JPS63267294A - 複合セルピンおよびこれらをコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 欧州特許出願（ＥＰ−Ａ　）公開第０．１９０，６５２
号には、そのときから「ロイセルピン−２」（ｈＬＳ２
）と命名されたヒトセルピンが開示されている。このＥ
Ｐ−Ａでは、また、ｈ　Ｌ　Ｓ　２のｃＤＮＡを再生し
ており、個々のアミノ酸が置換、削除または挿入されて
いる適宜に修飾されたタンパク質を産生ずる修飾遺伝子
または部分遺伝子の調製の可能性についても指摘してい
る。例えば、「構築ブロック原理」について言及してい
るが、これは、活性中心の上流のアミノ酸配列をコード
する部分遺伝子Ｉを、活性中心の下流のアミノ酸配列を
コードする部分遺伝子■と結合させて、その間に活性中
心をコードする遺伝子フラグメントを挿入するものであ
る。

ｈＬＳ２をコードするゲノムクローンが今や見出され、
その遺伝子構造が決定された。この遺伝子構造は、本発
明によって新規の複合セルピンの製造に利用される。

セルピンは、血液凝固、補体の活性化および炎症反応の
種々の局面においてプロテアーゼインヒビターとして機
能する一群のタンパク質である。

セルピンは、相互のアミノ酸の相同率が約２０−３５％
であるタンパク質の一族に属している（Ｒ。

Ｆ、　０ｏｏｌｉｔｔｌｅ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２２２
　（１９８３）　４１７−４１９：　ＬＲａｇ３、Ｎｕ
ｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅｓ、　１４　（１９８６）
　１０７３−１０８８）。

これらのプロテアーゼインヒビターの特異性は、一方で
は、反応中心のＰ１位置のアミノ酸によって決定され（
Ｍ　、　Ｌａｓｋｏｗｓｋ　ｉおよび１．１ｃａｔｏ、
Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　４９　（１
９８０）　５９３−６２９）、他方では、明らかにまた
セルピンの活性に影響を及ぼす他のアミノ酸配列および
構造因子によっても決定される。これに加えて、あるセ
ルピン、例えば、アンジオテンシノーゲンなとでは、Ｎ
末端領域が独立した機能的および構造的役割を果してい
る（Ｓ、　５ｙｎｄｅｒおよびＲ，１ｎｎｉｓ、　Ａｎ
ｎｕ、　Ｒｅｖ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　４８　（１９７９）　７５５−７８
２）。

セルピンの一次および三次構造は、相互に類似している
（　Ｈ、Ｌｏｅｂｅｒｍａｎｎら：　　、Ｊ、　Ｍｏ１
．　Ｂｉｏｌ。

１７７　（１９８４）　５３１−５５６；　Ｓ、　Ｃ，
Ｂｏｃｋら：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２５　（１９
８６）　４２９２−４３０１）が、驚いたことには、こ
れは、例えば、グロビンなどの他の多くのタンパク質族
の場合のように同一の遺伝子構造に基づくものではない
。これまでに述べられてきたセルピン遺伝子の中では、
ヒトα１−抗トリシンおよびラットアンジオテンシノー
ゲンをコードする遺伝子のみが相同するエクソン／イン
トロン構造を有する（Ｔ、　Ｔａｎａｋａら：　　Ｊ、
Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　２５９　（１９８４）　８０６３−８０６
５）。各々、５個のエクソンが対応する位置で４個のイ
ン）Ｃｆンで分断されている。しかしながら、これまで
に知られている他のセルピン遺伝子の構造は、このパタ
ーンとはかなり異なっている。ヒト抗トロンビン■遺伝
子は、６個のエクソンを含む（Ｅ、　Ｖ。

Ｐｒｏｃｈｏｗｎ　ｉ　ｋ　ら：　　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、
　ＣＩ＋ｅｍ、　２６０　（１９８５）９６０８−９６
１２）が、相同性は、αｌ−ｌ−抗トリプシンはアンジ
オテンシノーゲンの５個のイントロン位置のひとつとの
間に認められるだけである。ヒトＣ１インヒビターをコ
ードする遺伝子は、少なくとも７個のイントロンを有す
るが、これらの位置はまだわかっていない（Ｓ、　Ｃ，
Ｂｏｃｋら：　前出）。

