FI80382C - Foerfarande foer framstaellning av ett koncentrat av antihemotilfaktorn. - Google Patents
Foerfarande foer framstaellning av ett koncentrat av antihemotilfaktorn. Download PDFInfo
- Publication number
- FI80382C FI80382C FI844557A FI844557A FI80382C FI 80382 C FI80382 C FI 80382C FI 844557 A FI844557 A FI 844557A FI 844557 A FI844557 A FI 844557A FI 80382 C FI80382 C FI 80382C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- peg
- ahf
- precipitation
- process according
- concentrate
- Prior art date
Links
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 70
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 65
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 51
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 33
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 29
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 29
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 26
- 238000009938 salting Methods 0.000 claims description 26
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 20
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 19
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 claims description 18
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 claims description 18
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 claims description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 17
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 17
- 229960003646 lysine Drugs 0.000 claims description 16
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 15
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 claims description 12
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 claims description 12
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 claims description 12
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 11
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 7
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 7
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 7
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 6
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 claims description 6
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 claims description 6
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 6
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229960003121 arginine Drugs 0.000 claims description 6
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 claims description 6
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 3
- 229960003589 arginine hydrochloride Drugs 0.000 claims description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 claims description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims description 2
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 claims description 2
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 claims 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 claims 1
- 229920000604 Polyethylene Glycol 200 Polymers 0.000 claims 1
- 230000000603 anti-haemophilic effect Effects 0.000 claims 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 claims 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 claims 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 68
- 102100026735 Coagulation factor VIII Human genes 0.000 description 48
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 48
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 34
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Inorganic materials [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 33
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 27
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 17
- 229920002560 Polyethylene Glycol 3000 Polymers 0.000 description 14
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 14
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 11
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 11
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical group Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 7
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 229910018072 Al 2 O 3 Inorganic materials 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 3
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexanoic acid Chemical compound NCCCCCC(O)=O SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001146702 Candidatus Entotheonella factor Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 201000003542 Factor VIII deficiency Diseases 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101710093543 Probable non-specific lipid-transfer protein Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- GICLSALZHXCILJ-UHFFFAOYSA-N ctk5a5089 Chemical compound NCC(O)=O.NCC(O)=O GICLSALZHXCILJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 1
- 238000000760 immunoelectrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- -1 mono- Chemical class 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 description 1
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2/00—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor
- A61L2/0005—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor for pharmaceuticals, biologicals or living parts
- A61L2/0011—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor for pharmaceuticals, biologicals or living parts using physical methods
- A61L2/0023—Heat
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/13—Amines
- A61K31/14—Quaternary ammonium compounds, e.g. edrophonium, choline
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2/00—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor
- A61L2/02—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor using physical phenomena
- A61L2/04—Heat
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
- Y10S530/829—Blood
- Y10S530/83—Plasma; serum
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
1 80382
Menetelmä antihemofiilitekijä VIII:n konsentraatin valmistamiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää antihemofiilitekijä VIII:n, jota nimitetään AHFtksi, konsentraatin valmistamiseksi.
Tiedetään, että veren koaguloitumiskykyä säätelee koaguloi-tumisproteiinien systeemi, jossa AHF eli tekijä VIII on tärkeänä aineosana.
Hemofilia-A-potilaat ovat menettäneet joko täydelleen tai osittain kyvyn muodostaa AHF:ä. Tämän sairauden hoidossa injektoidaan AHFsä sisältäviä valmisteita ja sen vuoksi on tärkeätä, että nämä valmisteet sisältävät sopivan korkeat AHF-konsentraatiot ja niin alhaiset konsentraatiot kuin on mahdollista muita proteiineja, kuten esimerkiksi fibrino-geeniä ja immunoglobuliineja.
Erikoisesti inhibiittoripotilaiden hoidossa - so. sellaisten potilaiden, jotka muodostavat vasta-aineita AHF:ä vastaan ja jotka sen vuoksi tarvitsevat ylimäärän valmistetta - on korkeilla AHF:n annostuksilla tärkeätä, että ominaisvaikutus (AHF-yksikköjä/mg proteiinia) on korkea, sillä "muiden proteiinien" antaminen suurina määrinä voi aiheuttaa haitallisia sivuvaikutuksia. Immunoglobuliinien aiheuttamista sivuvaikutuksista AHF-hoidossa on tehty selkoa esimerkiksi: Tilsner et. ai., Miinch. Med. Wschr. 124 (1982) n:o 22, sivut 553-557.
