PT87009B

PT87009B - Processo de engenharia genetica para a preparacao de dna codificante de hibridoserpinas

Info

Publication number: PT87009B
Application number: PT87009A
Authority: PT
Inventors: Eugen Uhlmann; Friedrich Hein; Hermann Ragg; Gerald Preibisch; Werner Lindenmaier
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1987-03-20
Filing date: 1988-03-18
Publication date: 1992-06-30
Also published as: HUT46740A; DK151788A; AU1328888A; DK151788D0; DE3709255A1; JPS63267294A; FI881268A; AU611676B2; ZA881948B; EP0283932A2; FI881268A0; EP0283932A3; KR880011340A; IL85789A0; PT87009A

Description

Através da patente europeia com o ns (EP-A) 0 190 652 conhece-se uma serpina humana que recebeu entretanto a designação de Leuserpina-2 (hLS2). Nesta EP-A indica-se ainda o cDNA para a HLS2 e refere-se a possibili dade de produzir genes modificados ou genes parciais que conduzem às proteínas modificadas correspondentes em que se substituem, eliminam ou introduzem aminoácidos individuais. Menciona-se por exemplo um Principio de Construção por Peças no qual um gene parcial I, que codifica para a sequência de aminoácidos antes do centro activo, se combina com um gene parcial II, que codifica para a sequência de aminoácidos depois • do centro activo, mantendo um fragmento de gene intermédio, 1 que codifica para um centro activo.

Descobriu-se então o clono genómico que codifica para a hLS2 e esclareceu-se a sua estrutura genética. E_sta construção genética utiliza-se, de acordo com a invenção, para a preparação de novas hidridoserpinas.

As serpinas são um grupo de proteínas que tem funçSes como inibidores de proteinase na coagulação do sangue, na activação complementar e em vários aspectos das reacções inflamatórias. As serpinas pertencem a uma família de proteínas, cujos membros possuem uma homologia de aminoácidos de cerca de 20 a 35% entre si (R. F. Doolittle, Science 222 (1983), 417-419; H. Ragg, Nucl. Acids. Res. 14 (1986), 1073-1088). A especificidade destes inibidores de proteinase é determinada^ por um lado, por um aminoácido na posição PI do centro reactivo (m. Laskowski e I. r^ato, Annu. Rev. Siochem. 49(1980), 593-629), e por outro lado, por outras sequências de aminoácidos e elementos estruturais gue tem também uma clara influência sobre a actividade das serpinas. Além disso, no caso de algumas serpinas, como por exemplo o angiotensinogénio, a região N-terminal desempenha um papel funcional e estrutural próprio (S. Synder e R. Innis, Annu. Rev. Biochem. 48 (1979), 755-782).

Surpreendentemente a semelhança entre a estrutura primária e terciária das serpinas (h.Loebermann et al., J. Mol. Biol. 177 (1984), 531-556; 3. G. Bock et al. Biochemistry 25 (1986), 4292-4301( não está relacionada com qualquer estrutura genética unitária, como é o gue se verifica em muitas outras famílias de proteína, por exemplo nas globinas. De entre os genes de serpina até agora descritos apenas os da Antitripsina humana e do angiotensinogénio de rato apresentam estruturas exão-intrão equivalentes (T. T_anaka et al., J. Biol. Cifrem. 259 (1984), 8063-80 65): cada grupo de 5 exães é interrompido por 4 intrões em posição correspondentes A estrutura dos restantes genes de serpina até agora conhecidos distingue-se contudo claramente deste padrão. 0 gene de antitrombina III humana contém 6 exões (Ε. V. Prochownik et al.

J. Biol. Chem. 260 (1985), 9608-9612), contudo, apenas um dos 5 intrões se deixa homologar com uma das posições de intrão da antitripsina ou do angiotensinogénio. 0 gene do inibidor Cl humano apresenta pelo menos 7 intrões, cuja localização não é contudo ainda conhecida (S. C. Bock et. al., vide acima).

Descobriu-se então que a estrutura do gene de hLS2 corresponde à da antitripsina e à do angiotensinogenio de rato no gue respeita ao número e â localização dos intrões. Esta analogia utiliza-se de acordo com a invenção para a preparação das hibridoserpinas.