イントロンの数および位置の点から、ｂ　Ｌ　Ｓ　２遺
伝子構造は、α　−抗トリプシンおよび（ラット）アン
ジオテンシノーゲンの遺伝子構造に対応することが現在
明らかになった。この相同性は、本発明によって、複合
セルピンの製造に利用される。

本発明は、その種々の態様について特許請求の範囲に定
義されている。本発明の展開および好ましい実施態様は
、以下に説明される通りである。

本発明は、また、第１図および第２図、および表１によ
って表される（ここで、あるいは以下にいう「第２図」
は、その連続である第２ａ図をも含むものとする）。

第１図は、ｂ　Ｌ　Ｓ　２遺伝子構造を図式化して示し
たものである。　「ＥＸｌ」〜ｒＥｘ５Ｊはエクソンを
表す。制限酵素切断部位は、次のように略称されている
。

Ｂ　　　＝ＢａｍＨＩ　　　　　Ｎ　　　＝ＮｃｏＩＢ
ｇ＝ＢｇｌＩＩ　　　　　　５ｓ＝Ｓｓ　　ｔ　　ＩＥ
　　　＝ＥｃｏＲＩ　　　　Ｘ　　　＝ＸｂａＩＨ＝Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ ＢｇｌＩＩおよびＮ　ｃ　ｏ　［の場合、第２図のよう
に複合遺伝子の構築に必要な切断部位のみが表示されて
いる。

第２図（正しい比例尺ではない）は、複合セルピン遺伝
子の構造を示したもので、この遺伝子は、ｈ　Ｌ　Ｓ　
２のエクソン１から４までを有し、第１図のように中実
棒線て表示されて「ＥＸｌ」〜ｒ　Ｅ　ｘ　４Ｊと命名
されている。この遺伝子は、さソンを有し、これは、図
中斜線つき棒線て示され制限酵素の慣例名称の略称は、
第１図と同様であるが、さらに次の略号を用いた。

Ｐ　　＝Ｐｓｔｌ Ｓ　＝Ｓａ口 Ｓｍ＝Ｓｍａｌ Ｘｈ＝ＸｈｏＩ Ｉ（＝クレノウボリメラーセで埋填 ５１＝５１ヌクレアーゼで分解 Ｐ　ｈ　＝アルカリホスファターゼ Ｌ　＝リンカー △は、突出末端を分解または埋填によって平滑末端にし
た切断部位を表す。

表１は、エクソンおよびｈＬＳ２遺伝子の側面（ｆｌａ
ｎｋｉｎｇ）領域のＤＮＡ配列を示す。ここで、イント
ロン配列は、小文字で表示されている。正しい３′転写
末端の形成に必要なシグナルペプチドおよびシグナルＡ
ＡＴＡＡＡには下線を施した。

エクソン／イントロン境界は、既知の１１　ｒ−Ｓ　２
ｃＤＮＡとの比較から明らかにされたものである。

矢印は、今までに見出された最長のｈ　Ｌ　Ｓ　２ｃＤ
ＮＡクローンの５゛開始を示す。

本発明において用いる用語「複合セルピン」は、当該タ
ンパク質が、実質的にはｈＬＳ２エクソンに対応するア
ミノ酸ブロックおよび同じ遺伝子構造を有する相似セル
ピンから成り、ブａテアーゼ阻害作用を示す物であるこ
と、を意味する。　「複合セルピン」という表現は、ま
た、異なる起源からの同一のエクソンの組合せによって
理論向に得られる自然の産生物を除外する意味をもつ。

　「実質的ごこ」とは、遺伝子操作によって得られる産
生物は、公知の方法、例えは、アミノ酸の追加、削除ま
たは置換などによって修飾することができるという事実
を表すものである。これらのタイプの修飾は、例えば、
適当なリンカ−またはアダプターの挿入によって可能で
ある。

本発明に係る組換え遺伝子の製造においては、合成遺伝
子フラグメントを用いることも可能である。この方法に
は、制限酵素の切断部位が追加されて導入される可能性
があり、これによってコードされるアミノ酸配列の追加
修飾が可能になるという利点がある。このようにして、
例えば、活性中心を修飾すること、一般には、変化した
基質特異性および／または活性を有する複合セルピンを
製造することも可能になる。

