CN85106820A - 万古霉素类抗生素的固相受体分析法 - Google Patents

Abstract

本发明是关于测定能够结合D-丙氨酰 -D-丙氨酸二肽的抗生素物质，如万古霉素类的糖 肽抗生素和其衍生物及糖苷配基的方法。本发明的 再一个主题是利用本发明之方法的材料构成(药盒) 和工具。

Description

本发明涉及测定能够结合D-丙氨酰-丙氨酸二肽的抗生素物质如万古霉素类糖肽抗生素及其衍生物或糖苷配基的方法。本发明的再一个目的是关于利用本发明之方法的材料构成（药盒）和工具。

Teicoplanin是美国专利4239751号中所述的以前定名为teichomycin的抗生素物质之国际非专利商标名（INN）。除万古霉素外，其它“万古霉素类”抗生素尚包括有瑞斯托菌素、阿克他菌素、teicoplanin，avoparcin，类放线菌素、LL-AM-374、A477、OA7653、A35512B、A515668、AAD216、A41030、A47934以及其个别因子、衍生物和糖苷配基。

已知万古霉素和瑞斯托菌素A能干扰细菌细胞壁主要成分-肽葡聚糖的合成。据信这种干扰可导致细胞生长抑制和细胞的溶解破坏，这是由于这些抗生素与羧基末端上有D-Ala-D-Ala残基的五肽前体（UDP-N-乙酰胞壁酰五肽）产生了特异结合（H.R.Perkins，Biochem.J.111，195（1969））。

最近发现，teicoplanin也可通过同样的机制结合敏感细菌的生长之肽葡聚糖。特别是发现teicoplanin与万古霉素和瑞斯托菌素A及相似抗生素一样，也与在羧基末端含D-Ala-D-Ala二肽的肽葡聚糖相结合。如此推测，其可能抑制细菌转肽酶和阻止细胞壁肽葡聚糖的交联。这些抗生素也结合D-丙氨酰-D-丙氨酸二肽或D-丙氨酰-D-丙氨酸羧基末端寡肽。

据证明或认为，万古霉素类的其它种抗生素也按同样的机制作用，因此能够结合D-丙氨酰-D-丙氨酸二肽或D-丙氨酰-D-丙氨酸羧基末端寡肽。

除万古霉素类抗生素外，本方法也适用于检测其它能结合D-丙氨酰-D-丙氨酸二肽或D-丙氨酰-D-丙氨酸羧基末端寡肽的其它非糖肽类或非万古霉素类抗生素。

据此，可将D-丙氨酰-D-丙氨酸或D-丙氨酰-D-丙氨酸寡肽看作是上述抗生素物质的“分子受体”。

检测抗生素物质，特别是teicoplanin和其它万古霉素类抗生素的方法，迄今主要还是建立在TLC，HPLC及对敏感微生物测定法之基础上的（参见所列举的美国专利）。

鉴于当前这类抗生素的治疗应用以及进行深入临床研究的需要，有必要在各领域内，特别是生物学领域内建立一种用于测定万古霉素类抗生物质的迅速、简便、可靠而又适于自动操作的分析方法。

业已发现，借助于一种可靠，准确、迅速而敏感的方法，有可能测定teicoplanin以及其它有相同作用机制并能结合于相同“分子受体”的抗生素（如万古霉素类的其它抗生素）。所用的方法是建立于竞争或饱和结合分析基础上的，并使用了可吸附于方便的固相上的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧基末端寡肽之适当结合形式。D-丙氨酰-D-丙氨酸羧基末端寡肽可以是三、四、五、六或七肽且其中的羧基末端二肽是D-丙氨酰-D-丙氨酸。优选的本发明之D-丙氨酰-D-丙氨酸羧基末端寡肽是三肽ε-氨基己酰-D-丙氨酰-D-丙氨酸（以下简写为：ε-Aca-D-Ala-D-Ala）。

