FI82254B - Foerfarande foer framstaellning av nya, terapeutiskt anvaendbara peptider och salter daerav. - Google Patents

Description

1 82254

Menetelmä uusien terapeuttisesti käyttökelpoisten peptidien ja niiden suolojen valmistamiseksi

Keksinnön kohteena on menetelmä uusien terapeutti-5 sesti käyttökelpoisten peptidien valmistamiseksi, joilla on kaava I

R3 _

10 R1-Tyr-X2-Gly-N-CH- (CH_) —I

l2 n^AZ2 15 jossa R1 on vety, 1 tai 2 hiiliatomia sisältävä alkyyliryh-mä tai amidinoryhmä, R2 on 1 tai 2 hiiliatomia sisältävä alkyyli, R3 on vety tai karbamyyli, X2 on D-radikaali, jolla on kaava 20 H0N-C=NH 2 ,

NH

(fH2>m -NH-CH-CO- 25 Z1 ja Z2 ovat samoina tai erilaisina kumpikin vety, halogeeni, nitro tai trifluorimetyyli ja ainakin toinen niistä on muu kuin vety, m on 2, 3 tai 4, ja n on 0, 1 tai 2, sillä edellytyksellä, että kun R3 on karbamyyli, n on aina 30 1, ja niiden suolojen valmistamiseksi.

Uudet kaavan I mukaiset peptidit on havaittu arvokkaiksi ihmis- ja eläinlääkinnässä kivun ehkäisemiseksi ja lievittämiseksi, eli mainitut yhdisteet ovat analgeetteja. 35 Kivun turvallinen ja tehokas ehkäiseminen on jo kauan ollut tutkimuksen kohteena ja lääkärin ja eläinlää- 2 82254 kärin käytettävissä on lukuisia analgeettisia lääkeaineita. On havaittu, että nämä lääkeaineet tehoavat mainitulla tavalla kahdesta toisistaan erotettavissa olevasta mekanismista joko toisen tai molempien avulla. Kumpaakaan me-5 kanismia ei vielä tunneta täysin. Toisen näistä mekanismeista, joka aiheuttaa ns. keskushermostoanalgesian, uskotaan vaikuttavan keskushermoston (aivojen ja selkäytimen) reseptoreihin, ja toinen ääreishermostoanalgesian aiheuttava menetelmä liittyy näiden rakenteiden ulkopuolisiin 10 tapahtumiin.

Lääkeaineisiin, jotka ainakin olennaisesti vaikuttavat keskushermostovälitteiseen komponenttiin, kuuluvat morfiini, heroiini ja muut opioidit [ks. esim. Goodman ja Gilman, "The Pharmacological Basis of Therapeutics", 6. 15 painos (1980), Macmillan Publishing Co., Inc.; erityisesti luku 22, ss. 494 - 534], Tällaiset yhdisteet ovat arvokkaita, koska ne tehoavat ankaraan ja monasti muistakin syistä huonosti siedettävään kipuun, esim. terminaalisai-rauteen, kuten syöpään liittyvään kipuun, leikkauksen jäl-20 keiseen kipuun ja synnytyskipuihin. Mutta kuten tiedetään (ed. viite luku 23, ss. 535 - 584) voi morfiinin ja vastaavien jatkuva käyttö johtaa fyysiseen riippuvuuteen lääkeaineesta ja lääkeaineen kasvaneeseen sietoon sekä vieroitusoireisiin käytön lopettamisen jälkeen. Tutkimukset 25 ovat osoittaneet, että nämä ilmiöt samoin kuin sivuvaikutuksena ilmenevä hengityksen lamautuminen, jotka kaikki liittyvät keskushermostoon, ovat läheisesti sidoksissa analgeettiseen tehoon.

Hiljattain havaitut ääreishermostoanalgeetit eivät 30 ole luonteeltaan opioideja.

Vuonna 1975 Hughes et ai. [Nature 255 (1975) 577 -579) raportoivat identifioineensa aivoista kaksi rakenteellisesti lähisukuista, voimakkaan opiaattiagonistiak-tiivisuuden omaavaa pentapeptidiä, jotka ristittiin metio-35 niini-enkefaliiniksi ja leusiini-enkefaliiniksi. Sittemmin on näiden ja lukuisten analogien ominaisuudet selvitetty

II

3 82254 yksityiskohtaisesti ja on saatu kuva yhdisteluokasta, jonka farmakologinen kirjo muistuttaa suuresti opioidien kirjoa. Analgeettisen vaikutuksen yhteydessä on erityisesti havaittu, että enkefaliinit aiheuttavat fyysisen riippu-5 vuuden/siedon [Wei, J. Pharmacol. Exp. Ther. 216 (1981) 12-18]. Niillä on ristisieto opioidien kanssa [Waterfield et ai., Nature 260 (1976) 620 - 625] ja ne vaikuttavat hengitystä lamauttavasti [Isom et ai., Pharmacologist 21/3 (1979) 198].

10 Tästä täysin poiketen kaavan I mukaisten peptidien indusoima analgesia syntyy olennaisesti pelkästään ääreishermostossa. Yhdisteillä ei ole merkittävässä määrin kes-kushermostoanalgeettista vaikutusta ja erityisen edullisia ne ovat siksi, etteivät ne lamauta hengitystä ja että fyy-15 sinen riippuvuus/sieto on erittäin vähäinen. Uskotaan, että nämä edulliset ominaisuudet ja vaikutuksen spesifisyys liittyvät yhdisteiden kyvyttömyyteen merkittävässä määrin läpäistä veri-aivoeste.

Kaavan I mukaisissa yhdisteissä X2 on erityisesti 20 jokin seuraavista D-radikaaleista: 2-amino-4-guanidinobutyryyli (m on 2), arginyyli (m on 3) ja homoarginyyli (m on 4).

Kun Z1 ja Z2 merkitsevät halogeenia, ne voivat olla 25 fluori, kloori, bromi tai jodi.

Kaavan I mukaisten peptidien alaluokkia muodostuu peptideistä, joissa ( i ) R1 on amidinoryhmä (ii ) R2 on etyyli 30 (iii) R3 on vety (iv) X2 on D-arginyyli (v) toinen ryhmistä Z1 ja Z2 on vety ja toinen on nitro tai fluori, edullisesti 4-asemassa (vi) n on 1.

35 Kaavan I mukaisten peptidien lisäluokan muodostavat peptidit, joissa R1 on amidinoryhmä ja R3 on karbamyyli.

4 82254

Kaavan I mukaisia peptidejä ovat: H2NC( =HN) -Tyr-D-Arg-Gly-N( C2H5) -CH2-CH2- 5 H2NC( =HN)-Tyr-D-Arg-Gly-EtPhe(4N02)-NH2, H2NC(=HN)-Tyr-D-Arg-Gly-EtPhe(4F)-NH2 ja H2NC( =HN) -Tyr-D-Arg-Gly-N( C2H5)-CH2-^^ 10 sekä niiden suolat.

Tässä aminohapoista ja niiden radikaaleista käytetyt lyhenteet ovat tekniikan tasolla tavanomaisia ja löydettävissä esim. julkaisusta Biochem. J. 126 (1972) 773 -780. Edellä ja seuraavassa tarkoitetaan aina kiraalisten 15 aminohappojen ja niiden radikaalien L-konfiguraatiota, jollei muuta ilmoiteta.

Peptidien suoloissa biologinen aktiivisuus on pep-tidiosassa ja siten happo on vähemmän tärkeä, joskin on suositeltavaa terapeuttiselta kannalta, että happo on koh-20 teelle farmakologisesti hyväksyttävä. Esimerkkejä farmako logisesti hyväksyttävistä hapoista ovat mineraalihapot, kuten kloorivety-, bromivety-, fosfori-, metafosfori-, typpi- ja rikkihappo, sekä orgaaniset hapot, kuten viini-, etikka-, sitruuna-, omena-, maito-, fumaari-, bent-25 soe-, glykoli-, glukoni-, guloni-, meripihka- ja aryyli-sulfoni-, esim. p-tolueenisulfonihappo. Farmakologisesti hyväksyttäviä suoloja ja suoloja, jotka eivät tässä mielessä ole hyväksyttäviä, voidaan käyttää vapaiden peptidien eristämiseksi ja/tai puhdistamiseksi ja ei-hyväksyttä-30 vät suolat ovat käyttökelpoisia myös siksi, että ne voidaan tekniikan tasolla tunnettujen menetelmien avulla muuttaa hyväksyttäviksi suoloiksi.

Kaavan (I) mukaisten peptidien analgeettiset ominaisuudet ja erityisesti niiden selektiivinen vaikutus 35 ääreishermostoon on osoitettu seuraavien tutkimusten avulla.

Il 5 82254 (1) Tutkittaessa analgeettista aktiivisuutta sekä kuumalevytesti [Woolfe ja MacDonald, J. Pharmacol. Exp. Ther. 80 (1944) 300] että ärsykkeen aiheuttama väänteleh-timis(ojentelu)testi [Van der Wende ja Margolin, Fed.

5 Proc. 15 (1956) 494] ovat tekniikan tasolla vakiotestejä. Vaikka uskotaan, että kipua voidaan jälkimmäisessä testissä lievittää joko keskushermoston tai ääreishermoston välityksellä, pidetään todennäköisenä, että kuumalevytestissä synnytettyyn kipuun voidaan vaikuttaa vain keskusher-10 moston välityksellä. Testattaessa näiden kirjallisuudessa kuvattujen menetelmien modifikaatioiden avulla peptidit ovat osoittautuneet huomattavasti tehokkaammiksi väänte-lehtimistestissä kuin kuumalevytestissä parenteraalisesti (ts. perifeerisesti) annettaessa. Tämä tarkoittaa sitä, 15 että tarvitaan pienempi määrä yhdistettä testiärsykkeen aiheuttaman vasteen pienentämiseksi määrätyssä määrin, mikä osoittaa vaikutuksen kohdistuvan ääreishermostoon.

(2) Analgesian kestoajat, jotka aikaansaadaan kuumalevy- ja vastaavasti vääntelehtimistestissä antamalla 20 peptidejä perifeerisesti (parenteraalisesti), osoittavat, että yhdisteet läpäisevät veri-aivoesteen suhteellisen hitaasti ja vain rajoitetusti.

(3) Peptidien perifeerisellä (parenteraalisella) annolla vääntelehtimistestissä aikaansaatu analgesia voi- 25 daan antagonisoida antamalla parenteraalisesti kvaternaa- rista opioidiantagonistia, N-allyylinormorfiinimetjodidia [N-metyylinalorfiini, Koczka et ai., Acta Chim. Acad. Sei. Hung. 51 (1967) 393], eli saman vaikutuksen aikaansaamiseksi on opioidin läsnäollessa annettava suurempi annos 30 peptidiä kuin ilman opioidia. Koska kvaternaarisen yhdisteen kyky läpäistä veri-aivoeste on minimaalinen [ks. Ta-vani et ai., European J. Pharmacol. 59 (1979) 151 - 154], sekä peptidin indusoima analgesia että sen antagoinisoitu-minen tapahtuvat ääreishermostossa.

35 On havaittu, että edellä kuvattujen analgeettisten ominaisuuksien lisäksi kaavan I mukaisilla peptideillä ja 6 82254 niiden suoloilla on (a) ripulinvastainen ja (b) yskää lievittävä vaikutus määritettyinä farmakologisten vakiomene-telmien avulla.