エクソンの組換えにおいて、エクソンは、スプライシン
グおよび他の転写後の処理に必要なイントロン内の全て
の必要配列を包括して有効に用いられる。連結のために
は、例えば、突出しているＤＮＡ配列を分解または埋填
によって平滑末端にすることができ、こうしてエクソン
は、必要であれば、有用な制限酵素の基質として作用す
る合成オリゴヌクレオチドリンカーの挿入物と適宜連結
することができる。

このタイプのエクソンモジュールは、本発明によると、
相互に正しい相対的配置方向にあって、正しい配列であ
れば、実質的にはいかなる所望の組合せにおいてもリガ
ーゼ反応で組み立てることができる。このようにして得
られる複合遺伝子は、用いられるプロモーターがセルピ
ン固有のものでなければ、適切な真核細胞のプロモータ
ーに連結することができ、必要に応じて、ポリアゾニレ
−ジョンシグナルに連結できて、さらに、適当な真核細
胞に導入した後、それらの発現をそこで行うことが可能
である。

昆虫や哺乳類細胞のような高等細胞を、宿主／ベクター
システムとして既知の方法で用いることが可能である。

これらのタイプの真核細胞発現システムが、今や多数知
られている。必要に応じて、形成されている複合セルピ
ンｍＲＮＡを単離すること、およびこれを用いてｃＤＮ
Ａを合成して、これに適当な転写シグナルを付けた後、
細菌または酵母中で発現させるの用いることも可能であ
る。

酵母が用いられる場合には、酵母に特徴的な糖化タンパ
ク質を得ることが可能である。

変化させた基質特異性または活性を有する複合セルピン
の産生の可能性の他に、本発明は、ふたつの機能を有す
るタンパク質の製造方法を提供する。これらタンパク質
は、例えば、アンジオテンシン■および抗トリプシンの
活性を含み、したがって、水分平衡を調節するだけでな
く、エラスターゼ機能に対する阻害効果をも有する。

ざらに、本発明は、ｈＬＳ２のゲノムＤＮＡの全部また
は一部を含む診断的補助物に関する。これら補助物は、
ｈ　Ｌ　Ｓ　２遺伝子中の遺伝的欠損の検出またはヒト
ＤＮＡまたはＲＮＡを含む材料を対応する遺伝子プロー
ブとハイブリダイゼーション（対合）させる診断的方法
に使用されるものである。

本発明の詳細は、次の諸例に説明される通りである。と
くに記載がない限り、パーセント表示は重量パーセント
を表す。

１鳳 コスミドバンクの構築は、Ｗ、　Ｌ団ｄｅｎｍａｉｅｒ
らの方法（３５ｔｈ　Ｍｏ５ｈａｃｈ　ＣＣｏ１１ｏｑ
ｕｉｕ　１９８４、”　Ｔ　ｈ　ｅＩｍｐａｃｔ　ｏｆ
　Ｇｅｎｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
　１ｎＥｕｋａｒｙｏｔｉｃ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ”、Ｓｐｒｉｎ３ｅｒ−ＶｅｒｌａｇＢｅｒｌｉｎ、
　）Ｉｅｉｄｅｌｂｅｒｇ　１９８５）によって、Ｃ１
ａＩおよびアルカリホスファターゼで処理しておいたベ
クターｐ　ＨＣ７９−２ｃ　ｏ　ｓ　／　Ｔ　Ｋに結合
させた、Ｍ　ｓ　ｐ　Ｉで部分切断しておいたヒトゲノ
ムＤＮＡフラグメントを用いて行った。コスミドバンク
は、約ａｏｏ、ｏｏｏｉの独立したクローンを含む。

１．８Ｘ１０　個にパッケージングされたコスミドを、
δｍｌのＴＭ緩衝ｔ＆（５０ｍＭ）リス−塩酸、ｐＨ７
，５，１０ｍＭＭｇ５Ｏ）および５ｍｌの大腸菌ＤＨＩ
の一晩培養物と混合して、３７℃で２０分分間上うせず
にインキュベートした。この大腸菌培養は、０．４％マ
ルトースを含むＮＺ培地（１０ｇ／リットルＮＺアミン
、　５８７リツトル塩化ナトリウム、　　２ｇ／リット
ＩＬＭｇＣｌ　　２・　６　　Ｈ２Ｏ，４ｍｇ／リット
ルチアミン）中で３７℃で増殖させておいたものである
。

