HU193569B

HU193569B - Process for producing new tri-and tetra-peptides and pharmaceutical compositions containing them

Info

Publication number: HU193569B
Application number: HU842048A
Authority: HU
Inventors: Georges W Hardy; Lawrence A Lowe; Terence W Smith
Original assignee: Wellcome Found
Priority date: 1983-05-26
Filing date: 1984-05-25
Publication date: 1987-10-28
Also published as: EP0127154A2; ATE57188T1; EP0127154A3; GB8314646D0; GR81890B; NZ208283A; AU2870184A; ES8606395A1; CA1251898A; IL71932A; ES8604991A1; DK258884D0; EP0127154B1; US4540682A; IL71932A0; ES545189A0; FI842104A; DE3483338D1; HUT34764A; FI842104A0

Description

A találmány tárgya eljárás az ember- és állatgyógyászatban egyaránt hasznos gyógyhatású új peptidek, valamint ilyeneket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására.

A találmány szerinti eljárás közelebbről az (I) általános képletü vegyületek,valamint savaddíciós sóik előállítására vonatkozik, amelyek az ember- és állatgyógyászatban egyaránt, értékes fájdalomcsillapító hatásuk alapján hasznosíthatók.

Az (I) általános képletben R¹ jelentése hidrogénatom, 1-2 szénatomos alkil- vagy amidinocsoport,

R² jelentése 1-2 szénatomos alkilcsoport,

R³ jelentése hidrogénatom vagy karbamilcsoport,

X² jelentése (a) általános képletü D-konfigurációjú csoport, amelyben m jelentése 3 vagy 4,

Z¹ és Z² jelentése lehet azonos vagy különböző, és mindegyik lehet hidrogénatom, halogénatorh, nitro- vagy trifluor-metil-csoport és legalább az egyik jelentése hidrogénatomtól eltérő, és n jelentése 0, 1 vagy 2, feltéve, hogy ha R³ jelentése karbamilcsoport, n jelentése mindig 1.

X² előnyös jelentései a következő D-csoportok: arginil (m=3) és homoarginil (m=4).

Z¹ és Z² halogéncsoportok előnyös jelentései fluor-, klór-, bróm- vagy jódatom.

A hatásos mértékű fájdalomcsillapítás régóta tárgya a legkülönbözőbb kutatásoknak, amelyek során nagyszámú fájdalomcsillapító szert vizsgáltak meg ember- és állatgyógyászati felhasználásra. Ezekről a szerekről megállapították, hogy hatásukat két különböző mechanizmus szerint — amelyek közül vagy mindkettő, vagy csak az egyik hat — fejtik ki.

Az egyik ilyen mechanizmus szerint a gyógyszerek úgynevezett központi fájdalomcsillapító hatásúak, és hatásukat a központi idegrendszer receptorainak tulajdonítják (agy és gerincvelő), míg a perifériális fájdalomcsillapítók más mechanizmus szerint ható szerek és működésüket e rendszeren kívüli területeken fejtik ki.

A központi közvetítéssel ható szerek közé tartoznak például a morfin, a heroin és más opiod jellegű vegyületek (lásd például Goodman és Gilman, „The Pharmacological Basis of Therapeutics, 6. kiadás (1980), Macmillan Publishing Co., 22. fejezet 494—534). Ezek a vegyületek igen hatásosak erős és makacs fájdalmak esetében, így például rákos megbetegedések, műtétek utáni fájdalmak vagy szülési fájdalmak esetében. Ismeretes továbbá, hogy ezen szerek ismételt adagolása esetében

H₂NC/:HN/.Tyr.D - Arg.Gly fizikai függőség, gyógyszermegszokás, valamint a megvonással kapcsolatos jelenségek léphetnek fel (lásd például a fentiekbeh idézett könyv 23. fejezete, 535—584). A kutatá5 sok során kimutatták, hogy ezek a jelenségek, valamint a további káros mellékhatások, mint például a légzési nehézségek, összefüggnek a központi idegrendszerrel és kapcsolatban vannak a gyógyszerek erősségével.

¹θ A találmány szerinti eljárással előállított vegyületek perifériális típusú fájdalomcsillapítók, és így nem opiod jellegűek.

Hughes és munkatársai 1975-ben beszámoltak (Natúré, 1975, 225, 577—579) szerke15 zetileg hasonló pentapeptidről, amelyek erős opiát agonista hatásúak, és amelyek neve metionin-enkefalin és leucin-enkefalin. Ezek¹nek, valamint számos analógjuknak tulajdonságát megvizsgálva, megállapították, hogy farmakológiai tulajdonságaik igen hasonlóak az opiodok tulajdonságaikhoz. Különösen kimutatható volt, hogy fájdalomcsillapító hatásmechanizmusuk alapján a fizikai függőség és a megszokás jelensége esetükben is 25 fentáll (Wei, J. Pharmacolog. Exp. Ther., 216, 12—18, 1981), továbbá a kereszt-megszokás opiodokkal (Waterfield et. al., Natúré, 1976, 260, 624—625), valamint légzési nehézséget is okoznak [Isom és mtársai, Pharma30 col. 21/3, 198 (1979)].

Ezzel ellentétben a találmány szerinti eljárással előállított (I) általános képletü peptidek csak perifériális fájdalomcsillapító hatásúak. A vegyületek központi íájdalomcsilla35 pító hatással nem rendelkeznek, légzési nehézséget nem okoznak, és csak igen kis mértékű a veszélye a fizikai függőségnek és megszokásnak. Ezeket az előnyöket,valamint specifikus hatásukat annak tulajdonítjuk, 40 hogy a vegyületek egyáltalán nem kereszteződnek vér-liquorgáttal [blood/brain barrier].

Az (I) általános képletü vegyületek alcsoportjai közül megemlítjük azokat a vegyü45 leteket, amelyekben

i) R¹ jelentése amidinocsoport, ii) R² jelentése etilcsoport, iii) R³ jelentése hidrogénatom, iv) X² jelentése D-arginil-csoport,

ν) Z¹ és Z² jelentései közül az egyik hidrogénatom, a másik nitrocsoport vagy fluoratom, előnyösen a 4-es helyzetben, vi) n jelentése 1.

Az (I) általános képletü vegyületek továb5 bi előnyös alcsoportját képezik azok a vegyületek, amelyekben R¹ jelentése amidino- és R³ jelentése karbamilcsoport.

A találmány szerinti eljárással előállított (I) általános képletü vegyületek közül előj nyösek például a következő vegyületek: n/c₂h₅/.ch₂.ch₂-c₆h_u-no₂

H₂NC/:HN/.Tyr.D-Arg.Gly. EtPhe/4F/.NH₂H₂ NC/:HN/-Tyr-D-Arg-Gly-EtPhe(4F)-NH₂H₂ NC/:HN/-Tyr-D-Arg-Gly-N:C₂H₅)-CH₂-C₆Hi»-5F

-2193569

A találmány leírása során alkalmazott rövidítések azonosak a szakterületen általánosan alkalmazott rövidítésekkel [például Biochem. J. (1972) 126, 773—780], Az eddigi, valamint a további hivatkozásokban a királis aminosavak konfigurációja, hacsak másként nem jelöljük, L-konfiguráció.

A találmány szerinti eljárással előállított (1) általános képletű peptidek savaddíciós sóinak biológiai aktivitása a peptid-résznek tulajdonítható, így a sók előállításához alkalmazott savak fajtájának lényegében nincs különösebb jelentősége, bár a farmakológiailag elfogadható savakat előnyben részesítjük. Ilyen savak például a következők: sósav, foszforsav, metafoszförsav, salétromsav, kénsav, borkősav, ecetsav, citromsav, maleinsav, tejsav, fumársav, benzoesav, giikolsav, gulonsav, borostyánkősav és arilszulfonsavak, mint például p-toluolszulfonsavak. A farmakológiailag elfogadható, valamint egyéb savakkal alkotott sók a peptidek elválasztásánál és tisztításánál is alkalmazhatók, és természetesen a farmakológiailag nem elfogadható sók ismert eljárásokkal farmakológiailag elfogadható sókká alakíthatók át.

A találmány szerinti eljárással előállított (1) általános képletű peptidek fájdalomcsillapító hatását és különösen szelektív perifériális hatásúkat a kővetkező vizsgálatokkal bizonyítottuk.

(1) Mind a meleg-lemezes (hotplate) vizsgálat [Woolfe és MacDonald, J. Pharmacol. Exp.Ther., 80, 300, (1944)],valamint az irritálószer-kiváltotta rángatódzás vizsgálat [Vander Wende és Margolin, Fed.Proc., 15, 494 (1956)] ismert eljárások a szakterületen a fájdalomcsillapító hatás vizsgálatára. Minthogy ez utóbbi vizsgálatnál a fájdalomcsillapítás kiinduló helye vagy centrális vagy perifériális, várható, hogy a meleg-lemezes vizsgálatnál az csak centrális lehet. A találmány szerinti eljárással előállított peptidek fenti eljárásokkal való vizsgálata során azt tapasztaltuk, hogy azok sokkal hatásosabbak a rángatódzási vizsgálat során, mint a meleg-lemezes vizsgálatnál parenterális (azaz perifériális) adagolás esetén, azaz adott hatás eléréséhez a vizsgálatok során alacsonyabb dózis elegendő volt, jelezve a perifériás jellegű hatásmechanizmust.

(2) A találmány szerinti eljárással előállított peptidek által kiváltott fájdalomcsillapító hatás kialakulása mind a meleg-lemezes, mind a rángatódzási vizsgálat esetében parenterális adagolást alkalmazva azt mutatja, hogy e vegyületek igen lassan és igen kis mértékben hatolnak be a vér-liquorgátba.

(3) A találmány szerinti eljárással előállított peptidek a rángatódzási vizsgálatok során perifériás (parenterális) adagolás esetén antagonista hatást mutatnak perifériásán (parenterálisan) adagolt kvaterner opioid N-allil-normorfin metiodiddal [N-metil-nalorfin, Koczka és munkatársai, Acta Chim, Acad,

Sci. Hung., 51, 393 (1967)], azaz a peptidekből azonos hatás eléréséhez nagyobb mennyiség szükséges opioidok jelenlétében, mint nélkülük. Mivel a kvaterner vegyület vér-li5 quorgátba való behatolása minimális [Tavani és munkatársai, European J. Pharmacol. 59, 151 —154, (1979)], mind a peptid kiváltotta fájdalomcsillapító hatás, mind az antagonista hatás a perifériás szinteken megy végbe. tO A találmány szerinti eljárással előállított peptidekről a fentieken túlmenően megállapítottuk, hogy még hasmenéscsökkentő és köhögéscsil lapító hatással is rendelkeznek, melyeket ismert farmakológiai eljárásokkal vizsgáltunk.

