FI81207B - Reseptorprov av solid fas foer antibiotika av vancomycin-klass. - Google Patents

Description

1 81207

ΚΙ INTEÄFAASIN EN RESEPTORI KOE VANKOMYSIINILUOKAN ANTIBIOOTEILLE

Tämä keksintö koskee menetelmää, jolla määritetään antibiootteja, joilla on kyky sitoutua D-alanyy1i-D-a1 aniini-5 dipeptidiin, kuten vankomysiini1uokan glykopeptidianti-biootteja ja niiden johdannaisia tai aglykoneita. Tämän keksinnön kohteena ovat edelleen testipakkauksen (kit) koostumukset ja keinot keksinnön mukaisen menetelmän hyödyntämiseksi.

Teikoplaniini on aikaisemmin teikomysiininä nimetyn an-10 tibiootin, joka on kuvattu US-patentissa 4 239 751, kansainvälinen ei rekisteröity (INN) nimitys, "vankomysiini-luokkaan" kuuluvia muita antibiootteja ovat vankomysiini , ristosetiini, aktaplaniini , teikoplaniini , avoparsiini, aktinoidiini, LL-AM374, A 477 , OA 7653 , A 3551 2 B, A 15 515668, AAD 216, A 41030, A 47934 sekä näiden yksittäiset tekijät, johdannaiset ja aglykonit.

On tunnettua, että vankomysiini ja ristosetiini A häiritsevät peptidoglykaanin, joka on bakteeri soiuseinän päära-kennekomponentti, synteesiä. On uskottu, että tämä häi-20 rintä, joka johtaa solukasvun estymiseen ja mahdollisesti solun hajoamiseen lysioitumalla (liukenemalla), johtuu spesifisestä sitoutumisesta, joka tapahtuu näiden antibioottien ja pentapeptidi-prekursorin välillä, jolla on D-Ala-D-Ala-jäännös karbonyylipäässä (UDP-N-asetyylimura-25 myylipentapeptidi)(H.R. Perkins, Biochem. J. 111, 195 (1969)).

Äskettäin on havaittu, että myös teikoplaniini toimii saman mekanismin mukaisesti sitoutuessaan sensitiivisten bakteerien kasvavaan peptidoglykaaniin. Erityisesti havaittiin, 30 että teikoplaniini, kuten vankomysiini ja ristosetiini A ja samanlaiset antibiootit, sitoutuu peptidoglykaaneihin, jotka sisältävät D-Ala-D-Ala-dipeptidi n karboksyylipäässä.

2 81207 Näin toimiessaan ne luultavasti estävät bakteeri-trans-peptidaasin ja estävät soluseinän peptidoglykaanin risti i nkytkey tyrni sen . Nämä antibiootit myös sitovat D-ala-nyyli-D-alaniini-dipeptidin tai D-alanyyli-D-alaniini-5 karboksipäätteisen oiigopeptidi n.

Myös muut vankomysiiniluokan antibiootit ovat osoittaneet tai niiden oletetaan toimivan samalla vaikutusmekanismilla ja siten ne kykenevät sitoutumaan D-alanyyli-D-alaniini-dipeptidiin tai D-alanyyli-D-alaniini-karboksi-10 päätteiseen oiigopeptidiin.

Vankomysiini1uokan antibioottien lisäksi tätä menetelmää voidaan sopivasti käyttää määritettäessä muita ei-glyko-peptidisiä tai ei-vankomysiinin kaltaisia antibiootteja, jotka kykenevät sitoutumaan D-alanyyli-D-alaniini-dipep-15 tidiin tai D-alanyyli-D-alaniini-karboksipäätteiseen o1i-gopepti dii n.

D-alanyyli-D-alaniinia tai D-alanyyli-D-alaniini-oiigopep-tidiä voidaan pitää tämän vuoksi edellä kuvattujen enti-bioottien "mol ekyyl i reseptori na11.

20 Tähän asti tunnetut menetelmät antibioottien ja erityisesti teikoplaniinin ja muiden vankomysiini1uokan antibioottien määrittämiseksi, ovat perustuneet ohutkerroskromato-grafiaan (TLC), korkeapainenestekromatografiaan (HPLC) ja herkillä mikro-organismeilla suoritettuihin kasvukokei-25 siin (bioassays)(kts. esimerkiksi edellä mainittu US-patentti).

Hoitavan terapeuttisen käytön kannalta ja eräiden näiden antibioottien kliinisen tutkimuksen etujen kannalta on ilmennyt tarvetta koemenetelmistä niiden määrittämiseksi 30 nesteistä, erityisesti biologisista nesteistä, jotka menetelmät olisivat nopeita, helppoja, luotettavia ja sopivia automaattisesti suoritettaviksi.

On havaittu, että on mahdollista määrittää teikoplaniini ja muut antibiootit (kuten vankomysiini 1uokan muut anti- 3 81207 biootit), joilla on sama vaikutusmekanismi ja jotka sitoutuvat samoihin "molekyylireseptoreihin", käyttäen luotettavaa, tarkkaa, nopeaa ja sensitiivistä menetelmää, joka perustuu kilpailevaan tai kyllästyvään sitoutumismene-5 telmään ("competitive or saturation binding assays) ja jossa käytetään D-alanyyli-D-alaniini-karboksipäätteisen oiigopeptidin sopivaa, konjugoitua muotoa adsorboituna ta vanoma i s e11 e kiinteälle faasille.