D-丙氨酰-D-丙氨酸羧基末端寡肽是与适当的载体结合的，以便于使其吸附于固相表面。这种情况下，适当的载体可以是能够共价连接D-丙氨酰-D-丙氨酸羧基末端寡肽的任何蛋白质或其它高分子物质，以形成一种能够吸附（即能够缩短物理键）于经选择之固相表面的结合物。

这类载体的较好的例子有白蛋白，特别是小牛白蛋白。不过卵白蛋白，人或猪白蛋白也是适用的。

使携带D-丙氨酰-D-丙氨酸羧基末端寡肽的载体吸附于其上的固相表面，最好是分析上用的支持和/或容纳工具的表面。就本申请的范围来说，“支持和/或容纳工具”是指任何能够包含或至少是能暴露在液体试剂F的分析工具，较好的有玻璃、塑料微量滴定板、试管或塑料薄膜。优选的“支持和/或容纳工具”是聚乙烯或聚苯乙烯微量滴定板的孔。

正如前已说过的，“被分析物”，即能够用本发明之方法分析的物质，是能够结合D-丙氨酰-D-丙氨酸二肽或D-丙氨酰-D-丙氨酸羧基末端寡肽的抗生素物质，如teicoplanin或万古霉素类的其它抗生素物质（定义如前），其个别因子、衍生物、糖苷配基或假糖苷配基，或可与所说的“分子受体”结合的其它非万古霉素类或非糖肽类抗生物质。

本发明之方法是建立在竞争或饱和结合分析基础上的。

众所周知，竞争方法是一种定量测定某被分析物的方法，即用已知量的“被标记分析物”与该被分析物竞争有限数目的“结合位点”。饱和方法实质上不同于竞争方法，前者是以两步骤方法进行的，即首先以被分析物与过量的“结合位点”平衡，之后加“被标记分析物”以饱和所有仍可被占有的结合位点。

本领域内的技术人员都很清楚;本发明之方法中的“结合位点”即所谓“分子受体”，即吸附于分析用“支持和/或容纳工具”之表面上的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧基末端寡肽结合物。“被标记分析物”是指通过任何已知“标记”工具如放射性同位素示踪剂或适当的酶标记的被分析物。放射性同位素示踪剂是通常在放射免疫分析中所使用的示踪剂。如¹²⁵I，而酶标记物则是通常在酶联免疫分析方法中所使用者。较好的酶标记物是辣根过氧化物酶。当“被标记分析物”是酶标记的分析物时，最好是于一种适当的显色底物存在下进行比色测定。如在使用放射性同位素标记情况下，则通常是用闪烁图象（scintillographic detecticn techniques）测定。

因此，本发明的一个主题是测定选自万古霉素类抗生素、其个别因子、衍生物或糖苷配基、其它糖肽抗生素以及非糖肽抗生素等被分析物的方法，所有这些被分析物均具有结合由D-丙氨酰-D-丙氨酸二肽或D-丙氨酰-D-丙氨酸羧基末端寡肽所代表的“分子受体”的共有性质。该方法包括将测定量的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧基末端寡肽同能够吸附于分析用“支持和/或容纳工具”的塑料表面上的大分子载体结合，被动地吸附于所说的表面上，同时或继后加入被试样品和已知量的标记的被分析物，参照分析已知量被分析物得到的标准曲线，计算出结合于固相体系的标记之被分析物的量。

本领域内技术人员可以意识到，D-丙氨酰-D-丙氨酸羧基末端寡肽与适当载体的偶联可借助于本身已知的方法实现。一般要使用偶联剂，一种优选的偶联剂是戊二醛。其它已知的偶联剂包括：碳化二亚胺、二异氰酸盐、酸酐、重氮化合物、

氮化物、以及溴化氰。相似地，已知的偶联方法和试剂，如上面所报告的，也可用于将“标记酶”连接到分析物上，以制备“被标记分析物”。这种情况下，戊二醛也是优选的偶联剂。