Az (I) általános képletű új vegyületek és savaddíciós sóik előállítását hasonló szerkezetű vegyületek irodalomból ismert előállítási eljárásaihoz hasonló eljárásokkal állít20 juk elő. Ilyen eljárásokat ismertetnek például a következő irodalmi helyeken: a) Schroder és Luebke, „The Peptides*¹ (Academic Press, 1965), b, Stewart és Young, „Solid Phase Peptíde

Synthesis (W H Freeman és Co., 1969), cí Bellean és Malek, J Am.Chem.Soc. 90:

165,1968,

d) Beyerman, Helv. Chim. Acta 56: 1729, 1973,

e) Tilak, Tetrahedron Letters 849 (1970), f' „Methoden dér Organischen Chemie“ (Houben-Weyl), Vol. 15, „Synthese von Peptiden“, í. és 2. rész (Georg Thieme Verlag, 1974),

g) „The Peptides: Analysis, Synthesis, Bio35 logy“, Gross, E. és Meienhoíer, . J. eds., 1—4. kötet (Academic Press, 1979),

t) „Peptides: Syntheses, Physical Data“, Voelter, W. és Schmid-Siegmann, Ε., 1—6. kötet (Georg Thieme Verlag, 1983), ⁴⁰ i) Atherton, E. et al., Bioorganic Chem. 8, 351—370 (19791.

j) Sheppard, R. C., Chemistry in Britain, 402— 414 (1983),

k) Atherton, E. et al., J.C.S. Chem. Comm.,

1151 — 1152 (1981) .

(1) Az (I) általános képletű vegyületek előállítására egyik út, ha a megfelelő amínosavakat kapcsoljuk a kívánt sorrendben valamely ismert peptid szintézis vagy szilárd fázi5® sú reakció egyikével, vagy pedig először előállítjuk, majd azután kapcsoljuk az egyes alegységeket. A reakciókat úgy vihetjük végbe, hogy például aktiváljuk a kapcsolandó aminosavak karboxilcsoportját és védjük a nem reagáló amino-, illetve karboxilcsoportokat. Ezen reakciók részletes leírása, a megfelelő védőcsoportok, az alkalmas reakciókörülmények ismertetése (mind a kapcsolási, mind a védőcsoportok eltávolítására vonatkozó reak60 ciókra vonatkozóan), megadva minimális racemizálódás feltételeit, megtalálhatók a fentiekben idézett irodalmi helyeken.

A fentiek szerint az (I) általános képletű vegyületeket előállíthatjuk, ha (II) általános képletű vegyületeket — a képletben R' jelenté3

-3193569 se megegyezik az (I) általános képletnél megadottakkal, a Y¹ jelentése egy olyan fragmens (gyök), amelynek szekvenciája azonos az (I) általános képletű vegyület megfelelő N-terminális fragmensének szekvenciájával — (III) általános képletű vegyülettel — a képletben Y² jelentése azonos a fentiekben ismertetett peptid fentmaradó részével és magába foglalja annak megfelelő C-terminális fragmens (gyök) szekvenciáját — reagáltatunk: és a (II) és (III) általános képletű vegyületek adott esetben védettek és/vagy aktiváltak lehetnek, végül kívánt esetben a védőcsoportokat eltávolítjuk.

(2) Egy másik eljárás szerint az (I) általános képletű vegyületeket úgy állítjuk elő, hogy (IV/1) általános képletű C-terminális peptid karbonsavat — a képletben R¹ és X²jelentése azonos az (I) általános képletnél megadottakkal és Q jelentése hidroxilcsoport — (VI) általános képletű aminnal — a képletben R², Ζ¹, Z² és n jelentése azonos az (I) általános képletnél megadottakkal — reagáltatunk, vagy (IV/1) általános képletű C-terminális peptid karbonsavat — a képletben R¹ és X² jelentése a fenti és Q jelentése (IV/2) képletű csoport — a képletben R², Ζ¹, Z² jelentése a fenti — amidálunk.

Azokat a peptideket állíthatjuk elő például ezzel a módszerrel, amelyekben R³ jelentése karbamilcsoport, és úgy járunk el, hogy például (IV) általános képletű vegyületeket — a képletben R¹, R², X², Z‘ és Z² jelentése azonos az (I) általános képletnél megadottakkal és OR⁴ jelentése alkalmas, cserélhető csoport, például alkoxi-, aralkoxi- vagy ariloxicsoport, így például 1-4 szénatomos alkoxicsoport, például metoxi-, etoxi-, propoxi-, butoxi-, benzil-oxi- vagy a peptidkémiából ismert más hasonló csoport — reagáltatunk ammóniával.

Azokat a vegyületeket, amelyekben R³jelentése hidrogénatom, előállíthatjuk még, ha például (V) általános képletű peptid karbonsavat vagy annak reakcióképes származékát és (VI) általános képletű amint reagáltatunk. Az (V) és (VI) általános képletekben R¹, R², X², Ζ¹, Z² és n jelentései azonosak az (1) általános képletnél megadottakkal. A reakciót kívánt esetben az 1.) pontnál leírt reakció szerint, azokkal a reagensekkel és eljárásokkal (beleértve az (V) általános képletű vegyület N-végcsoportjainak védését), a megfelelő peptid-kapcsolási eljárással is elvégezhetjük.

(3) A peptideket előállíthatjuk például a megfelelő peptid. — amelyben X² jelentése (b) képletű D-csoport, amelyben m jelentése azonos az (I) általános képletnél megadottakkal és R⁵ jelentése hidrogénatom vagy amidinocsoport, feltéve, hogy R¹ és R⁵ valamelyike hidrogénatom — amidinálásával, például l-amidino-3,5-dimetil-pirazol vagy kémiai megfelelőjének alkalmazásával (pl. Means, G. és Feemy, R.Chemical Modification 4 of Proteins, 5.fej. 93—95; Holdén Day Inc., 1971)

A D-arginil és D-homoarginil peptideket a megfelelő D-ornitil és D-lizil vegyületekből állíthatjuk elő, míg a D-(2-amino-4-guanidino-butiril) peptideket a megfelelő D-(2,4-diamino-butiril) vegyületekből nyerjük.

Belátható, ha a megfelelő peptidreagensben R¹ és R⁵ is hidrogénatom és az előállítani kívánt vegyületben R’-et végcsoportként hidrogénatomként kívánjuk megtartani, az amidálási lépés alatt a peptid N-végcsoportját védeni kell. Az ilyen reakciók részletezése, a megfelelő védőcsoportök ismertetése, az amidálási reakció utáni eltávolításuk lehetőségei az előzőekben ismertetett irodalmi helyeken részletezve vannak.

\ (IV) általános képletű észtereket, az (V) általános képletű karbonsavakat, valamint a megfelelő D-ornitilt, D-Iizilt és D-(2,4-diaminobutiril)-t az 1) pontnál leírtakhoz hasonló, ismert eljárásokkal állíthatjuk elő.

A találmány szerinti eljárással előállított (I) általános képletű vegyületek izolálását a szabad peptid vagy sója formájában egyaránt elvégezhetjük, és belátható, hogy a szabad peptidet sóvá, vagy a sót ismét a szabad vegyületté alakíthatjuk a területen ismert eljárások szerint.

A találmány szerinti eljárással előállított (I) általános képletű új vegyületeket és farmakológiailag elfogadható savaddíciós sóikat az ember- és állatgyógyászatban egyaránt alkalmazhatjuk hasmenés és dizentéria kezelésére, köhögés- és fájdalomcsillapítóként. Ez utóbbi területről megemlítjük például a 'ágy-szöveti sérüléseknél, műtétek után, szülésnél és szülés után, menstruációs zavaroknál fellépő, neuralgia, myalgia, artritis és reumatikus, valamint csontváz-izomzattal összefüggő fájdalmak csökkentését.

A találmány szerinti vegyületeket adagolhatjuk orálisan, parenterálisan (szubkután, intradermálisan, intramuskulárisan, intravérásan), rektálisan, helyileg (dermálisan, bukkálisan, szublinguálisan). Az adagolás mértéke igen sok tényezőtől függ, így például a kezelendő betegtől, a betegség komolyságától, az adagolás módjától, és végső soron a kezelő orvos döntésére van bízva, bár bizonyos esetekben embereknél ön-adagolás is megengedhető.

Emberek esetében a hatásos dózis általában 0,5 és 50 g, előnyösen 1 és 25 mg, még előnyösebben 2 és 12,5 mg közötti érték, leggyakrabban 5 mg (szabad pepiidre számolva). Az adagolás kívánt esetben egész napon át történhet, például háromszor vagy négy altalommal ismételve.

Állatgyógyászatban emlős állatok kezelésénél, például macskák, kutyák, marhák, birkák, sertések és lovak esetében, a fenti mennyiségek az állatorvos döntésétől függően csökkenthetők vagy növelhetők.

Bár a találmány szerinti vegyületek önmagukban is adagolhatok, előnyös,ha gyógy-47 szerkészítményekké alakítjuk őket. A találmány szerinti készítmény előállítási eljárásnál hatóanyagként (I) általános képletű új pepiidet vagy farmakológiailag elfogadható savaddíciós sóját egy vagy több gyógyszerészeti célra alkalmas hordozóanyaggal és adott esetben más adalékanyaggal keverünk el és adagolásra alkalmas készítménnyé alakítjuk.

A készítmények lehetnek például orális, parenterális (szubkután, intradermális, intramuszkuláris, intravénás), rektális és helyi (dermális, bukkális, szublinguális) adagolásra alkalmas készítmények. A legalkalmasabb adagolási módot a kezelendő beteg és állapota határozza meg általában. A készítményeket általában egység-dózisok formájában állítjuk elő, oly módon hogy a hatóanyagot [(I) általános képletű vegyület vagy sója] a kívánt hordozóval és a szükséges egyéb adalékanyaggal jól elkeverjük, majd a kívánt formájú készítménnyé alakítjuk.

• A találmány szerinti eljárással előállíthatunk például orális adagolásra alkalmas készítményeket, így például kapszulákat, ostyaburkolatú készítményeket vagy tablettákat, amelyek mindegyike meghatározott mennyiségű hatóanyagot tartalmaz, továbbá porokat vagy granulátumokat, vizes vagy nem vizes oldatokat vagy szuszpenzíókat, olaj-a-vízben vagy víz-az-olajban típusú emulziókat. A hatóanyagot bolus, elektuárium vagy pasztakészítményekbe is foglalhatjuk.

A tablettákat előállíthatjuk sajtolással vagy öntéssel, adott esetben egy vagy több további adalék jelenlétében. Sajtolt tabletták esetében a sajtolást alkalmas gép segítségével végezzük a por vagy granulátum formájú anyagból, amely adott esetben kötő-, kenő-, inért hígító-, felületaktív- vagy diszpergálóanyagokat is tartalmaz, öntési eljárásnál a poralakú anyagot alkalmas inért folyadékkal ’ nedvesítjük. A tabletták adott esetben bevonatos vagy bemetszett tabletták is lehetnek és készíthetők úgy is, hogy a hatóanyag bomlása lassú vagy szabályozott legyen.

A parenterális adagolású készítmények lehetnek például vizes vagy nem vizes steril injekció oldatok, amelyek tartalmazhatnak még anitoaxidánsokat, puffereket, bakteriostatokat és olyan anyagokat, amelyek a készítményt a vérrel izotóniássá teszik; vizes vagy nem vizes szuszpenziók, amelyek még tartalmazhatnak szuszpendáló vagy sűrítő anyagokat. A készítményeket kiszerelhetjük egység-dózisok vagy több dózist tartalmazó készítmények formájában, így például zárt ampullák vagy fiolák formájában vagy fagyasztva szárított (liofilizált) formában, amelyeket közvetlenül a felhasználás előtt hígítunk steril folyadékkal, például injekció céljára alkalmas vízzel. Azonnal alkalmazható injekció készítményeket előállíthatunk az előzőekben leírt por-, granulátum- vagy tabletta-készítményekből is.