D-alanyyli-D-alaniini-karboksipäätteinen oiigopeptidi voi 10 olla tri-, tetra-, penta-, heksa- tai heptapeptidi, jossa karboksipäätteinen dipeptidi on D-alanyyli-D-alaniini. Keksinnön mukainen edullinen D-alanyyli-D-alaniini-karbok-sipäätteinen oiigopeptidi on tripeptidi £.-ami nokaproyyl i --D-alanyyli-D-alaniini (lyhennetty: £_-Aca-D-Ala-D-Ala).

15 D-alanyyli-D-alaniini-karboksipäätteinen oligopeptidi on konjugoitu sopivaan kantoaineeseen, jotta se kykenee adsorboitumaan kiinteällä faasipinnalla. Sopivia kantoaineita voivat olla tässä tapauksessa mikä tahansa proteiini tai muu, suuren molekyylipainon omaava aine, joka pystyy si-20 toutumaan kovalenttisesti D-alanyyli-D-alaniini-karboksi-päätteiseen oiigopeptidiin, muodostaen konjugaatin, joka kykenee adsorboitumaan (t.s. kykenee muodostamaan fysikaalisia sidoksia) valitun kiinteän faasipinnan kanssa.

Edullinen esimerkki tällaisesta kantoaineesta on albumii-25 ni, ja erityisesti naudan albumiini. Kuitenkin käyttökelpoisia ovat myös kananmunan, ihmisen ja sian albumiini.

Kiinteä faasipinta, jolle D-alanyyli-D-alaniini-karboksipäätteinen oiigopeptidi-kantoaine adsorboidaan on mieluimmin analyyttinen kantaja. Tämän ha- 30 kemuksen piirissä termillä "kantaja" tarkoitetaan mitä tahansa analyyttistä välinettä, joka voi sisältää tai ainakin voidaan saattaa nestemäisten reagenssien vaikutuksen alaiseksi. Edullisia esimerkkejä näistä ovat lasiset tai muoviset mikrotiitteri1evyt 4 81207 tai koeputket tai muoviset kalvot. Edullisia kantajia ovat polyetyleeni- tai polystyreen i-mi kroti i tteri1e-vyjen kolot.

Kuten jo edellä mainittiin "analyytti" t.s. aine, joka 5 voidaan testata keksinnön mukaisella menetelmällä, on antibiootti, joka kykenee sitoutumaan D-alanyyli-D-alaniini-dipeptidi in tai D-alanyyli-D-alaniini-karboksipäätteiseen oiigopeptidiin, tällaisia ovat teikoplaniini tai muu, van-komysiiniluokan antibiootti (kuten jo edellä määriteltiin), 10 sen yksittäinen tekijä, johdannainen, aglykoni tai pseudo- aglykoni tai muu, ei-vankomysiinin kaltainen tai ei-glyko-peptidinen antibiootti, joka sitoutuu mainittuun "molekyy-1ireseptori in".

Keksinnön mukainen menetelmä voi perustua kilpailevaan tai 15 kyllästyvään sitoutumismenetelmään.

Kuten on tunnettua kilpaileva menetelmä on sellainen, jossa analyytti määritetään kvantitatiivisesti tunnettua, määrää "leimattua analyyttiä" vastaan "kilpailtaessa rajoitetusta määrästä analyytille tarjotuista sitoutumispaikoista".

20 Kyllästetty menetelmä eroaa olennaisesti kilpailevasta me netelmästä siinä, että se on kaksivaiheinen menetelmä, jossa analyytti tasapainoitetaan ylimäärällä "sitoutumispaik-koja", jonka jälkeen lisätään "leimattua analyyttiä" kaikkien vielä käytettävissä olevien sitoutumispaikkojen tyy-25 dyttämi seksi.

Alan ammattimiehelle on selvää, että keksinnön mukaisessa menetelmässä "sitoutumispaikat" ovat niin sanottuja "molekyyli reseptorei ta" , t.s. D-alanyyli-D-alaniini-karboksi-päätteinen oiigopeptidi-konjugaatti adsorboituna 30 analyyttisen kantajan pinnalle.

"Leimattu analyytti" tarkoittaa analyyttiä, joka on leimattu jollain tunnetulla "leimaus" menetelmällä, kuten radioisotooppimerkei11ä tai mieluimmin entsyymeillä.

5 81207

Radi oisotooppimerkkejä ovat sellaiset, joita tavallisesti 1 pc käytetään radio-immunokokeissa, kuten I, kun taas ent-symaattinen merkkiaine on jokin tavallisesti entsyymi-si-toutumisimmunokokeessa käytetty yhdiste. Edullinen entsyy-5 mimerkki on piparjuuri-peroksidaasi.

Kun "leimattu analyytti" on entsyymi 1 eimattu analyytti mittaus tapahtuu mieluimmin koi orimetrisesti sopivan kro-mogeenisen substraatin läsnäollessa. Kun kysymyksessä on radioisotooppisesti leimattu yhdiste käytetään tavallises-10 ti tuikelaskinta.

Näin ollen yhtenä keksinnön kohteena on menetelmä analyy-tin määrittämiseksi, joka analyytti on vankomysiini 1uokan antibiootti, sen yksittäinen tekijä, johdannainen tai agly-koni, jokin muu glykopeptidinen antibiootti, sekä ei-gly-15 kopeptidinen antibiootti, joilla kaikilla on yhteisenä piirteenä sitoutuminen "molekyylireseptori in", joka on D-alanyyli-D-alani ini-di peptidi tai D-alanyyli-D-alaniini-karboksipäätteinen oiigopeptidi.

