rH XC XC —I —1 «t*tc«i«a:*£CuEuuc3 3 C C 300 e Φ 3 t. φ - · Φ to to —I 03 Φ to—I—I >3 x:

---- ^«^«tCCCOriMOE-'CU

O 3 E- E- -103 C >3« E

o Φ SZ Φ CÖ -I Φ to —I >3 to

H CU ,3 EH to > H J C o J C

•H >3 C —I Φ O. Φ O O. 10 O ta (Λ rH Ή CÖ JZ tO —ImtO >3 Φ E- M O O > CU <£ M —I < μΟ CO < 5 ro 3 E- φ c. c Φ O 3 o tf) C >3 rH χ: —1 φ to c m φ φ Ια! rO CC E-1 M co < CU —I 1-0 CO < δ t· O.C to O. 3 t, >> o CÖ φ s OJ L, to >1 to Φ XC rH t- rH x: jg w E-I < J < μ-3 E-ι C5 H < Cu o >3 E 3 3 o bO E 3 E O 3 - - - H Ή —I rH —I XC Li tO Φ (0 03 φ

'Jj ή o O O C5 H < < J < -1 J

i2 8491 6 4 W W 0) rt p bO ¢) 0>ow

ή >> >> xi γη 0) χ χ: x:cM-rH

*H .J U Ol, < ε < Ou EH -=T IE

OCt-iCCDLOOT3n ^ r-i XZ CO W 4) 0) X >aOJ >1 rvJUEn<<JC0iX,X3X3^ ¢0 O 3 3 W 4 0) X OP 4 rjLAQl 0! ·Η SZ rH XT X (1) £

Xl 2C Or M B-1 Or ε Cm 3 WOO) C C >3 3 3 hO 3 1—1 >>C— '—I to to I—I (1) 4 u 4 C3 J ΛΙ Η «ΐ < CT J J c£ ,χ rt p pom >3 >3 c 3 4 o.

Γ-] 4 Ή rH Γ-H f—I 4 rH 00 < ε ε c\j χ cr cr o ,j m <c 4 4 -X X O to rH rt rH >3 4' Έ- 1—1 Cl XZ i-H >3 CO rH rt —I *—' ch m ε E-1 m xi > < > c: *h X W C P Lot- 3 3 jj £-

^ Ή 4 Χ: (Ό >3 rH rH 4 H

Ε·· χ cr ε E-iroE-1 cr cr ε «* J- c X 3 C 303 b03 4

°3 -C <H rH rl Ifi J) X 4 H

EH < E-ι cr cr cr ro XI < χ i_i

3 C rt rH P 3 Lot* to hO

rH to * i rt 4 4 XI f- XI >3 X

CT < <C > S XI fHPOgH χ <

bO X O OP C to bO O 3 C

H XZ 4 X 4 rH >, X σ"\ 4 <H

<c Eh 0- Dr ε O X! <C CO XI CO

rH to a 4 X 3 p c X O C.

3 >3 to XI 4 4 4 to 4rHlO

H* >-3 «I D-. CO i_3 ε < 10 ·=Τ *£

OtO X 4 to rH 4 >3tr 3 Cr CM>s4rH ^HrtrHrHXOrH 4

ajrJCOMX>IHOEHOCO

X O 4 C C to Q. X p rH 4

XIp'rH to to >3 to 4 4 rt rH

Ehcmih < <C x <t CO ε > tH

C0 403 »—I »—I CO P X 3 >3

XI Ό rH rt rt >3 4 4 4 rH

xi Dtcxju > > ο ε co xi cr 4 rt 3 0 0- rH Q. 10 to C rt

-CrH4COi-rttO>3>3tOrH

EH *c XJ CM Eh > «t J j c <c 0.0 rt E- o 3 3 tO C Op --· to X rH 4 O rH 4 Ρ -—I >34 < EH < corner XI χ ο Eh ε

3 O. O. >3 h0O3 O Q. C C

4 to to rH X CM rH X Cr tO CO

rJ<i«scr*tonc3CL,EH<ct 3 X to to 3 COrH bOtO >3

'X. 4 4 >3 >3 rH H fl· rt X >3 rH

•J to xi xi cr o to > < xj o

4 4 4 4 C Ο. iH O 3 3 C

rH XI rH XZ to 10 rt VO rH iH M

in eh m ex <c < > m cr cr «t O EX 3 X 3 C 4 rH o 3 to --- X tO 4 >3 4 tO rH rt CO 4 >>

EH <C X Eh XI < HH > rt r] XJ

4 (0 >3 4 bO CÖ 3 rH WOO.