在这些偶联反应中，反应物之间的比例可有显著的差异，但在大多数情况下“标记酶”和被分析物之间的比例，以及D-丙氨酰-D-丙氨酸羧基末端寡肽和载体之间的比例，最好都是大约1∶1。但如果相偶联的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧基末端寡肽是ε-Aca-D-Ala-D-Ala，且大分子载体是小牛血清白蛋白（BSA）时，则这两种反应剂之间的摩尔比例可为1∶1至10∶1。

根据本发明的方法，竞争分析法包括：

a）将D-丙氨酰-D-丙氨酸羧基末端寡肽与能够吸附于分析用“支持和/或容纳工具”之表面上的大分子载相联接，并被动地吸附于所说的表面上;

b）向其中加入被试样品连同已知量的“被标记分析物”并温育之;

c）参照用已知被分析物获得的标准曲线，估算出结合于固相体系的“被标记分析物”的量，借以算出试验样品中被分析物的量。

本发明之一个突出特征体现于在本发明之方法中使用ε-Aca-D-Ala-D-Ala作为D-丙氨酰-D-丙氨酸羧基末端寡肽。其二是使用血清白蛋白，特别是小牛血清白蛋白（BSA）作为能吸附于塑料表面上的大分子载体。

本发明之再一个特征体现于使用酶标记的被分析物作为“被标记分析物”;而优选的“标记”酶是辣根过氧化物酶。此外本发明之方法的特征还表现于其所测定的分析物是选自teicoplanin和teicoplanin衍生物，糖苷配基或假糖苷配基者。

本发明还有一个特征是涉及用于测定人血清样品中选自teicoplanin和其它万古霉素类抗生物质，或其个别因子、衍生物或糖苷配基等分析物的竞争方法，其包括：

a）用磷酸盐缓冲盐水（PBS）、小牛血清白蛋白（BSA）以及某种表面活性剂如聚环氧乙烷山梨聚糖单月桂酸酯（吐温

20），制备稀释缓冲液，pH7.0-7.5;

b）制备溶于磷酸盐缓冲盐水和稀释血清（pH7.0-7.5）的被试抗生素的标量标准稀释液系列（包括零标准管）;

c）用上述稀释缓冲液将被试血清样品稀释到选定的稀释度;

d）将辣根过氧化物酶与被分析物的结合物加到各样品管中，混匀之;

e）将各混合物移入已用限定量BSA-ε-Aca-D-Ala-D-Ala涂膜的塑料微量滴定板的孔中;

f）在湿盒内，于室温下温育约2小时后，用加有0.05-（0.1%（v/v）吐温

20的PBS（pH7.0-7.5）彻底洗各孔。

g）加入能对辣根过氧化物酶反应生色的显色底物。

h）分光光度法测定各种样品的光密度。

i）以分析标准样品得到校准曲线为据，通过内推各被试样品的竞争比例，计算出被试样品中被分析物的浓度。

竞争比例被定义为样品之比光密度与零标准之比光密度间的比例。

上述方法即所谓的“竞争”结合分析法，其特征在于对每种样品来说可得到的结合位点总数少于被分析物和标记的被分析物的总和。

但这一方法学上的问题是可以通过“相继饱和”分析法得以改进的，即是说通过两步骤结合反应来完成，并加以使用。

第一步是使标准物或被试样品中所含的被分析物与过量的BSA-ε-Aca-D-Ala-D-Ala平衡，第二步是在洗涤后将酶标记的被分析物加至足以饱和其余的结合位点并用适当的显色底物显示所结合的酶活性。

将D-丙氨酰-D-丙氨酸羧基末端寡肽与能够吸附于“支持和/或容纳工具”表面上的适当的大分子载体相结合，以其涂敷所说的表面，这一技术是新的，并体现为本发明之进一步的主题。同样，使D-丙氨酰-D-丙氨酸羧基末端寡肽与能够吸附于塑料表面上的适当的大分子载体结合，以其涂敷塑料微滴定孔或试管也是新的，并代表了本发明的一个目的。相似地，用BSA-ε-Aca-D-Ala-D-Ala结合物涂敷塑料微量滴定孔或试管的技术是新的，并代表了本发明之进一步的主题和突出特征。