Tässä menetelmässä analyyttisten 20 kantajien muovipinnalle adsorboidaan passiivisesti mää rätty määrä D-alanyyli-D-alaniini-karboksipäätteistä o1i-gopeptidiä, joka on konjugoitu mainitulle pinnalle adsorboitumaan kykenevän makromolekyylisen kantoaineen kanssa, ja lisätään joko samanaikaisesti tai myöhemmin testattava 25 näyte ja tunnettu määrä leimattua analyyttiä ja arvioidaan kiinteään faasi systeemi in sitoutuneen leimatun analyytin määrä vertaamalla standardi käyrään, joka saadaan testaamalla tunnetut analyyttimäärät.

Alan ammattimies voi arvostaa sitä, että D-alanyyli-D-30 -alaniini-karboksipäätteisen oiigopeptidin liittäminen sopivaan kantoaineeseen voidaan tehdä tekniikassa sinänsä tunnetuilla menetelmillä. Tarkoituksenmukaisesti käytetään kytkentäainetta; edullinen kytkentäaine on glutaariaide-hydi. Muita tunnettuja kytkentääineita ovat karbodi-imidit, 6 81207 di-isosyanaatit, anhydridit, diatsoniumyhdisteet, atsi-dit ja syaanibromidi. Samalla tavalla tunnettuja kytkentä-menetelmiä ja -reagensseja, kuten edellä esitettyjä, voidaan käyttää myös "leimatun entsyymin" liittämiseksi ana-5 lyyttiin valmistettaessa "leimattua analyyttiä". Myös tässä tapauksessa glutaarialdehydi on edullinen kytkentää!ne .

Näissä kytkentäreaktioissa reagenssin välinen suhde voi vaihdella huomattavasti, vaikkakin monissa tapauksissa 1:1 "leimatun entsyymin" ja analyytin välillä ja vastaavasti 10 D-alanyyli-D-alaniini-karboksipäätteisen oiigopeptidin ja kantoaineen välillä on edullinen. Lisäksi kun kysymyksessä on kytkentäreaktio D-alanyyli-D-alaniini-karboksipäätteisen oiigopeptidin, joka on E.-Aca-D-Ala-D-Ala , ja makromolekyy-lisen kantoaineen, joka on naudan seerumialbumiini (BSA), 15 välillä, näiden kahden reagenssin moolisuhde voi vaihdella 1:1 - 10:1.

Kilpaileva koe keksinnön menetelmän mukaisesti käsittää: a) analyyttisten kantajien pinnalle adsorboidaan passiivisesti D-alanyyli-D-alaniini-20 karboksipäätteinen oiigopeptidi, joka on konjugoitu mai-tulle pinnalle adsorboitumaan kykenevän makromolekyylisen kantoaineen kanssa; b) tähän lisätään ja inkuboidaan testattavaa näytettä yhdessä tunnetun määrän kanssa"1eimattua analyyttiä"; 25 c) analyytin määrä testattavassa näytteessä arvioidaan, määrittämällä kiinteään faasisysteemiin sitoutuneen "leimatun analyytin" määrä vertaamalla standardi käyrään, joka saadaan tunnetuilla analyyttimäärillä .

Tämän keksinnön mukainen edullinen suoritusmuoto on sel-30 lainen, jossa D-alanyyli-D-alaniini-karboksipäätteinen oligopeptidi on ^.-Aca-D-Ala-D-Ala keksinnön mukaisessa menetelmässä. Tämän keksinnön mukainen toinen edullinen suoritusmuoto on sellainen, jossa muovipinnoille adsor- 7 81207 hoitumaan kykenevä makromolekyylinen kantoaine on seerumi-albumiini ja mieluimmin naudan seerumialbumiini (BSA).

Edelleen tämän keksinnön mukainen edullinen suoritusmuoto on sellainen, jossa käytetään "leimattuna analyyttinä" 5 entsyymi 1eimattua analyyttiä, mieluimmin "leimaava" entsyymi on oiparjuuri-peroksidaasi.

Edelleen keksinnön mukainen edullinen suoritusmuoto on sellainen, jossa keksintöä käytetään analyytin määrittämiseksi, joka on teikoplaniini tai teikoplaniinijohdannainen, 10 aglykoni tai pseudoglykoni.

Keksinnön mukainen erityisen edullinen suoritusmuoto on kilpaileva menetelmä analyytin määrittämiseksi, joka on teikoplaniini tai jokin muu vankomysiiniluokan antibiootti tai sen yksittäinen tekijä, johdannainen tai aglykoni, ih-15 misen seeruminäytteissä, joka menetelmä käsittää: a) valmistetaan 1aimennuspuskuri, jonka pH on 7,0 - 7,5, fosfaattipuskuroidusta suolaliuoksesta (PBS), naudan seerumial bumi inistä (BSA) ja pinta-aktiivisesta aineesta, kuten polyetyleenioksidi-sorbitaani-mono-1aura atista 20 (Tween ® 20); b) valmistetaan testattavan antibiootin mittastandardi- laimennokset (mukaanluettuna nollastandardi) fosfaattipus-kuroituun suolaliuokseen (PBS) ja laimennettuun seerumiin pH 7,0 - 7,5; 25 c) laimennetaan testattavat seeruminäytteet valittuun laimennukseen edellä mainitulla 1aimennuspuskuri11 a; d) jokaiseen näytteeseen lisätään piparjuuri-peroksi-daasi-analyytti-konjugaatin liuos, sekoitetaan; e) jokainen näistä seoksista siirretään mikrotiitteri1e-30 levyn muovi koi oi hi n, jotka on päällystetty rajoitetulla määrällä BSA-£.-Aca-D-A1a-D-Ala-konjugaattia; 8 81207 f) inkuboidaan 2 tuntia kosteassa laatikossa huoneen lämpötilassa, jonka jälkeen kolot pestään hyvin PSBrllä + 0,05-0,1-% (til./til.) Tween® 20, pH 7,0-7,5; g) lisätään piparjuuri-peroksidaasin kanssa väriä ke- 5 hittävä kromogeenisubstraatti; h) jokaisen näytteen optinen tiheys määritetään spektro-fotometrisesti, ja i) analyyttikonsentraatio testi näytteissä lasketaan in-terpoloimal1 a jokaisen näytteen kilpaileva suhde standar- 10 deilla saadulta kaiibrointikäyrältä.