Kaavan I mukaiset peptidit ja niiden suolat voidaan 5 valmistaa tekniikan tason tuntemilla menetelmillä analogi sen rakenteen omaavien yhdisteiden valmistamiseksi ja pelkästään valmistuksen valaisemiseksi viitataan alla lueteltuun kirjallisuuteen.

(a) Schroder ja Luebke, "The Peptides" (Academic 10 Press, 1965).

(b) Stewart ja Young, "Solid Phase Peptide Syn-tesis" (W H Freeman & Co., 1969).

(c) Bellean ja Malek, J. Am. Chem. Soc. 90 (1968) 165.

15 (d) Beyerman, Helv. Chim. Acta 56 (1973) 1729.

(e) Tilak, Tetrahedron Letters 849 (1970).

(f) "Methoden der Organischen Chemie" (Houben-Weyl), voi. 15, "Synthese von Peptiden", osat 1 ja 2 (Georg Thieme Verlag, 1974).

20 (g) "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology",

Gross, E. ja Meienhofer, J. toim., vol. 1-4 (Academic Press, 1979).

(h) "Peptides: Syntheses, Physical Data", Voelter, W. ja Schmid-Siegmann, E., vol. 1-6 (Georg Thieme Ver- 25 lag, 1983).

(i) Atherton, E. et al., Bioorganic Chem. 8 (1979) 351 - 370.

(j) Sheppard, R. C., Chemistry in Britain, 402 -414 (1983).

30 (k) Atherton, E. et al., J. C. S. Chem. Comm., 1151 - 1152 (1981).

Kaikki edellä ja jäljempänä esitetyt kirjallisuusviitteet on liitetty tähän viitteeksi.

Erään tällaisen valmistusohjeen mukaisesti peptidit 35 ja niiden suolat valmistetaan kytkemällä peräkkäin asian mukaisia aminohappoja joko käyttäen klassisia peptidisyn-

II

7 82254 teesimenetelmiä tai kiintofaasimenetelmiä tai valmistamalla ensin peptidien alayksiköt ja kytkemällä ne sitten yhteen. Tällaiset reaktiot voidaan toteuttaa esim. aktivoimalla käytettävän aminohapon reagoiva karboksyyliryhmä ja 5 suojaamalla reagoimattomat amino- ja karboksyyliryhmät. Yllä mainitussa kirjallisuudessa on yksityiskohtaisesti kuvattu (sekä kytkemisreaktioihin että suojaryhmien poistoon liittyviä) sopivia aktivoivia ja suojaavia (maskee-raavia) ryhmiä ja sopivia reaktio-olosuhteita rasemoitumi-10 sen minimoimiseksi.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä kaavan 1 mukaisten peptidien ja niiden suolojen valmistamiseksi

a) reagenssi, jolla on kaava II

15 R1 - Y1 - OH II

jossa R1 merkitsee samaa kuin kaavassa I ja Y1 on osaradi-kaalisekvenssi, joka on identtinen vastaavan N-päätteisen osaradikaalisekvenssin kanssa kaavassa I, saatetaan rea-20 goimaan reagenssin kanssa, jolla on kaava III

H - Y2 III

jossa Y2 on identtinen yllä määritellyn tuotepeptidin lop-25 puosan kanssa ja sisältää sen vastaavan C-päätteisen osaradikaalisekvenssin, ja tarpeen mukaan reagenssit II ja III ovat valinnaisesti suojattuja ja/tai aktivoituja; ja tarpeen mukaan poistetaan suojaus tuottesta; b) vastaava C-päätteinen peptidikarboksyylihappo 30 tai sen asianmukainen reaktiivinen johdannainen amidoi- daan; c) l-amidino-3,5-dimetyylipyratsolilla tai sen kanssa ekvivalentilla reagenssilla amidoidaan vastaava peptidi, jossa X2 on D-radikaali, jolla on kaava 35 NH-R5 <ch2).

-NH-CH-CO- 8 82254 jossa m merkitsee samaa kuin kaavassa I ja R5 on vety tai amidinoryhmä, sillä edellytyksellä, että ainakin toinen ryhmistä R1 ja R5 on vety, jonka jälkeen saatu tuote tarpeen mukaan muutetaan vapaaksi tai sen suolaksi.

5 Kohdan b) mukaisesti peptidit, joissa R3 on karba-

myyli, voidaan siis valmistaa saattamalla ammoniakki reagoimaan peptidiesterin kanssa, jolla on kaava IV

10 CO.OR4 _ 1 R1-Tyr-X2-Gly-N-CH-CH2—IV 15 jossa R1, R2, X2, Zl ja Z2 merkitsevät samaa kuin kaavassa I ja -OR4 on sopiva korvautuva alkoksi-, aralkoksi- tai 20 aryylioksiryhmä, esim. 1-4 hiiliatomia sisältävä alkoksi (ts. metoksi, etoksi, propoksi tai butoksi) tai bentsyy-lioksi. Peptidikemiassa tunnetaan useita tällaisia reaktiivisia ryhmiä.

Samoin kohdan b) mukaisesti peptidit, joissa R3 on 25 vety, voidaan analogisesti valmistaa saattamalla peptidi-karboksyylihappo, jolla on kaava V

R1 · Tyr · X2 · Gly · OH V

30 tai sen johdannainen reagoimaan amiinin kanssa, jolla on kaava VI

Z1

HN(r2,-C''2-<CH2»„-<^ VI

z

II

9 82254 jolloin R1, R2, X2, Z1, Z2 ja n merkitsevät samaa kuin kaavassa I. On huomattava, että haluttaessa voidaan reaktio suorittaa samoissa olosuhteissa ja käyttäen samoja rea-gensseja ja menetelmiä (mm. yhdisteen V N-pään suojaami-5 nen) kuin kohdassa a) peptidien kytkemismenetelmien yhteydessä.

Niinpä D-arginyyli- ja D-homoarginyylipeptidit voidaan valmistaa vastaavista D-ornityyli- ja D-lysyyliyhdis-teistä ja D-(2-amino-4-guanidinobutyryyli)-peptidit saa-10 daan vastaavista D-(2,4-diaminobutyryyli)-yhdisteistä.

On huomattava, että kun vastaavassa peptidireagens-sissa sekä R1 että R5 ovat vetyjä ja R1 halutaan säilyttää vetynä kaavan I mukaisessa lopputuotteessa, on välttämätöntä suojata peptidin N-pääte amidointivaiheessa. Yllä 15 mainitussa kirjallisuudessa on yksityiskohtaisesti kuvattu sopivia suojaryhmiä ja niiden poistoa amidoinnin jälkeen.

Esterit (IV), karboksyylihapot (V) ja vastaavat D-ornityyli-, D-lysyyli- ja D-(2,4-diaminobutyryyli)-peptidit voidaan valmistaa edellä kohdassa a) kuvattuja mene-20 telmiä vastaavien vakiomenetelmien avulla.

Saatujen tuotteiden muuttaminen vapaiksi peptideiksi tai niiden suoloiksi samoin kuin saatujen suolojen muuttaminen muiksi suoloiksi voidaan toteuttaa tekniikan tasolla tunnettuja tavanomaisia menetelmiä käyttäen.

25 Kaavan I mukaisia peptidejä ja niiden farmakologi sesti hyväksyttäviä suoloja voidaan käyttää sekä ihmisettä eläinlääkinnässä ripulin ja punataudin hoidossa, yskänlääkkeenä ja kivun ehkäisemiseksi ja lievittämiseksi. Viimeksi mainitulla alueella erityisindikaatioita ovat, 30 vain muutaman esimerkin mainitaksemme, pehmeäkudosvamman aiheuttama kipu, leikkauksen jälkeinen kipu, synnytykseen liittyvä ja synnytyksen jälkeinen kipu, kuukautisiin, neuralgiaan ja myalgiaan liittyvä kipu, niveltulehdukseen ja reumaan liittyvä kipu sekä lihaskivut yleensä.

10 82254

Peptidejä ja suoloja voidaan antaa ihmis- tai eläinkohteelle suun kautta, parenteraalisesti (kuten ihonalaisesti, ihonsisäisesti, lihakseen ja laskimoon), peräsuoleen ja paikallisesti (kuten iholle, suuonteloon ja 5 kielen alle). Yhdisteen tehoannoksen koko riippuu lukuisista tekijöistä, mm. kohteesta, ko. sairaudesta ja sen vaikeusasteesta sekä antoreitistä ja viime kädessä määräävästä lääkäristä tai eläinlääkäristä, joskin halutun lopputuloksen subjektiivisesta luonteesta johtuen voidaan 10 lääkitys joissakin tapauksissa jättää ihmiskohteen harkinnan varaan.

Kaikissa yllä kuvatuissa indikaatioissa tehoannos ihmiselle on kuitenkin yleensä 0,5 - 50 mg, tavallisemmin 1 - 25 mg ja useimmiten 2 - 12,5 mg. Erityisen sopiva an-15 nos on 5 mg (kaikki annokset laskettu vapaana peptidinä; käytettäessä suolaa on arvot korjattava vastaavassa suhteessa ). Näiden määrien anto voi tarpeen mukaan tapahtua useita kertoja päivässä, esim. kolme tai neljä kertaa päivässä. Eläinlääkinnässä, esim. hoidettaessa muita nisäk-20 käitä kuin ihmistä, kuten kissoja, koiria, nautaeläimiä, lampaita, sikoja ja hevosia, voi eläinlääkäri suurentaa tai pienentää yllä mainittuja annoksia kohteen painon ja lajin mukaan.

Vaikka yhdisteitä voidaan antaa sellaisinaan, on 25 suositeltavaa antaa ne farmaseuttisen formulaatiokoostu-muksen muodossa. Tällaiset formulaatiot sisältävät edellä määritellyn kaavan I mukaista peptidiä tai sen farmakologisesti hyväksyttävää suolaa yhden tai useamman sille sopivan kantajan ja valinnaisesti muiden terapeuttisten ai-30 neosien kanssa. Kantajan (kantajien) on oltava "hyväksyttävä" siinä mielessä, että se sopii yhteen formulaation muiden aineosien kanssa eikä vahingoita formulaation saajaa.

Formulaatioihin kuuluvat sellaiset, jotka voidaan 35 antaa suun kautta, parenteraalisesti (kuten ihonalaisesti,

II

11 82254 ihonsisäisesti, lihakseen ja laskimoon), peräsuoleen ja paikallisesti (kuten iholle, suuonteloon ja kielen alle), joskin sopivin antoreitti voi riippua saajan tilasta ja lajista. Formulaatiot voivat sopivasti olla yksikköannos-5 muodossa ja ne voidaan valmistaa farmasian alalla tunnettuja menetelmiä käyttäen. Kaikkiin menetelmiin kuuluu vaihe, jossa saatetaan yhteen peptidi tai suola (tehoaine) ja kantaja, joka muodostuu yhdestä tai useammasta tarpeellisesta aineosasta. Formulaatiot valmistetaan tavallisesti 10 siten, että tehoaine ja nestemäiset kantajat tai hienojakoiset kiinteät kantajat tai molemmat sekoitetaan huolellisesti tasaiseksi seokseksi, jonka jälkeen tuote saatetaan tarpeen mukaan haluttuun formulaatiomuotoon.

Suun kautta annettavat formulaatiot voivat olla 15 erillisinä yksikköinä, kuten kapseleina, tärkkelyskapse-leina tai tabletteina, joista jokainen sisältää ennalta määrätyn määrän tehoainetta, jauheena tai rakeina, liuoksena tai suspensiona vesipitoisessa nesteessä tai vedettömässä nesteessä tai öljy-vedessä-neste-emulsiona tai vesi-20 öljyssä-neste-emulsiona. Tehoaine voi myös olla boluksen, lääkepuuron tai tahnan muodossa.