Rektális adagolású készítményeket általában kúpok formájában állítjuk elő, és hordozó193569 anyagként leginkább kakaó-vajat, polietilénglikolt vagy szilárd zsírokat alkalmazunk.

A helyileg alkalmazható készítmények közé tartoznak például a bukkális vagy szubIjnguálís készítmények, például szopogatható tabletták, amelyek az aktív hatóanyagot ízanyagokkal, így például cukorral, akác- vagy tagant-mézgával elkeverve tartalmazzák, vagy pasztillák, amelyek a hatóanyagot zselatin, glicerin, cukor vagy akác-mézga horcozóban tartalmazzák.

A készítmények egység-dózisának előnyös formái azok, amelyek egy adagban az előzőekben leírt mennyiségű hatóanyagot vagy annak megfelelő részét tartalmazzák.

Helyi alkalmazású készítmények közé tartóznak például a vizes vagy nem vizes formában kiszerelt dermális készítmények, például kenőcsök, lemosok, paszták, zselék, sprayk, reroszólok vagy fürdpolajok. A kenőcsök leletnek olajos, abszorpciós, vízben oldható cagy emulzió típusúak, és hordozóanyaguk lehet például vazelin, lanolin, polietilénglikol vagy ezek keveréke. Ezek a készítmények különösen alkalmasak lokalizált helyi fájdalmak kezelésére, így például artritis vagy reumatikus fájdalmak esetében, és előnyösen naponta egyszer vagy többször használhatók a kívánt területen. Általában 0,05— 2%, előnyösen 0,1 —1,0%, még előnyösebben 0,2—0,5% hatóanyagot tartalmaznak.

A találmány szerinti eljárással előállított készítmények bármilyen más, az adott típusú készítményekhez egyébként alkalmazható ismert más adalékanyagot is tartalmazhatnak, így például az orális adagolású készítmények különböző ízjavító anyagokat.

Az előzőek alapján összefoglalva, a találmány a következőket foglalja magában:

a) (I) általános képletű új pepiid vegyületek és eljárás az (I) általános képletű vegyületek előállítására, valamint

b) az új (I) általános képletű vegyületeket vagy farmakológiailag elfogadható savaddíciós sóikat és gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyagot tartalmazó gyógyszerkészítmények és eljárás előállításukra.

A (II) — (VI) általános képletű vegyületek újak.

A következő példákban a találmányt mutatjuk be közelebbről, anélkül, hogy azokra korlátoznánk azt. A hőmérsékletet mindenhol Celsius fokban adtuk meg.

Kísérleti rész

Alkalmazott rövidítések:

DMF dimetil-formamid

THF tetrahidrofurán .

DCC1 diciklohexil-karbodiimid

HOBT 1-hidroxi-benzo-triazol

NMM N-metil-morfoIin

DCHA diciklohexil-amin

DCU diciklohexil-karbamid

Tlc. (Merck szilikagél lemez) a következő oldószer-rendszerekkel:

-5193569

SÍ n-butanol/ecetsav/víz 3:1:1 térfogatarányban

Síi metil-etil-keton

SIII kloroform/metanol/ 32%-os vizes ecetsav 120:90:5 térfogatarányban

SIV kloroform/metanol 8:1 térfogatarányban

SV kloroform/metanol/0,880 ammónia 120:90:5 térfogatarányban

SVI kloroform/metanol/ 32%-os vizes ecetsav 120:90:40 térfogatarányban

SVII kloroform/metanol/0,880 ammónia 120:90:40 térfogatarányban

Hplc.

oszlop: Zorbax C-8, 4,6 mm belső

0x25 cm mozgó fázis: aceton it ril/0,1 mólos ammónium-acetát, pH 4,0 folyási sebesség: 2 ml/perc detektálás: 254 nm

Az ismert intermediert, a védett BOC-Tyr-D-Arg.HCl dipeptidet az (1) vázlatnak megfelelően szintetizáltuk.

(A) BOC-Tyr-D-Arg-OMe

1,184 g BOC-Tyr'-t 20 ml THF-ban oldunk és hozzáadunk 5 ml THF-ban oldott 0,426 g NMM-t, majd a keveréket —25°C-ra hűtjük, hozzáadunk 5 ml THF-ban oldott 0,549 g klór-hangyasav-izobutil-észtert, és a reakciót — 150°C-on 5 percig végezzük. Ezután hozzáadunk 1,0 g D-Arg-OMe.2HCl-at (Helv.Chim. Acta, 41, (1968), 1867) és 0,387 g NMM-et 20 ml DMF-ben és 2 ml vízben oldva, és a kapott keveréket —-15°C-on 2,5 órán át keverjük. Ezután hozzáadunk 4,6 ml 2 mólos kálium-hidrogén-karbonát-oldatot, és a keverést 0°C-on további 30 percig folytatjuk, majd az oldószert vákuumban eltávolítjuk, és a maradékot ctil-acetát és víz között megosztjuk. A szerves fázist elválasztjuk, vízzel kétszer mossuk, a vizes fázisokat egyesítjük, a pH-t ecetsav adagolásával 7-re beállítjuk, az oldatot sóval telítjük, 5:1 arányú kloroform/butanol eleggyel extraháljuk, majd kétszer kloroformmal mossuk. A szerves fázisokat egyesítjük, kétszer telített sóoldattal mossuk, vízmentes magnézium-szulfáton szárítjuk és vákuumban betöményítjük. A maradékot vízmentes éterben elkeverjük, a kitermelés 1,28 g (78%).

(B) BOC-Tyr-D-Arg.HCI

1,28 g védett dipeptidet 40 ml metanolban és 10 ml vízben oldunk, hozzáadunk 5,7 ml 1 mólos NaOH-ot,és a kapott keveréket szobahőmérsékleten 3,5 órán át keverjük. Ezután az oldatot 5,7 ml 1 mólos sósav adagolásával semlegesítjük, az oldószert vákuumban eltávolítjuk, és a visszamaradó vizes oldatot fagyasztással szárítjuk.

A nyers terméket tartalmazó oldatot Zorbax C-8 oszlopon sótalanítjuk, metanollal eluáljuk, az elválasztott dipeptidet vízben oldjuk, ekvivalens mennyiségű 1 mólos 6 sósavval kezeljük és fagyasztva szárítjuk, a kitermelés 0,78 g (58%).

Elemanalízis a C₂₀H₃₁N₅O₆.HC1.2H₂O összegképletü vegyületre:

számított: C% 48,83; H% 6,91; N% 14,24; mért: C% 49,06; H% 6,79; N% 13,73;

Tlc.: egy folt Sí, SIII, SV-ben

1. példa

H.Tyr.D-Arg.Gly.N (Et) ,CH₂CH₂-C₆H₄-4-\O₂-diacetát előállítása (2 vázlat szerinti vegyület) (A) 2-(4-nitro-fenil)-etil-etil-amin-hidrobroni id l-bróm-2- (4-nitro-fenil) -etánt (Aldrich, 10 g, 50 mmól) egy éjszakán át szobahőmérsékleten keverünk etil-amin etanolos oldatával (33%, 25 ml, ~180 mmól), majd a kapott narancssárga oldatot bepároljuk, és a kristályos maradékot 10 ml etanolban felvesszük, a kapott anyagot szűrjük,és a szűrletet egy másik, azonos módon készült azonos termékkel egyesítjük.

Kitermelés 5 g (36%), o.p.: 211 213°C.

Elemanalízis a C₁₀H₁₅N₂O₂Br összegképletű vegyületre:

számított: C% 43,65; H% 5,50; N% 10,18_;

Br% 29,04· mért: C% 43,88; H% 5,73θΝ% Ίθ,19Br% 28,82.

(B) BOC-Gly-N-( Et).CH₂CH₂-C₆H₄-4-NO₂3,89 g BOC-Gly-t (J.A.C.S., 79, (1957)6180) és 6,0 g HOBT-t 50 ml DMF-ben oldunk, lehűtjük —10°C-ra és hozzáadunk 4,58 g DCCL-1, a kapott reakciókeveréket — 5°C-on 30 percig keverjük, majd 4,08 g 4-nitro-fenetil-etil-amin-hidrokloridot és 1,5 g NMM-t adagolunk hozzá, és a keverést 5°C hőmérsékleten 72 órán át folytatjuk. A diciklohexil-karbamidot szűréssel eltávolítjuk, a szűrletet betöményítjúk, a maradékot etil-acetátban felvesszük, háromszor 5%-os Na₂CO₃ oldattal, egyszer vízzel, kétszer 5%-os ci-tromsav oldattal és kétszer vízzel mossuk, magnézium-szulfáton szárítjuk és vákuumban betöményítjük. A kapott olajos maradékot éterben oldjuk, a még jelenlévő diciklohexil-karbamidtól szűréssel elválasztjuk, a szűrletet ismét betöményítjük, a kapott olajos anyag (4,76 g) benzinnel elkeverve nem szilárdul meg.

(C) H.Gfy-N(Et)-CH₂-CH₂-C₆H₄-4-NO₂.HCl

A 4,76 g védett amidot 35 ml jégecetben o djuk és 45 perc alatt hozzáadunk 35 ml 2 mólos HCl/ecetsav oldatot szobahőmérsékleten. A kapott anyagot vákuumban betöményítjük és éterrel elkeverjük. Kitermelés 366 g (94%), o.p.: 191 —194°C.

Elemanalízis a C₁₂H|₈N₃O₃C1 összegképletű vegyületre számított: C% 50,09; H% 6,26; N% 14,61; mért: C% 49,85; H% 6,38; N% 14,56.

-6193569 (D) BOC-Tyr-D-Arg-Gly-N(Et)CH₂-CH₂-C₆H₄-4-NO₂ előállítása

1,97 g BOC-Tyr-D-Arg-HCl-t 20 mi DMFbeti oldunk és hozzáadunk 1,13 g HOBT-t, majd az oldatot lehűtjük —10°C-ra és 0,86 g DCCl-t adagolunk hozzá. Ezután a reakciókeveréket —5°C hőmérsékleten tartjuk 30 percig, majd hozzáadjuk 1,2 g Gly-N(Et)CH₂CH₂-C6H₄-NO₂.HCl-ot és 0,42 g NMM-t 5 ml DMF-ban oldva, majd a kapott keveréket 5°C-on 72 órán át keverjük. Ezután a diciklohexil-karbamidot szűréssel elválasztjuk, a szűrletet vákuumban betöményítjük, a maradékot 150 ml etil-acetát és 25 ml víz között megosztjuk, a szerves fázist ötször vízzel extraháljuk, a vizes fázisokat egyesítjük és háromszor 200—200 ml 5:1 arányú etil-acetát/n-butanol eleggyel kirázzuk. Az etil-acetát/n-butanol-os extraktumokat egyesítjük, háromszor 150 ml 5%-os Na₂CO₃ oldattal, kétszer 100 ml 5%-os citromsav oldattal és kétszer 100 ml vízzel mossuk, vákuumban betöményítjük, majd vízből és kétszer etanolból szárazra pároljuk. A végső maradékot éterrel elkeverjük.