Kilpaileva suhde määritettiin näytteen spesifisen optisen tiheyden ja nollastandardin spesifisen optisen tiheyden suhteena.

Edellä esitetty menetelmä on niin sanottu "kilpaileva" si-15 toutumiskoe, jolle on tunnusomaista, että tarjolla olevien sitoutumispaikkojen kokonaismäärä jokaisessa näytteessä on alhaisempi kuin analyyttien ja leimattujen analyyttien summa.

Kuitenkin tätä menetelmää voidaan muuttaa ja käyttää "vai-20 heittaisessa kyl1ästymis"-kokeessa, joka käsittää kaksivaiheisen sitoutumisreaktion.

Ensimmäisessä vaiheessa analyytti, joka sisältää standardin tai testattavan näytteen, tasapainoitetaan ylimäärällä BSA-^-Aca-D-Ala-D-Ala-konjugaattia ja toisessa vaiheessa, 25 pesun jälkeen, lisätään entsyymi 1eimattu analyytti jäljellä olevien sitoutumispaikkojen kyllästämiseksi. Sitoutunut entsyymiaktiivisuus ilmaistaan käyttäen sopivaa kromo-geenisubstraattia.

Analyyttiset kantajat, jotka on 30 päällystetty D-alanyyli-0-alaniini-karboksipäätteisei 1ä oiigopeptidillä, joka on konjugoitu sopivaan makromolekyy- 9 81207 liseen, mainitulle pinnalle adsorboitumaan kykenevään kan-toaineeseen, ovat uusia ja kuuluvat myös tämän keksinnön piiriin.

Myös muovimikrotiitterikolot ja putket, jotka on päällys-5 tetty D-alanyyli-D-alaniini-karboksipäätteisellä oligo-peptidillä, joka on konjugoitu sopivaan, makromolekyyli-seen, muovipinnoille adsorboitumaan kykenevään kantoai-neeseen, ovat uusia ja kuuluvat myös tämän keksinnön piiriin.

10 Samalla tavalla muovimikrotiitterikoiot ja putket, jotka on päällystetty BSA- -Aca-D-Ala-D-Ala-konjugaati11 a, ovat uusia ja kuuluvat myös tämän keksinnön piiriin ja ovat tämän keksinnön edullinen suoritusmuoto.

Erityisesti keksinnön mukaiset edulliset, päällystetyt mik-15 rolevyt tai putket ovat muovikoloja tai -putkia, jotka on päällystetty 0,025 ^ig:sta T /jg:aan, mieluimmin 0,1 - 0,2 ^grlla BSA- -Aca-D-Ala-D-ala-konjugaattia .

Keksinnön mukaiset kantajat ovat sopivia käytettäväksi manuaalisissa sekä automatisoi-20 duissa koemenetelmissä. Tämä "joustavuus" on erityisen tärkeää lopullisen käyttäjän tarpeita ajateltaessa.

Itse asiassa automatisoitu menetelmä voi olla erittäin käyttökelpoinen monien, hoidettavien potilaiden kliinisessä seurannassa sekä pidettäessä yllä annostetun lääkkeen 25 terapeuttista tasoa tai kontrolloitaessa tai tutkittaessa lääkkeen hajoamista biologisissa nesteissä, kun taas manuaalinen menetelmä voi olla riittävä laboratoriotyöskentelyssä.

Tämä keksintö koskee myös reagenssien testipakkausta (a 30 kit) keksinnön mukaisen menetelmän hyödyntämiseksi määritettäessä helposti, nopeasti, luotettavasti ja tarkasti analyytti, joka on vankomysiiniluokan antibiootti, sen 10 81 207 yksittäinen tekijä, johdannainen tai aglykoni, jokin muu glykopeptidinen antibiootti sekä ei-glykopeptidinen antibiootti, joilla kaikilla on yhteisenä piirteenä sitoutuminen "molekyylireseptoriin", joka on D-alanyyli-D-alanii-5 ni-dipeptidi tai D-alanyyli-D-alaniini-karboksipäätteinen oiigopeptidi, joka testipakkaus sisältää: a) analyyttiset kantajat, jotka on päällystetty D-alanyyli-D-alaniini-karboksipäättei-sellä oiigopeptidillä, joka on konjugoitu muovipinnoille 10 adsorboitumaan sopivaan, kykenevään makromolekyyliseen kan-toaineeseen; b) leimatun analyytin ja/tai c) analyyti n standardi valmisteen.

Kun leimausaine on entsyymi, kuten piparjuuri-perok-15 sidaadi, testipakkaus voi sisältää myös kromogeenisubstraatin.