AHF:ä saadaan tavallisesti ns. kryosakasta, joka muodostuu pääasiallisesti fibrinogeenistä, albumiinista, IgG:stä ja IgM:stä, kun taas AHF muodostaa vain alle 1 % proteiinien kokonaismäärästä. Kryosakan ominaisvaikutus on tyypillisesti 0,1-0,3 yksikköä AHF/mg proteiinia.
On tunnettua, että osa tarpeettomasta proteiinista voidaan poistaa seostamalla glysiinin tai polyetyleeniglykolin (PEG) 2 80382 avulla. Saostaminen voidaan haluttaessa suorittaa useita kertoja, ensin yhden saostavan aineen ja sitten toisen avulla.
Siten on jo kauan tunnettua saostaa AHF noin 2 M glysiinin avulla alhaisessa lämpötilassa, vrt. Webster et ai., Amer. J. Med. Se. 250, n:o 6, sivut 643-650 (1965). Webster käytti kryosakkaa, joka liuotettiin veteen ja fraktioitiin alhaisessa lämpötilassa (< 10°C) glysiinin kasvavilla konsentraatioilla aina 2,3-molaarisiin asti. Tämän tyyppinen saostaminen perustuu siihen seikkaan, että AHF saostuu kylmässä fibrinogeenin kanssa, kun lisätään glysiiniä. Tuloksena on ominaisvaikutus 0,3-0,5 AHF-yksikköä/mg proteiinia.
EP-patenttijulkaisussa n:o 32 655, vrt. DK-patenttihakemusta n:o 1762/80, on tunnettua, että kun uudelleen liuotettuna kryosakkaa fraktioidaan käyttäen 2 M glysiiniä saostavana aineena korkeammissa lämpötiloissa kuten esimerkiksi 30°-45°C:ssa, saostuu suuri osa muita proteiineja kuten esimerkiksi fibri-nogeeniä ensiksi, niin että AHF jää päällä olevaan osaan, josta se voidaan ottaa talteen.
Kun käytetään PEG:ä saostavana aineena, suoritetaan usein fraktioitu PEG-saostus, jolloin suurin osa fibrinogeenistä ja jonkin verran IgM:ä poistetaan saostamalla alhaisella PEG-konsentraatiolla (2-6 %) ja sen jälkeen saostetaan AHF korkealla PEG-konsentraatiolla (5-15 %) albumiinia sisältävästä päällä olevasta osasta. Tällaisia PEG/PEG-saostuksia selostetaan esimerkiksi: Newman et ai., Brit. J. Haematology 21, 1971, sivu 1; US-patenttijulkaisu n:o 3 652 530; DK-patentti-hakemus n:o 364/77; FR-patenttijulkaisu n:o 2 460 305; DK-patenttihakemus n:o 3602/81. Näillä menetelmillä saadaan AHF-konsentraattia, jonka ominaisvaikutus on 1-3 yksikköä/mg proteiinia.
Samoin tunnetaan menetelmiä, jotka sisältävät monivaihesaostuksia useamman kuin yhden saostavan aineen avulla. Glysiini-saostus alhaisessa lämpötilassa esimerkiksi voidaan suorittaa ennen tai jälkeen PEG/PEG-saostuksia ja glysiinisaostukset il 3 80382 voidaan haluttaessa suorittaa sekä ennen että PEG/PEG-saos-tusten jälkeen. Tästä on tehty selkoa US-patenttijulkaisussa 3 682 881 ja US-patenttijulkaisussa n:o 3 631 018. Tavallisesti saadaan tulokseksi tällöin valmisteita, joiden ominaisvai-kutus on 1-3 yksikköä/mg proteiinia.
Kun tässä yhteydessä saostetaan glysiinillä alhaisessa lämpötilassa, käytetään AHF:ä sisältävää sakkaa, so. seuraavissa PEG-saostuksissa on uudelleenliuotetussa AHF:ä sisältävässä sakassa ainoastaan alhainen glysiinikonsentraatio liuoksessa.