特别是本发明所优选的被涂敷的微量滴定板或试管是用0.025μg至1μg、最好是0.1-0.2μgBSA-ε-Aca-D-Ala-D-Ala涂敷的塑料孔。

本发明的“支持和/或容纳工具适用于自动分析程序，也适用于手动分析程序。这种“灵活性”对满足客户的需要是非常重要的。事实上，自动程序完全可以用于对许多治疗的病人进行临床监测，以保持用药的治疗剂量及控制或研究药物在体液中的分配情况，而手动程序用于实验室规模的分析是合适的。

就材料的构成方面来说，本发明也包含了利用本发明之方法的试剂药盒，以简便、迅速、可靠和准确地测定选自万古霉素类抗生素、其个别因子、衍生物或糖苷配基、其它糖肽抗生素，以及非糖肽抗生素的被分析物-所有这些被分析物均具有结合由D-丙氨酰-D-丙氨酸二肽或D-丙氨酰-D-丙氨酸羧基末端寡肽所代表的“分子受体”的共同特征，药盒包含有：

a）用D-丙氨酰-D-丙氨酸羧基末端寡肽之结合物涂敷的分析用“支持和/或容纳工具”，而所说的结合物是与能够吸附于塑料表面上的适当的大分子载体结合的。

b）标记的被分析物和/或

c）被分析物的标准制剂。

当标记物质是一种酶，如辣根过氧化物酶时，药盒还可包含有显色底物。

本领域内的技术人员都很清楚的是：“药盒”中不仅还可有其它组成部分，如缓冲溶液、显示工具等，而且药盒的某些组成部分亦可以分离的形式存在，并用于同样目的。而本发明方法中所用的分离形成的组成部分，也包括于本发明的方法和材料构成之内。

下列实施例旨在进一步阐明本发明，而不构成对本发明范围的限定。

实施例1：BSA-ε-Aca-D-Ala-D-Ala的制备

a）使ε-氨基己酰-D-丙氨酰-D-丙氨酸（ε-Aca-D-Ala-D-Ala）与小牛血清白蛋白（BSA）结合

使用双功能交联剂戊二醛，以“两步法”将ε-Aca-D-Ala-D-Ala结合于BSA：BSA（250mg）溶解于0.1M碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液（4.5ml，pH9.5）中。加戊二醛（25%水溶液，0.5ml）并于室温下反应1小时。之后将反应物料对0.9%NaCl透析过夜。将ε-Aca-D-Ala-D-Ala（125mg）溶于pH9.5的0.5M碳酸钠缓冲液（0.5ml）中，加入经透析的反应物料中并于室温下搅拌6小时。之后加1M赖氨酸（0.5ml）并将混合物于室温放置2小时，以封闭未反应的活性基团。再将结合物对含有0.15M    NaCl的0.05M磷酸钾缓冲液（PBS，pH7.3）透析。

b）结合物的凝胶过滤

如上得到的透析混合物通过冷藏的Sephacryl    S-200柱（可控制网孔的共价交联的烷基葡聚糖和N，N′-亚甲双丙烯酰胺）（Pharmacia化学试剂公司）（0.8cm×100cm）以便由过量未反应材料或低分子量副产物中提纯结合物，用PBS（pH10.4）平衡并洗脱（流速＝10毫升/小时）。以分光光度法记录280nm透光度以监测洗脱。收集相当于随外水体积洗脱的峰值部分（总体积15毫升），用1M    HCl中和并用PBS（pH7.3）作4倍稀释。将该混合物以0.5毫升等分量装入小瓶内，冻干并于-80℃保存。所制备之结合物的量足可用于涂敷每板96个孔的微量滴定板10，000个以上。

实施例2：用BSA-ε-Aca-D-Ala-D-Ala涂敷微量滴定板

制备每周用于微量滴定板的储备溶液：用PBS（pH7.3，0.5毫升）溶解小瓶内的冻干之BSA-ε-Aca-D-Ala-D-Ala（以上例中所述方法制备）;该溶液可储存数周而不丧失活性，故可作为每周实验使用的储备溶液。