Alan ammattimiehelle on selvää, että "kit" (testipakkaus) voi sisältää mahdollisesti muiden yhdisteiden, kuten puskuriliuosten, ilmaisuaineiden jne. lisäksi myös joitain 20 sellaisia yhdisteitä, jotka voivat testipakkauksessa esiintyä erillisessä muodossa, mutta samaa käyttöä varten. Myös nämä yhdisteiden erilliset muodot käytettäväksi tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä kuuluvat tämän keksinnön mukaisen asian ja menetelmäkoostumuksen piiriin.

25 Seuraavat esimerkit kuvaavat edelleen keksintöä, niiden tarkoitus ei kuitenkaan ole rajoittaa keksinnön piiriä.

li 11 81207 ESIMERKKI 1 BSA-E-Aca-D-Ala-D-Ala-konjugaatin valmistus a) E -ami nokaproyyl i - D - a 1 anyyl i-D-al an i i n i n (E-Aca-D-A1a-D-ala) konjugaatio naudan seerumialbumiiniin (BSA) 5 E-Aca-D-Ala-D-Ala konjugoidaan BSA:han "kaksi-vaihe menetelmänä" käyttäen glutaarialdehydiä ristiinkytkevänä rea-genssina: BSA (250 mg) liuotetaan 0,1 M Na-karbonaatti--bikarbonaatti puskuriin, pH-arvossa 9,5 (4,5 ml). Lisätään glutaarialdehydiä (0,5 ml 25-% vesipitoinen liuos) ja seok-10 sen annetaan reagoida 1 tunti huoneen lämpötilassa. Sen jälkeen reaktiomassa dialysoidaan 0,9 % NaCl :ää vastaan yli yön. E-Aca-D-Ala-D-Ala (125 mg) liuotetaan 0,5 ml:aan 0,5 M Na-karbonaattipuskuria, pH:ssa 9,5, lisätään dialy-soituun reaktiomassaan ja hämmennetään 6 tuntia huoneen 15 lämpötilassa. Sen jälkeen lisätään 1 M lysiiniä (0,5 ml) ja seosta pidetään huoneen lämpötilassa 2 tuntia reagoimattomien aktiiviryhmien sulkemiseksi. Sen jälkeen konju-gaatti dialysoidaan 0,05 M K-fosfaattia vastaan, joka sisältää 0,15 M NaCl (PBS), pH 7,3.

20 b) Konjugaatin geelisuodatus

Konjugaatin puhdistamiseksi ylimääräisestä, reagoimattomasta aineesta tai alhaisen molekyylipainon omaavista sivutuotteista, edellä saatu, dialysoitu seos valutetaan läpi jäähdytetystä Sephacryl S-2 0 0 - pyiväästä (kontrolloitu 25 huokoskoko, kovelenttisesti ristiinkytketty ai kyy!idekst-raani ja N,N-metyleeni-bis-akryyliamidi)(Pharmacia Fine Chemical s)(0,8 cm x 100 cm), tasapainoitettu ja eluoitu PBSrllä, pH 10,4 (virtausnopeus = 10 m1/h). Eluointia seurataan spektrofotometrisesti rekisteröimällä transmittans-30 si aallonpituudella 280 nm. Fraktiot, jotka vastaavat pylvään tilavuudella eluoituvaa maksimia, yhdistetään (kokonaistilavuus = 15 ml), neutraloidaan 1 M HC1 :11ä ja laimennetaan nelinkertaisesti PB S:11ä , pH 7,3, 0,5 ml:n annokset tätä seosta laitetaan pieniin pulloihin, 1yofi1isoidaan 12 81 207 ja pidetään -80°C:ssa. Valmistetun konjugaatin määrä on riittävä yli 10 000 mikrolevyn päällystämiseen, jokaisessa mikrolevyssä on 96 koloa.

ESIMERKKI 2 5 Mikrolevyjen päällystäminen BSA-E-Aca-D-Ala-D-Ala-konjugaati11 a

Varastoliuos mikrolevyjen viikottaiseen valmistukseen valmistetaan liuottamalla lyofilisoidun BSA-£-Aca-D-Ala-D-Ala--konjugaatin pienpullon sisältö (valmistettu edellä esite-10 tyssä esimerkissä 1 kuvatulla tavalla) PBSrään, pH 7,3 (0,5 ml); tätä liuosta voidaan varastoida viikkoja ilman, että aktiivisuus vähenee ja se on sen tähden sopiva käytettäväksi viikottaiSten valmisteiden varastoiiuoksena.

Mikrolevyjen kolot täytetään tämän varastoiiuoksen 1/2000 15 laimennoksella 100 /il/kolo, paitsi yksi vaakasuora kolori-vi (tarkoituksenmukaisesti viimeinen), joka pidetään sok-kokokeena. Nämä sokkokoekolot täytetään 100 /il :11a PBS:ää, pH 7,3. Mikrolevyjä inkuboidaan 3 tuntia huoneen lämpötilassa, peitetyssä laatikossa, jonka jälkeen ne pestään 5 20 kertaa tyhjentämällä ja täyttämällä tislatulla vedellä. Lisätään 200 μΐ/kolo 3-% BSA:ta PBS:ssä, pH 7,3 ja annetaan adsorboitua 2 tuntia huoneen lämpötilassa päällystämättömän muovipinnan täyttämiseksi. Levyt pestään taas tislatulla vedellä, ravistellaan kuivaksi ja säilytetään 25 4°C:ssa, kunnes niitä käytetään.