Jos glysiiniä käytetään korkeassa lämpötilassa PEG-saostuksen yhteydessä, glysiinisaostus suoritetaan ensiksi jättämällä AHF päällä olevaan osaan, jossa glysiinikonsentraatio on korkea ja AHF saostetaan sitten päällä olevasta osasta PEG-saostuksen avulla korkealla PEG-konsentraatiolla. Näin voidaan päästä ominaisvaikutukseen 1-3 yksikköä/mg proteiinia.
Tämäntyyppisen glysiini/PEG-saostuksen avulla saatu konsentraat-ti muistuttaa konsentraattia, joka on saatu PEG/PEG-saostuksel-la. Kuten käy ilmi taulukosta 1, sisältää ensimmäisen saostuksen päällä oleva osa enemmän IgM:ä ja IgG:tä lämpimän saostuksen jälkeen 2 M glysiinin avulla kuin saostuksen jälkeen alhaisella PEG-konsentraatiolla (4 %). Lopullisen saostuksen jälkeen korkealla PEG-konsentraatiolla (9 %) sisältää kon-sentraatti glysiini/PEG-saostuksesta vähemmän IgM:ä ja IgG:tä kuin konsentraatti PEG/PEG-saostuksesta.
Taulukko 1
Vertailu kryosakassa olevan AHF m PEG/PEG-saostuksen ja lämpimän glysiini/PEG-saostuksen välillä
Fraktio___% AHF % IgM % igG
Kryosakka 100 100 100
Ensimmäisen PEG-saostuksen päällä oleva osa 72 38 55 PEG/PEG-konsentraatti 40 24 15
Glysiinisaostuksen päällä oleva osa 68 76 79
Glysiini/PEG-konsentraatti 36 18 8 4 80382
Syytä tähän ei tiedetä, mutta on otaksuttava, että polaarisella aminohapolla glysiinisaostuksen päällä olevassa osassa on sisäänsuolausvaikutus, erikoisesti emäksisiin proteiineihin, niin että IgM ja IgG eivät saostu helposti PEG:n avulla. Glysiini/PEG-saostuksen avulla saadussa konsentraatissa on kuitenkin vielä haitallisen korkea fibrinogeeni-, IgG- ja IgM-pitoisuus, vrt. seuraavaa taulukkoa 2.
Kyseessä olevan keksinnön kohteena on saada aikaan hyvin puhdasta AHF-valmistetta, jolla on sellainen liukoisuus, jota ei tähän asti voitu saavuttaa ja korkea ominaisvaikutus.
Keksintö perustuu siihen yllättävään havaintoon, että voidaan saada erikoisen puhdasta AHF-valmistetta, joka on käytännöllisesti katsoen täysin vapaata muista proteiineista, erikoisesti immunoglobuliineista, fraktioimalla kryosakkaa PEG:n avulla sillä tavoin, että huomattavan suuri osa, etupäässä ainakin 80 % fibrinogeenista, saostetaan ensiksi ja sen jälkeen suoritetaan saostus käyttämällä lisää PEG:tä ja läsnä on sisäänsuolausainetta. Sisäänsuolausaineen lisääminen itsessään ei aiheuta minkäänlaista saostumista, mutta sisäänsuolausaineen läsnäolo muuttaa olosuhteita seuraavan PEG-saostuk-sen aikana siten, että saadaan aikaan tarkempi fraktioiminen, so. puhtaampi AHF-valmiste, jolla on korkea ominaisvaikutus; vrt. seuraavaa taulukkoa 2. Korkean puhtausasteen ansiosta voidaan valmiste liuottaa hyvin pieneen volyymiin vesipitoista injektionestettä konsentraatioon 45 -500, usein 200-500 yksikköä tekijä VIII:C (AHF) per ml. Kun normaali injektio-annos on 1000 yksikköä, on noin 2-5 ml:n injektiovalmiste täten riittävä. Kun parhaitten kaupallisesti saatavien AHF-valmiste iden liukoisuus on määritelty 40-50 yksiköksi per ml, mikä vastaa injektiovolyymiä 25-20 ml, merkitsee keksinnön mukainen valmiste täten hyvin merkittävää helpotusta potilaalle.
11 5 80382
Taulukko 2
Glysiinilisäyksen vaikutus PEG/PEG-saostuksen aikana uudel-leenliuotetusta kryosakasta
Menetelmä AHF-yksi- köitä/mg % IgG % IgM % fibr.