Tlc.: a fő folt reagál a Pauly reagenssel (tyrosin) és a Sakaguchi reagenssel (arginin).

(E) H-Tyr-D-Arg-Gly-N-(Et)CH₂.CH₂-C₆H₄-4-NO₂.diacetát előállítása

1,9 g védett tripeptidet 15 ml jégecet és

7,5 ml anizol keverékében oldunk, majd szobahőmérsékleten 30 percig 22,5 ml 2 mólos HCl/ecetsav oldattal kezeljük, majd vákuumban betöményítjük, a maradékot éterrel elkeverjük, a kapott nyers terméket 20 ml vízbe oldjuk, majd vízzel és kétszer éterrel mossuk az anizol-maradék eltávolítására. A vizes fázist 5x50 cm-es karboxi-metil-cellulózzal töltött oszlopon kromatografáljuk, 5,1 pH-jú ammónium-acetáttal eluálva. A fő fázist C—18 szilikagéllel töltött oszlopon sótalanítjuk, így nyerjük a kívánt terméket, amely Hplc-re és Tlc-re tiszta (Sí, SVI, SVII). Elemanalízis a C27H₃₈N₈O_S.2CH₃CO₂H.H₂O összegképletű vegyületre:

mért:	C% 52,74; H% 7,06; N% 15,58;
	+32,1°
		(c=I, metanol)
[a]²⁶	+37,9°
2.	példa
N	amidino-Tyr-D-Arg-Gly-N(Et)-CH₂CH₂-

-C₆H,-4-NO₂.diacetát előállítása

708 mg H-Tyr-D-Arg-Gly-N(Et)-CH₂CH₂-C₆H₄-NO₂.diacetátot 4 ml etanol és 1 ml DMF keverékében oldunk, majd hozzáadunk 246 mg l-amidino-3,5-dimetil-pirazoI-acetátot és 0,2 ml trietil-amint, és a kapott keveréket 55°C-on 7 órán át, és szobahőmérsékleten egy éjszakán át keverjük. Ezután a keverékből vákuumban az oldószert eltávolítjuk, a maradékot etil-acetáttal elkeverjük, és a ka12 pott nyers terméket karboxi-metil-cellulózzal töltött oszlopon kromatografáljuk, az eluálást lineáris gradiensű ammónium-acetáttal végezve (0,005 mól -► 0,5 mól) 5,1 pH-η. A terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük és háromszor fagyasztva szárítjuk az illékony puffer oldat eltávolítására.

A Tlc (Sí, SVI, SVII) egy fő komponenst jelez. A Hplc (30%-os acetonitril) egy fő csúcsot mutat.

Elemanalízis a

C_2(sH₄₀N₁₀O₆.2CH₃CO₂H.l,5H₂O ' összegképletű vegyületre:

számított: C% 50,55; H% 6,72; N% 18,44; mért: C% 50,52; H% 6,72; N% 18,36;

[a)²⁵ +22,4ή nc=l, metanol) [αί”₆+25,1·0

3. példa

H-Tyr-D-Arg-Gly-EtPhe(4NO₂)-NH₂.diacetát előállítása (3 vázlat) (A) BOC-Phe(4NO₂).NH₂ előállítása

19,33 g BOC-Phe(4NO₂)-at (J.Chem.Soc. Japan, 62, (1941), 31) DMF-ban oldunk, lehűtjük — 15°C-ra és hozzáadunk 6,3 g NMM-t és 8,51 g klór-hangyasav-izobut 1-észtert, majd a keveréket —15°C-on 5 percig keverjük. Ezután 1 órán át ammóniát buborékoltatunk keresztül az oldaton és a — 15°C-os hőmérsékletet még további egy órán át fenntartjuk. Ezután a maradék ammónia eltávolítására nitrogént buborékoltatunk keresztül az oldaton, az oldószert vákuumban eltávolítjuk, és a visszamaradó szilárd anyagot etil-acetát és víz között megosztjuk. A szerves fázist 5 %-os citromsav oldattal, vízzel, 5%-os nátrium-hidrogén-karbonat-oldattal, végül ismét vízzel mossuk, vízmentes magnézium-szulfáton szárítjuk, bepároljuk, és a maradékot etil-acetát/benzol elegyben elkeverjük. A kitermelés 16,94 g (88%).

Tisztítás Tlc-val (Sí, SIII, S\+

Elemanalízis a

C₁₄H_I9N₃O₅ összegképletű vegyületre: számított: C% 54,37; H% 6,Í5; N% 13,59; mért: C% 54,44; H% 6,12; N% 13,35.

(B) H-Phe(4NO₂)-NH₂.HCl előállítása

16,9 g BOC-Phe(4NO₂).NH₂-ot 150 ml anizolban szuszpendálunk, majd 500 ml 1 mólos HCl/ecetsav eleggyel kezeljük 30 pereg szobahőmérsékleten, majd 35°C-os vákuumban betöményítjük, és a maradékot éterben elkeverjük.

Kitei melés 13,6 g.

Tlc-re tiszta (Sí, SIII, SV).

(C) H-EtPhe(4NO₂).NH₂ előállítása

13,6 g H-Phe(4NO₂)-NH₂.HCl-t 200 ml etant’lban szuszpendálunk, majd 18,7 g nátri jm-hidrogén-karbonát-tal kezeljük. A kapó t szuszpenziót keverés közben vissza7

-7193569 folyatás mellett melegítjük, hozzáadunk 4,45 ml etil-jodidot, és a visszafolyatást további 5 órán át folytatjuk, majd a^reakciókeveréket lehűtjük és szűrjük. A szűrletet betöményítjük,és az olajos maradékot benzollal elkeverve megszilárdítjuk. Az így kapott anyagot szilikagélen kromatografáljuk 5% metanol/diklór-metán eleggyel eluálva. Kitermelés 2,75 g tisztított anyag.

(D) BOC-Gly-EtPhe(4NO₂).NH₂ előállítása

2,03 g BOC-Gly-t (J.A.C.S., 79, (1958)

6180) és 3,13 g HOBT-t 20 ml DMF-ban oldunk, és az oldatot lehűtjük —10°C-ra, hozzáadunk 2,39 DCCl-t, és a reakciókeveréket — 10°C-on 30 percig hagyjuk állni, majd N-EtPhe (4NO₂) ,NH₂ DMF-os oldatát adagoljuk hozzá. A keveréket 5°C-on egy éjszakán át keverjük, majd még 2,03 g BOC-Gly-t és 2,39 g DCCl-t adagolunk, és a reakciókeveréket szobahőmérsékleten 48 órán át hagyjuk állni. Ezután a diciklohexán-karbamidot szűréssel elválasztjuk, a szürletet vákuumban betöményítjük, az olajos maradékot etil-acetátban oldjuk, a diciklohexil-karbamidot ismét leszűrjük, szűréssel elválasztjuk, a szűrletet kétszer 5%-os nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal és egyszer vízzel mossuk, szárítjuk, és az oldószert eltávolítjuk. Kitermelés 4,41 g (96%) amorf szilárd anyag. Tlc-vel (SI, SIII, SV) kevés diciklohexil-karbamid mutatható ki.

(E) H-Gly-Et-Phe(4NO₂)-NH₂.HCI előállítása

A 4,4 g védett dipeptidet 20 ml anizolban oldjuk, majd szobahőmérsékleten 30 percig 60 mi 1 mólos HCI/ecetsav oldattal reagáltatjuk, a kapott oldatot betöményítjük, és a kapott anyagot éterrel elkeverjük. Kitermelés 3,69 g (100%).

F) BOC-Tyr-D-Arg-Gly-Et-Phe(4NO₂)-NH₂előállítása

1,77 g BOC-Tyr-D-Arg-HCl-t, 0,98 g HOBT-t és 1,20 g Gly.EtPhe(4NO₂)-NH₂.HCl-t 130 ml DMF-ban oldunk és lehűtjük — 10°Cra. Ekkor hozzáadunk 0,75 g DCCl-t és 0,37 g NMM-t,és a reakciókeveréket 5°C-on 72 órán at keverjük, majd szűrés és bepárlás után az olajos maradékot 5:1 arányú etil-acetát/n-butanol elegy és NaCl-dal telített 5%-os nátrium-hidrogén-karbonát-oldat között megosztjuk. A szerves fázist a fenti összetételű oldószerrel mossuk és vákuumban betöményítjük. A maradékot kétszer vízből és kétszer etanolból ismét bepároljuk,és a kapott terméket további tisztítás nélkül alkalmazzuk a következő reakciólépésben.

G) H-Tyr-D-Arg-Gly-Et-Phe(4NO₂)-NH₂-diacetát előállítása

A 2,13 g védett tetrapeptid-amidot 10 ml anizollal és 100 ml 1 mólos HCI/ecetsav oldattal szobahőmérsékleten 40 percig reagáltatjuk, majd az oldószer elpárologtatása és a maradék vízmentes éterben való elkeverése után nyerjük a nyers terméket, amelyet 8 karboxi-metil-cellulózzal töltött ötször 50 cmes oszlopon kromatografálunk, az eluálást 5,1 pH-η lineáris gradiensű ammónium-acetát oldattal végezve. A frakciókat egyesítés után háromszor fagyasztva szárítjuk.

Tlc-re tiszta (SI, SVI, SVII) és Hplc-re analitikailag tiszta.

Elemanalízis a

C3₂H₄₇NgO_I1.H₂O összegképletü vegyületre:

számított: C% 49,93;	H% 6,63;	N% 16,38;
mért:	C% 50,18;	H% 6,35;	N% 16,33.
[<⁵ -	41,8°]
	f(c=l.	metanol)
\|C -	51,2°J

4. példa

N-amidino-Tyr-D-Arg-Gly-Et-Phe(4NO₂)x xNH₂-diacetát előállítása

321 g H-Tyr-D-Arg-Gly-Et-Phe(4NO₂)* xNH₂-diacetátot 2 ml etanolban és 0,5 ml DMF-ben oldunk, majd hozzáadunk 108 mg 1-a midino-3,5-dimeti l-pir azol-acet átot és 0,09 ml trietil-amint, és a reakciókeveréket 55°C-on 5 órán át és szobahőmérsékleten egy éjszakán át keverjük. Ezután az oldószert eltávolítjuk, a kapott terméket karboxi-metil-cellulózzal töltött oszlopon kromatografáljuk, az eluálást 5,1 pH-η lineáris gradiensű ammónium-acetáttal (0,005 mól-> -»-0,5 mól) végezve,

A kapott anyag Tlc-re (SI, SYI) és Hplc-re (30%-os acetonitril) tiszta.

Elemanalízis a

C₂₉H₄₁N, ,O₇.2CH₃CO₂H.2,5H₂O összegképletü vegyületre:

számított: C% 48,29; H% 6,58; N% 18,78; mért: C% 47,92; H% 6,28; N% 18,61.