ESIMERKKI 3 HRP-teikoplaniinin valmistus a) Teikoplaniinin leimaaminen piparjuuri-peroksidaa-silla (HRP) 30 Teikoplaniini leimataan piparjuuri-peroksidaasi11 a käyttäen "kaksi-vaiheista menetelmää" ja siinä glutaarialdehydiä li 13 81 207 bifunktionaalisena ristiinkytkevänä reagenssina.

Teikoplaniini (20 mg) 0,1 M Na-karbonaatissa , pH 11,5 (2 ml) lisätään 25-¾ glutaarialdehydin vesipitoiseen liuokseen (0,2 ml). Seos neutraloidaan 1 M HC1 :11ä ja dialysoi-5 daan perusteellisesti 0,9-¾ NaCl:ää vastaan (ainakin 3 vaihtoa). Piparjuuri-peroksidaasi (10 mg) 0,5 M Na-karbonaatti/-bikarbonaatti-puskurissa, pH 9,5 (0,5 ml) lisätään ja hämmennetään 3 tuntia 37°C:ssa. Sen jälkeen 1 M lysiiniä (0,5 ml) lisätään liuokseen reagoimattomien aktii-10 viryhmien täyttämiseksi (15 tuntia 4°C:ssa).

b) HRP-teikoplaniinin geelisuodatus 1,5 ml edellä esitetyllä tavalla saatua HRP-teikoplaniinin konjugaattia säädetään pH-arvoon 11 ja geelisuodatetaan jäähdytetyn Sephacryl S-200-Pylvään läpi (0,8 cm x 100 cm), 15 joka on tasapainotettu ensin PBS:ään, pH 11, ja eluoidaan samalla puskurilla, virtausnopeuden ollessa 20 ml/h. Eluoin-tia seurataan spektrofotometrisesti rekisteröimällä trans-mittanssi aallonpituudella 280 nm. Noin 2,5 ml:n fraktiot otetaan talteen 4°C:ssa. Maksimifraktiot (fraktiot, joil-20 la on maksimaalinen koi orimetrinen kehitys, testattaessa sopivalla kromogeenireagenssi11 a) yhdistetään ja neutraloidaan välittömästi 1 M HClrllä.

c) HRP-teikoplaniinin affiniteettikromatografia

Edellä saadut fraktiot puhdistetaan edelleen affiniteetti-2 5 kromatografisesti D-alanyyli-D-alaniini - £>aminokaproyyli--Sepharose-pylväässä (0,8 cm x 10 cm), joka on tasapainoi-tettu ensin PBS:11ä, pH 7,3. Sen jälkeen kun pylvästä on valutettu 40 ml/h, pylväs pestään tasapainoituspuskuri11 a ja eluoidaan PBSrllä, pH 11. Eluointia seurataan spektro-30 fotometrisesti rekisteröimällä transmittanssi aallonpituudella 280 nm, kerätään 2 ml:n fraktiot. Maksimi fraktiot yhdistetään, neutraloidaan 1 M kloorivetyhapol1 a ja teiko-planiini-HRP-konjugaatin entsyymiaktiivisuus testataan.

ΐ4 81 207

Aktiivisimmat fraktiot jaetaan eriin ja varastoidaan -80°C:ssa.

d) HRP-teikoplaniinin aktiivisuuden arvioiminen

Tehdään useita laimennoksia edellä saaduista HRP-teiko-5 planiinivalmisteista PBTBA-puskuriin (PBS, pH 7,3, joka sisältää 3 % BSArta, 0,5 % Tween® 20, 10 mM bentsamidii-nia ja 2 mg/ml 8-ani1ino-1-naftaleenisulfonihappoa) jokaista näytel aimennosta , 100 1 /koi o, lisätään BSA-^-Aca-D- -Ala-D-Ala-konjugaati1 la päällystettyjen mikrolevyjen vaa-10 kasuorille riveille ja inkuboidaan 2 tuntia peitetyssä laatikossa huoneen lämpötilassa. Mikrolevyt pestään 8 kertaa tyhjentämällä ja täyttämällä PBS:11ä pH 7,3, joka sisältää 0,05 % Tween® 20, ja ravistellaan kuivaksi. 200 jjI kromogeeni1iuosta (1 mg/ml o-fenyleenidiamiinia, 5 mM 15 H202:ta 0,1 M Na-sitraattipuskurissa , pH 5) lisätään jo kaiseen koloon. 30 minuutin kuluttua huoneen lämpötilassa entsymaattinen reaktio pysäytetään lisäämällä 4,5 M H2S0^:ää 50 ^il/kolo. 15 minuuttia myöhemmin jokaisen kolon optinen tiheys mitataan aallonpituudella 492 nm. Näyt-20 teiden aktiivisuus ilmoitetaan 1aimennustekijänä , joka antaa tulokseksi 0,100-0,200 optista tiheysyksikköä .

ESIMERKKI 4

Teikoplaniinia sisältävien seeruminäytteiden testi a) Laimennuspuskurin valmistus 25 1 00 ml:aan fosfaatti puskuroi tua suolaliuosta ^"(PBS) pH 7,3] lisätään 200 mg 8-anilino-1-naftaleenisulfonihappoa (ANSA), 0,5 ml Tween® 20 ja 3 g naudan seerumial bumi inia. Tätä seosta hämmennetään varovasti kunnes tapahtuu liukeneminen, jonka jälkeen pH säädetään arvoon 7,3.

30 b) Laimennetun testiseerumin valmistus 1 ml ihmisen seerumia laimennetaan 9 ml :11a edellä valmistettua 1aimennuspuskuria.