Kryosakka 0,32 100 100 100 4 % PEG/9 % PEG 2,53 15 24 1 2 M glysiini/9 % PEG 2,27 8 18 2 4 % PEG/2 M glysiini + 12 % PEG 4,36 4 13 0,5
Keksinnön mukaisessa saostuksessa käytetään täten glysiiniä sisäänsuolausaineena, joka stabiloi haitalliset proteiinit pitämällä ne liuoksessa, kun taas aikaisemmin tunnetut menetelmät perustuvat glysiiniin ulossuolausvaikutukseen fibrinogeeni/AHFiään. Sisäänsuolausaineen käytön ansiosta PEG/PEG-saostuksessa saadaan siis aikaan selektiivisempi AHF:n seostaminen.
Ilman että pitäydyttäisiin missään erikoisteoriassa oletetaan, että sisäänsuolausaineen vaikutus johtuu siitä, että se lisää pintavarauserotusta tekijä Villin ja muiden proteiinien, erityisesti IgGsn välillä.
On tärkeätä poistaa suurin osa fibrinogeenistä ensimmäisessä vaiheessa, koska muutoin AHF-valmiste olisi pahoin fibrino-geenin saastuttama ja koska fibrinogeenin läsnäolo toisessa vaiheessa häiritsisi sisäänsuolausvaikutusta ja estäisi tekijä Villin selektiivistä saostamista.
Sisäänsuolausaine voi olla sopivasti jokin aminohappo, erikoisesti emäksinen aminohappo, kuten lysiini, arginiini ja histidiini, samoin kuin jokin polaarinen aminohappo, kuten seriini, glutamiini ja glysiini etenkin niiden hydro-kloridimuodossa. Esimerkkejä muista sopivista sisäänsuolaus-aineista ovat E-aminoheksaanihapot ja hiilihydraatit, kuten mono-, di- ja oligosakkaridit samoin kuin sokerialkoholit, esimerkiksi glukoosi, sakkaroosi, sorbitoli ja glyseroli.
6 80382
Taulukossa 3 on tutkimus näistä aineista.
Taulukko 3
Sisä änsuolausaineiden vaikutus uudelleenliuotetusta kryosa-kasta saadun AHF:n PEG/PEG-saostukseen
Sisäänsuolausaine Ominaisvaikutus AHF:n tuotos %:issa _ yksikköä/mg_plasmasta_
Ei mitään 2,53 18 2 M glysiini 4,36 17 0,5 M seriini 2,94 19 0,5 M glutamiinihappo 1,28 17 0,5 M lysiini 8,4 18 0,5 M arginiini 7,0 14 1.0 M ε-aminoheksaanihappo 5,0 10 0,5 M glukoosi 3,85 18 1.0 M sakkaroosi 5,35 20
Parhaana pidetty sisäänsuolausaine on lysiini. Piirros esittää lysiinin vaikutusta AHF:n PEG/PEG-saostukseen, ilmaistuna AHF-yksikköinä/mg proteiinia (kuvio 1) ja vastaavasti tuotoksen prosenteissa laskettuna kryosakasta erilaisilla lysiinin kon-sentraatioilla (kuvio 2). Lysiiniä lisätään mieluummin kon-sentraatioihin 0,1-0,9, erikoisesti 0,4-0,8, kaikkein mieluimmin konsentraatioihin 0,5-0,7 moolia/1.
Kuten kuviosta 1 käy ilmi, ovat lisätty lysiinimäärä ja lopputuotteen ominaisvaikutus keskenään suhteellisia, mutta jopa pienet lysiinimäärät omaavat selvän vaikutuksen. Kuten kuviosta 2 käy ilmi, AHF-tuotos kuitenkin huononee käytetyllä PEG-konsentraatiolla, jos käytetään yli 0,75 M lysiiniä, koska tällä lysiinimäärällä on sisäänsuolausvaikutus myös AHFtään.
Toinen suosittu sisäänsuolausaine on arginiini, jonka vaikutus AHF:n PEG/PEG-saostukseen käy ilmi seuraavasta taulukosta 4, josta voidaan nähdä, että hyviä tuotoksia saadaan konsentraatioilla 0,2-0,8. Tuotokseen nähden on parhaana pidetty määrä 0,3-0,5, erityisesti 0,4 moolia/1.