A invenção eacontrs-se definida nos seus vários aspectos nas reivindicações da patente. A concretização da invenção e as formas de execução preferenciais esclarecem-se em seguida.

A invenção representa-se ainda nas figuras 1 e 2 bem como na Tgbela 1 (anexo), para a qual, bem como para a Figura 2 e sua continuação, se indicam as seguintes observações:

A Figura 1 apresenta a estrutura do gene de hLS2, de forma esquemática. Ξχ 1 a Ex 5 representam os exões. A_s posições de corte de restrição abreviam-se do seguinte modo:

= BamHI

Bg = BglII

E = EcoRI

N = Ncol

Ss = SstI

X = Xbal

Ά » HindiII

Por BglII e Ncol assinalam-se apenas as posições de corte necessárias para a construção do gene híbrido de acordo com a Figura 2.

A Figura 2 mostra (não à escala) a. cons trução de um gene de hibridoserpina com os exões 1 a 4 de

hLS2, repres-ntados pelos espaços a cheio e referidos como Ex 1 a Ex 4 como na Figura 1, e com o exão 3'-terminal do gene de antitripsina humana representado pelo espaço a tracejado e referido como Ex cc^-AT.

Enquanto se abreviam as designações usuais dos enzimas de restrição, mantem-se valiÈs as explicações da Figura 1; além disso utilizam-se as seguintes abreviaturas :

P =* PstI

S =Sall

Sm -Smal

Xh =Xhol

K = enchimento com polimerase de Klen ow

SI - degradação com nucleaseS1

Ph = fosfotase alcalina

L = Ligante (Linker)

Δ assinala posições de corte tornadas planas por degradação ou enchimento dos extremos aguçados.

A tabela 1 mostra as sequências de DNA dos exões e das regiões adjacentes do gene de hLS2, em gue as sequências de intrões se representam por letras minúsculas. 0 sinal peptídico e o sinal AATAAA necessário para a construção de extremos de transcrição 3¹ correctos encontram-se subli· nhados. As fronteiras exão - intrão identificam-se por comparação com o cDNA de hLS2 conhecido. A seta assinala o ponto de início 5' do clono de cDNA de hLS2 mais longo até agora encontrado.

A designação hibridoserpina significa, no contexto da presente invenção, que se trata de uma proteína constituida por blocos de aminoácidos, correspondendo de facto a exões de hLS2 e de serpinas com a mesma construção genética, e que apresenta uma actividade inibitória da proteínase. Além disso, a expressão hibridoserpinas abrange os produtos natu rais que se podem obter teoricamente por combinação de exões idênticos a partir de origens diferentes.De facto quer dizer que os produtos obtidos por via da engenharia genética se podem modificar por proc.issos conhecidos, por exemplo por introdução, eliminação ou substituição de aminoácidos. Tais modificações são por exemplo possíveis por aplicação de agentes de lincagem ou de adooftadores adequados.

Ng preparação, de acordo c-..m a invenção, do gene recombinante podem também empregar-se fragmentos de genes sintéticos. Este processo tem a vantagem de se poderem introduzir posições de corte adicionais para os enzimas de restrição, permitindo modificações adicionais das sequências de aminoácidos codificados. Deste modo podem modificar-se também, por exemplo, os centros activos, e em geral produzir hibridoserpinas com uma especificidade e/ou actividade do substrato modificada.

Ng recombinação dos exões utilizam-se por conveniência todas as sequências necessárias entre os intrões, que são precisas para a junção e outros processos de pós-transcrição. Para a ligação podem-se aplanar por exemplo as séquências de DNA que sobressaem, por degradação ou enchimento dos extremos aguçados, e ligar deste modo os exões como pretendido, conforme o caso, por introdução de ligantes de oLigonucleótidos sintéticos que servem como substratos para enzimas de restrição adequados. Os exões-médulo deste tipo podem compor-se, de acordo com a invenção, numa reacção de ligase, na combinação desejada, mas na orientação relativa entre si correcta e na sequência certa. Os genes híbridos assim obtidos podem, quando não se utiliza um promotor próprio de serpina, ligar-se com um promotor eucariotico apropriado e, conforme o caso, com um sinal de poliadenilação e, ex rímir -se por introdução na célula eucariótica apropriada.