微量滴定板的各孔以每孔100μl加入1/2000稀释的该储备液，但须将一竖排的孔（通常是最后一排）留作空白，空白孔内各加100μl的PBS（pH7.3）。在一覆盖的盒子中于室温下将微量滴定板温育3小时，之后用蒸馏水洗5次。每孔加200μl溶于PBS（pH7.3）的3%BSA，并于室温下使其吸附2小时，以封闭未包被的塑料表面。再用蒸馏水洗板，摇动至干并保存于4℃备用。

实施例3：HRP-Teicoplanin的制备

a）用辣根过氧化物酶（HRP）

标记teicoplanin

使用戊二醛作双功能交联剂，以“二步法”用辣根过氧化物酶标记Teicoplanin。

将溶于0.1M碳酸钠（2ml，pH11.5）的Teicoplanin（20mg）加到25%戊二醛水溶液（0.2ml）中。用1M    HCl中和该混合物并对0.9%NaCl广泛透析（至少换3次）。加入溶于0.5M碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液（0.5ml，pH9.5）的辣根过氧化物酶（10mg）并于37℃搅拌3小时。之后向其中加1M赖氨酸（0.5ml）以封闭未反应的活性基团（于4℃放置15小时）。

b）HRP-Teicoplanin的凝胶过滤

将如上得到的1.5mlHRP-teicoplanin结合物之pH调到11并在经过制冷的Sephacryl    S200柱（0.8cm×100cm）柱上进行凝胶过滤，用PBS（pH11）预平衡并用同一缓冲液洗脱，流速20ml/小时。洗脱用记录280nm透光度的分光光度仪监测。洗脱于4℃下进行，每管收集2.5ml。合并峰值洗脱部分（即用适当的显色剂分析时表现有最大显色反应的部分）并用1M    HCl中和之。

c）HRP-Teicoplanin的亲合层析

将上述方法得到的洗脱物通过D-丙氨酰-D-丙氨酸-ε-氨基己酰-Sepharose柱（0.8cm×10cm），经亲合层析以进一步纯化。柱用PBS（pH7.3）预平衡。装柱后用平衡缓冲液以40ml/小时流速洗柱，并用PBS（pH11）洗脱。洗脱过程通过记录280nm透光度以进行分光光度检测。每管收集2ml。合并峰值管内容，用1M盐酸中和并试验Teicoplanin-HRP结合物的酶活性。将有最大活性的部分分装并于-80℃储存。

d）HRP-Teicoplanin活性的检定

将上述方法得到的HRP-teicoplanin制品在PBTBA缓冲液（含3%BSA，0.5%吐温 20，10mM苯甲脒和2mg/ml8-苯胺基-1-萘磺酸的PBS，pH7.3）中作一系列稀释，以每孔100μl将样品稀释液加到BSA-ε-Aca-D-Ala-D-Ala包被的微量滴定板之各竖列孔内，在覆盖的盒内于室温下温育2小时。将微量滴定板连续倒空、装满，如此用含0.05%吐温

20的PBS（pH7.3）洗8次，之后摇动至干。向各孔内加200μl显色溶液（1mg/ml邻苯二胺，5mM H₂O₂，溶于0.1M柠檬酸钠缓冲液，pH5）。于室温下反应30分钟后，每孔加50μl的4.5M H₂SO₄，以终止酶促反应。15分钟后，于492nm检测各孔光密度。样品活性以得到0.100-0.200光密度单位的稀释因数表示。