Il 7 80382
Taulukko 4
Arginiinin vaikutus AHF:n PEG/PEG-saostukseen
Moolia arginiinia/1 Tuotos-% plasmasta AHF-yksiköitä/mg _proteiinia_ 0 20 2,3 0,2 20 4,9 0,4 17 6,4 0,6 14 6,1 0,8 4 4,6 Käytetyt PEG:n ja sisäänsuolausaineen konsentraatiot samoin kuin pH saostuksen aikana ovat riippuvaisia erikoisesti käytetystä sisäänsuolausaineesta, ja yleisesti voidaan sanoa, että suuremman varauksen omaavia sisäänsuolausaineita voidaan käyttää alemmilla konsentraatioilla. Sisäänsuolausaineen valittu konsentraatio on kompromissi, koska korkeat konsentraatiot voivat pienentää IgG:n määrän lähes täydelleen, mutta jonkin verran tekijä VIII:a suolautuu samanaikaisesti, mikä pienentää tuotosta.
Voidaan käyttää PEG:tä, jonka molekyylipaino on 200 - 20 000, mieluummin 2000 - 12 000, erikoisesti 3000 - 6000, mutta PEG 3000 on parhaana pidettyä. PEG-konsentraatio ensimmäisessä saostusvaiheessa on tavallisesti 2-6 paino-%, mieluummin noin 4 paino-% ja tavallisesti se on 6-20 paino-% toisessa vaiheessa, mieluummin noin 12 paino-%. pH ensimmäisessä vaiheessa voi olla 6,0-8,5, mieluummin 6,2-6,6, erikoisesti noin 6,4, ja toisessa vaiheessa 5,0-8,5, mieluummin 6,0-6,6, erikoisesti noin 6,3.
Lämpötila ensimmäisessä saostusvaiheessa voi olla 6-20°C, mieluummin 18-22°C. Toisessa saostusvaiheessa lämpötila on myös mieluummin 18-22°C (huoneenlämpö).
Kyseessä olevan tekijä VIII:n konsentraatin talteenotossa voidaan käyttää humaaniveriplasman kryosakkaa tai muita tekijä VIII:a sisältäviä verifraktioita samoin kuin muiden eläinlajien, esimerkiksi sikojen plasmafraktioita. Tässä tapauk- 8 80382 sessä käytetään tavallisesti esimerkiksi PEG-saostuksen avulla saatua verifraktiota kryosakan asemesta.
Keksinnön mukaista menetelmää selostetaan tarkemmin joidenkin esimerkkien avulla seuraavassa, jotka valaisevat myös kon-sentraattien valmistamista. Valmisteen tekemistä varten voidaan jos halutaan, AHF-liuos kuumakäsitellä 10 h ajan 60°C:ssa ja läsnä on tällöin sopivaa stabiloivaa ainetta hepatiittia vastaan suojaamiseksi.
Esimerkki 1
Kryosakka 600 ml:sta humaaniveriplasmaa liuotetaan uudelleen 28 ml:aan sitraatti/glukoosipuskuria ja vapautetaan protrom-biinikomplekseista adsorboimalla AljO^n avulla. Sen jälkeen lisätään 4 paino-% PEG 3000:ta. pH säädetään arvoon 6,4 käyttäen 0,5 M HCl:ä ja seosta inkuboidaan 30 min huoneenlämmössä. Saostunut proteiini poistetaan sentrifugoimalla ja ly-siini-HCl:ää lisätään konsentraatioon 0,55 moolia/1. Lisätään vielä 8 paino-% PEG 3000:ta ja pH säädetään arvoon 6,3 käyttäen 0,1 M NaOH:ta. Inkuboidaan 45 min huoneenlämmössä ja erotetaan sakka sentrif ugoimalla ja liuotetaan uudestaan sitraatti/glu-koosi-NaCl:ään, pH 7,8. Uudelleen liuotetun sakan ominaisvai-: kutus on 12 yksikköä tekijä VIII:C (AHF) per mg proteiinia ja tekijä VIII:C tuotos plasmasta on 20 %.
Seuraava taulukko 5 osoittaa, että ominaisvaikutusta voidaan lisätä huomattavasti ja immunoglobuliini G:n pitoisuutta voidaan pienentää suhteessa PEG/PEG-saostukseen ilman sisään-suolausaineen läsnäoloa.