４ｍｇ／’）ッ）１１のチアミンを含む４０ｍ１のＬＢ
培地（１０ｇ／リッ目バクトドリブトン（ディフコ社製
）、５８７リツトル酵母抽出物（ディフコ社製）、１０
８／リツトル塩化ナトリウム）を添加後、培養液を３７
℃て１時間振とうした。

このタイプの細菌培養の試料５ｍｌを寒天プレート（２
３Ｘ２３ｃｍ、１．４％寒天および５０℃ｇ／ｍ１アン
ピシリンを含む）表面の高圧滅菌したニトロセルロース
膜上にまいた。コロニーの半径が０、　５ｍｍになるま
で、プレートを３７°Ｃて培養した。レプリカフィルタ
ーの調製、ハイブリダイゼーションのためのコロニーの
溶解および固定は、既知の方法にて行った（Ｄ、　Ｈａ
ｎａｈａｎおよびＮ。

Ｍｅｓｅｌｓｏｎ：　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ
ｎ＋ｏｌｏｇｙ　１００　（１９８３）３３３−３４２
　；　Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ　ら：　　Ｍｏ１ｅｃ旧
ａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）Ｉａｒｂｏｒ、１９８２）
。フィルターは、前洗浄ｔａ　（Ｍａｎｉａｔｉｓら：
前出、３２６頁）にて４２°Ｃで１時間洗浄した。前ハ
イブリダイゼーション（４−６時間）およびハイブリダ
イゼーション（６０℃で１６時間）を、次の溶液中で行
フた。

０．９　　Ｍ　　ＮａＣ１ ０，１８Ｍ　　）リス−塩酸、ｐＨ８，０５×デンハー
トの溶液 ０．２％（ｗ／ｖ）　Ｓ　Ｄ　Ｓ　（ソジウムドデシル
サルフエート） ２００ノ１ｇ／ｍｌせん断加熱仔つシ拘腺ＩＩＪＡ２０
０　Ｉｔ　ｇ／ｍｌ酵母ＲＮＡ ０．５％（Ｖ／Ｖ）非イオン系洗浄°剤（ノニデトＰ−
４０、シグマ社製） ハイブリダイゼーションに用いたプローブは、次のｈＬ
Ｓ２ｃＤＮＡ制限酵素フラグメントてあった（Ｅ　Ｐ−
Ａ第０．１９０，６５２号）。

Ａ）プラスミドｐＨ１４からの１．　０７ｋｂＨｉｎｄ
ＩＩＩフラグメントであって、ｈＬＳ２ｃＤＮＡの５′
側半分を包含する。

Ｂ）プラスミドｐＬ　１０／２からの０．　５ｋｂＸｍ
ｎＩフラグメント。このフラグメントは、ｈＬＳ２ｃＤ
ＮＡの３′側半分（位置１１２１−１６１９）に位置し
ている。

上記のフラグメントは、各々、関連のプラスミドを記述
の制限酵素で処理することによって切断して取り出して
、アガロースゲルにて分画し、電気的に溶出させた後に
ニックトランスレーション法に供した。　（≧１０　”
ｃｐｍ／　ｕ　ｇ　；　Ｍａｎｉａｔｉｓら：前出）。

ハイブリダイゼーションの後、膜を、室温、４５°Ｃお
よび６０℃で０．１％ＳＤＳを含む０、ｌＸ５ＳＣ（Ｉ
ＸＳＳＣ＝０．１５ＭＮａＣ１，１５ｍＭクエン酸ナト
リウム、ｐＨ７，０）で各々３０分間洗浄した。

乾燥後、これらの膜をＸ線フィルムの露出に使用した。

ハイブリダイゼーションしているコロニーを、希釈によ
って単離して、ニトロセルロース膜上て培養し、溶解し
、さらに記述したように、ハイブリダイゼーションに供
した。ざらに単離操作を行った後に、全７５０，０００
個の分析されたコロニーのうち、３個の独立したハイブ
リダイゼーション陽性のクローンが残フた。クローンｐ
４Ｒは、プローブＡとのみ対合し、プローブＢとは対合
しなかった。これとは逆に、クローンｐ６Ｒおよび１）
９Ｒは、プローブＢとのみ対合し、プローブＡとは対合
しなかった。