[a]²⁵ = -44,2° (c=l, metanol) («1^6 = -53,6°

A következőkben felsorolt peptideket a peptid-kémiában ismert és az előző példákban leírtakhoz hasonlóan állítottuk elő. Mindegyik vegyületet diacetát addíciós sója formájában izoláltuk, hacsak más utalást nem teszünk. Elemanalízis adatai azoknak a vegyületeknek, amelynél az optikai forgatóképesség adatai nem szerepelnek:

6. példa számított: C% 53,17; H% 6,97; N% 15,50;

mért: C% 53,03; H% 6,89; N% 15,58;

7. példa számított: C% 51,81; H% 7,06; N% 16,99;

mért: C% 52,00; H% 6,76; N% 17,06;

19. példa számított: C% 51,88; H% 6,83; N% 15,34;

mért: C% 51,50; H% 6,69; N% 15,75;

20. példa számított: C% 54,62; H% 7,05; N% 14,39;

mért: C% 54,80; ' H% 6,99; N% 14,50;

28. példa számított: C% 47,88; H% 6,40; N% 13,96;

mért: C% 47,68; H% 6,48; N% 14,08;

-8193569

OOOOO o°°0O

T- n kO o r> n

Λ Λ Λ Λ »\ ί****1 Λ ^Λ * Λ ·\

5— τ— <τ c\] Γ, „ fr> co <r cn <3- m <J- cn cn CT» t— ! cn <j- <3· + + + I + I I I I +

O +

CD in jf 04 in metanol/

0000000 O kO Ό -- X N

0 0 0 9 cn σ* oo coj rn σ* o oo *— Nt M Ol X, x -+ + + + I

1

0

0 0

0

0 0

0

O

00

sí

r.

0

un

σ\

cn

Γ**

\O 00

0

r-s.

00

OJ

cn

Γ-s- <t

σ>

0 II i

LT)

<O

r*

<N

r-'s

cn

kO

00

lo un

r*

0

04

r*

04

cn

cn T-

OJ

m

cn

04

cn

C4

cn

1

T—

cn

04 04

04

cn

OJ

cn

oj cn

OJ

iin

CJ 1

+

1

I

+

+ +

+

+ +

+

|CM

Q

ca

N 'cí 1—I 2 'ClJ

OJ

N

PC tel

PC te PC

Ol OJ

Ο O j—I 1—! r~‘I 222222UUO

I I I I I n οι en cn 1*1 te

OJ OJ

	CM		OJ	CM		Cl	CM				f—t	0		O		CM		OJ		OJ	CM	CM 1—4	1—4	r-4	μ í-i
fu	0	Pm	0	0	2	Pm	0	Pm	2	Pu	υ	2	Pm	Z	P-i	0	Pm	O	Pm	0	0	0 u	O	O	M W
1	2	I	2	2	1	u	2	1	1	1	1	1	1	1	1	2	1	2	1	2	2	2 1	1	1	1 1
Nt	1	sí	1	1	Nt	1	1	<·	CN	n	Nt	CN	OJ	04	CN	1	CN	1	01	1	1	1 Nt	sí	sí	Nt Nt
			Nt	st			Nt									CN		CN		Nt	Nt	Nt

T—

04

0

O

0

*—

T—

T~

0

*- 0

0

T—

^T—

*“

OJ

CM

1 C4

¢4

CM

C4

PC

HM HM

H*M

2

PC

2 2

S

HM

HM Sz

g

PC £m

PC

2

PC

μ j hm

2

HM

2

HM

PC

PC SZ

PC

HM

C

O

0

0 1

O i

U i

0 I

0 1

u

<n

m

in

m

1Λ

in

m

in

m

,n m

m

in

m

in

m

in

m

PC

HM h*m

2

1—1

2

cn

PC

2

PC

Pm

2

PC

3: 2

2

PC

2

PC

CM

OJ

CM

OJ

PC

(M

CM

OJ

CM

OJ OJ

OJ

CM

OJ

01

CM

u 1

O 1

0 1

U 1

c 1

U 1

0 1

O t

O 1

υ 1

O l

O i

U 1

CJ 1

u 0 1 1

υ 1

O 1

0 1

u 1

O 1

U 1

O 1

O i

O 1

ω

60

κ

60

Μ

60

ÖŰ

60

μ

μι

μ

Ρ4

μ

< I

ι

< I

<! I

<C Ι

<J Ι

<5 I

<1 1

1

<: I

<ΰ I

< >

< ι

< I

C I

< 1

<1 1

«< 1

< I

<υ I

<3 I

1

< 1

<3 I

*< {

<υ I

< I

1 Ω

i

1 Ω

I Ω

1 Ζ*1

1 Ω

1 Ö

1 Ω

1

1 Ω

	1				2 2
(—1	1		• ·		·
	1 2	2	—	2		2
	ί		0		0
	1		2		sz
	1		OJ		CM
π3	1		2		PC
	1
ι—4	I ·	•	•	0	□	0
Ό	1 un	<D	>-	00		0
Pm	1

2222222222

2 2 2 te PC te te

OJ OJ OJ 01 I te te te pe te

PC te te o te u te &

oi x <f ni x r- ® co c *- o-i 01 -í lo co ο-, o o:

T- 01 01 oi oi 01 oi oi oi 01 01 x x x

33. H₂NC/:HN/ D-Arg -C₂H₅ CONII,, 1 4-F H -12,8

-9193569

34. példa

H-Tyr-D-Har-Gly-N( Et)-CH₂CH₂-C_eH₄-4-NO₂.diacetát előállítása

TFA (A) H-D-Lys-OH előállítása g D-lizin-hidrokloridot 55 ml 1 mólos NaOH-ban oldunk, majd hozzáadunk 11 ml s-etil-trifluor-tio-acetátot,és a kapott keveréket szobahőmérsékleten gyenge nitrogénáramban 7 órán át erőteljesen keverjük, majd szobahőmérsékleten egy éjszakán át állni hagyjuk. Ezután a keveréket jéggel lehűtjük, a terméket szűréssel elválasztjuk, kevés hideg vízzel és etanollal mossuk, majd P₂O₅-on szárítjuk. Kitermelés: 4,5 g. Tlc.-vel egyetlen folt (SI, SIII).

Elemanalizis a

CgH,₃N₂O₃F₃ összegképletű vegyületre: számított: C% 36,67; H% 5,41; N% 11,57; mért: C% 39,69; H% 5,55; N% 11,43;

TFA jelentése trifluor-metil-csoport.

D-Har jelentése D-homoarginil

TFA * (B) BOC-Tyr-D-Lys-OH előállítása

5,11 g BO’C-Tyr-OH-t és 2,09 g N-hidroxi-szukcinimidet 20 ml dioxán, 5 ml etil-acetát és 10 ml DMF elegyében oldunk, majd az oldatot lehűtjük —5°C-ra és hozzáadunk 3,75 g DCCl-t, —5°C-on 1 órán át keverjük, majd 1 óra alatt hagyjuk szobahőmérsékletre melegedni. Ekkor a DCU-ot szűréssel elválasztjuk, kétszer etil-acetáttal mossuk, a szűrleteket egyesítjük, jéggel lehűtjük, majd hozzáadunk 4,4 g H-D-Lys-OH-t, 90 ml vízTFA ben oldott 3,06 g nátrium-hidrogén-karbonátot és 15 ml DMF-ot, majd a kapott reakciókeveréket egy éjszakán át szobahőmérsékleten keverjük, szűrjük és vákuumban az illékony szerves oldószereket eltávolítjuk. A visszamaradó vizes DMF oldatot vízzel hígítjuk, a pH-t szilárd citromsav adagolásával 3,5-re beállítjuk és egyszer 150 ml, majd kétszer 75 ml etil-acetáttal extraháljuk, a szerves extraktumokat 50 ml 5%-os citromsav oldattal, majd kétszer 50 ml vízzel mossuk, vízmentes magnézium-szulfáton szárítjuk. Ily módon 10,6 g olajos terméket nyerünk.

(C) BOC-Tyr-D-Lys-OH előállítása

Az előző lépésben előállított terméket 56 ml metanolban oldjuk, hozzáadunk 56 ml 1 mólos NaOH-t és a reakciókeveréket 20 órán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd a pH értékét 1 mólos HCl-val 7,0-re állítjuk be. Az így kapott oldatot 250 ml vízzel hígítjuk és I mólos HCl-val 4,0-es pH-ra megsavanyítjuk, a reagálatlan kiindulási anyagokat háromszor 100 ml etil-acetáttal kimossuk, a terméket C18-szilikagéllel töltött 2,5 x 50 cmes oszlopon való kromatografálással (eluálószer: víz, majd metanol) választjuk el, a metanolos eluátumokat egyesítjük, betömé10 nyitjuk, a maradékot vízben oldjuk és fagyasztva szárítjuk.

Kitermelés 5,21 g.

Tlc re tiszta (SIII);

Elemanalízis a

C₂₀H₃₁N₃O_el,5H₂O összegképletű vegyületre: számított: C% 55,04; H% 7,80; N% 9,63; mért: C% 55,02; H% 7,64; N% 9,73;

(D) BOC-Tyr-D-Har-OH.HCI előállítása

3.5 g BŐC-Tyr-D-Lys-OH-t 20 ml etanolba ί oldunk, hozzáadunk 2,11 g 1-amidino-3,5-dimetil-pirazol-acetátot és 1,7 ml trietil-amínt, majd a keveréket 65 °C-on 7,5 órán át, majd szobahőmérsékleten egy éjszakán át hagyjuk állni. Ezután az oldószert eltávolítjuk, a maradékot 25 ml 4%-os ecetsav oldat és 25 ml etil-acetát között megosztjuk, a vizes fázist elválasztjuk, 20 ml etil-acetáttal mossuk, majd ötször 47 cm-es karboxi-metilcellulózzal töltött oszlopon kromatografáljuk, az eluálószer ammónium-acetát (0,005 mól -► 0,1 mól, pH 5,1). A terméket fagyasztva szárítással nyerjük, mennyisége

3,6 g . Ezt a terméket még tovább tisztítjuk reverz fázisú kromatográfiával (C8-szilikagélen), majd végül hidroklorid sóvá alakítj ik.

Kitermelés 2,86 g.

Elemanalízis a

C₂₁H₃₄N₅O₆C1.H₂O összegképletre: számított: C% 49,85; H% 7,12; N% 13,85; mért: C% 49,69; H% 7,02; N% 14,06;

(E) BOC-Tyr-D-Har-Gly-N(Et)-CH₂-CH₂C₆H₄-4-NO₂ előállítása

487.5 mg BOC-Tyr-D-Har-OH.HCl-t és 270 mg HOBT-t 10 ml DMF-ban oldunk, az oldatot —5°C-ra hütjük és hozzáadunk 206 g DCCl-t. A keveréket ezután 0°C-on 30 percig állni hagyjuk, majd hozzáadunk

287,5 mg Gly-N(Et)-CH₂CH₂-C₆H₄-4-NO₂-t és 101 mg NMM-t és 5°C-on 72 órán át keverjük. Ezután a DCU-ot eltávolítjuk, az oldatot betöményítjük, és a maradékot 75 ml 5%-os citromsav oldat és 50 ml etil-acetát között megosztjuk, a vizes fázist elválasztjuk, kétszer 50 ml etil-acetáttal mossuk, és a pH-t szilárd kálium-karbonáttal 6,0-os értékre beállítjuk. A terméket háromszor 75 ml etil-acetát/n-butanol eleggyel (4:1) kiextraháljuk, az extraktumokat egyesítjük, szárazra pároljuk, majd egyszer vízből és háromszor etanolból ismét bepároljuk.