Esimerkki 2 30 ml:aan kryoliuosta, joka on adsorboitu A^O-jjn avulla, lisätään 4 paino-% PEG 3000:ta. pH säädetään 6,4:ään 0,5 M HCl:n avulla ja seosta inkuboidaan 30 min huoneenlämmössä. Saostettu proteiini poistetaan sentrifugoimalla ja "sisään-suolausainetta" lisätään. Sen jälkeen lisätään vielä 8 paino-% PEG 3000:ta ja pH säädetään arvoon 6,3 0,1 M NaOH:n avulla.
Il 9 80382
Inkuboidaan 45 min ajan huoneenlämmössä ja sakka eristetään sentrifugoimalla ja liuotetaan uudelleen sitraatti/glukoosi/ NaClrään, pH 7,8.
Taulukossa 6 ovat tulokset, jotka on saatu eri sisäänsuolaus-a ineilla.
10 80382
CO CO
d 3
4-> -P
3 to 3 O' Λί ε Λί e
•H \ ra H \ (O
(0 aO H tö ati -H
>-nC en o h > -n d en :0 -h oo »a· h· en :0 -H o en o o oi cn -*r •H X -H *· * - H ti2 Ή ··«-«.·- (ti ti< (U 04 H 04 (ti ti4 (U H ·** O ro tN ^ φ
G Ή +J H C -H -P OI
H M O -H CO o G u gy n 0 >i a o >i a (0 (0 :rcJ -P :tÖ 4-1
•n CO ti CO
-H O (ti -H U iC
ti2 ·· £ cr> 00 O ti2 ·· £ CO 00 OO i—I OO 04 oo
Qj M CO i—I ·—I OI (ti M CO i—li—I rH rH 04 r-l 4-1 H (ti ti H (0
H H H i—I
<*> > a * dp > a tn cp e s ro :tti * :iti :iti 4-> o o o ati 4-i ·>=ρ oi h h r·· m ti ·· h n 4-1 ·· oj
•H O -HCJ
H CP -H CP
en h en h 1 * > * ID -H I (ti ΙΟ -H I (ti
•rl 3 (0 -H 3 CO
O <u Qiid OCtiQjM m λ ti am ti a m X O O (ti λ: O O (ti oo h oi o en en o- 3 P —i ti e» 'S* co 3 h h ti o oi oi ^ oi h i—I a ti (O Is i—1 Cti 4-1 Ή 3 (0 0 3 (ti 0 (ti to -H 3 3 to -H 3 E-i £ d -P Eh £ d 4-> (ti (ti
co CO
I (0 I CO
(ti (ti (ti (ti 4-1 u Φ 4-1 U Φ
• •4-1 ·· -P
»ti H ti ati H 4-> r-il-HOCOi·^ 04 TO M O 00 OI i—I O 00 CO 00 :0H3OO h :0 H 3 O O m coooio ti2i>4-li—I,—| ,—| ti^^-Pt—I H r-4i—li—1 X 0 o X 3 •r4 I(ti Ci I—I ·Η ati a co -n a to to a X -H O II tie; -H o
>4 X 1-1 X ti* H
dP O I
O 00 -H
W H OI e au (ti O O (ti dp w w :to « en (0(0 a a r—i o ti2 ή ή 04 i—l (Ti \ <ti (0 co d
\ dP DP-H 04 I (0 ati £! -H 0 H
r-i d P en -h aO -h o en 0 -h 04 OI -H O 3 r—I -Hdd OMd
. . 00 i—I i—I -H (0 O d *H ·ι·4 O (0 *H
en >, HO -HHgtieitiiCP
ati I I I X 4-i 0 £ d -H en (ti 3 X M
E h 4-> 3 ero en >1 | h (0 (ti HOOO ati (Oio ati >1 H ω toto
(tiWWWSP d-p -PH (ti S
η-p aaa ;<o :(0-pio h to g a o a a (ti m:(ti ati <U P £ a m
Il d dPdPdPin g ui d 4J S m o a m o en (ti H H H H * < (0 * *
dg H- H H O -K UI (OH WOlHHtitiHHO
II
n 80382
Esimerkki 3 2.5 litrasta plasmaa saatu kryosakka liuotetaan uudelleen 100 ml:aan sitraatti/glukoosipuskuria ja vapautetaan protrombii-nikompleksista adsorboimalla A^O^n kanssa. Lisätään 4 paino-% PEG 3000:ta. pH säädetään arvoon 6,4 0,5 M HCl:n kanssa ja seosta inkuboidaan 30 min huoneenlämmössä. Saostunut proteiini poistetaan sentrifugoimalla ja lisätään arginiini-HCl:ä kon-sentraatioon 0,40 moolia/1 saakka. Lisätään vielä 8 paino-% PEG 3000:ta ja pH säädetään arvoon 6,3 0,1 M NaOH:n kanssa. Inkuboidaan 45 min huoneenlämmössä ja eristetään sitten sakka sentrifugoimalla ja liuotetaan se uudelleen 20 ml:aan sitraat-ti/sakkaroosi/NaCl, pH 7,8. Konsentraatti sisältää 360 yksikköä tekijä VIII:C ja 52 mg proteiinia (ominaisvaikutus 7 yk-sikköä/mg).