XI rH rH rH X rH 4 (Ö >»OW

o- <x cr m < < xi > xi^T< i3 8491 6 d 3

JC r—I

D-. O

O >J C

-3· .—I >> ο E-1

(HOD (β VO H

> H

C 3 O C

JT D CO D

Eh J ZT CO

Ci D 60 XT XT L, E-ι a. <

.H 3 ΟΛΟ D

i> J CO

C-ι D O

x: x: ι- Ε-1 a. cu c o e

•C C- CO

Ε-ί Oi «C

rt bO rt

(H L fH

< C <

C Cl. .H

(H 10 rt o c > I- (H 60

C. rt C

Eh > < O >> C, >,

PO (H XT .—I

•=T O Eh C3

3 O D -P

rH in £ D

o zt ο-. ς:

3 60 O D

(H C f— JZ

O C 0-.

C r-ι 3

w rt D

«ΐ > (J

I"! «Η C 3

• - rt (H D

> O J

C C (0 jc x: >5

Eh Eh O

D C C

.- .H D D

.-. M CO CO

C 3 C

x: d jz

.: Eh ,j H

>> O 60

rH C C

: O Ol, <

.1. C -P W

- - .H D H

o s ac i4 8491 6 §2 U o O O O O · Eh Eh En o . < < < lA.p EH < Eh El < < * U O O Oj E-ι < O < fcn o < < O p En O O O 0*0 Eh o P H En Eh »O < EhO< O <

0·Εη O O O O < LTi O < O

Eh O Eh < O < Eh < · O O

P < < P O · < O < Eh Eh tn O · Eh Eh < < o < O < U U O O O O C! Eh O · Eh < O < Eh < Ph < < ° O O · O < O < EH < Eh ° * E-· Eh o Eh O O o O Eh Eh Eh U'' P O < O O O Eh O · < O Eh

o o o < m« O O O O O O

Eh*P P o Eh < En Cl O O O

UEH<<<OOEH ir\ · Eh <

< O O O O · O < E in E O

< Εη·0 O Eh O Eh Eh O Eh

Eh < E-I Fh < o Eh Εη·< u O O O Eh Eh · Eh < O <

C5 Eh 0*0 Eh O Eh O Eh O

*PP<EhEhEhEhO<Eh

O O o < O O <·Εη < O

< O O O O · O O O O Eh <

O O · Eh O < < < O < < O

O ·—< < O O o < o O · O Eh

< U O O O 0*0 Eh O Eh O O

< ρ·< Eh E in E &h Eh Ehoo < o < oontH o o < o · o

O O < O O Εη·0 < O O

< Eh O · < Eh O o < O Eh

•O O O Eh < O O O < O

< O Eh O O O <·< o <£

Eh < Eh < · < Eh O < O O

0·< < o < Eh O O < <

O <00 O O O < Eh · O O

< < IT\ O < o · < Eh < Eh < O < hH . Eh O O < < O < Eh

Eh O O O Eh O O O O < · O

< < < < O O O · Eh O < O

.···. o < 0*0 O O -=r Eh < O O

•UEhO<EhOOOEhEh Eh < < < o < Εη·< < Eh U < < O · < < < o Eh Eh ::: U · < O Eh o O O < o Eh --- p Eh O o Eh Eh < 0·< < O Eh < < O · O < O < <