15 81 207 c) Standardi 1iuoksen valmistus

Noin 5 mg:n teikoplaniininäytteet (punnitaan tarkkaan) laitetaan lasisiin koeputkiin, 0,5 ml dimetyyliformamidia lisätään ja seos liuotetaan ravistelemalla tai sonikoimalla.

5 Sen jälkeen lisätään PBS pH:ssa 7,3, jotta konsentraatiok-si tulee 2 mg/ml. Sen jälkeen liuos laimennetaan PB S:11ä, pH 7,3, jolloin saadaan seuraavat teikoplaniinin laimennokset: 8, 4, 2 , 1, 0,5, 0,25, 0,125, 0,062 , 0,031 jug/ml . Laimennettu ihmisen seerumi on nol1astandardi.

10 d) HRP-teikoplaniini1iuoksen valmistus HRP-teikoplaniini, joka saadaan esimerkissä 3 esitetyllä tavalla, laimennetaan 1:70 1aimennuspuskurilla .

e) Kromogeeni1iuoksen valmistus 20 mg o-fenyleenidiamiini 20ml:ssa 0,1 M Na-sitraattipusku-15 ria, pH 5, lisätään 10 jjl:aan Η202:ί3 36-¾ (pa i no/ti 1 .).

f) Testi näytteiden valmistus

Seerumi- tai plasmanäytteet laimennetaan 1:10 laimennus-puskurilla.

g) Testimenetelmä 20 Jokainen standardi!iuos (0,5 ml), nollaliuos mukaanluettuna, sekä jokainen testinäyte (0,5 ml) siirretään muovikoe-putki in. Edellä valmistettu HRP-teikoplaniini1iuos (0,5 ml) lisätään putkiin ja sekoitetaan. Sen jälkeen 100 μΐ jokaista näitä liuosta laimennetaan kolmena rinnaikkaisenanäyt-25 teenä BSA-£;-Aca-D-Al a-D-Al a-konjugaati 11 a päällystetyn mikrotiitterilevyn koloon, valmistettu esimerkissä 2 esitetyllä tavalla. Nollastandardiliuokset lisätään mikrotiitterilevyn "sokkokoekoloihin". Levyjä inkuboidaan sen jälkeen 2 tuntia huoneen lämpötilassa kosteassa laatikossa ja pes-30 tään hyvin 8 kertaa, tyhjentämällä ja täyttämällä PBS:llä, joka sisältää 0,05 ¾ Tween® 20. Sen jälkeen mikrolevyt ie 81207 ravistellaan kuivaksi. Sen jälkeen edellä mainittu kromo-geeniliuosta lisätään 200 yl/kolo. 30 minuutin kuluttua entsymaattinen värinkehitysreaktio pysäytetään lisäämällä 4,5 M H2S0^:ää 50 μΐ/kolo. 15 minuutin kuluttua jokaisen 5 kolon optinen tiheys mitataan aallonpituudella 492 nm.

h) Tulosten arviointi

Sokkokoeliuosten, standardiliuosten ja testi näytteiden optisten tiheyksien keskiarvot arvioidaan erikseen. Sen jälkeen kun sokkonäytteen optinen tiheys on vähennetty 10 standardista sekä testinäytteistä, määritetään jokaisen näytteen kilpaileva suhde jakamalla jokainen näin saatu optinen tiheys nol1astandardin optisella tiheydellä. Τεεί i näy t te iden tei koplani i ni pi toi suus saadaan i nterpoloi -maila vastaavat kilpailevat suhdearvot kaiibrointikäy-15 rältä. Kaiibrointikäyrä piirretään 1ogit-1og-paperi11 e, sijoittamalla jokaisen standardi näytteen kilpaileva suhde sitä vastaavaa teikoplaniinikonsentraatiota vastaan.

SOVELLUTUSALUE: (toistettujen kokeiden perusteella) 0 ,05 - 40 ^ig/ml .

Mieluimmin sovellutusalue on 0,1 - 30 /jg/ml tei kopl ani i nia. TARKKUUS: - kokeessa: CV% yhtä kuin 7,2 - kokeiden välillä: CV% yhtä kuin 11,2 TÄSMÄLLISYYS: - taiteensaantialue 87-125¾.

Claims (13)