クローンｐ４Ｒ，ｐ６Ｒおよびｐ９ＲからのコスミドＤ
ＮＡをアルカリ溶解法にて分離した（Ｍａｎｉａｔｉｓ
ら：前出）。ＤＮＡ調製物を種々の制限エンドヌクレア
ーゼで切断して、０．７％または１％のアガロースゲル
にて分画し、ニトロセルロース膜上にまいた（Ｅ、　５
ｏｕｔｈｅｒｎ：　　Ｊ、　Ｍｏ１ｅｃ。

Ｂｉｏｌ、　９８　（１９７５）　５０３−５１７）。

コスミドのエクソンを含むＤＮＡフラグメントの同定は
、放射線ラベルした下記のｈＬＳ２ｃＤＮＡの種々の制
限酵素フラグメントとのハイブリダイゼーションによっ
て行った。

プローブ１　：　ｈ　Ｌ　Ｓ　２　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの位
置１と３１０との間の領域を含むＨｉｎｄｌｌＩ／Ｂａ
ｍＨＩフラグメント（ＨｉｎｄＩ１１部位は、ｈＬＳ２
ｃＤＮＡがクローニングされるベクターｐＵｃ１３のポ
リリンカー領域に位置する）。

プローブ２：　ｈＬＳ２ｃＤＮＡの位置３１１から８３
４までを包含するＢａｍＨＩフラグメント。

プローブ３：位置９８４と１３９９の間の領域を含むＰ
ｖｕｎフラグメント。

プローブ４：位置１１２１と１６１９の間の領域を包含
するＸｍｎＩフラグメント。

プローブ５：位置１５６０と２０８１の間の領域を包含
するＥｃｏＲＩフラグメント （ＥｃｏＲ１部位のひとつは、ベクターｐＵＣ１３のポ
リリンカー領域に位置している）。

ここに明記した制限酵素切断部位の位置は全て、ｃＤＮ
Ａのコード鎖に係るものである。

ハイブリダイゼーションは、各々４２℃で一晩上記のハ
イブリダイゼーション緩衝液で行った。

その後、膜を、０．１％ＳＤＳを含む２ｘｓｓｃ中で室
温で２×１５分間、次いで、０．１％ＳＤＳを含む０．
ｌＸ５ＳＣ中で４２℃で２×１０分間洗浄して、乾燥し
てＸ線フィルム上に露出させた。プローブを除くために
、膜を各々熱湯槽中で２分間インキュベートして、これ
を再びリハイブリダイゼーションに用いた。

第一のエクソン（Ｅｘｌ）の同定のために、ＤＮＡ配列 ３’−ＣＧＣＧＧＴＧＡＡＧＡＧＴＣＴＴＴＧＴＧＴＣ
ＴＣ−５’（これは、通常の５’−３’方向とは逆に表
示されている）を有するオリゴヌクレオチドをホスホル
アミダイト法（Ｍ、　Ｄ、　Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ　ら：
Ｊ、、Ａｍ。

Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　１０３　（１９８１）　３１８
５−３１９１）によって合成し、ポリアクリルアミド／
尿素ゲルにて精製した。

オリゴヌクレオチドの配列は、Ｔ、Ｈｕｙｎｈらの方法
によって得られたλｇｔｌｏｃＤＮＡバンクから分離さ
れたヒ）ｈＬＳ２ｃＤＮＡ配列に基づいた。

この方法は、Ｄ、　Ｍ、　Ｇｌｏｖｅｒ　（編集）、Ｄ
ＮＡＣｌｏｎｉｎｇ、ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐ
ｒｏａｃｈ、　Ｖｏｌ、　ｌ、ＩＲＬＰｒｅｓｓ、０ｘ
ｆｏｒｄ　　ＵＫ、ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＳ　Ｄ、Ｃ，
１９８５，４９−７８頁に記述されている。クローンＴ
）４ＲのコスミドＤＮＡを、サザンテクニックを用いて
上記のように分析した。上記のＤＮＡ配列を有するオリ
ゴヌクレオチドをγ−Ｐ−ＡＴＰ　（ＮＥＮ）およびポ
リヌクレオチドキナーゼ（Ｍａｎｉａｔｉｓら：前出）
を用いて放射線ラベルした。ハイブリダイゼーション温
度は４２℃であった。