Como sistemas de vector hospedeiro podem empregar-se, de um modo por si conhecido, células superiores

como células de insectos ou de mamíferos. Conhecem-se, an- í tretanto, em grande número, tais sistemas de e.epressão sucaritódicos. Conforme o caso, pode também isolar-se o mRNA de hibridoserpina formado e utilizar-se para a síntese de cDNA, que se pode então utilizar-após introdução de sinais de transcrição adequados- para a expressão em bactérias ou leveduras. No caso de se trabalhar com leveduras podem obter-se proteínas glicosiladas típicas das leveduras. ;

/. I

Para alem da possibilidade de produzir | hibridoserpinas com especificidade e/ou actividade de subs- ;

í trato modificado, a invenção abre o caminho para a preparação ‘ de proteínas bifuncionais gue compreende por exemplo -asI actividades da angiotensina II e da antitripsina, apresentan- ! do assim, para além de um efeito regulador do teor em égua, j uma influência sobre a função da elastase.j

A invenção refere-se ainda a meios de diagnóstico gue contêm DNA genómico de hLS2 total ou parcial, para a identificação de defeitos genéticos em genes de hLS2 ou para processos de diagnóstico em que se bioridiza material contendo DNA ou RNA humano com as amostras de gene apropriadas.

Os exemplos seguinte destinam-se a ilustrar de perto a invenção. Os dados percentuais indicados são ponderais, salvo indicação em contrário.

Exemplo 1:

Isolamento de cosmídeos hl>5 2 de um banco de genes de placenta humana.

D© acordo com o método de h. Lindenmaier et al., (em; 35° Colloquium Mosbach 1984, Teh Impact of Gene Transfer Technigues in Eui.aryotic Deli Biology, Springer-Verlag Berlin, H_eidelberg 1985) preparou-se um banco de

cosmídeos, ligando-se os fragmentos de DNA humano genómicos parcialmente cindidos com MspI, com o vector pHC79-2cos/TK, tratado comClal e com fosfatase alcalina. 0 banco de cosmídeos contém cerca de 500 000 clonos independentes. Misturaram-se 1,8 x 10^ cosmídeos empilhados com 5 ml de tampão TM (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgSO₄) e 5 ml de uma cultura de 1 dia de E. ccoli DH1, desenvolvida a 57°C em meio de NZ (10 g/1 NZ-amina, 5 g/1 de cloreto de sódio, 2 g/1 MgCl₂.6 H-pO, 4 mg/1 de tiamina) com 0,4% de maltose, e incubaram-se durante 20 minutos a 37°C sem agitação. Após adição de 40 ml de meio UB (10 g/1 de Bactotrypton (Difco), 5 g/L de extrato de levedura (Difco), 10 g/1 de cloreto de sódio) e de 4 mg/1 de tiamina, agitou-se a cultura durante 1 hora a 37°C.

Distribuiram-se fracções de 5 ml desta cultura bacteriana na superfície de uma placa de agar (25x25 cm; meio LB com 1,4% de agar e 50 jag/ml de ampicilina) sobre membranas de .nitrocelulose tratadas em autoclave. Incuba- . ram-se as placas a 57°C, até as colónias apresentarem um diâmetro de cerca de 0,5 mm. A preparação de filtros de replicação, a lisagem e a fixação das colónias para a hibridação efectuou-se de acordo com métodos conhecidos (D. Hanahan e M. Meselson, Methods in Enzymology 100 (1985), 553-542; T. Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1982). Lavaram-se os filtros durante 1 hora a 42°C com prewashing solution (solução de pré-lavagem)(Maniatis et al., ref^ anterior, pag. 326).