Tabletti voidaan valmistaa puristamalla tai valamalla valinnaisesti yhden tai useamman apuaineen kanssa. Puristetabletit voidaan valmistaa puristamalla sopivassa 25 koneessa vapaasti juoksevassa muodossa, esim. jauheena tai rakeina, oleva tehoaine valinnaisesti seoksena sideaineen, liukastusaineen, inertin laimentimen, liukastavan pinta-aktiivisen aineen ja dispergointiaineen kanssa. Valetut tabletit voidaan valmistaa valamalla sopivassa koneessa 30 seos, joka muodostuu jauhetusta, inertillä nestelaimenti-mella kostutetusta yhdisteestä. Tabletit voidaan valinnaisesti päällystää tai urittaa ja ne voidaan formuloida siten, että tehoaine vapautuu niistä hitaasti tai kontrolloidusti .

35 Parenteraalisesti annettaviin formulaatioihin kuu luvat vesipitoiset ja vedettömät steriilit ruiskeliuokset, i2 82254 jotka voivat sisältää hapettumisen estoaineita, puskureita, bakteriostaatteja ja liuenneita aineita, jotka tekevät formulaation isotoniseksi saajan veren kanssa, sekä vesipitoiset ja vedettömät steriilit suspensiot, jotka voivat 5 sisältää suspendointiaineita ja sakeuttamisaineita. Formu-laatiot voivat olla yksikköannos- tai moniannossäiliöissä, esim. suljetuissa ampulleissa ja pienissä pulloissa, ja ne voidaan varastoida kylmäkuivattuina (lyofilisoituina), jolloin lisätään vain steriiliä nestekantajaa, esim. in-10 jektioon tarkoitettua vettä, välittömästi ennen käyttöä. Ilman esivalmisteluja voidaan yllä kuvatuista steriileistä jauheista, rakeista ja tableteista valmistaa ruiskeliuok-sia ja -suspensioita.

Peräsuoleen annettavat formulaatiot voivat olla 15 peräpuikkoina, jotka sisältävät tavanomaisia kantajia, kuten kaakaovoita, polyetyleeniglykolia tai kovetettua rasvaa.

Formulaatioihin, jotka on tarkoitettu annettaviksi paikallisesti suuhun, esim. imeskeltäviksi tai kielen al-20 le, kuuluvat oribletit, joissa tehoaine on makua antavassa perusaineessa, kuten sakkaroosissa ja arabikumissa tai traganttikumissa, tai pastillit, joissa tehoaine on perusaineessa, kuten gelatiinissa ja glyserolissa tai sakkaroosissa ja arabikumissa.

25 Edullisia yksikköannosformulaatioita ovat sellai set, jotka sisältävät tehokkaan määrän tehoainetta, kuten yllä on kuvattu, tai sopivan osan siitä.

Paikallisesti iholle eli dermaalisti käytettävät formulaatiot voivat olla vedettömässä muodossa voiteina, 30 kasvovesinä, tahnoina, hyytelöinä, suihkeina, aerosoleina ja kylpyöljyinä. Sanonta voide käsittää formulaatiot (kuten kauneusvoiteet), jotka sisältävät rasvaisia, absorboituvia, vesiliuokoisia ja emulsiotyyppisiä perusaineita, kuten vaseliinia, lanoliinia, polyetyleeniglykoleja ja 35 niiden seoksia. Tällaiset formulaatiot ovat erityisen arvokkaita paikallisen kivun, esim. niveltulehdukseen ja

II

13 82254 reumaan liittyvän kivun ehkäisyssä ja lievittämisessä ja niitä voidaan tarpeen mukaan levittää halutulle alueelle kerran tai useita kertoja päivässä. Yhdisteen sopiva kon-sentraatio niissä on alueella 0,05 - 2 paino-% (w/w), 5 edullisesti mieluummin 0,1-1 paino-% (w/w) ja edullisimmin 0,2 - 0,5 paino-% (w/w) vapaana peptidinä laskettuna.

On selvää, että yllä erityisesti mainittujen aineosien lisäksi nämä formulaatiot voivat sisältää muita tekniikan tasolla tavanomaisia ja ko. formulaatioon liittyviä 10 aineita, esim. suun kautta annettavat formulaatiot voivat sisältää makuaineita.

Seuraavien esimerkkien tarkoituksena on valaista käsiteltävänä olevaa keksintöä sitä mitenkään rajoittamatta. Kaikki lämpötilat ovat celsiusasteina.

15 Kokeellinen osa

Lyhenteet: DMF = dimetyyliformamidi, THF = tetra-hydrofuraani, DCCI * disykloheksyylikarbodi-imidi, HOBT = 1-hydroksibentsotriatsoli, NMM = N-metyylimorfOliini, DOHA - disykloheksyyliamiini, DCU = disykloheksyyliurea.

20 TLC (Merck silikageelilevyt) liuotinsysteemeillä SI = n-butanoli/etikkahappo/vesi (3:1:1 tilavuus-osina), SII = metyylietyyliketoni, SIII = kloroformi/meta-noli/32 % vesipitoinen etikkahappo-vesi (120:90:5 tila-vuusosina), SIV = kloroformi/metanoli (8:1 tilavuusosina), 25 SV - kloroformi/metanoli/0,880 ammoniakki (120:90:5 tilavuusosina), SVI = kloroformi/metanoli/32 % vesipitoinen etikkahappo (120:90:40 tilavuusosina), SVII = kloroformi/-metanoli/0,880 ammoniakki (120:90:40 tilavuusosina).

HPLC: Pylväs: Zorbax C-8, 4,6 (sisähalkaisija) mm x 30 25 cm; liikkuva faasi: asetonitriili/0,IM ammoniumasetaat- ti, pH 4,0; virtausnopeus: 2 ml/min, detektio: 254 nm.

Yhteinen välituote eli suojattu dipeptidi BOC-Tyr-D-Arg*HCl syntetisoitiin kaavion 1 mukaisesti: i4 82254

Kaavio 1:

BOC-Tyr D-Arg-OH

H+ BOC--OH H-1 OMe 5 H+ BOC--4 OMe

BOC J-L OH

10 (A) BOC-Tyr-D-Arg-OMe 1,184 g:aan BOC-Tyrriä1 20 ml:ssa THFrää lisättiin 0,426 g NMM:ää 5 mlrssa THF:ää. Seos jäähdytettiin -25 °C:seen, käsiteltiin 0,549 g:11a isobutyyliklooriformaat-15 tia 5 ml:ssa THFrää ja annettiin reagoida kaksi minuuttia -15 °C:ssa. Esijäähdytetty liuos, jossa oli 1,0 g D-Arg-OMe·2HC1:ää2 ja 0,387 g NMM:ää 20 mlrssa DMFrää ja 2 mlrssa vettä lisättiin, ja seosta sekoitettiin 2,5 tuntia -15 °Crssa. 4,6 ml 2 M KHC03-liuosta lisättiin ja seosta sekoi-20 tettiin 30 minuuttia 0 °Crssa. Liuottimet haihdutettiin vakuumissa ja jäännöksen annettiin jakaantua etyyliasetaattiin ja veteen. Orgaaninen faasi pestiin kahdesti vedellä. Yhdistettyjen vesiuutosten pH säädettiin arvoon 7 lisäämällä etikkahappoa ja keittosuolalla kyllästämisen 25 jälkeen ne uutettiin kloroformi-butanoli-seoksella 5rl ja sitten kahdesti kloroformilla. Yhdistetyt orgaaniset kerrokset pestiin kahdesti kyllästetyllä keittosuolaliuoksella, kuivattiin magnesiumsulfaatin päällä ja konsentroitiin vakuumissa. Jäännöstä hierrettiin kuivassa eetterissä. 30 Saanto 1,28 g (74 %).

(B) BOC-Tyr-D-Arg·HC1 1,28 g suojattua dipeptidiä liuotettiin 40 mlraan metanolia ja 10 mlraan vettä. 5,7 ml 1 M NaOH-liuosta lisättiin, seosta sekoitettiin 3,5 tuntia huoneenlämpötilas-

II

is 82254 sa ja sitten neutraloitiin lisäämällä 5,7 ml 1 M HClrää. Metanoli poistettiin vakuumissa ja jäljelle jäänyt vesipitoinen liuos kylmäkuivattiin.

Epäpuhtaan tuotteen vesiliuoksesta poistettiin suo-5 lat absorboimalla Zorbax C-8 -kolonniin ja eluoimalla tämän jälkeen metanoligradientilla. Eristetty dipeptidi liuotettiin veteen, käsiteltiin yhdellä ekvivalentilla 1 M HClrää ja kylmäkuivattiin.

Saanto 0,78 g (58 %).

10 Analyysi C20H31N5O6 · HC1 ♦ 2H20

Laskettu: C 48,83 H 6,91 N 14,24 %

Saatu: C 49,06 H 6,79 N 13,73 % TLCrssä yksi täplä liuotinsysteemeillä SI, SIII ja SV.

15 Esimerkki 1 j-.

H-Tyr-D-Arg-Gly-N( Et) -CH2CH2-( VN02-diasetaatti

Kaavio 2: '-' H-Tvr D-Arg Gly N(Et) · CHZ ♦ CH2~^^^NQ2 BOC — OH H-N(Et)-CH2.CH NO 2 BOC--N(Et)*CH2*CH NO 2 25 BOC---^ OH H--N(Et) ·ΟΗ2·ΟΗ2—^^^-N02 H+ | BOC -^--N( Et) · CH2 · CH2-^^V N02 H----N( Et) .CH2.CH2-^VN°2 30 '-' A)2-(4-nitrofenyyli)etyylietyyliamiinihydrobromidi Yli yön vallitsevassa lämpötilassa sekoitettiin 10 g (50 mmol) l-bromi-2-(4-nitrofenyyli)etaania (Aldrich) ja 35 etyyliamiinin etanoliliuosta (33 %, 25 ml, n. 180 mmol).

ie 82254

Oranssinvärinen liuos haihdutettiin kiteiseksi jäännökseksi. Kiintoaines eristettiin käyttäen apuna 10 ml etanolia. Konsentroimalla suodos saatiin toinen TLC:n mukaan identtinen tuotesaanto, joka yhdistettiin ensimmäiseen saan-5 toon.

Saanto 5 g (36 %), sp. 211 - 213 eC. Tuote puhdistettiin kiteyttämällä uudelleen etanoli-eetteri-seoksesta.

Saanto 4,25 g, sp. 212 - 214 °C; TLC: homogeeninen liuotin-systeemeillä SIII ja SV.