膜を、６ＸＳＳＣで室温で（２Ｘ１５分間）および３３
℃で（２Ｘ３０分間）洗浄した。

ハイブリダイゼーション実験を基にして、コスミドの重
複している制限酵素フラグメントを、標準法によってベ
クターｐＵｃ１３にサブクローニングした。エクソンお
よび隣接するイントロン領域をマクサム−ギルバート化
学分解法にて配列決定した（Ａ、　Ｍａｘａｍおよび−
，Ｇ１１ｂｅｒｔ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ　６５　（１９８０）　４９９−５６０）。

第１図は、配列決定、さらに制限酵素切断およびサザン
ブロッティングによって得られたｈＬＳ２遺伝子の構造
を図示したものである。

発現可能な複合セルピン遺伝子の構築は、例を示すこと
によって、また、表１（および第２図）を参照して説明
される。もちろん、記述されている制限フラグメントの
代わりに、他の適当なりＮＡフラグメントおよびＤＮＡ
フラグメンＩ・の他の組合せを用いることは可能である
。とくに、ｈＬＳ２特異性ブロモター領域の代わりに、
他の真核細胞プロモーター、例えば、他のセルピン遺伝
子からのものを用いることも可能である。

Ｌ２ ■制限フラグメント　■含有物　■末端の修飾お■プロ
モーター領域を含むｈＬＳ２遺伝子のエクソン１ ■大ｇ［からのＤＮＡポリメラーゼ■のフレノウフラグ
メントによる埋填；５ａｌｌによる切断およびＳｌヌク
レアーゼによる処理をしておいたベクターｐＵｃ１３へ
のサブクローニング■１．３ｋｂＸｂａＩ／Ｈｚｎｄｍ ■ｈＬＳ２遺伝子のエクソン２（中でもシグナルペプチ
ドをコードする） ■フレノウフラグメントによる埋填；ＢａｍＨＩおよび
Ｓｌヌクレアーゼによって処理しておいた■ｈＬＳ２遺
伝子のエクソン３ ■Ｓｌヌクレアーゼによる切断；５ａｌＩによる切断お
よびＳ１ヌクレアーゼによる処理をしておいたベクター
ｐＨｃ１３へのサブクローニング■１．　０ｋｂＢ　ｇ
　Ｉ　ＩＩ／　Ｂ　ａｔｎＨＩ■ｈＬＳ２遺伝子のエク
ソン４ ■フレノウフラグメントによる埋Ｑ；ＳｍａＩおよびア
ルカリホスファターゼによる処理をしておいたベクター
ｐＵｃ１３へのサブクローニング全てのエクソン含有制
限フラグメントは、エクソン／イントロン境界部に正し
いスプライシングに必要なりＮＡ配列をも含んでいる（
Ｂ、　Ｒｕ５ｋｉｎら一：　　　Ｃｅ１ｌ　　３８　　
（１９８４）　　３１７−３３１；　　Ｅ、　　Ｋｅｌ
ｌｅｒ　　ら：Ｐｒｏｃ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｌ
ＩＳＡ　８１　（１９８４）　７４１７−７４２０；　
Ｂ。

Ｗｉｅｒｉｎｇａ　ら：　　Ｃｅ１ｌ　３７　（１９８
４）　９１５−９２５）。

アガロースゲルでのＤＮＡフラグメントの単離、フラグ
メント末端の処理およびベクターｐＵＣ１３へのサブク
ローニングは、標準法（Ｍａｎｉａｔｉｓら：面出）に
て行う。挿入物の位置方向は、制限酵素切断によって確
認して、正しい挿入位置方向を有するプラスミドを複合
セルピン遺伝子の構築に用いる。