实施例4：含血清样品的teicoplanin的分析

a）稀释缓冲液的制备

于100ml磷酸缓冲盐水（PBS，pH7.3）内加入200mg8-苯胺基-1-萘磺酸（ANSA），0.5ml吐温 20和3g小牛血清白蛋白。将该混合物轻轻搅匀并使之完全溶解，之后将pH调至7.3。

b）稀释之试验血清的制备

将1ml人血清用9ml上述稀释缓冲液稀释。

c）标准溶液的制备

将大约5mg    teicoplanin（准确称重）的样品放入玻璃试管内，向其中加0.5ml二甲基甲酰胺，经摇动或超声处理使混合物溶解。之后加PBS（pH7.3）至浓度为2mg/ml。再用PBS（pH7.3）稀释该溶液，得到有如下稀释度的teicoplanin：8，4，2，1，0.5，0.25，0.125，0.062，0.031μg/ml。以稀释的人血清作为零标准。

d）HRP-Teicoplanin溶液的制备

用稀释缓冲液将以实施例3之方法制得的HRP-teicoplanin稀释至1到70倍。

e）显色溶液的制备

将20mg邻苯二胺加到20ml之0.1M柠檬酸钠缓冲液（pH5）内，之后再加36%（w/v）H₂O₂10μl。

f）试验样品的制备

用稀释缓冲液将血清或血浆样品作1∶10稀释。

g）分析方法

将包括零溶液的各标准溶液（0.5ml）以及各试验样品（0.5ml）移入塑料试管内。向其中加入如上制备的HRP-teicoplanin的溶液（0.5ml）并混匀之。将上述各溶液以每孔100μl加到实施例2中制备的用BSA-ε-Aca-D-Ala-D-Ala包被的微量滴定板中，且各加三复孔。零标准溶液则加到微量滴定板的“空白孔”中。将板于室温下在一湿气盒中保温2小时，用含有0.05%吐温

20的PBS彻底洗8次，之后将板摇动至干。再以每孔200μl向各孔加入上述的显色溶液。显色酶促反应进行30分钟后，每孔加4.5M H₂SO₄各50μl，以终止反应。于15分钟后测定各孔429nm的光密度。

h）结果的判定

分别计算出空白、标准溶液以及试验样品之光密度的平均值。由标准和试验样品的光密度值减去空白孔的光密度值，再将所得光密度差值除以零标准的光密度即得出各样品的竞争比例。在校准曲线上内推相应的竞争比例值，即得出试验样品的teicoplanin含量。在对数坐标纸上以各标准样品的竞争比例对相应的teicoplanin浓度作图，则很容易画出校准曲线。

应用范围（基于多次重复实验）：可测定的teicoplanin之浓度范围为0.05-40μg/ml，最好是0.1-30μg/ml。

精密度：一次分析内：CV%等于7.2;

多次分析间：CV%等于11.2。

准确度：回收率为87-125%。

Claims (25)

1、测定选自万古霉素类抗生素，其个别因子、衍生物或糖苷配基、其它糖肽抗生素、以及非糖肽抗生素的被分析物(所有这些被分析物均具有结合由D-丙氨酰-D-丙氨酸二肽或D-丙氨酰-D-丙氨酸羧基末端寡肽的“分子受体”的共同性质)的方法，其包括将已确定的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧基末端寡肽与能够吸附于分析用“支持和/或容纳工具”表面上的大分子载体相连接，使该结合物被动地吸附于所说的表面上，同时或继后加入被试样品及已知量的被标记分析物，参照由分析已知量被分析物得到的标准曲线，计算出结合于固相体系的被标记分析物的量。

2、根据权利要求1的方法，其中D-丙氨酰-D-丙氨酸羧基末端寡肽结合物与被分析物及被标记分析物的总量相比是有限数量的，且被试样品和已知量的被标记分析物是同时加入以吸附固相的。

3、根据权利要求1的方法，其中D-丙氨酰-D-丙氨酸羧基末端寡肽结合物的结合位点超过被试样品的量，被试样品和被标记分析物是相继加入的，且被标记分析物的量就是其结合所说已吸附结合物的所有可被占有的结合位点数量。

4、根据权利要求1的方法，其中被分析物是选自万古霉素、teicoplanin、阿克他菌素、avoparcin、类放线菌素、LL-AM-374、A477、OA7653、A35512B、A515668、AAD216、A41030、A47934以及其个别因子、衍生物和糖苷配基的万古霉素类抗生素物质。