10 Analyysi C10H15N2O2Br

Laskettu: C 43,65 H 5,50 N 10,18 Br 29,04 %

Saatu: C 43,88 H 5,73 N 10,19 Br 28,82 % (B) BOC-Gly-N( Et)-CH2CH2 N02

Liuos, jossa oli 3,89 g BOC-Gly^ä1 ja 6,00 g 15 H0BT:tä 50 ml:ssa DMF:ää, jäähdytettiin -10 °C:seen ja käsiteltiin 4,58 g:11a DCCI:tä. Reaktioseosta sekoitettiin 30 minuuttia -5 °C:ssa, ennen kuin siihen lisättiin 4,08 g 4-nitrofenetyylietyyliamiinihydrobromidia ja 1,50 g NMM:ää. Seosta sekoitettiin 72 tuntia 5 °C:ssa. Disyklohek-20 syyliurea poistettiin suodattamalla ja suodos konsentroi tiin. Jäännös otettiin etyyliasetaattiin ja pestiin kolmesti 5-%:isella Na2C03-liuoksella, kerran vedellä, kahdesti 5-%:isella sitruunahappoliuoksella ja kahdesti vedellä. Etyyliasetaattiuutos kuivattiin magnesiumsulfaatin päällä 25 ja haihdutettiin vakuumissa. Näin saatu öljy liuotettiin eetteriin, suodatettiin pienen disykloheksyyliureamäärän poistamiseksi, haihdutettiin uudelleen ja saatiin 4,76 g öljyä, joka ei kiinteytynyt hierrettäessä petrolieetteris-sä.

30 (C) H-Gly-N(Et)-CH2CH2-^^-N02*HCl 4,76 g suojattua amidia liuotettiin 35 ml:aan jää-etikkaa ja liuosta käsiteltiin 35 ml:11a 2 M HCl/etikka-happoseosta 45 minuuttia huoneenlämpötilassa. Konsentroimalla vakuumissa ja hiertämällä kuivassa eetterissä saa-35 tiin kiinteä tuote.

Saanto 3,66 g (94 %), sp. 191 - 194 °C.

Il 17 82254

Analyysi C12H18N303C1

Laskettu: C 50,09 H 6,26 N 14,61 %

Saatu: C 49,85 H 6,38 N 14,56 % (D) B0C-Tyr-D-Arg-N( Et )CH2CH2—(O^— N02 5 Liuokseen, jossa oli 1,97 g BOC-Tyr-D-Arg·HC1:ää 20 ml:ssa DMF:ää, lisättiin 1,13 g H0BT:tä. Liuos jäähdy tettiin -10 °C:seen ja siihen lisättiin 0,86 g DCCI:tä. Seosta seisotettiin 30 minuuttia -5 °C:ssa ja sitten lisättiin liuos, jossa oli 1,2 g Gly-N(Et)CH2CHj-^Q^-N02»HC1:ää 10 ja 0,42 g NMM:ää 5 ml:ssa DMF:ää. Reaktioseosta sekoitettiin 72 tuntia 5 °C:ssa. Disykloheksyyliurea poistettiin suodattamalla ja suodos konsentroitiin vakuumissa. Epäpuhtaan tuotteen annettiin jakaantua 150 ml:aan etyyliasetaattia ja 25 ml:aan vettä. Orgaaninen faasi uutettiin 15 viidesti vedellä ja yhdistettyjä vesiuutoksia ravisteltiin kolmesti 200 ml:n kanssa etyyliasetaatti-n-butanoliseosta 5:1. Etyyliasetaatti-butanoliuutokset pestiin kolmesti 150 ml:11a 5-%:ista Na2C03-liuosta, kahdesti 100 ml:11a 5-%:is-ta sitruunahappoliuosta ja kahdesti 100 ml:11a vettä, kon-20 sentroitiin vakuumissa, haihdutettiin uudelleen kahdesti vedestä ja kahdesti etanolista. Muodostunutta vaahtoa hierrettiin eetterissä.

TLC: päätäplä reagoi Paulyn reagenssin (tyrosiini) ja Sa-kaguchin reagenssin (arginiini) kanssa.

25 (E) H-Tyr-D-Arg-Gly-N(Et)CH2CH2-^Q^-N02-diasetaatti 1,90 g suojattua tripeptidiamidia liuotettiin seokseen, jossa oli 15 ml jääetikkaa ja 7,5 ml anisolia. Tätä liuosta käsiteltiin 30 minuuttia huoneenlämpötilassa 22,5 ml:11a 2 M HCl-etikkahapposeosta. Konsentroimalla vakuu-30 missä ja hiertämällä kuivassa eetterissä saatiin epäpuhdas tuote, joka liuotettiin 20 ml:aan vettä ja pestiin kahdesti eetterillä jäljelle jääneen anisolin poistamiseksi. Vesiliuos vietiin 5 x 50 cm:n karboksimetyyliselluloosaa sisältävään kolonniin ja eluoitiin ammoniumasetaatin line-35 aarisella gradientilla, pH 5,1. Pääpiikistä poistettiin ie 82254 suolat C-18-silikageelikolonnissa ja saatiin peptidituote.

Analyyttisen HPLC:n ja TLC:n (liuotinsysteemit SI, SVI ja SVII) mukaan tuote oli puhdas.

Analyysi C27H3eN806 · 2CH3C02H · H20 5 Laskettu: C 52,54 H 6,78 N 15,82 %

Saatu: C 52,74 H 7,06 N 15,58 %

[a] o* = +32,1 ° O

C (C = 1, MeOH)

ta] 5 46 = +37,9 ° J

10

Esimerkki 2 N-amidino-Tyr-D-Arg-Gly-N( Et )-ΟΗ2ΟΗ2-^0^-Ν02-diasetaatti 708 mg H-Tyr-D-Arg-Gly-N( Et)-CH2CH2-^^N02-15 diasetaattia liuotettiin seokseen, jossa oli 4 ml etanolia ja 1 ml DMF:ää. 246 mg l-amidino-3,5-dimetyyli-pyratsoli-asetaattia ja 0,2 ml trietyyliamiinia lisättiin. Seosta sekoitettiin seitsemän tuntia 55 °C:ssa ja sitten huoneenlämpötilassa yli yön. Poistamalla liuottimet vaakumissa ja 20 hiertämällä etyyliasetaatissa saatiin epäpuhdas tuote, joka puhdistettiin kromatograf ioimalla karboks ime tyyli sei-luloosakolonnissa. Eluoitiin ammoniumasetaatin lineaarisella gradientilla pH:ssa 5,1 (0,005 M -» 0,5 M). Tuotetta sisältävät fraktiot yhdistettiin ja kylmäkuivattiin kolme 25 kertaa haihtuvan puskurin poistamiseksi.

TLC (liuotinsysteemit SI, SVI ja SVII) osoitti yhden pää-komponentin. HPLC (30 %:inen asetonitriili) osoitti yhden piikin.

Analyysi C28H40N1006 · 2CH3C02H · 1,5H20 30 Laskettu: C 50,59 H 6,72 N 18,44 %

Saatu: C 50,52 H 6,72 N 18,36 % [a] p5 = +22,4 ° 7 | (C = 1, metanoli)

35 [a]s 46 = +25,1 ·J

II

i9 82254

Esimerkki 3 H-Tyr-D-Arg-Gly-EtPhe( 4N02) -NH2 -diasetaatti Kaavio 3: H-Tyr D-Arg Gly Et Phe(4 NO,)-NH, 5

BOC--OH

BOC--NH2 10 H--NH2 BOC--OH H( Et)—NH2 BOC--( Et)--NH2 15 P+ BOC--OH H--(Et)--NH2 /+ BOC--h--( Et)---NH2 20 H--i--( Et)—LnH2 (A) BOC-Phe(4N02 )-NH2 19,33 g BOC-Phe(4N02): ta3 liuotettiin DMF:ään ja jäähdytettiin -15 °C:seen. 6,30 g NMM:ää ja 8,51 g isobu-25 tyyliklooriformaattia lisättiin ja seosta sekoitettiin viisi minuuttia -15 °C:ssa. Liuoksen läpi kuplitettiin ammoniakkia tunnin ajan ja lämpötila pidettiin -15 °C:ssa vielä tunti. Reaktioseoksen läpi kuplitettiin typpeä ylimääräisen ammoniakin poistamiseksi. Sitten liuotin pois-30 tettiin vakuumissa ja saatiin kiintoaine, jonka annettiin jakaantua etyyliasetaattiin ja veteen. Orgaaninen faasi pestiin 5-%:isella sitruunahappoliuoksella, vedellä, 5-%:isella NaHC03-liuoksella ja lopuksi vedellä. Vedettömän magnesiumsulfaatin päällä kuivauksen ja haihdutuksen jäl-35 keen, kiintoainetta hierrettiin etyyliasetaattipetrolieet- terissä ja saatiin 16,94 g (88 %).

20 82254 TLC:n mukaan puhdas (liuotinsysteemit SI, SIII ja SV). Analyysi C14H19N305

Laskettu: C 54,37 H 6,15 N 13,59 %

Saatu: C 54,44 H 6,12 N 13,35 % 5 (B) H-Phe(4N02)NH2*HC1 16,9 g BOC-Phe( 4N02 )-NH2: ta suspendoitiin 150 ml: aan anisolia ja suspensiota käsiteltiin 500 ml:11a 1 M HC1-etikkahappo-seosta. 30 minuutin huoneenlämpötilassa seiso-tuksen jälkeen seos konsentroitiin vakuumissa 35 °C:ssa ja 10 jäännöstä hierrettiin kuivassa eetterissä.

Saanto 13,6 g; TLC:n mukaan puhdas (liuotinsysteemit SI, SIII ja SV).

(C) H-EtPhe(4N02)-NH2 13,6 g H-Phe(4N02)-NH2*HCl:ää suspendoitiin 200 15 ml:aan etanolia ja suspensiota käsiteltiin 18,7 g:11a

NaHC03:a. Sekoitettua suspensiota kuumennettiin palautus-jäähdyttäen ja siihen lisättiin 4,45 ml etyylijodidia. Kun suspensiota oli kuumennettu palautusjäähdyttäen viisi tuntia, seos jäähdytettiin ja suodatettiin. Jäännös kon-20 sentroitiin öljyksi, joka kiinteytyi hierrettäessä petro-lieetterissä. Tämä aine puhdistettiin kuivapylväskromato-grafioimalla silikageelillä eluoiden 5-%:isella metanolil-la dikloorimetaanissa.

Puhdistetun aineen saanto 2,75 g.

25 (D) B0C-Gly-EtPhe(4N02)-NH2 2,03 g BOC-Gly^ä1 ja 3,13 g H0BT:tä liuotettiin 20 ml:aan DMF:ää ja liuos jäähdytettiin -10 °C:een. 2,39 g DCCI:tä lisättiin ja seoksen annettiin reagoida 30 minuuttia -10 °C:ssa, ennen kuin siihen lisättiin liuos, jossa 30 oli H-EtPhe(4N02)-NH2:ta DMF:ssä. Reaktioseosta sekoitettiin yli yön 5 °C:ssa ja sitten lisättiin vielä 2,03 g BOC-Gly:tä ja 2,39 g DCCI:ää. Tämän jälkeen reaktion annettiin tapahtua 48 tuntia huoneenlämpötilassa. Disykloheksyyli-urea poistettiin suodattamalla, suodos konsentroitiin va-35 kuumissa öljyksi, joka liuotettiin etyyliasetaattiin, di-sykloheksyyliurea poistettiin suodattamalla ja suodos pes-

II

2i 82254 tiin kahdesti 5-%:isella NaHC03-liuoksella ja kerran vedellä. Kuivaamisen ja liuottimen poistamisen jälkeen saatiin 4,41 g (96 %) amorfista kiintoainetta.

TLC osoitti tuotteessa olevan hiukan disykloheksyyliureaa 5 (liuotinsysteemit SI, SIII ja SV).