17 81 207

1. Menetelmä analyytin määrittämiseksi, joka on vanko-mysiini1uokan antibiootti, sen yksittäinen tekijä, johdannainen tai aglykoni, muu glykopeptidinen antibiootti tai 5 ei-glykopeptidinen antibiootti, joilla kaikilla on yhteisenä piirteenä sitoutuminen "molekyylireseptoriin", joka on D-alanyyli-D-alaniini-dipeptidi tai D-a1anyyli-D-a1a-niini-karboksipäätteinen oiigopeptidi , tunnettu siitä, että menetelmässä analyyttisten kantajien pinnalle passiivises-10 ti adsorboidaan määrätty määrä D-alanyyli-D-alaniini-kerhoksi päätteistä oiigopeptidiä, joka on konjugoitu mainitulle pinnalle adsorboitumaan kykenevään makromolekyyli-seen kantoaineeseen, joko samanaikaisesti tai myöhemmin lisätään testinäyte ja tunnettu määrä leimattua analyyttiä 15 ja arvioidaan kiinteään faasisysteemiin sitoutuneen leimatun analyytin määrä vertaamalla standardi käyrään, joka saadaan testaamalla tunnetut määrät analyyttiä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että D-alanyyli-D-alaniini-karboksipäät- 20 teistä oiigopeptidikonjugaattia on rajoitettu määrä verrattuna analyytin ja leimatun analyytin kokonaismäärään ja testinäyte ja tunnettu määrä leimattua analyyttiä lisätään samanaikaisesti adsorboivaan kiinteään faasiin.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n -25 n e t t u siitä, että D-alanyyli-D-alaniini-karboksipäät- teisen oiigopeptidikonjugaatin sitoutumispaikat ylittävät testattavan analyytin määrän, testattava analyyt- ti ja leimattu analyytti lisätään peräkkäin ja leimatun analyytin määrä on sellainen, että se sitoo kaikki mainitun 30 adsorboivan konjugaatin jäljellä olevat sitoutumispaikat.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että analyytti on vankomysiini1uokan anti is 81207 biootti, joka on vankomysiini, ristosetiini, teikoplaniini, aktaplaniini, avoparsiini, aktinoidiini, LL-Am-374 , A 477 , OA 7653, A 35512 B, A 515668, AAD 216, A 41030, A 47934 seka näiden yksittäiset tekijät, johdannaiset ja aglykonit, 5 erityisesti teikoplaniini.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että D-alanyyli-D-alaniini-karboksipäätteinen peptidi on £„-aminokaproyyl i-D-al anyyl i-D-alani ini.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n -10 n e t t u siitä, että makromolekyylinen kantoaine on proteiini, erityisesti albumiini.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että analyyttiset kantajat ovat mikrotiitteri-levyjen koloja tai koeputkia tai muovikalvoja, erityisesti poly- 15 etyleeni- tai polystyreenimikrotiitteri1evyjen koloja.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että "leimatun analyytin" leimaava aine on entsyymi, erityisesti piparjuuriperoksidaasi.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n -20 n e t t u siitä, että a) valmistetaan 1aimennuspuskuri pH 7,0 - 7,5, joka sisältää fosfaatti puskuroidun suolaliuoksen (PBS), naudan seerumi aibumiinin (BSA) ja pinta-aktiivisen aineen, kuten esimerkiksi polyetyleenioksi di-sorbi taani-mono-1auraati n 25 (Tween ® 20); b) valmistetaan testattavan antibiootin mittastandar-di1 aimennokset (nol1astandardi mukaanluettuna) fosfaatti-puskuroituun suolaliuokseen (PBS) ja laimennettuun seerumi in, pH 7,0 - 7,5; 19 81 207 c) testattavat seeruminäytteet laimennetaan valittuun laimennokseen edellä esitetyllä 1aimennuspuskuri11 a ; d) lisätään piparjuuriperoksidaasi-analyyttikonjugaatin liuos jokaiseen näytteeseen, sekoitetaan; 5 e) siirretään jokainen näistä seoksista mikrotiitteri- levyn muovi koi oi hi n , joka on päällystetty rajoitetulla määrällä BSA-£-Aca-D-Ala-D-Ala-konjugaattia; f) inkuboidaan noin 2 tuntia huoneen lämpötilassa kosteassa laatikossa, jonka jälkeen kolot pestään hyvin PSB: 10 11ä + 0,05 -0,1-% (til./til.) Tween ® 20 pH 7,0-7,5; g) lisätään piparjuuriperoksidaasin kanssa väriä kehittävä kromogeenisubstraatti ; h) mitataan spektrofotometrisesti jokaisen näytteen optinen tiheys; 15 i) analyytin konsentraatio lasketaan testattavissa näyt teissä interpoloimal1 a jokaisen näytteen kilpaileva suhde kaiibrointi käyrä!1ä, joka saadaan analyytin standardi1 ai-mennoksilla.

10. Analyyttiset välineet, tunnettu siitä, että 20 kantaja on päällystetty D-alanyyli-D-alaniini-karboksipäätteisenä oiigopeptidillä, joka on konjugoitu mainitulle pinnalle adsorboitumaan kykenevään sopivaan makromolekyyliseen kantoaineeseen käytettäväksi patenttivaatimuksen 1 mukaisessa menetelmässä.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukaiset analyyttiset väli neet, tunnettu siitä, että D-alanyyli-D-alaniini-karboksipäätteinen peptidi on -aminokaproyyli-D-alanyyli--D-alaniini, makromolekyylinen kantoanne on proteiini, erityisesti albumiini ja kantajat ovat mikrotiitteri1evyn ko-30 loja tai koeputkia tai muovikalvoja, erityisesti polyety-leeni- tai polystyreenimikrotiitteri1evyjen koloja. 20 81 207

12. Testipakkauksen (kit) koostumus patenttivaatimuksen 1 mukaisen menetelmän suorittamiseksi, tunnettu siitä, että pakkaus sisältää a) kantajat, jotka on päällystetty D-alanyyli-D-ala- 5 niini-karboksipäätteiseilä oiigopeptidi11ä, joka on konju-goitu mainitulle pinnalle adsorboitumaan kykenevään sopivaan makromolekyyliseen kantoaineeseen; b) leimatun analyytin ja/tai c) analyytin standardivalmisteen.

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen testipakkaus (kit), tunnettu siitä, että D-alanyyli-D-alaniini-karbok-sipäätteinen peptidi on E-ami nokaproyyl i -D-al anyyl i -D--alaniini, makromolekyylinen kantoaine on proteiini, erityisesti albumiini, kantajat ovat mikrotiitterilevyjen ko-15 loja tai koeputkia tai muovikalvoja, erityisesti polyety-leeni- tai polystyreenimikrotiitteri1evyjen koloja. 21 81207