正しい配列におけるｈＬＳ２遺伝子のエクソンｌから４
の連結およびエクソンの相互に正しい位置方向へ配置は
、同様に既知の方法にて行う。

遺伝子の３′末端エクソンを有する１、７ｋｂの長さの
Ｘ　ｈ　ｏ　Ｉ　／　Ｈｉ　１１　ｄ　ＩＩＩフラグメ
ントをヒトα　−抗トリプシン遺伝子を含むゲノムクロ
ーンから単離する（に、　Ｌｏｎｇら：　　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ　２３（１９８４）　４８２８−４８３
７；　Ｍ、　Ｌｅｉｃｈｔら：　　Ｎａｔｕｒｅ　２９
７（１９８２）　６５５−６５９）。このエクソンは、
なかでも、タンパク質の反応中心をコードする（Ｇ、　
Ｌｏｎｇら：前出；　　Ｒ，Ｃａｒｒｅｌｌ　ら：　Ｎ
ａｔｕｒｅ　２９８　（１９８２）３２９−３３４）。

末端の（Ｉ条復およびＥｃｏＲＩリンカ−５’ＣＣＧＡ
ＡＴＴＣＣＧ　　３’ の取り付けの後、フラグメントを、ＥｃｏＲＩおよびア
ルカリホスファターゼで処理しておいたベクターｐＵｃ
１３に連結させる。

反応中心のアミノ酸メチオニンおよびセリンをコートす
る。自然に産生されるα　−抗トリプシンの変異体にお
いては、メチオニル基がアルギニル基に置換されていた
。この変化は、突然変異タンパク質に抗血栓的性質をも
たらす（Ｍ、　０ｖｅｎら：Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　
Ｊ、　Ｍｅｄ、　３０９　（ｆ９８３）　６９４−６９
８）。このタイプの突然変異は、既知の方法、例えば、
インビトロ突然変異（Ｗ、　Ｋｒａｍｅｒら：　Ｎｕｃ
ｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　１２　（１９８４）　
９４４１−９４５６）によって導入できる。このように
１１条飽きれるエクソンは、もちろん、複合セルピン遺
伝子の本発明による構築にも用いることができる。

ｈＬＳ２遺伝子のエクソン１から４まで（例２）既知の
方法で連結させる（第２図）。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のｈＬＳ２遺伝子の構造を図示する、
説明図である。 第２図および第２ａ図は、本発明の複合セルピン遺伝子
の構築を示す、説明図である。 出１人代理人　　佐　藤　−雄

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒトロイセルピン−２（ｈＬＳ２）の遺伝子構造を
   有するエクソンに実質的に対応するアミノ酸の部分配列
   を含む、複合セルピン。 ２、ｈＬＳ２、α＿１−抗トリプシンまたはアンジオテ
   ンシノーゲンのエクソンに対応するアミノ酸の部分配列
   を含む、請求項１に記載の複合セルピン。 ３、ｈＬＳ２のエクソン／イントロン構造を有してセル
   ピンをコードする少なくとも二つの遺伝子からのエクソ
   ンからの、ｈＬＳ２に対応する遺伝子構造を有する遺伝
   子の組換え工程およびこの組換え遺伝子の宿主細胞での
   発現工程からなることを特徴とする、複合セルピンの製
   造法。 ４、宿主細胞が高等真核細胞である、請求項３に記載の
   製造法。 ５、ｈＬＳ２に対応する遺伝子構造を有するセルピン遺
   伝子のエクソンを含み、ｈＬＳ２に対応する遺伝子構造
   を有する組換え遺伝子。 ６、エクソンが、関連イントロンのスプライシングシグ
   ナルおよび分枝ポイントを側面に有している、請求項５
   に記載の遺伝子。 ７、ｈＬＳ２のエクソンを含むゲノムＤＮＡフラグメン
   ト。 ８、ｈＬＳ２からのゲノムＤＮＡ。 ９、請求項５から７までのいずれか１項に記載のＤＮＡ
   でトランスフェクションさせた宿主細胞。 １０、請求項１または２に記載の複合セルピンを含む、
   医薬物。 １１、請求項７または８に記載のゲノムＤＮＡの全部ま
   たは一部を含む、診断補助物。 １２、ヒトＤＮＡと、請求項７または８に記載のＤＮＡ
   とのまたは対応するＲＮＡとのハイブリダイゼーション
   からなる、診断法。