(E) H-Gly-EtPhe(4N02)-NH2.HCl 4,4 g suojattua dipeptidiamidia liuotettiin 20 ml:aan anisolia ja liuosta käsiteltiin 60 ml:11a 1 M HC1-etikkahapposeosta. 30 minuutin huoneenlämpötilassa seiso-10 tuksen jälkeen seos konsentroitiin ja jäännöstä hierrettiin kuivassa eetterissä.

Saanto 3,69 g (100 %).

(F) BOC-Tyr-D-Arg-Gly-EtPhe(4N02) -NH2 1,77 g BOC-Tyr-D-Arg-HCl:ää, 0,98 g H0BT:tä ja 1,20 15 g Gly-EtPhe( 4N02)-NH2*HCl:ää liuotettiin 30 ml: aan DMF:ää ja liuos jäähdytettiin -10 °C:seen. 0,75 g DCCI:tä ja 0,37 g:aa NMM:ää lisättiin ja seosta sekoitettiin 72 tuntia 5 °C:ssa. Suodattamisen ja haihduttamisen jälkeen jäljelle jääneen öljyn annettiin jakaantua etyyliasetaatti-n-buta-20 noli-seokseen (5:1) ja NaCl:llä kyllästettyyn 5-%:iseen

NaHC03-liuokseen. Orgaaninen faasi pestiin kerran edellä mainitulla seoksella ja konsentroitiin vakuumissa. Haihduttamalla uudelleen kahdesti vedestä ja kahdesti etanolista saatiin epäpuhdas tuote, joka käytettiin sellaise-25 naan seuraavassa vaiheessa.

(G) H-Tyr-D-Arg-Gly-EtPhe( 4N02) -NH2-diasetaatti 2,13 g:aa suojattua tetrapeptidiamidia käsiteltiin 10 ml:11a anisolia ja 100 ml:11a 1 M HCl-etikkahapposeosta 40 minuuttia huoneenlämpötilassa. Haihduttamalla ja hier-30 tämällä kuivassa eetterissä saatiin epäpuhdas tuote. Tämä vietiin 5 x 50 cm:n karboksimetyyliselluloosapylvääseen ja eluoitiin ammoniumasetaatin lineaarisella gradientilla pH:ssa 5,1. Puhdasta tuotetta sisältävät fraktiot yhdistettiin ja kylmäkuivattiin kolmesti.

35 Puhdas TLC:n (liuotinsysteemit SI, SVI ja SVII) ja analyyttisen HPLC:n mukaan.

22 8 2254

Analyysi C32H47N9On · 2H20

Laskettu: C 49,93 H 6,63 N 16,38 %

Saatu: C 50,18 H 6,35 N 16,33 % [a]” = -41,8 ° Ί 5 l (C = 1, MeOH) [a]“6 = -51,2

Viitekirjallisuus: 1. J.A.C.S. 79 (1957) 6180.

10 2. Helv. Chim. Acta 41 (1958) 1867.

3. J. Chem. Soc. Japan 62 (1941) 31 Khim. Prir. Soedin (1979) 543.

Esimerkki 4 15 N-amidino-Tyr-D-Arg-Gly-EtPhe(4N02)-NH2-diasetaatti 321 mg H-Tyr-D-Arg-Gly-EtPhe(4N02)-NH2-diasetaattia liuotettiin 2 ml:aan etanolia ja 0,5 ml:aan DMF:ää. 108 mg l-amidino-3,5-dimetyylipyratsoliasetaattia ja 0,09 ml tri-etyyliamiinia lisättiin, seosta sekoitettiin viisi tuntia 20 55 °C:ssa ja sitten yli yön huoneenlämpötilassa. Liuotti mien poistamisen jälkeen saatu epäpuhdas tuote vietiin karboksimetyyliselluloosapylvääseen ja eluoitiin ammonium-asetaatin lineaarisella gradientilla pH:ssa 5,1 (0,005 M -» 0,5 M). Eristämällä puhdistettu peptidi toistetun kylmä-25 kuivaamisen avulla saatiin aine, joka oli puhdas TLC:n (liuotinsysteemit SI ja SVI) ja HPLC:n (30 %:inen aseto-nitriili) mukaan.

Analyysi C29H41Nn07 · 2CH3C02H · 2, 5H20 Laskettu: C 48,29 H 6,58 N 18,78 % 30 Saatu: C 47,92 H 6,28 N 18,61 % [a]” = -44,2 ° 0 / (C = 1, metanoli) [a]g 46 = -53,6 ° ^ 35 Seuraavassa esitetyt peptidit valmistettiin pepti- dikemiassa tunnetuilla vakiomenetelmillä, jotka vastaavat edellisissä esimerkeissä kuvattuja menetelmiä. Kaikki yh- 11 23 82254 disteet eristettiin ja karakterisoitiin diasetaattiaddi-tiosuoloina, jollei muuta ilmoiteta.

Yhdisteiden, joille ei ole esitetty optisen kierron arvoja, alkuaineanalyysiarvot olivat seuraavat: 5 Esim. 6 Laskettu: C 53,17 H 6,97 N 15,50 Saatu: C 53,03 H 6,89 N 15,58

Esim. 7 Laskettu: C 51,81 H 7,06 N 16,99

Saatu: C 52,00 H 6,76 N 17,06

Esim. 19 Laskettu: C 51,88 H 6,83 N 15,34 10 Saatu: C 51,50 H 6,69 N 15,75

Esim. 20 Laskettu: C 54,62 H 7,05 N 14,39

Saatu: C 54,80 H 6,99 N 14,50

Esim. 28 Laskettu: C 47,88 H 6,40 N 13,96

Saatu: C 47,68 H 6,48 N 14,08 15 24 82254 Ό ΙΛ -J· OJIA o o o o o o o o o o Π Ό τ— Γ'*- ΓΌ Γ*» Ό 0 Γ^-3

X Q r-t-sfNN .(O •CO.iOJ

1—1 --i + + + ι + ι ι ι i + +

i~H

o c dj 4-> 0) e UV \ (VI ^ o ooooo o Οσα 1 1 o co vj- <r r-- o ° *— 0 r— m rv.

.,11 · · · · · uv · o · . .

X en -ί Ό N N M « (— · T— OCO

(J ro ro (M m r\j to r— r™ ro ro io ro + + + + I + IIII+ +

(VI

<vi xxxxxxxxxxxxxx (M rvi rvi io n _i nj t— ci-OU-OOi-L.u_ou-U_u_tJOu.

M IZIZZIUZ!IIIZI

'ίΐ'ί’ΐ I'ii I'S-njro^j-irM 'ί <r νΤ < nj C * (VI ( Ο Ο Ο τ— ί— s— <— τ— x— o o „ rvi (vi pj rvi nj rvi ro x x χ x x z

X XXXXXXZZZZZHXX

o o o o o o O (-)(_>(-> o <_> uvuvuvuvuvuvuvrouvuvuvuvuvuv <m xxxxxxxxxxxxxx

X (VJ (VI (VI (VJ (VJ (VI (VI <-J (VJ (VJ (VJ (VJ (VI (VI

u u u u u u u u u u u u u 0>O0)CDCT0)CT0)CnCT01CTCTCT (VI (-(-(-1-1-1.(.(-(.(.1.1.(.1.

> I I I I I I I I I I I I

QQQiSQQOQiaQOÖQO

/-S

2 z

X X

o: irx'-'x'-'xxxxxxxxx u o *7\j *oj

X X

3 ia Ό Is- oo O o r\J ro ia Ό Γ*- oo fr^r-r-r-r-r-r-r- k 0) e

•H

W

ω

II

25 82254 Ό o o o ο o ο o αααοα

IA Ο Ό Ό Ό τ- 00 tV CV O 00 (V IA

(V IA ······ v i · i t~I IA O V· Is- O *— Ό O Ό 00 T— ^r , . IA IA IV (V fA IA <V ΓΑ fV IA IA «-

J + + + + + ++ + + + + I

LJ A

O

e rö

-M

0)

E

IA S OOOOOOO o o o o o (MO T- vO 00 O 00 *— fV IA Is- V- O 00 n ····· · i · · · · - . Il «o IA Γ*·- O (V A- CV fA ΓΑ *— tv tv Y f\l f\l T- (NJ ΓΑ AJ AJ fA fV M fV i—

u <-) + + + + + + + + + + + I

LJ ^ tv tv (V o o —> —< —«

IV XXXXXXXZZOOO

l I I I I X X X

CV CV rA IA tA

tv tv tv tv tv (V

«- OU-OU-OU-O o Q —' —' —1 i- c_ M ZlZIZIZZZUOODCOU- i tv i rv i rv ι il tt li il rv tv tv vvvvvvvvj-v C *— <— O O t— * <— *— t— t— *— <— *— t—

("V (V

fA XX

CC xxxxxxxxxzxxxxz o o O <_>

IA IA IA IA IA IA IA IA IA IA IA LA IA IA IA

rv xxxxxxx xxxxxxxx cc tv tv tv tv tv (V IV tv tv tv tv tv (V (V rv

UUUUUUU UUUUOUUU

en en en oi o> oi oi oicnoicioioioici x <<<<«£<:< cc<c<ccc«j:«c

I I I I I I I I I I I I I I I

oaaaotooooaoooaa r% r' ιτ> rs rs r> rs 2 2 Z 2 2 2 22

X X X X X X XX

T- ♦· m ·· - ΓΟ ·· ·· ·· Q£ X X W W S^ N-/ X W X X W X V s—r OOOOOOO O <_><-> z z z z z z zz tv tv tv tv tv tv rv ro

XXXX X X XX

Ή a; v

TJ O CD r- tvrAViA^rv-00OO«—(VA

d) T-tV(VtV<VfVtV(\|iVrViVtArArAfA

E

. Ή to ω 26 82254

Esimerkki 34 H-Tyr-D-Har-Gly-N( Et )-CH2-CH2-^Q^N02-diasetaatti

TFA

(A) H-D-Lys-OH

5 10 g D-lysiinihydrokloridia liuotettiin 55 ml:aan 1 M NaOH-liuosta ja liuosta käsiteltiin 11 ml:11a s-etyy-litrifluoritioasetaattia. Seosta sekoitettiin voimakkaasti seitsemän tuntia huoneenlämpötilassa hitaassa typpivirras-sa. Yli yön huoneenlämpötilassa seistouksen jälkeen seos 10 jäähdytettiin jäissä ja tuote eristettiin suodattamalla ja pestiin pienellä tilavuudella kylmää vettä ja sitten etanolilla. Kuivattiin P205:n päällä.

Saanto 4,5 g; yksi täplä TLC:n mukaan liuotinsysteemeillä SI ja SIII.

15 Analyysi C8H13N203F3

Laskettu: C 39,67 H 5,41 N 11,57 %

Saatu: C 39,69 H 5,55 N 11,43 % TFA merkitsee trifluoriasetyyliryhmää

TFA

20 (B) BOC-Tyr-D-Lys-OH

5,11 g BOC-Tyr-OH:ta ja 2,09 g N-hydroksisukkin- imidiä liuotettiin seokseen, jossa oli 20 ml dioksaania, 5 ml etyyliasetaattia ja 10 ml DMF:ää. Liuos jäähdytettiin -5 °C:seen ja käsiteltiin 3,75 g:lla DCCl:ää. Seosta sekoi- 25 tettiin tunti -5 °C:ssa ja annettiin sitten lämmetä tunnin aikana huoneenlämpötilaan. DCU poistettiin suodattamalla ja suodos pestiin etyyliasetaatilla. Yhdistetyt suodokset jäähdytettiin jäissä ja käsiteltiin liuoksella, jossa oli

TFA

30 4,4 g H-D-Lys-0H:ta ja 3,06 g NaHC03:a 90 ml:ssa vettä ja 15 ml:ssa DMF:ää. Reaktioseosta sekoitettiin yli yön huoneenlämpötilassa, suodatettiin ja konsentroitiin vakuumis-sa haihtuvien orgaanisten liuottimien poistamiseksi. Muodostunut vesipitoinen DMF-liuos laimennettiin vedellä ja 35 pH säädettiin arvoon 3,5 lisäämällä kiinteätä sitruunahappoa. Tuote uutettiin etyyliasetaatilla (1 x 150 ml, 2 x 75 li 27 82254 ml) ja yhdistetyt orgaaniset uutokset pestiin 50 ml:11a 5-%:ista sitruunahappoa ja kahdesti 50 ml:11a vettä, kuivattiin vedettömän magnesiumsulfaatin päällä, konsentroitiin ja saatiin 10,6 g öljyä, jota ei karakterisoitu.