A pré-hibridação (4 a 6 horas) e a hibridação (16 horas a 60°C) efectuaram-se na seguinte solução:

0,9 M NaCl

0,18 M Tris-HCl, pH 8,0 x Solução de Denhardt 0,2 % (peso/volume) SDS (dodecilsulfato de sódio)

200 Aig/ml DRA de timp de vitela, cortado e aquecido

200 /ig/ml RNA de levedura

0,5% (volume/volume) de detergente não iónico (Nonidet P-40; Sigma)

Como sondas para a hibridação utilizaram-se os seguintes fragmentos de restrição de cDNA de hLS2 (EP-A 0 190 652):

A) Fragmento HindIII de 1,07 kb (kilobases) do plasmídeo pH 14, que compreende a metade 5’ do cDNA de hLS2.

B) Fragmento Xmnl de 0,5 kb do plasmídeo pL10/2.

Este fragmento está localizado na metade 3’ do cDNA de hLS2 (posiç3esll21 a 1619).

Os fragmentos referidos cortaram-se, por tratamento dos respectivos plasmídeos, com os enzimas de restrição apropriados; após separação em gele de agarose, electroeluiram-se e translaccionaram-se pelo processo i<k

Q (marcação isotrópica) (> 10 cpm/ug; Maniatis et al, vide acima).

Após a hibridação, lavaram-se as membra nas durante 30 minutos (cada lavagem) à temperatura ambiente, a 45°C e a 60°C com 0,1 x SSC (1 x SSC = 0,15 M NaCl, 15 mM citrato de sódio, pH 7,0), com SDS a 0,1%.

Após secagem revelaram-se filmes de raios X com estas membranas. As colónias a hibridizar isolaram-se por diluição, desenvolveram-se sobre membranas de nitrocelulose, lisaram-se e hibridizaram-se de novo. Após novo isolamento, de entre 750 000 colónias analisadas, restaram 3 clonos independentes positivos para a hibridização. 0 clono p4R hibridizava apenas com a sonda A, mas não com a sonda B. Pelo contrário, os clonos p6R e p9R hibridizavam apenas a sonda B mas não com a sonda A.

Isolou-se o DNA cosmídeo dos clonos p p4R, p6R e p9R de acordo com o método de lisagem alcalina ; (Maniatis et al,, vide acima). As preparações de DNA cortaram-se com vários endonucleases de restrição, separaram-se j em gel de agarose a 0,7$ ou a 1$ e transferiram-se para membranas de nitrocelulose (E. Southern, J. Molec. Biol. 98 (1975), 505-517). Os fia gmentos de DNA dos oosmídeos contendo exões identificaram-se por hibridação com vários fragmentos de restrição de oDNA de hLS2 marcados radioactivamente, como se explica em seguida:

Sonda 1 ί Fragmento HinlII-BamHI, que contém a região do cDNA de hLS2 entre as posições 1 e 510. (A posição HindIII está localizada na região de polilincagem do vector pUC15j no qual se encontra clonado o cDNA hLS2).

Sonda 2 : Fragmento BamHI, que contém as posições 511 a 854 do cDNA de hLS2.

Sonda 5 : Fragmento PvuII com a região entre as posições 984 e 1599.

Sonda 4 : Fragmento Xmnl, que contém a região entre as posições 1121 e 1619·

Sonda 5 ί Fragmento EcoRI, que compreende a região entre as posições 1560 e 2081 (uma das posições EcoRI está localizada na região de polilincagem do vector pUC15).

Todas as posições aqui referidas para os pontos de corte por enzimas de restrição referem-se à cadeia de codificação do DNA.

A hibridação efectuou-se sempre a 42°C, durante a noite, no tampão de hibridação anteriorisente mencionado. As membranas lavaram-se em seguida por 2 vezes durante 15 minutos à temperatura ambiente em 2 x SSC com 0,1$ SDS e depois 2 vezes durante 15 minutos a 42° C

im 0,1 x SSC com 0,1% SDS, secaram-se e expuseram-se a filmes de raios X. Para a separação das amostras, incubaram-se as membranas durante 2 minutos em banho maria à ebulição e utilizaram-se de novo para re-hibridação.