Kitermelés 800 mg habszerü anyag.

Tlc.-vel egy fő komponens (SI, SIII).

(F) H-Tyr-D-Har-Gly-N(Et)-CH₂-CH₃-C₆H₄-4-NO₂ előállítása

A 800 mg védett peptidet 5 ml anizol és 10 ml ecetsav elegyében oldjuk, majd hozzáadunk 10 ml 2 mólos HCl-t. 30 perc elteltével az oldószert vákuumban eltávolítjuk, a maradékot vízben oldjuk és éterrel mossuk. A nyers terméket karboxi-metil-cellulózon ioncserés kromatográfiával tisztítjuk.

-10193569

Tlc-re tiszta (Sí, SVI). Elemanalízis a

C_2SH₄₀N₈O₆.2CH₃CO₂H.0,5H₂O	össze	?gkép-
letre:
számított:	C% 53,86; H% 6,87;	N%	15,71;
mért:	C% 53,59; H% 6,98;	N%	15,92;
[< =	+36,6° Ί
	1 (c= 1, metán	ol)
r«i~6 =	+44,6° J
35. példa

N-amidino-Tyr-D-Har-Gly-N(Et)-CH₂CH₂-C₆H₄-4-NO₂.diacetát előállítása

263 mg Tyr-D-Har-Gly-N(Et)-CH₂CH₂-C₆H₄-4-NO₂.diacetátot 2 ml etanolban oldunk és hozzáadunk 115 mg l-amidino-3,5-dimetíl-pirazol-acetátot és 0,1 ml trietil-amint, és a reakciókeveréket 10 órán át 60°C-on állni hagyjuk. Ezután az etanolt eltávolítjuk, a nyers terméket víz és etil-acetát között megosztjuk, a vizes fázist 2,5x45 cm-es karboxi-metil-cellulózos oszlopon tisztítjuk.

Tlc-re tiszta (Sí, SVI, SVII).

Elemanalízis a

C₂₉H₄₂N₁₀O₆.2CH₃CO₂H.2,5H₂O összegképletre:

számított: C% 50,06; H% 6,95; N% 17,70; mért: C% 50,21; H% 6,72; N% 17,65;

36. példa

H-Tyr-D-Arg-Gly-N(Et)-CH₂CH₂-C₆H₄-4-NO₂.diacetát előállítása (A) BOC-Tyr-D-Arg-Gly-OBzI.HCI előállt1,42 g BOC-Tyr-D-Arg-OH.HCl-at, 0,81 g HOBT-t, H-Gly-OBZ 1-t, 1,06 g toluol-szulfonátot és 0,303 g NMM-t 15 ml DMF-ben, oldunk, lehűtjük —15°C-ra és hozzáadunk 0,618 g DCCl-t, majd a keveréket 4°C-on 24 órán át keverjük. Ezután szűrjük, vákuumban betöményítjük, a maradékot 100 ml etil-acetát és 100 ml jéghideg 1 mólos HC1 között megosztjuk, a vizes fázist egyszer 100 ml, majd kétszer 50 ml etil-acetáttal extraháljuk, az extraktumokat egyesítjük, háromszor 50 ml nátrium-hidrogén-karbonát, majd 50 ml telített nátrium-klorid-oldattal mossuk, szárítjuk és betöményítjük.

A kitermelés 1,44 g.

Tlc. kevés DCU jelenlétét mutatja ki.

(B) BOC-Tyr-D-Arg-Gly-OH.HCl előállítása

1,44 g benzil-étert 50 ml metanolban oldunk és 140 mg csontszén hordozós 10%-os palládium katalizátor jelenlétében 4 órán át hidrogénezzük. Ezután a katalizátort szűréssel elválasztjuk, az oldószert vákuumban eltávolítjuk, és a kapott anyagot éterrel elkeverjük.

Kitermelés 1,15 g.

(C) BOC-Tyr-D-Arg-Gly-N( Et)-CH₂CH₂-C₆H₄-4-NO₂ előállítása

530,5 g BOC-Tyr-D-Arg-Gly-OH.HCl-ot, 270 mg HOBT-t, 275 mg HN. (Et) ,CH₂.CH₂20

-C₆H₄-4-NO₂-t és 101 mg Et₃N-t 10 ml DMFban oldunk, az oldatot —5°C-ra lehűtjük, és hozzáadunk 206 mg DCCl-t. A reakciókeveréket 5°C-on 72 órán át keverjük, és a terméket előzőekhez hasonlóan nyerjük ki. Kitermelés 640 mg.

(D) H-Tyr-D-Arg-Gly-N( Et)-CH₂-CH₂-C₆H₄-4-NO₂.diacetát előállítása

A 640 mg védett pepiidet 11 ml anizol és 16 ml ecetsav elegyében oldjuk, majd hozzáadunk 16 ml 2 mólos HCl/ecetsav oldatot. Szobahőmérsékleten 34 percig hagyjuk a reakciókeveréket, majd vákuumban betöményítjük, és a maradékot víz és éter között megosztjuk A nyers terméket a vizes fázisból fagyasztva szárítással nyerjük ki és ioncserés kromatográfiával (karboxi-metil-cellulózon) tisztítjuk.

Tlc : Sl-re tiszta

Hplc.: azonos a más módszerrel izolált termékével.

[a]²⁴·⁵ +33,5⁰ (c=l, metanol) [«] ₅?6 +40,4°

Elemanalizis a

C₂₇H₃₈N₈O₆.2CH₃CO₂H₂H.H₂O összegképletre:

számított: C% 52,54; H% 6,78; N% 15,82; méit: C% 52,46; H% 7,32; N% 16,08.

példa

H-Tyr-D-Arg-Gly-EtPhe(4NO₂)-NH₂.diacetát előállítása (A) H-EtPhe(4NO₂)-OH.HCI előállítása g H-EtPhe(4 NO₂).NH₂-t 100 ml 6 mólos HCl-ban visszaíolyatás mellett 4 órán át melegtjük, majd a halványsárga oldatot lehűtjük és hűtőszekrényben egy éjszakán át állni hagyjuk. Ily módon nyerjük a cím szerinti terméket fehéres színű tűalakú kristályok formájában (4,6 g), amely 272—276°C-on bomlás közben olvad.

Elemanalízis a

C,,H₁₅N₂O₄C1 összegképletre:

számított: C% 48,09; H% 5,46; N% 10,2; méit: C% 48,22; H% 5,47; N% 10,2;

(B) H-Et Phe(4NO₂)-OMe.HCI előállítása ml metanolt 2 g tionil-kloriddal kezelünk — 15°C-on, majd hozzáadunk 4,12 g H-Et Phe(4 NO₂)-OH.HCl-ot, és a keveréket 2 órán át 20°C-on, majd visszaíolyatás mellett összesen 24 órán át keverjük. Ezután az oldószert vákuumban eltávolítjuk, a nyers terméket 40 ml metanolból és 40 ml éterből átkristályosítjuk.

Kitermelés 3,4 g.

(C BOC-Gly.EtPhe(4NO₂)-OMe előállítása

3,0 g BOC-Gly-t és 3,5 g HOBT-t 20 ml DMF-ban oldunk, az oldatot jéggel lehűtjük, és hozzáadunk 3,3 g DCCl-t, majd 30 perc elteltével 30 ml DMF-ban és 1 ml vízben oldott 3,3 g H-EtPhe(4NO₂)-OMe.HCl-ot és 11

-11193569

1,27 g NMM-t, majd a reakciókeveréket 0°C-on 1 órán át és szobahőmérsékleten egy éjszakán át keverjük. Ekkor Tlc-vel kimutatható, hogy a reakció teljesen végbement. Ezután további 1,18 g DCCl-t adunk a keverékhez, és a keverést még 24 órán át folytatjuk. A DCU-ot szűréssel elválasztjuk, a DMF-ot vákuumban eltávolítjuk, a maradékot etilacetátban felvesszük és 2 órán át hűtőszekrényben tartjuk. A DCU-t ismét leszűrjük és az etil-acetátos oldatot négyszer 5%-os nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, kétszer 10%-os citromsav oldattal, kétszer vízzel, és egyszer telített sóoldattal mossuk, az oldatot szárítjuk és betöményítjük. Az ily módon nyert 2,69 g nyers terméket további tisztítás nélkül használjuk fel a következő reakciólépésben. Tlc.-vel kevés DCU mutatható ki.

(D) H-Gly-EtPhe(4NO₂)-OMe.HCl előállítása

A 2,3 g védett dipeptideí 33 ml 1 mólos HCl/ecetsav oldattal kezeljük szobahőmérsékleten 1 órán át, a kapott anyagot vákuumban betöményítjük, a maradékot vízben oldjuk, háromszor éterrel mossuk és fagyasztva szárítjuk. Ily módon 1,42 g cím szerinti terméket nyerünk.

(E) BOC-Tyr-D-Arg-Gly-EtPhe(4NO₂)-OMe előállítása

1,96 g BOC-Tyr-D-Arg-HCl-ot és 1,11 g HOBT-t 17 ml DMF-ban oldunk, jéggel lehűtjük és hozzáadunk 0,93 g DCCI-t. A keveréket 0°C-on 1 órán át keverjük, majd hozzáadunk 17 ml DMF-ban oldott 1,42 g H-Glyx xEt.Phe(4NO_?)-OMe.HCI-ot és 0,42 g NMM-t, és a reakciókeveréket szobahőmérsékleten 24 órán át állni hagyjuk. Ezután még további 0,42 g DCCI-t adagolunk, és a keveréket 24 órán át keverjük. A szokásos feldolgozás után 3,6 g terméket nyerünk.

(F) H-Tyr-D-Arg-Gly-EtPhe(4NO₂)-OMe-diacetát előállítása

A 3,6 g védett tetrapeptid-metil-észterről a védőcsoportot ismert eljárás szerint eltávolítjuk és karboxi-metil-cellulózzal, kromatograíálással tisztítjuk.

Kitermelés 1,55 g.

Elemanalízis a

C₂₈H₄₀N₈O_g.2CH₃CO₂H. 1,5H₂O összegképletre; számított: C% 51,09; H% 6,62; N% 14,44; mért: C% 51,15; H% 6,44; N% 14,70;

(G) H-Tyr-D-Arg-GIy-EtPhe(4NO₂)-NH₂.diacetát előállítása

0,5 g tetrapeptid-metil-észtert 25 ml metanolban oldunk, az oldatot jégben lehűtjük és vízmentes ammóniával telítjük. Ezután a lombikot lezárjuk és szobahőmérsékleten 24 órán át állni hagyjuk. Tlc-vel kimutatható, hogy a reakció teljesen végbement. Az ammónia-felesleget elpárologtatjuk, és a kapott nyers terméket karboxi-metil-cellulózzal kromatografáljuk.