5 (C) BOC-Tyr-D-Lys-OH

Edellisestä vaiheesta saatu tuote liuotettiin 56 ml:aan metanolia ja käsiteltiin 56 ml:11a 1 M NaOH-liuos-ta. 20 tunnin huoneenlämpötilassa seisotuksen jälkeen pH säädettiin arvoon 7,0 lisäämällä IM HCl:ää ja metanoli 10 poistettiin vakuumissa. Muodostunut liuos laimennettiin 250 ml:11a vettä ja tehtiin happamaksi pH-arvoon 4,0 1 m HClillä. Reagoimatta jäänyt lähtöaine pestiin pois kolmesti 100 ml:11a etyyliasetaattia ja tuote eristettiin absorboimalla 2,5 x 50 cm:n C18-silikapylvääseen, eluoitiin 15 vedellä suolan poistamiseksi ja sitten eluoitiin metano-lilla. Metanolieluaatti konsentroitiin ja muodostunut jäännös liuotettiin veteen ja kylmäkuivattiin.

Saanto 5,21 g; puhdas TLC:n mukaan liuotinsysteemissä S1II.

20 Analyysi C20H31N3O6· 1,5HzO

Laskettu: C 55,04 H 7,80 N 9,63 %

Saatu: C 55,02 H 7,64 N 9,73 % (D) BOC-Tyr-D-Har-OH♦HC1

Liuosta, jossa oli 3,5 g BOC-Tyr-D-Lys-OH:ta 20 25 ml:ssa etanolia, käsiteltiin 2,11 g:11a l-amidino-3,5-di-metyylipyratsoliasetaattia ja 1,7 ml:11a trietyyliamiinia. Seosta seisotettiin 7,5 tuntia 65 °C:ssa ja sitten yli yön huoneenlämpötilassa. Liuottimen poistamisen jälkeen jäännöksen annettiin jakaantua 25 ml:aan 4-%:ista etikkahappoa 30 ja 25 ml:aan etyyliasetaattia. Vesifaasi eristettiin, pestiin jälleen 20 ml:11a etyyliasetaattia ja vietiin 5 x 47 cm:n karboksimetyyliselluloosapylvääseen. Gradienttieluu-tiolla 0,005 M -* 0,1 M ammoniumasetaatilla, pH 5,1, ja sitten kylmäkuivaamalla saatiin 3,6 g epäpuhdasta tuotet-35 ta. Tätä ainetta puhdistettiin edelleen käänteisfaasikro-matografioimalla C8-silikalla ja muutettiin lopuksi hydro- 28 82254 kloridikseen.

Saanto 2,86 g; TLC: yksi pääkomponentti liuotinsysteemeis-sä SI ja SIII.

Analyysi C21H34N506C1 · H20 5 Laskettu: C 49,85 H 7,12 N 13,85 %

Saatu: C 49,69 H 7,02 N 14,06 % (E) BOC-Tyr-D-Har-Gly-N(Et)-CH2-CH2 —^O^-N02 487,5 mg BOC-Tyr-D-Har-OH«HCl:ää ja 270 mg HOBT:tä liuotettiin 10 ml:aan DMF:ää. Liuos jäähdytettiin -5 10 °C:seen ja käsiteltiin 206 mg:11a DCCI:tä. Seosta seisotettiin 30 minuuttia 0 °C:ssa, käsiteltiin 287,5 mg:11a Gly-N(Et)CH2-CH2-^3^-NO*HCl:ää Ja 101 »g: 11a NMM:ää ja sekoitettiin 72 tuntia +5 °C:ssa. DCU:n poistamisen ja vakuu-missa konsentroinnin jälkeen jäännöksen annettiin jakaan-15 tua 75 ml:aan 5-%:ista sitruunahappoliuosta ja 50 ml:aan etyyliasetaattia. Eristetty vesikerros pestiin kahdesti 50 ml:11a etyyliasetaattia ja pH säädettiin arvoon 6,0 lisäämällä kiinteätä K2C03:a. Tuote uutettiin kolmesti 75 ml:11a etyyliasetaatti-n-butanoliseosta 4:1, yhdistetyt uutokset 20 haihdutettiin kuiviin ja haihdutettiin sitten uudelleen kerran vedestä ja kolmesti etanolista ja saatiin kiinteä vaahto.

Saanto 800 mg; TLC: yksi pääkomponentti liuotinsysteemeis-sä SI ja SIII.

25 (F) H-Tyr-D-Har-Gly-N(Et)-CH2-CH2-/Q\-N02- diasetaatti 800 mg suojattua peptidiä liuotettiin seokseen, jossa oli 5 ml anisolia ja 10 ml etikkahappoa ja liuosta käsiteltiin 10 ml:11a 2 M HCl:ää etikkahapossa. Kolmenkym-30 menen minuutin kuluttua huoneenlämpötilassa liuottimet poistettiin vakuumissa ja muodostunut jäännös liuotettiin veteen ja pestiin eetterillä. Epäpuhdas tuote puhdistettiin ioninvaihtokromatografioimalla karboksimetyylisellu-loosalla.

35 TLC: puhdas liuotinsysteemeissä SI ja SVI.

Analyysi C28H40N8O6«2CH3C02H · 0, 5H20

II

29 82254

Laskettu: C 53,86 H 6,87 N 15,71 %

Saatu: C 53,59 H 6,98 N 15,92 % ta] p5 = +36,6 ° 1 L (C = 1, metanoli)

5 [a] g 46 = +44,6° J

Esimerkki 35 N-amidino-Tyr-D-Har-Gly-N( Et) -CH2-CH2-^^-N02-diasetaatti 10 Liuosta, jossa oli 263 mg Tyr-D-Har-Gly-N(Et)-CH2- CH2 -^>-N02-diasetaattia 2 ml:ssa etanolia, käsiteltiin 115 mg:11a l-amidino-3,5-dimetyylipyratsoliasetaattia ja 0,1 ml:11a trietyyliamiinia kaikkiaan 10 tuntia 60 °C:ssa. Etanolin poistamisen jälkeen epäpuhtaan tuotteen annettiin 15 jakaantua veteen ja etyyliasetaattiin. Vesiliuos puhdistettiin karboksimetyyliselluloosapylväässä (2,5 x 45 cm). TLC: puhdas liuotinsysteemeissä SI, SVI ja SVII.

Analyysi C29H42N1006 · 2CH3C02H · 2, 5H20 Laskettu: C 50,06 H 6,95 N 17,70 % 20 Saatu: C 50, 21 H 6,72 N 17,65 %

Esimerkki 36 H-Tyr-D-Arg-Gly-N(Et)-CH2-CH2-/Q\-N02-diasetaatti (A) BOC-Tyr-D-Arg-Gly-OBzl·HC1 ' ' 25 Liuos, jossa oli 1,42 g B0C-Tyr-D-Arg-0H*HCl:ää, 0,81 g HOBT:tä, 1,06 g H-Gly-OBzl-tolueenisulfonaattia ja 0,303 g NMM:ää 15 ml:ssa DMF:ää, jäähdytettiin -5 °C:seen ja käsiteltiin 0,618 g:11a DCCI:tä. Seosta sekoitettiin 24 tuntia 4 °C:ssa, suodatettiin sitten ja suodos konsent-30 roitiin vakuumissa. Jäännöksen annettiin jakaantua 100 ml:aan etyyliasetaattia ja 100 ml:aan jääkylmää 1 M HCl:ää. Vesikerros uutettiin kerran 100 ml:11a ja kahdesti 50 ml:11a etyyliasetaattia, yhdistetyt orgaaniset uutokset pestiin kolmesti 50 ml:11a 5-%:ista NaHC03-liuosta ja ker-35 ran 50 ml:11a kyllästettyä NaCl-liuosta, kuivattiin, haihdutettiin ja saatiin amorfinen kiintoaine.

30 8 2254

Saanto 1,44 g, ei karakterisoitu; TLC osoitti, että tuotteessa oli DCU:ta.

(B) BOC-Tyr-D-Arg-Gly-OH.HC1 1,44 g bentsyylieetteriä liuotettiin 50 ml:aan me-5 tanolia ja hydrattiin 140 mg:11a 10-%:ista palladium-hii-likatalyyttiä. Neljän tunnin kuluttua katalyytti poistettiin suodattamalla, liuotin haihdutettiin vakuumissa ja tuotetta hierrettiin eetterissä.

Saanto 1,15 g.

10 (C) B0C-Tyr-D-Arg-Gly-N(Et)-CH2-CH2-/QVN02 530,5 mg B0C-Tyr-D-Arg-Gly-0H*HCl:ää, 270 mg Η0ΒΤ:tä, 275 mg HN-(Et)-CH2-CH2-^)-N02-HBr:ää ja 101 mg Et3N:ää liuotettiin 10 ml:aan DMF:ää. Liuos jäähdytettiin 15 -5 °C:seen ja sitä käsiteltiin 206 mg:11a DCCI:tä. Seosta sekoitettiin 72 tuntia 5 °C:ssa ja työstettiin yllä kuvatulla tavalla.

Saanto 640 mg.

(D) H-Tyr-D-Arg-Gly-N(Et)-CH2-CH2-^0^-N02-diasetaat- 20 ti 640 mg suojattua peptidiä liuotettiin seokseen, jossa oli 11 ml anisolia ja 16 ml etikkahappoa ja liuosta käsiteltiin 16 ml:11a 2 M HCl:ää etikkahapossa. Kolmenkymmenen minuutin kuluttua huoneenlämpötilassa reaktioseos 25 konsentroitiin vakuumissa ja jäännöksen annettiin jakaan tua veteen ja eetteriin. Epäpuhdas tuote eristettiin vesi-kerroksesta kylmäkuivaamalla ja puhdistettiin ioninvaih-tokromatografioimalla karboksimetyyliselluloosalla.

TLC: puhdas liuotinsysteemissä SI; HPLC-profiili oli 30 identtinen vaihtoehtoista reittiä eristetyn tuotteen kans sa.

[a]*4·5 = +33,5 ° 7 \ (C = 1, MeOH)

[a]52,V = +40,4°J

II

35 I 31 82254

Analyys i C27H3eNe06 · 2CH · C02H · 2, 5H20 Laskettu: C 52,54 H 6,78 N 15,82 %

Saatu: C 52,46 H 7,32 N 16,08 % 5 Esimerkki 37 H-Tyr-D-Arg-Gly-EtPhe( 4N02) -NH2-diasetaatti (A) H-EtPhe( 4N02)-OH*HC1 5 g H-EtPhe(4N02)-NH2: ta kuumennettiin palautus jäähdyttäen neljä tuntia 100 ml:ssa 6 M HCl:ää. Vaaleankeltai-10 nen liuos jäähdytettiin, pidettiin jääkaapissa yli yön ja saatiin 4,6 g tuotetta likaisenvalkoisina neulasina, jotka sulivat hajoten 272 - 275 °C:ssa.