Para a identificação do primeiro exão (Ex 1) sintetizou-se o oligonucleótido com a sequência de DNA

5’-CGCGGTGAAGAGTCTTTGTGTCTC-5 * (que aqui se refere na direcção inversa da 5’-5' habitual), de acordo com o método da fosforamidite (M.jD. Matteucci et al., J. Am. Chem. Soe. 103(1981), 3185-3191) e purifioou-se sobre um gel de poliacrilamida-ureia. A sequência do oligonucleótido derivou-se de uma sequência de cDNA de hLS2 humano, isolada a partir de ura banco de cDNA de gtlO, que se preparou de acordo oom o método de T. Huynh et al., em:

D.M. Glover (Hrsg.), DNA cloning, a Practical Approach, Vol. I, IRL Press, Oxford UK, Washington, D.C. 1985, pags. 49-78. 0 0 DNA cosmídeo do clono p4R analisou-se, como anteriormente descrito, por meio da técnica de Southern. 0 oligonucleótido com a sequência de DNA acima mencionado mar- /32 cou-se radioaotivamente com -P-ATP (NEN) e polinucleotidoquinase (Maniatis et al., vide acima). A temperatura de hibridação foi de 42°C.

A lavagem das membranas efectuou-se com 6 x SSC à temperatura ambiente (2 x 15 minutos) ou a 33°C (2 x 30 minutos).

Com base nas experiências de híbrida ção subclonaram-se fragmentos de restrição paralelos dos oosmídeos no vector pUC13 de acordo com processos padrão.

Os exões bem como as zonas de intrão vizinhas sequenciaram-se de acordo com os métodos de degradação química de A. Maxam e W. Gilbert, Methods in Enzyraology 65 (1980), 499-560,, A figura 1 mostra de modo esquemático a construção do gene hLS2 derivado por cisão de restrição e

Southern blottin

bem como por sequeneiação.

Exemplo 2:

Subclonagem de exães incluindo sequências de intrão colaterais do gene de hLS2 e construção de um gene híbrido de antitripsina hLS2-$^.

Descreve-se em seguida, como exemplo, a construção de um gene híbrido expressável de hibridoserpina, referida à Tabela 2 (e à Figura 2). Podem utilizar-se, evidentemente, em vez dos fragmentos de restrição descritos, outros fragmentos de DNA apropriados e outras combinaçães de fragmentos de DNA. Podem utilizar-se em particular, em vez de região promotora específica de hLS2, outros promotores eucarióticos, por exemplo os de um outro gene de serpina.

ω ο a φ Ρ •ρ Η φ

Φ ο τί ο S κο φ ο ítf (Β co ο α •Η ο tu 1—1 •Η Ο Td ρ Ο d S φ

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φ		Ο	β	ο	φ	φ	• •ν	-Ρ	φ
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ο	Φ	4=	β	ο	Ο	φ	Ρ	Ο
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C0	Ο	γ4			<44
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ο	ο			Ρ	Ο
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ο	•Η	Q	Ρ	-Ρ
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φ	·γ4	Η	Ρ	t>	H
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co	Ο	ο	«Η		ο
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ο	Ρ	Td	ο	Ο	Td	C0
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β	+³	Ρ		Ο	-Ρ
	ο	co	ο	Ρ	co	r-4
a	φ	Ρ	Ρ	Ρ	Ρ	C0
ο	>	4°	β	Φ	-Ρ	Cd
ο			φ	»k		1—1
	ο	Φ	S			CO
ο	β		«Η	ο	to
«0		Η	ρ	β	r-4	Φ
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Td ο ΚΟ •Η hO φ Ρ co ι

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C0 Α ρ φ Ρ

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Todos os fragmentos de restrição contendo exões abrangem simultaneamente as sequências de DNA eventualmente necessários para uma junção correcta nas fronteiras exão - intrão (B.Ruskin et al., Cell 38 (1984), 317-331;

E. Keller et al., P_roc. Natl. Acad. Sei. USA 81 (1984), 7417-7420; B. Wieringa et al., Cell 37 (1984), 915-925).

isolamento dos fragmentos de DNA sobre gel de agarose, o tratamento dos extremos dos fragmentos e a subclonagem no vector pUC13 efectuaram-se de acordo com métodos padrão (Maniatis et.al., vide acima). A orientação das inserções comprova-se por cisão de restrição e utilizam-se os plasmídeos com a orientação de inserções correcta para a construção do gene de hibridoserpina.