Elemanalízis a

C_2gH₃₉N₉O₇2CH₃CO₂H. 1H₂O összegképletre: számított: C% 51,09; H% 6,62; N% 14,44; mért: C% 51,15; H% 6,44; N% 14,70.

példa (4) vázlat szerinti vegyület

A) N-Etil-2-fluor-benzil-amin-hidrobromld

14,6 g 2-fluor-benzil-bromidot (Aldrich, 77 mmól) 150 ml 33%-os etanolos etil-aminnal elkeverünk és gőzfürdőn 1,5 órán át visszafolyatás mellett melegítjük. Ezután az oldószert vákuumban eltávolítjuk, a maradékot izopropanol és diizopropil-éter elegyébői átkiistályosítjuk, amikor is 10,4 g (58%) terméket nyerünk.

Op.: 165—166°C.

Elemanalízis a

C₉H₁₃NBrF összegképletű vegyületre: számított: C% 46,17; H% 5,60; N% 5,98; mért: C% 46,42; H% 5,59; N% 5,99;

B) BOC-Gly-N(Et)-CH₂-C₆H₄-2F

9,68 g (55,3 mmól) BOC-Gly-t, 12,94 g (120 mmól) N-etil-fluor-benzil-amin-hidrobrornidot, 14,92 g HOBT-t és 7,7 ml trietil-amint 120 ml DMF-ban oldunk, jéggel lehűtjük, hozzáadunk 12,53 g DCCI-t és a kapott keveréket szobahőmérsékleten 48 órán át keverjük. Ezután a DCU-t szűréssel eltávolítjuk, a szüretet betöményítjük és a visszamaradó anyagot etil-acetát és 5%-os nátrium-hidrogénkarbonát között megosztjuk. A szerves fázist háromszor 5%-os nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, telített nátrium-kloriddal, majd kétszer 5%-os citromsav-oldattal és végül kétszer telített nátrium-kloriddal mossuk, vízmentes magnézium-szulfáton szárítjuk, aktív szénen szűrjük és betöményítjük. A gumiszerű termék mennyisége 16,8 g (98%) és Tlc-vel kimutathatóan DCU nyomokat tartalmaz.

C) H-Gly-N(C₂H_S)-CH₂-C₆H₄-2F

Az első lépés szerinti nyert terméket (16,8 g, 54,2 mmól) 150 ml jégecetben oldjuk és szobahőmérsékleten 150 ml 2 mólos ecetsavas sósavval kezeljük 30 percig, szobahőmérsékleten. Ezután a keveréket betöményítjük, a maradékot víz és éter között megosztjuk, a vizes fázist az étertől elválasztjuk, fagyasztva szárítjuk, és a kapott gumiszerű anyagot izopropanol-diizopropil-étei elegyébői átkristályosítjuk.

A termék mennyisége 10,15 g (76%). Tlc-vel Sí, SIII, SV-ben tiszta.

Op.: 111 —113°C.

Elemanalízis a

C_hH,₆N₂OFC1 összegképletű vegyületre: számított: C% 53,55; H% 6,50; N% 11,35; mért: C% 53,50; H% 6,54; N% 11,37.

D) BOC-Tyr-D-Arg-Gly-N(C₂H₅)-CH₂-C₆H₄-2F

4,26 g (9 mmól) BOC-Tyr-D-Arg.HCl-ot, 2,43 g HOBT-t, 2,22 g (9 mmól) H-Gly-N(C₂H₅)-CH₂-C₆H₄-2F.HC1-oí és NMM-t 20 ml DMF-ban oldunk, —5°C-ra lehűtjük

-12193569 és hozzáadunk 1,85 g DCCl-t. A kapott reakciókeveréket 4°C-on 48 óráig keverjük, a DCU-t szűréssel elválasztjuk, a szűrletet vákuumban betöményítjük,és a nyers terméket etil-acetát és 5%-os citromsav között meg- ! osztjuk. A vizes fázist elválasztjuk, kétszer etil-acetáttal mossuk, a pH értékét szilárd kálium-karbonáttal 6-os értékre beállítjuk, és a kiváló csapadékot etil-acetát-n-butanol 4:1 arányú elegyével extraháljuk. A terméket 1 az etanol vákuumban való eltávolítása és többszöri etanolos oldás és ismételt bepárlás után nyerjük, mennyisége 6,3 g.

E) H-Tyr-D-Arg-Gly-N(C₂H₅)-CH₂-C₆H₄- ¹-2F-diacetát

6.3 g védett tripeptidet 25 ml anizol és 75 ml ecetsav elegyében oldunk és 2 mólos ecetsavas sósavval 30 percig szobahőmérsék- 2 létén kezeljük, majd a reakcióelegyet vákuumban betöményítjük, a maradékot vízben oldjuk és kétszer éterrel mossuk. A vizes fázist fagyasztva szárítjuk, a kapott 5,63 g nyers terméket ötször 50 cm-es karboxi-metil- 2 -cellulózzal töltött oszlopon lineáris gradiensű ammónium-acetáttal pH 5,1-es értéken eluáljuk.

F) H₂NC(:H N)-Tyr-D-Arg-GIy-N(C₂H₅)-CH₂-C₆H₄-2F-diacetát ³

7.3 g (10,9 mmól) előző lépés szerint nyert terméket 30 ml etanolban oldunk, hozzáadunk 3,24 g (16,4 mmól) 1-amidino-3,5-dimetil-pirazol acetátot és 3 ml (22 mmól) trietil-amintj és a kapott keveréket 65°C-on 4 órán át keverjük és egy éjszakán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Ezután az etanolt vákuumban eltávolítjuk, a nyers terméket vízben oldjuk, etil-acetáttal mossuk és az ₄előző lépésben leírtak szerint ioncserés kromatográfiával tisztítjuk.

Elemanalízis a

C₂₇H₃₈N₉O₄F.2CH₃CO₂H.H₂O képletű vegyületre: 4 számított: C% 52,47; H% 6,77; N% 17,77; mért: C% 52,31; H% 6,72; N% 17,54;

Farmakológiai vizsgálatok g (A) Forró-lemezes vizsgálat

Hím egereket (CFLP törzs, Hacking, Churchil) egyenként 55°C-os meleg vízfürdőbe merített rézlemez-aljú dobozba helyeztünk és megfigyeltük a reakcióidőt (max. _g30 másodperces'ideig), amely után a mancsaik rázásával vagy nyalogatásával kifejezték kellemetlen fájdalomérzetüket. Ezután ötös csoportokba osztva szubkután injekcióval vagy vizsgálandó vegyületet vagy 0,85%os sóoldatot adagoltunk a kísérleti álla- ® toknak, és a vizsgálatot 15 perc elteltével megismételtük. A vizsgálandó vegyület ED₅₀értékét azon állatok számából határoztuk meg, amelyeknél a reakcióidő kétszeresre nőtt a kezelés után. 6

B) Irritálószer által kiváltott rángatódzás vizsgálata

i) Ecetsav. Nőstény egerek (CDL, Charles River) ötös csoportjainak vizsgálandó anyaj got, illetve 0,85%-os sóoldatot adagoltunk szubkután, 15 perccel az intraperitoneálisan, 25 ml/kg mennyiségben adagolt 0,6%-os ecetsav előtt. 20 perc elteltével 2 és fél percen át számoltuk az irritálószer által kiváltott θ rángatódzó vagy kinyújtózkodó mozdulatokat, amelyeket a hátsó lábuk kinyújtása és a has összehúzódása alapján határoztunk meg.

ii) Fenil-benzokinon (PBQ). A vizsgálatot a fentiekben leírtakhoz hasonlóan végeztük, azzal az eltéréssel, hogy rángási/nyújtózkodási mozgások meghatározását 10 perccel az irritálószer beadagolása után kezdtük θ meghatározni, és az irritálószert 2,5 mg/kg mennyiségben, 10 ml/kg térfogatban adagoltuk. Az ED₅₀ értékeket regressziós analízis útján határoztuk meg, és értéke azonos azzal a dózismennyiséggel, amelynél a rán⁵ gási/kinyújtózkodási mozdulatok száma fele a kontrolinál meghatározott értéknek.

C) Antagonizmus kvaterner opioddal

Hím egerek (TFW, Tuck) hatos csoport0 ja nak intraperitoneálisan 16 mg/kg dózisban N-metil-narolphint vagy 0,85%-os sóoldatot adagoltunk [10 ml/kg dózisban], majd 2C perc elteltével szubkután adagoltuk a vizsgálandó anyagot [sóoldatban, 10 ml/kg dózisban], majd újabb 30 perc elteltével intraperitoneálisan 0,65%-os ecetsav oldatot [25 ml/kg dózisban]. Ezután minden csoportnál 15 perc elteltével 5 percep keresztül számoltuk a rángási/nyújtózkodási mozdulatoθ kát, majd regressziós analízis segítségével meghatároztuk a vizsgáit vegyületre vonatkozó ED₅₀ értékeket (azonosan a B) pontban leírtakhoz), valamint meghatároztuk azokat a dózisarányokat is, amelyek az azonos anti5 nociceptív hatás eléréséhez szükségesek a kvaterner vegyület jelenlétében, illetve hiányában.

D) Köhögés-ellenes hatás

A vizsgálatot Boura és munkatársai [Br.J. Pharmac., 39/1 (1970), 225] módosított vizsgálati eljárása szerint végeztük. Tengerimalacokat 30%-os citromsav aeroszollal kezeltük 30 perccel a vizsgálandó vegyület bea5 dagolása után [szubkután, 0,85% (s/s), sóoldatban], majd 12 és fél percen keresztül számoltuk a köhögések számát. A vegyületek ED₅₀ értékeit regressziós analízis segítségével határoztuk meg, és értéke azonos azzal a dózismennyiséggel, amely a köhögések számát felére csökkenti a kontrolihoz viszonyítva. Kontrollként sóoldatot adagoltunk a kísérleti állatoknak.

A fenti vizsgálatok eredményeit a követ5 kező táblázatban foglaltuk össze. Az értékek

-13193569

26 mg vegyület/testsúly kilogrammot jelentenek, * a vizsgálandó vegyületet 30 perccel az szabad pepiidben kifejezve. ecetsav/PBQ adagolás előtt adagoltuk,

A jelölések értelmezése: NE: nincs hatás, ** a vizsgálatot 30 perccel a kezelés után

p.o.: per os (szájon át), megismételtük.