Analyysi C11H15N204C1

Laskettu: C 48,09 H 5,46 N 10,20 % 15 Saatu: C 48,22 H 5,47 N 10,20 % (B) H-EtPhe( 4N02)-OMe·HC1 50 ml:aa metanolia käsiteltiin 2 g:11a tionyyliklo-ridia -15 °C:ssa ja 4,12 g H-EtPhe(4N02)0H*HCl:ää lisättiin. Seosta sekoitettiin kaksi tuntia 20 °C:ssa ja kuumen-20 nettiin sitten palautusjäähdyttäen kaikkiaan 24 tuntia. Liuotin poistettiin vakuumissa ja epäpuhdas tuote kiteytettiin 40 ml:sta MeOH:ta ja 40 ml:sta eetteriä.

Saanto 3,4 g.

(C) B0C-Gly-EtPhe(4N02)-OMe 25 3,0 g BOC-Gly:tä ja 3,5 g HOBT:tä liuotettiin 20 ml:aan DMF:ää. Liuos jäähdytettiin jäissä ja käsiteltiin 3,3 g:11a DCCIrtä. Kolmenkymmenen minuutin kuluttua lisättiin liuos, jossa oli 3,3 g H-EtPhe(4N02)-0Me*HCl:ää ja 1,27 g NMM:ää 30 ml:ssa DMF:ää ja 1 ml:ssa vettä, ja reak-30 tioseosta sekoitettiin yksi tunti 0 °C:ssa ja sitten yli yön huoneenlämpötilassa. TLC:n mukaan reaktio ei ollut päättynyt. Vielä 1,18 g DCCI:tä lisättiin ja seosta sekoitettiin 24 tuntia. DCU poistettiin suodattamalla ja DMF haihdutettiin vakuumissa. Jäännös otettiin etyyliasetaat- 32 8 2 2 5 4 tiin ja liuosta pidettiin kaksi tuntia jääkaapissa. DCU poistettiin suodattamalla ja etyyliasetaattiliuos pestiin neljästi 5-%:isella NaHC03-liuoksella, kahdesti 10-%:isella sitruunahappoliuoksella, kahdesti vedellä ja kerran keit-5 tosuolaliuoksella. Liuos kuivattiin, konsentroitiin ja saatiin 2,69 g öljyä, joka käytettiin sellaisenaan seuraa-vassa vaiheessa.

TLC osoitti, että tuotteessa oli DCU:ta.

(D) H-Gly-EtPhe( 4N02)-OMe·HC1 10 2,3 g:aa suojattua dipeptidiä käsiteltiin 33 ml:11a 1 M HCl:ää etikkahapossa yksi tunti huoneenlämpötilassa. Vakuumissa konsentroinnin jälkeen saatu jäännös liuotettiin veteen, pestiin kolmesti eetterillä ja kylmäkuivat-tiin.

15 Saanto 1,42 g.

(E) BOC-Tyr-D-Arg-Gly-EtPhe(4N02 )-OMe

Liuos, jossa oli 1,96 g BOC-Tyr-D-Arg-HCl:ää ja 1,11 g HOBT:tä 17 ml:ssa DMF:ää, jäähdytettiin jäissä ja sitä käsiteltiin 0,93 g:11a DCCI:tä. Seosta sekoitettiin 20 tunti 0 °C:ssa ja käsiteltiin sitten liuoksella, jossa oli 1,42 g H-Gly-EtPhe(4N02)-OMe·HC1:ää ja 0,42 g NMMtää 17 ml:ssa DMF:ää. 24 tunnin huoneenlämpötilassa seisotuksen jälkeen lisättiin vielä 0,42 g DCCI:tä ja seosta sekoitettiin 24 tuntia. Tavanomaisen työstön jälkeen saatiin 3,6 g 25 tuotetta.

( F) H-Tyr-D-Arg-Gly-EtPhe( 4N02) -OMe-diasetaatti 3,6 g:sta suojattua tetrapeptidimetyyliesteriä poistettiin suojaus tavalliseen tapaan ja esteri puhdistettiin kromatografioimalla karboksimetyyliselluloosalla. 30 Saanto 1,55 g.

Analyysi C29H«0N808 · 2CH3C02H · 1,5H20 Laskettu: C 51,09 H 6,62 N 14,44 %

Saatu: C 51,15 H 6,44 N 14,70 % (G) H-Tyr-D-Arg-Gly-EtPhe( 4N02) -NH2-diasetaatti 35 0,5 g tetrapeptidimetyyliesteriä liuotettiin 25 ml:aan metanolia. Liuos jäähdytettiin jäissä ja se kyl- tl 33 82254 tettiin vedettömällä ammoniakilla. Kolvi suljettiin ja sitä seisotettiin 24 tuntia huoneenlämpötilassa. TLC: n mukaan reaktio oli päättynyt. Ammoniakin ylimäärä ja meta-noli poistettiin haihduttamalla ja saatiin epäpuhdas tuo-5 te, joka puhdistettiin ioninvaihtografioimalla karboksime-tyyliselluloosalla. TLC:n ja HPLC:n mukaan tuote oli identtinen vaihtoehtoista reittiä valmistetun tuotteen kanssa.

Analyysi C28H39N907*2CH3C02H*1H20 10 Laskettu: C 51,13 H 6,52 N 16,78 % saatu: C 51,21 H 6,43 N 17,06 %

Farmakologiset tulokset (A) Kuumalevytesti 15 Uroshiiriä (kanta CFLP, Hacking ja Churchill) ase tettiin yksitellen kuparipohjalla varustettuun, 55-astei-seen vesihauteeseen ripustettuun pleksilaatikkoon ja hiirissä tarkkailtiin merkkejä levottomuudesta, kuten tassujen heiluttelua tai nuolemista. Reaktioaika (maksimi 30 20 sekuntiin saakka) merkittiin muistiin. Sitten viiden eläimen muodostamille ryhmille annettiin ruiskuttamalla ihonalaisesti joko testiyhdistettä tai kontrollina toimivaa keittosuolavehikkeliä (0,85 %) ja testi toistettiin 15 minuuttia käsittelyn jälkeen. Testiyhdisteiden ED50-arvot 25 laskettiin käsittelyn jälkeen reagoivien eläinten lukumäärästä, joiden reaktio aika oli kaksi kertaa pidempi kuin vastaava arvo ennen käsittelyä.

(B) Ärsykkeen aiheuttama vääntelehtimistesti (I) Etikkahappo. Viiden CDl-naarashiiren (Charles 30 River) muodostamat ryhmät saivat ihonalaisina ruiskeina joko testiyhdistettä tai kontrollina toimivaa keittosuola--vehikkeliä (0,85 %) 15 minuuttia ennen kuin vatsaonteloon ruiskutettiin 0,6-%:ista etikkahappoa tilavuusannoksena 25 ml/kg. Kahdenkymmenen minuutin kuluttua laskettiin ärsyk-35 keen indusoimat vääntelehtimis- tai ojenteluliikkeet 2,5 minuutin aikana. Vääntelehtimisenä/ojenteluna pidettiin 34 82254 takaraajan ojentelua, johon liittyi vatsan kokoonvetämis-tä.

(II) Fenyylibentsokinoni (PBQ). Tämä testi suoritettiin rinnan etikkahappotestin kanssa, mutta sillä erol-5 la, että vääntelehtimis- tai ojenteluliikkeiden kestoajan laskeminen aloitettiin 10 minuuttia PBQ-ärsykkeen annon jälkeen. PBQ-annos oli 2,5 mg/kg eli tilavuusannoksena 10 ml/kg.

Testiyhdisteiden ED50-arvot laskettiin lineaarireg-10 ressio-analyysin avulla annokselle, jolla kontrolleihin verrattuna ilmeni vain puolet vääntelehtimisien/ojentelu-jen lukumäärästä.

(C) Kvaternaariseen opioidiin liittyvä antagonismi

Kuuden TFW-uroshiiren (Tuck) muodostamat ryhmät 15 saivat vatsaonteloruiskeena joko N-metyylinalorfiinia (16 mg/kg) tai kontrollina keittosuolavehikkeliä (0,85 %) tilavuutena 10 ml/kg ja 20 minuutin kuluttua testiyhdisteen keittosuolaliuosta (10 mg/kg, ihonalaisesti) ja vielä 30 minuutin kuluttua 0,6-%:ista etikkahappoa (25 ml/kg, vat-20 saonteloon). Vääntelehtimisien/ojentelujen kokonaismäärä ryhmää kohti määritettiin viiden minuutin aikana, joka aika alkoi 15 minuuttia etikkahapon annon jälkeen. Lineaa-riregressioanalyysin avulla laskettiin testiyhdisteiden ED50-arvot [määriteltyinä kuten edellä kohdassa (B)] sekä 25 niitä vastaavat annossuhteet, ts. suhteet yhdisteen annoksille, jotka tarvittiin saman epämiellyttävän ärsytysvaikutuksen saavuttamiseksi kvaternaarisen yhdisteen läsnäollessa ja ilman sitä.

(D) Yskää lievittävä teho 30 Tässä testimenetelmässä, joka oli modifikaatio Bou- ra et al.'in [Br. J. Pharmac., 39/1 (1970) 225] kuvaamasta menetelmästä, marsuja käsiteltiin 30 % sitruunahappoa sisältävällä aerosolilla 30 minuuttia sen jälkeen, kun tes-tiyhdistettä, joka oli liuotettu 0,85 paino-%:iseen (w/w) 35 keittosuolaliuokseen, oli annettu ihonalaisena ruiskeena. Yskimisten lukumäärä laskettiin 12,5 minuutin altistuksen

II

35 8 2 2 5 4 aikana. ED50-arvot (annos, joka tarvittiin yskimisten lukumäärän vähentämiseksi 50 %:lla keittosuolaliuoksella käsiteltyihin kontrolleihin verrattuna) laskettiin lineaari-regressioanalyysin avulla.

5 Tulokset ilmenevät oheisesta taulukosta ilmaistuna arvona mg yhdistettä/kg kehonpainoa, ja tarpeen mukaan vapaana peptidinä.

NE: ei vaikutusta, p.o. - suun kautta, * testiyhdistettä annettu 30 minuuttia ennen etikkahappo/PBQ:ta, ** testi 10 toistettu 30 minuuttia käsittelyn jälkeen.

36 82254 I P Ό r— r— 2 >i « O O O O .

W (U * · O · 0 U ΓΟ C · Ο α « c o

C <U

«o m M M w >, > p

Q

I 2 tn a) “ c 2 41 ο t> in -o <i- <— CCDfl' ' J ' sq α;<ιη'— ^ ° -<r o ro m c

·»-( *H

a ή

Ή I H

P «0

iJ rl (\J

<U OP „ *- o o!S§ CO ^ GO ~ s § o CPin 'O o r\JOOoa WC P 0

WO P D

> HI ·Η Λ « P ~

U I

~ P „ Γ>- 0 . oo a _

3 ο ?$ ~ °. O

.g Λ 'O O 2 ° ° O

* rH <0 >. — r>i

«Ρ -H

01 C 6 C I P ·* * ·* -K * * a> z p „ m m o o o .J, c oo · · · •00·*^'^ P Ό O'fOrn NM Mo N>f Or- πιλ

3 g nl o o . ^ 0>r- c , °.JQ

po, o · Ο · Ο · O O ^ .