O 0*0 O Eh O Eh O O O

P<EhEh<Eh<<o*0 O O O H O < · O < < <

< O O O ·< Eh O O O O O O

* < *5 P ° p u < Eh ΙΠ Eh O O

l_l < u <(\J< Eh < EH^r.O < <

•H O O O 0*0 tn Eh Eh O O

W 0*0 < < < Eh O O O Eh M < Eh < < o O < 0.0 £

5 o O < o <·Εη O < Eh O

-- £ O <.< < o O < Ph < Eh ^ O O O O < O < Eh <.0 L Eh O O O O O · O O Ph o

g O O <.fH O < Eh O Eh O

-- 8 1-1 0<0000Eh00 15 8491 6

O O O O O O · O < CD CD CD

< O <·< E-ι CD O < Eh «£ CD

• U < «C < o < O < O <·ο

OOO O O O O <C »CD CD O CD

O IA Eh E-1 <C · £h E-· O O Eh Eh E-· CD f-- · O OOEH<<0<EHCD

o

CD CD Eh O OOO CD CD «CD CD O

< «e E-ι < <c o · O E-1 E-· CD E-· O

CD < · < C < ,-h CD O O < O <C

O

E-'CDCDOCDCDCE-'O ia * o o

o E-< E-1 < O CD · < E-· E-ι cv < O

CD < < · O CD CD O O < .-h CD C

•E-· O CD < CD CD CD CD CD O · CD

t* E-< E-1 O < EH O · Eh O E-· E-1

Eh < < < · < o CD CD CD < CD

0*0 CD CD O O < < CD O E-1

< < < E-· O < < < · E-· O O

E-< O O < < · Eh CD O < CD C

. O

E-I O O · O < CD <IAO < CD o o

< < O O < < COEh CD Eh . Eh O

Eh < CO < O O CD <-H · O O t-! < <C

O

CD O Ε-ι·0 CD CD O E-I CD CDOO

*<<oE-iE-iE-<oocu m.o o < cd cd < o < · < e «e ,-t u < o E-I < · CD CD CD < CD < < CD · O O O E—' < <C o E-I < cc < «e o o < o < < · o o o

< < O O 0*0 CD O O O O

E-1 «e · < E-ι O E-· E-ι <c o < o CD < CD E-ι EH O < < E-i · CD <

< < < O < E-ι O · CD < CD < O

< O E-I LA*< E-I E-I CD O < O CD

• < E-I < CO < o < CD < CD E-i · CD

o E-ι < E-i E-ι cd o E-ι o · o cd o < O E-* < < · < < CD *--1 E-ι E-< E-· <

< · < < < < CD E-ι «h < O < CD

< O CD CD E-ι O CD O · < O O

< E-ι «e E-I E-I · CD E-ι CD E-I CD <

< E-· · CD CD O E-I < C O CD O

O O CD CD < O CD < E-· · < O

E-I O Ei O E-I < · < < < o «e E-ι CD O · E-· CD CD < < C o <£

— 0*0 E-I E-I O O CD CD O < O CD · CD

ia< o o O o < E-i < · < < E-· E-i

VO CD O O E-I CA.CD O O O E-I «Ϊ CD

- - O

E-I · O E-I < < CD «e o IA O O < E-I < < CD CD e O O H .< «e o O CD CD CD < · CD O E-I ·—l «e < <

CD < · < < o CD O < CD O O

E-ι O < «S < < E-ι CD <*CD E-i ... O E-i < < CD o »o < «: CD«< o O <·0 E-I O CD CD O Eh cd •E-i E-i E-ι E-· e < E-· < <c «s*o < fc-1 < E-I < CD CD · O O < <

< O O O O · CD E-ι E" CD CD < O

O o.< E-*<E-i<EhE-<E*<CD

____: o t- CD o E-· o <c <c cd*o <C CD

o E-I E-I O O CD O · < <£ u CDOO < E-I 0*0 E-I CD LA O E-ι E-I <C CV < <

ti CD CD < OCACD O CD < m . CD O

O < CD O O < · CD CD O E-ι O

< E-· < · CD E-ι O E-ι CD Eh E-ι e

•O < < EH Eh CD < O Eh Eh · O

i6 8 4 9 1 6 o < E-1 < < P O Ö O U < O C3 «Ϊ H<t <Ε-ιο<υΕ-ι< ·<Ε-< < u o o o < E-< ΟΗ0«ί<£0«ϊ P0<0c5e-(0<E-I0 Ηοο«ϊε-ιο<ο<:< u · E-· <C O O O O <C O C3 ϋ o «a: o o <c o «£ ou<<IE-'0<0E-'E-' ^UO«a:uo<c3«a:o t-«<< < E-ι E-· o u <c <£ r <ooou<<ce->

E-1 O O <C < O < O O «C

E-|u<E-'<<£E-<0E-'0 ζ-5<ϋΕ-'Ε-'θ«ϊΗΕ-'θ OOUOCUE-O

• E-< O < U E-· < O E-< O E-1 Ε-|θ< < O < E-> «=c o o E-'OOOCE-'OO'iE-1

<OUOE-'E-'OU 0*0 < < E-ι O < E-1 E-1 E-I

<-> < υ o u E-< o o o «=: U<U<<oE-|E-'00 E-iO<OOE^UO ^ΟΕ-ιΕ-ιοοο«ϊ«3:ο U0<<eC000«a:E-1 c-)OOE-'E-'OOU<o u«s:<<o<oe-i