2. tábláját

Vegyület	Meleg-lemez /AZ	ZB/ Rangatodzás Ecetsav	PBO	N—metilnalorfin /a/	/CZ Rángatodzas	/D/ Köhögésellen esség
Sóoldat Zb/	Dózis arany • /a/: Zb/
dextropropoxif en	25,9		2,6	6,9	6,8	1,0
indomet- acin morfin	NE CÖlOO 1,8	0,45*	0,9 0,38	0,24	0,4	0,9
pentazocin t. példa	NE 2l 1 00 NE fi 100	2,3 t4,0	p.o. 3,5* 6,2	12,5	2,8	4,5	3,0
2. példa	NE ffl 50	p.o. 30,6*	p.o. 43,5* 0,18	1,2	0,12	9,6	0,06
3. példa	1,0	0,03	p.o. 10,0* 0,02	0,08	0,03	3,4	0,001
4. példa	p.o. 159,9”* 1.5	p.o. 0,9* 0,009*	p.o. 14,0* 0,008	0,007	0,001	5,1	0,01
33. példa	1,5	0,008*	p.o. 1,9* 0,08	0,01	0,002	6,5	0,004
	p.o. NE ffl 100*		p.o. 25,6*

(E) Hasmenés ellenes hatás

Nőstény patkányokat (Cobs Wistar, Charles River) 24 órán át koplaltattunk, majd 30 orálisan 10 ml/kg dózisban a vizsgálandó vegyület vizes oldatát adagoltuk. 15 perc elteltével mindegyik patkánynak 1 ml ricinusolajat adtunk orálisan, majd megfigyeltük a hasmenés megjelenését. A vegyületek ED₅₀ értéke azonos azzal a dózissal, amely a Hasmenést megszünteti a kísérleti állatok 50%-ánál és ezt a ricinusolaj adagolása után különböző idők elteltével határoztuk meg. A kapott eredményeket a következő 3. táblázatban foglaltuk össze.

3. táblázat

Vegyület	4 Λ f * 1,0 óra	1,5 éra*	2,0 éra*	2,5 éra*
1 . példa	8,5	30,3	40,5
2, példa	1,9	3,2	16,7	28,6
3. példa		0,11	0,31	0,46
33_O példa	0,02	0,03	0,02	0,05

ricinusolaj adagolása után (F) Kardiovaszkuláris hatás

A vizsgálatnál a 2. példa szerint előállított vegyület oldatát (0,85-os sóoldatban) adagoltuk 300—400 gr-os hím patkányoknak (Wistar) intravénás bolus injekciók formájá- 55 bán, 0,1 ml/100 g dózisban. A vizsgált vegyület 0,01 és 1,0 mg/testsúlykilogramm dózisok között, a dózistól függő hipotenziós bradycardiaval kísért hipotenziós hatást mutatott.

(G) Toxicitás

Egereknél a 2. példa szerinti eljárással előállított vegyület a következő mértékben mutatott toxikus hatást:

500 mg bázis vegyület/kg p.o. adagolás ese- gg tén: az állatok 1/5-e elpusztult 14

200 mg bázis vegyület/kg s.c. adagolás esetén: az állatok 5/5 része elpusztult.

Gyógyszerkészítmények előállítása

A következő formulázási példákban a „vegyület megnevezés minden esetben valamely előzőek szerint definiált (I) általános képletü vegyületet jelent, és mennyisége a szabad peptidre vonatkozik.

a) Kapszula-készítmény összetétel: Vegyület 5,0 mg

Magnézíum-sztearát 0,75 mg

Laktóz BP 200 mg-ig

Az összetevőket elkeverjük, kemény zselatinkapszulákba töltjük úgy, hogy minden

-14193569 kapszula 5 mg hatóanyagot tartalmazzon (szabad peptidre számítva), b) Tablettakészítmény

összetétel:
Vegyület	5,0 mg
Avicel PH 101	22,5 mg
Hidroxi-propil-cellulóz	9,0 mg
Polivinil-pirrolidon K30	6,0 mg
Magnézium-sztearát	0,75 mg
Laktóz BP	150,0 mg-ig
c) Fagyasztva szárított mény összetétel:	injekciókészít-
Vegyület	5,0 mg
Manóitól	62,5 mg
Víz (injekció céljára)	2,0 ml-ig

Az összetevőket a víz 9/10 részében feloldjuk, majd a teljes mennyiségre kiegészítjük. Ezután steril körülmények között a szűréssel sterilizált oldatot megfelelő steril fiolákba töltjük, fiolánként 2,5 ml mennyiségben, majd részlegesen bezárjuk fagyasztott dugóval és megfagyasztjuk, végül alumínium fedővel lezárjuk inért gáz atmoszférában.

d) Kúpkészítmény

összetétel:
Vegyület	5,0 mg
Szilárd zsír BP	1000,0 mg-ig
e) Dermális lemosófolyadék
összetétel:
Vegyület	0,4 g
Szorbitán-monolaurát	0.6 g
Poliszorbát	0,6 g
Ketosztearil-al kohol	L2 g
Glicerin	6,0 g
Metil-p-hidroxi-benzoát	0,2 g
Tisztított víz BP	100,0 ml-ig

A metil-p-hidroxi-benzoátot és a glicerint

75°C-on 70 ml vízben oldjuk, a szorbitán-mono-laurátot, a poliszorbát 20-at és a keto-sztearil-alkoholt 75°C-on összeolvasztjuk és a vizes oldathoz adagoljuk. A kapott emulziót homogenizáljuk, állandó keverés közben lehűtjük, hozzáadjuk a maradék vízben oldott hatóanyagot, és a teljes homogenitásig keverjük.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás (I) általános képletű peptidek — a képletben

R¹ jelentése hidrogénatom, 1-2 szénatomos alkilcsoport vagy amidinocsoport,

R² jelentése 1-2 szénatomos alkilcsoport, R³ jelentése hidrogénatom vagy karbamilcsoport,

X² jelentése (a) általános képletű D-konfigurációjú csoport,

Z¹ és Z² jelentése azonosan vagy különbözően hidrogénatom, halogénatom, nitro- vagy trifluor-metil-csoport, és legalább az egyik hidrogénatomtól eltérő, m jelentése 3 vagy 4 és π jelentése 0, 1 vagy 2, feltéve, ha R³ jelentése karbamilcsoport, π jelentése mindig 1 — és farmakológiailag elfogadható savaddíciós sóik előállítására, azzal jellemezve, hogy

a) valamely (II) általános képletű vegyületet — a képletben R¹ jelentése a fenti és Y¹ jelentése olyan gyök, amelynek szekvenciája azonos az (I) általános képletű vegyület megfelelő N-terminális részgyökének szekvenciájával — valamely (III) általános képletű vegyülettel reagáltatunk — a képletben Y² jelentése azonos a fenti peptid fennmaradó részével, és szekvenciája azonos a megfelelő C-terminális részgyök szekvenciájával — a

5 (II) és (III) általános képletű vegyületek kívánt esetben a megfelelő· helyen védve és/vagy aktiválva lehetnek, majd adott esetben a védőcsoportokat eltávolítjuk,

b) valamely (IV/1) általános jtépletü C-terminális peptidkarbonsavat— a képletben R¹ és X² jelentése a tárgyi kör szerinti és Q jelentése hidroxilcsoport — vagy reakcióképes származékát valamely (VI) általános képletű aminovegyülettel — a képletben R², Z¹, Z² és n jelentése a tárgyi kör szerinti — reagáltatunk, vagy

c) valamely. (IV/1) általános képletű C-terminális peptidkarbonsavat — a képletben R¹ és X² jelentése a tárgyi kör szerinti és Q jelentése (IV/2) általános képletű csoport, amelyben R², Z¹ és Z² jelentése a tárgyi kör szerinti — vagy reakcióképes származékát am dálunk, vagy

d) olyan (I) általános képletű vegyületet, amelynek képletében R¹, R², R³, Z¹, Z² és n jelentése a fenti és X² jelentése (b) képletű csoport — a képletben R⁵ jelentése hidrogénatom — amidinálunk, és kívánt esetben a fenti eljárások bármelyikével nyert (1) általános képletű peptidet — a képletben R¹ jelentése hidrogénatom, R², R³, X², Z', Z² és n jelentése a tárgyi kör szerinti — amidinálunk, és kívánt esetben a fenti eljárások bármelyikével nyert terméket sav addíciós sóvá alakítjuk.
2. Az 1. igénypont szerinti c) eljárás olyan (I) általános képletű vegyületek előállítására, amelyben R¹, R², X², Z‘, Z² jelentése az 1. igénypont tárgyi köre szerinti, n jelentése 1 és R³ jelentése karbamoilcsoport, azzal jellemezve, hogy valamely (IV) általános képletű peptidésztert — a képletben R¹, R², X², Z¹, Z² jelentése a fenti és OR⁴ jelentése alkalmas helyettesíthető alkoxi-, aralkoxivagy ariloxicsoport — ammóniával reagáltatunk.
3. Az 1. igénypont szerinti b) eljárás olyan (I) általános képletű vegyületek előállítására, amelyben R¹, R², X², Z¹, Z² jelentése az 1. igénypont tárgyi köre szerinti, R³ jelentése hidrogénatom és n jelentése 1, azzal jellemezve, hogy valamely (V) általános képletű vegyületet — a képletben R^l és X² jelentése a fenti — vagy annak reakcióképes származékát valamely (VI) általános képletű vegyü15

-15193569 lettel — a képletben R¹, R², X², Z', Z² és n jelentése a fenti — reagáltatunk.
4. Az 1—3. igénypontok bármelyike szerinti eljá rás, azzal jellemezve, hogy olyan (I) általános képletü vegyületet, amelyben R¹ jelentése hidrogénatom, R², R³, X², Z¹ és Z² jelentése az 1. igénypont szerinti és n jelentése 1 — amidinálunk.
5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan kiindulási vegyületet alkalmazunk, amelyben X² jelentése D-arginil és R’, R², R³, Z', Z² és n jelentése az 1. igénypont szerinti.
6. Az 1. vagy 5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan kiindulási vegyületet alkalmazunk, amelyben R² jelentése etilcsoport és R', R³, Z¹, Z² és n jelentése az 1. igénypont szerinti.
7. Az 1. vagy 5—6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan kiindulási vegyületet alkalmazunk, amelyben R³ jelentése karbamoilcsoport és R¹, R², X², Z¹, Z² és n jelentése az 1. igénypont szerinti.

81 Az 1. vagy 5—6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan kiindulási vegyületet alkalmazunk, amelyben R³ jelentése hidrogénatom és R¹, R², X², Z¹, Z² és n jelentése az 1. igénypont szerinti.
9. Az 1. vagy 5—8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan kiindulási anyagot alkalmazunk, amelyben π jelentése 1 és R¹, R², R³, X², Z¹ és Z²

5 jelentése az 1. igénypont szerinti.
10. Az 1—9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan kiindulási anyagot alkalmazunk, amelyben Z¹ és Z² közül az egyik hidrogénatom és a

10 másik nitrocsoport vagy fluoratom és R¹, R², R³, X² és n jelentése az 1. igénypont szerinti.
11. Az 1—9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan
15 kiindulási vegyületet alkalmazunk, amelyben Z¹ és Z² jelentései közül az egyik hidrogénatom, a másik jelentése az 1. igénypont szerinti és 4-es helyzetben van, és R¹, R , R³, X² és n jelentése az 1. igénypont szerinti.
20 12. Eljárás gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként 1. igénypont szerinti eljárással előállított új (I) általános képletü pepiidet — a képletben R¹, R², R³, X², Z¹, Z² és n jelentése ²⁵ az 1. igénypont szerinti — vagy farmakológiailag elfogadható savaddíciós sóját gyógyszerészeti hordozóanyaggal és kívánt esetben alkalmas adalékanyaggal összekeverjük és adagolásra alkalmas készítménnyé alakít30 juk.