£ · ° o o · e Φ a · · · a .

p cl a ο.

OJ “·

P

§ Q * "0 ft j, *0 -tl

►> rv -K · O' M XL

oj mm CO ro o 2

ro OOO S

— M O *- · O · · f-, O O o ° P * · +j a cl

M

♦ >i OOO * ... j, !> _ ο o ooo ^ p .1-00. ^ *“ ^ o o m m o S ^ r-* O 5 § LU UJ ILI LLJ ‘ 3 p z Z 2 2 . Q- «e o <u ·

-— Q) CL

< p ' Ή cn Ή Ή o c c 04 -H ·.-( 0 **H ·Η u in cn 0) aJ -«-4 o oo OJ O-PCco *-< cn ro ^ ro

4J ^ ω ·Η 4J

(/1 4-J£-H(T3 ·..· · •h wo4-(4j ε ε ε ε ε Ό M Ό U c -H -H -H -H --» x; djcoai w w w w w sh qmso. ωωωω ω li 37 8 2 2 5 4 (E) Teho ripuliin

Cobs Wistar-naarasrottien (Charles River) annettiin paastota 24 tuntia ennen testiyhdisteen antoa suun kautta vesiliuoksena annostilavuutena 10 ml/kg. Viisitoista mi-5 nuuttia yhdisteen annon jälkeen kukin rotta sai suun kautta 1 ml risiiniöljyä ja sitten eläimistä tarkkailtiin ripulin oireita. Kunkin yhdisteen ED50-arvot, jotka laskettiin annoksena (mg vapaata peptidiä/kg kehonpainoa),joka tarvittiin ripulin lievittämiseksi 50 %:ssa eläimiä, joh-10 dettiin tuloksista, jotka saatiin määrättyinä ajankohtina risiiniöljyn annon jälkeen.

Yhdiste 1,0 h* 1,5 h* 2,0 h* 2,5 h*

Esim. 1 8,5 30,3 40,5

Esim. 2 1,9 3,2 16,7 28,6 15 Esim. 3 0,11 0,31 0,46

Esim. 33 0,02 0,03 0,02 0,05 * risiiniöljyn annon jälkeen (F) Kardiovaskulaariset vaikutukset 20 Esimerkin 2 yhdistettä liuotettuna 0,85 paino- %:iseen (w/w) keittosuolaliuokseen annettiin Wistar-uros-rotille (300 - 400 g) bolusruiskeena laskimoon annostilavuutena 0,1 ml/100 kg kehonpainoa. Annostusalueella 0,01 - 1,0 mg/kg (laskettuna vapaaksi peptidiksi) voitiin havaita 25 annoksesta riippuvaa hypotensiota ja siihen liittyvää bra-dykardiaa.

(G) Toksisuus

Hiiressä esimerkin 2 yhdiste osoittautui toksiseksi seuraavasti: 500 mg (emästä)/kg p.o.: 1/5 eläintä kuoli, 30 200 mg (emästä)/kg s.c.: 5/5 eläintä kuoli.

Farmaseuttiset formulaatiot

Seuraavassa "yhdisteellä" tarkoitetaan yllä määritellyn kaavan I mukaisen peptidin suolaa, jonka paino on laskettu vapaaksi peptidiksi.

38 82254 (A) Kapseli

Yhdiste 5,0 mg

Magnesiumstearaatti 0,75 mg Laktoosi BP ad 200,0 mg 5 Aineosat sekoitettiin ja seoksella täytettiin kova- gelatiinikapseleita siten, että jokainen sisälsi 5,0 mg yhdistettä vapaaksi peptidiksi laskettuna.

(B) Tabletti

Yhdiste 5,0 mg 10 Avicel PH 101 22,5 mg

Heikosti substituoitu hydroksipropyylisellu-loosa 9,0 mg

Polyvinyylipyrrolidoni 15 K30 6,0 mg

Magnesiumstearaatti 0,75 mg

Laktoosi BP ad 150,0 mg (C) Kylmäkuivattu ruiske

Yhdiste 5,0 mg 20 Mannitoli 62,5 mg

Injektioon tarkoitettu vesi ad 2,5 ml

Mannitoli ja yhdiste liuotettiin 9/10:aan veden kokonaismäärästä ja loput vedestä lisättiin liukenemisen 25 tapahduttua. Liuos steriloitiin steriileissä olosuhteissa suodattamalla sopivan steriilin, steriloivan suodattimen läpi ja pakattiin puhtaisiin, steriileihin pulloihin, 2,5 ml pulloa kohti. Pullojen kaulaan työnnettiin löyhästi kylmäkuivaustulpat ja pullot kylmäkuivattiin. Pullot sul-30 jettiin inerttikaasukehässä ja tulpat varmistettiin alu-miinikauluksella.

(D) Peräpuikko

Yhdiste 5,0 mg

Kovetettu rasva BP ad 1000,0 mg

II

39 82254 (E) Ihonhoitoneste Yhdiste 0,4 g

Sorbitaanimonolauraatti 0,6 g

Polysorbate 20 0,6 g 5 Setostearyylialkoholi 1,2 g

Glyseriini 6,0 g

Metyyli-p-hydroksibentsoaatti 0,2 g

Puhdistettu vesi BP ad 100,00 ml

Metyyli-p-hydroksibentsoaatti ja glyseriini liuo-10 tettiin 70 ml:aan vettä 75 °C:ssa ja sorbitaanimonolauraatti, polysorbaatti 20 ja setostearyylialkoholi sulatettiin yhdessä 75°C:ssa ja seos lisättiin vesiliuokseen. Muodostunut emulsio homogenoitiin, homogenaatin annettiin jäähtyä jatkuvasti sekoittaen ja veden loppuosaan liuotettu yhdis-15 te lisättiin. Tuote sekoitettiin homogeeniseksi.

Claims (20)

1. 40 82254
2. 1. Menetelmä uusien terapeuttisesti käyttökelpoisten peptidien valmistamiseksi, joilla on kaava I 5 i 2 i3 JFVzl R -Tyr-X -Gly-N-CH-(CH2)n—( ( J[)
3. 1. X^-T^Z2 H 10 jossa R1 on vety, 1 tai 2 hiiliatomia sisältävä alkyyliryhmä tai amidinoryhmä, R2 on 1 tai 2 hiiliatomia sisältävä alkyyli, R3 on vety tai karbamyyli,
4. 15 X2 on D-radikaali, jolla on kaava H_N-C=NH
5. 2. NH «fVm
6. 20 -NH-CH-CO- Z1 ja Z2 ovat samoina tai erilaisina kumpikin vety, halogeeni, nitro tai trifluorimetyyli ja ainakin toinen niistä on muu kuin vety, 25. on 2, 3 tai 4 ja n on 0, 1 tai 2, sillä edellytyksellä, että kun R3 on karbamyyli, n on aina 1, ja niiden suolojen valmistamiseksi, tunnet-t u siitä, että 30 a) reagenssi, jolla on kaava II R1-Y1-0H II jossa R1 merkitsee samaa kuin kaavassa I ja Y1 on osaradi- II 41 82254 kaalisekvenssi, joka on identtinen vastaavan N-päätteisen osaradikaalisekvenssin kanssa kaavassa I, saatetaan reagoimaan reagenssin kanssa, jolla on kaava III
7. 5 H-Y2 III jossa Y2 on identtinen yllä määritellyn tuotepeptidin loppuosan kanssa ja sisältää sen vastaavan C-päätteisen osaradikaalisekvenssin, ja tarpeen mukaan reagenssit II ja 10 III ovat valinnaisesti suojattuja ja/tai aktivoituja; ja tarpeen mukaan poistetaan suojaus tuotteesta; tai b) vastaava C-päätteinen peptidikarboksyylihappo tai sen asianmukainen reaktiivinen johdannainen amidoi-daan; tai 15 c) l-amidino-3,5-dimetyylipyratsolilla tai sen kanssa ekvivalentilla reagenssilla amidinoidaan vastaava peptidi, jossa X2 on D-radikaali, jolla on kaava NH-R5 20 I 2. m -NH-CH-CO- jossa m merkitsee samaa kuin kaavassa I ja R5 on vety tai amidinoryhmä, sillä edellytyksellä, että ainakin toinen 25 ryhmistä R1 ja R5 on vety, jonka jälkeen saatu tuote tarpeen mukaan muutetaan vapaaksi peptidiksi tai sen suolaksi.
8. 2. Patenttivaatimuksen 1 b) mukainen menetelmä kaavan I mukaisen peptidin tai sen suolan valmistamiseksi, 30 jossa R3 on karbamyyli, tunnettu siitä, että ammoniakki saatetaan reagoimaan peptidiesterin kanssa, jolla on kaava IV 42 8 2 2 5 4 i°'°r4 zl iv R1-Tyr-X2-Gly-N-CH-CH0—( Cl) «2
9. 5 R jossa R1, R2, X2, Z1 ja Z2 merkitsevät samaa kuin kaavassa I ja -OR4 on sopiva korvautuva alkoksi-, aralkoksi- tai aryylioksiryhmä.
10. 3. Patenttivaatimuksen 1 b) mukainen menetelmä kaa van I mukaisen peptidin tai sen suolan valmistamiseksi, jossa R3 on vety, tunnettu siitä, että peptidi-karboksyylihappo, jolla on kaava V
11. 15 R1-Tyr-X2-Gly.OH V tai sen reaktiivinen johdannainen saatetaan reagoimaan amiinin kanssa, jolla on kaava VI 20 HN(R2)-CH2-(CH2)n-<^^^’ z 25 jolloin R1, R2, X2, Z1, Z2 ja n merkitsevät samaa kuin kaavassa I.
12. 4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että R1 on amidinoryhmä. 30 5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen me netelmä, tunnettu siitä, että X2 on D-arginyyli.
13. 6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että R2 on etyyli.
14. 7. Jonkin patenttivaatimuksista 1, 2 ja 4 - 6 mu-35 kainen menetelmä, tunnettu siitä, että R3 on kar- bamyy1i. Il 43 82254
15. 8. Jonkin patenttivaatimuksista 1 ja 3 - 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että R3 on vety.
16. 9. Jonkin patenttivaatimuksista 1, 3 - 6 ja 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että n on 1.
17. 10. Jonkin patenttivaatimuksista 1-9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että toinen ryhmistä Z1 ja Z2 on vety ja toinen on nitro tai fluori.
18. 11. Jonkin patenttivaatimuksista 1-9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että toinen ryhmistä Z1 10 ja Z2 on vety ja toinen on 4-asemassa.
19. 12. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä peptidin valmistamiseksi, joka on _ H2NC( =HN)-Tyr-D-Arg-Gly-N( C2H5) -CH2-CH2-/q\-N02 , H2NC(=HN)-Tyr-D-Arg-Gly-EtPhe(4N02) -NH2, '—
20. 15 H2NC(=HN)-Tyr-D-Arg-Gly-EtPhe(4F)-NH2 tai H2NC( =HN)-Tyr-D-Arg-Gly-N(C2H5)-CH2—~^0) tai sen suolan valmistamiseksi, tunnettu siitä, että amidinoidaan kutakin vastaava kaavan I mukainen pep-20 tidi, jossa R1 on vety. 44 8 2 2 5 4