OOE-IUOUOOE-IO

• < E-ι E-< O E-ι u <c o o E-< uoe-|cjo<co«3:e-iu uuouoe-'E-i< OCE-iO^E-'^OE-'O E-1 · u E-1 < < o o c E-1 < o<e-ioE-iuu<c«3:o Hocj<e^o<o Ε-'<<£Ε-'Ε-'<0<£Ε-,< OUOE-iU<CE-iOE-iC3 <öE-'<:ooe-'«3:ou o o«rE-'OE-'E-*oE-'

LHO O O O <£ < O o O O

mpE-'OE-'Ooooou • · E-< <C <£. O o <c o o < < OE-ioo<<e-'U ooocuE-'^oE-'E-i P^O<C<E-'OOUO ^> · t-1 o o En o e-ι c E-1 E-1 oo<E-io-a:«a:o C-500«i<0<0<0 E-'E-'E-'E-'OCOOE-'O ooe-o<ohoue^ ...' ouooue-<oo

«COOUOOE-IOOO <E-*0<E-<U0E-IC3C3 ---- ^UE-iHOE-iE-iOE-iH

- - οΕ-ιΕ-ιουοοΕ-1 •00<ϊΕ-ιΕ-ΐ0«ϊ<ϊ0υ CJpeCOC^OE-'OE-i .---. <F(CJ<<0E-IE-IC50

o E-'E-'OE-'OOE-'U

O O « O OOE-IOOOOE-I

p-=roE-'0<E-'<E-<uo E-< ·—i «=c o < < o o Ei o o ΕηΕ-ιΟΟ<«ϊοΕ-·

- - - OOOE-IOC30<«CO

E-'OOE-'E-'^UEhuO

^<<«<E-'OE-<OEiO

E-<oo<ce-'<«ce-' OOOE-,EhE-<OÖE-'C5 •aoE-<<E-,OOE-<<< οοαοοοΕ-^οοο 000<<ϊΕ-ι<Ε-' O O < O O E-I o o u < - Ε-ι·<οΕ-'<Ε-'θο<:οΗ <00UU00E-t<0< EHE-|<E-iOooo<t - OOOE-'öO<<E-iE-'< E-,<ou<ooc3o<e-i Ε-·θ<Ε-<<Ε-ιΕ-<Ε-<υ<:< I:

Claims

17 84 91 6

1. Menetelmä mahdollisesti glykosyloitujen protei-naasi-inhibiittoriaktiivisuutta omaavien proteiinien val- 5 mistamiseksi, tunnettu siitä, että viedään cDNA, joka koodaa proteiinia, jolla on sivuilla 11-13 esitetty aminohapposekvenssi I, ilmentymissysteemiin ja saatetaan se ilmentymään siellä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että käytetään cDNA:ta, joka saadaan seulomalla ihmisen maksakudosnäytteestä tehdystä cDNA-geenipankista käyttämällä koetinta, jolla on seuraava DNA-sekvenssi II: 5' GGGTTGGCTACTCTGCCCATGAAGA 3'.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että cDNA:lla on sivuilla 14-16 esitetty DNA-sekvenssi I.

4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että cDNA sisältää DNA-sekvenssin I nukleotidit 1 - noin 1330 ja 1340 - 1442 sa- 20 moin kuin DNA-sekvenssin, joka sisältää aminohappojaksoa Arg-Ser, Met-Ser, Val-Ser, Lys-Ala, Tyr-Ser tai Leu-Met vastaavat kodonit lukukehyksessä mainittujen kahden nuk-leotidisekvenssin välissä.

5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen me- 25 netelmä, tunnettu siitä, että cDNA koodaa lisäksi signaalipeptidiä.

6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan proteiinia, jolla on proteinaasia inhiboiva vaikutus ja joka 30 sisältää aminohapposekvenssin I aminohapot 1 - 443 ja/tai 446 - 480.

7. Jonkin patenttivaatimuksista 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan proteiinia, joka sisältää aminohapposekvenssin I.

8. Menetelmä jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukaisesti valmistetun proteiinin tai glykoproteiinin ie 8491 6 eristämiseksi, tunnettu siitä, että raakaproteii-ni saadaan tekemällä affiniteettikromatografia käyttäen apuna vasta-aineita, jotka on saatu tekemällä immunisointi sivuilla 11-13 esitettyä aminohapposekvenssiä I vastaavil-5 la oligopeptideillä. i9 8491 6