5、根据权利要求1的方法，其中被分析物是teicoplanin。

6、根据权利要求1的方法，其中D-丙氨酰-D-丙氨酸羧基末端寡肽是ε-氨基己酰-D-丙氨酰-D-丙氨酸。

7、根据权利要求1的方法，其中大分子载体是一种蛋白质。

8、根据权利要求1的方法，其中大分子载体是白蛋白。

9、根据权利要求1的方法，其中分析用“支持和/或容纳工具”是微量滴定板的孔或试管，或塑料薄膜。

10、根据权利要求1的方法，其中分析用“支持和/或容纳工具”是聚乙烯或聚苯乙烯微量滴定板的孔。

11、根据权利要求1的方法，其中“被标记分析物”的标记物是酶。

12、根据权利要求1的方法，其中被标记分析物的标记物是辣根过氧化物酶。

13、根据权利要求1的方法，其包括：

a）用磷酸缓冲盐水（PBS），小牛血清白蛋白（BSA）和一种表面活性剂如聚环氧乙烷山梨聚糖一月桂酸酯（吐温

20）制备pH7.0-7.5的稀释缓冲液;

b）制备溶于磷酸缓冲盐水（PBS）和稀释之血清（pH7.0-7.5）的被试抗生素的标量标准稀释液系列（包括零标准管）;

c）用上述稀释缓冲液将被试血清样品稀释到选定的稀释度;

d）将辣根过氧化物酶与被分析物的结合物加到各样品管中，混匀之;

e）将各混合物移入已用限定量BSA-ε-Aca-D-Ala-D-Ala包被的微量滴定板的塑料孔中;

f）于室温下，在湿盒中温育约2小时，用加有0.05-0.1%（v/v）吐温 20的PBS（pH7.0-7.5）彻底洗各孔;

g）加入能对辣根过氧化物酶反应生色的显色底物;

h）分光光度法测定各样品的光密度;

i）以分析标准样品得到的校准曲线为据，通过内推各被试样品的竞争比例，计算出被试样品中被分析物的浓度。

14、根据权利要求1的方法中使用的分析用“支持和/或容纳工具”是以与能够吸附于其表面上的大分子载体相结合D-丙氨酰-D-丙氨酸羧基末端寡肽包被的。

15、根据权利要求14的分析工具，其中D-丙氨酰-D-丙氨酸羧基末端寡肽是ε-氨基己酰-D-丙氨酰-D-丙氨酸。

16、根据权利要求14的分析工具，其中大分子载体是一种蛋白质。

17、根据权利要求14的分析工具，其中大分子载体是白蛋白。

18、根据权利要求14的分析工具，其中所说的工具是微量滴定板的孔或试管，或塑料薄膜。

19、根据权利要求14的分析工具，其中所说的工具是塑料微量滴定板，其为在孔的内表面上用所说的结合物包被的。

20、用于完成权利要求1之方法的材料组成（药盒），其包含：

a）用D-丙氨酰-D-丙氨酸羧基末端寡肽之结合物包被的分析用“支持和/或容纳工具”，而所说的结合物是与能够吸附于其表面上的大分子载体相结合的，

b）标记的被分析物，和/或

c）被分析物的标准制剂。

21、根据权利要求20的药盒，其中包被分析用“支持和/或容纳工具”的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧基末端寡肽是ε-氨基己酰-D-丙氨酰-D-丙氨酸。

22、根据权利要求20的药盒，其中参于包被“支持和/或容纳工具”的大分子载体是一种蛋白质。

23、根据权利要求20的药盒，其中参与包被“支持和/或容纳工具”的大分子载体是白蛋白。

24、根据权利要求20的药盒，其中所说的分析用“支持和/或容纳工具”是微量滴定板的孔或试管。

25、根据权利要求20的药盒，其中所说的分析用“支持和/或容纳工具”是微量滴定板的塑料孔或试管。