A ligação dos exões 1 a 4 do gene de hLS2 na sequência correcta e na orientação correcta dos exões entre si efectua-se também de acordo com métodos conhecidos.

Exemplo 3í

Subclonagem do exão 3'-terminal do gene de antitripsina humana

A partir de um clono genómico com o gene de antitripsina humana isola-se um fragmento Xhol/HindIII com 1,7 kb de comprimento com o exão 3'-terminal do gene (G. Long et al., Biochemistry 23 (1984), 4828-4837; K. Leicht et al., Nature 297 (1982), 655-659). Este exão codifica, entre outros, para o centro reactivo da proteína (G. Long et al., vide acima; R. C_arrell et al., N_ature 298 (1982), 329-334). Após separação dos extremos e introdução de ligantes de EcoRI

5' CCGAATTCGG 3' introduz-se o fragmento no vector pUC13 tratado com EcoN.I e fosfatase alcalina.

gene de antitripsina α.^ humana codifica para os aminoácidos metionina e serina no centro reactivo da proteína. Numa variante naturalmente ocorrente da antitripsina o grupo metionilo encontra-se substituído por um grupo arginilo. Esta substituição confere à proteína mutada propriedades antitrombóticas (M. Owen et al., New England J. Med. 309 (1983), 694—698). As mutações deste tipo podem introduzir-se por processos conhecidos, por exemplo através de mutagénese in vivo (b. Kramer et al., Nucleic Acids. Res. 12 (1984), 9441-9456). Os exões modificados deste modo podem empregar-se também/ naturalmente, para a construção de genes de hibridoserpina de acordo com a invenção.

Os exões 1 a 4 do gene de h.LS2 (exemplo 2) ligam-se com o exão 3’-terminal do gene de antitripsina oCp por meio de um processo conhecido.

Tabela 1

CTCGGGAGGTTGAGGCTGGXGTGAGCCAÃGÃTCÃCGCCÃCTGCACTTCTGCCreSÇTOÇ^SAeTeAGAeeêTeÇ^êMEAfcaAeAGAXAefiGeAÔSSS:

O .3	b • 0	• 0
H	0	u
<	o	H
H		0
δ	0	o
H	0	A

H	0
	§
b	§
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0 0	<! 0	1—< <í
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ti 0 E- A	Si
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53	<υ 0

g	cuo 53
0	3 0
b	3b
t-< o	ti H
C-> O	£*£
δ	0.0 53
0	0.0
£	53
0	0.0
	53

Tabela 1 (Qontinuação)

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360 369

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(Qontinuação)

Tabela

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Claims

REIVINDICAÇÕES _ L^â Processo para a preparação de hibridoserpinas, caracterizado por se recombinar um gene possuindo uma estrutura genética correspondente a h’>S 2, a part?Ír de exões de pelo menos dois genes que apresentam a estrutura exão-intrão da leuserpina-2 humana (hLS 2) e que codificam uma serpentina, e se efectuar a expressão do gene assim recombinado numa célula hospedeira.

1, caracterizado por cariótica.

Processo de acordo a célula hospedeira com a reivindicação ser uma célula euProcesso de acordo com a reivindicação
2, caracterizado por a célula hospedeira sor uma célula eucariótica superior.

_ 4 â „

Processo de acordo com as reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado por os exões codificarem sequências parciais de aminoácidos que correspondem a exões de hLS 2_tde a^-antitripsina ou de angiotensinogénio.

- IS

- 5£· Processo de acordo com uma ou mais das reivindicações anteriores, caracterizado por os exões serem flanqueados pelos sinais de junção e pelas zonas de ramificação (branch points) dos intrões correspondentes.

A requerente declara que os primeiros pedidos desta patente foram apresentados na República Federal Alemã em 20 de Março de 1987, sob o n2 p 37 09 255.3.