Esimerkki 4 2.5 litrasta plasmaa saatu kryosakka liuotetaan uudelleen 100 ml:aan sitraatti/glukoosipuskuria ja vapautetaan protrom-biinikompleksista adsorboimalla A^O^jn kanssa. Lisätään 4 paino-% PEG 3000:ta. pH säädetään arvoon 6,4 0,5 M HCl:n avulla ja seosta inkuboidaan 30 min huoneenlämmössä. Saostunut proteiini poistetaan sentrifugoimalla ja lysiini-HCl:ä lisätään konsentraatioon 0,55 moolia/1. Lisätään vielä 8 paino-% PEG 3000:ta ja pH säädetään arvoon 6,3 0,1 M NaOH:n avulla. Inkuboidaan 45 min huoneenlämmössä ja eristetään sakka sentrifugoimalla ja uudelleenliuotetaan se 5 ml:aan sitraatti/sak-karoosi/NaCl, pH 7,8. Konsentraatti sisältää 460 yksikköä tekijä VIII:C ja 30 mg proteiinia (ominaisvaikutus 15 yksik-köä/mg).
Esimerkki 5 80 kg:sta plasmaa saatu kryosakka liuotetaan uudelleen 2500 ml:aan sitraattipuskuria ja vapautetaan se protrombiini-kompleksista adsorboimalla A^O^sn avulla. Lisätään 4 paino-% PEG 3000:ta. pH säädetään arvoon 6,4 0,5 M HCl:n avulla ja seosta inkuboidaan 30 min huoneenlämmössä. Saostunut proteiini poistetaan sentrifugoimalla ja gysiini-HCl:ää lisätään konsentraatioon 0,55 moolia/1 saakka. Lisätään vielä 8 paino-% 12 80382 PEG 3000:ta ja pH säädetään arvoon 6,3 0,1 M NaOH:n avulla. Inkuboidaan 45 min huoneenlämmössä ja eristetään sakka sentrifugoimalla ja uudelleenliuotetaan se 60 ml saan sit-raatti/sakkaroosi/NaCl. Liuos suodatetaan steriilisti ja jaetaan 15 pikkupulloon. Pakastamisen ja pakastekuivauksen jälkeen sisältää pullo 1000 yksikköä AHFsää ja ominaisvaiku-tus on 37 yksikköä/mg proteiinia.
Kaiken kaikkiaan saatiin talteen 15 000 AHF-yksikköä 60 mlssta liuosta, joten voidaan todeta, että liukoisuus on vähintään 250 yksikköä/ml.
Esimerkki 6 13 litrasta plasmaa saatu kryosakka liuotetaan uudelleen 525 ml:aan sitraatti/glukoosipuskuria ja vapautetaan proto-trombiinikompleksista adsorboimalla Ala03:n kanssa. Lisätään 4 paino-% PEG 3000:ta. pH säädetään arvoon 6,4 käyttämällä 0,5 M HCl:a ja seosta inkuboidaan 30 min huoneen lämmössä. Saostunut proteiini poistetaan sentrifugoimalla ja lysiini-HClsää lisätään konsentraatioon 0,55 moolia/1. Lisätään vielä 8 paino-% PEG 3000:ta ja pH säädetään arvoon 6,3 käyttämällä 0,1 M NaOH:a. Inkuboidaan 45 min huoneen lämmössä ja eristetään sakka sentrifugoimalla ja uudelleenliuotetaan se 2,1 ml sitraatti/sakkaroosi/NaCl, pH 7,8. Konsentraatti, jonka tilavuus on 3,1 ml, sisältää 2180 yksikköä. FVIII:C ja 81 mg proteiiniliukoisuus on siten 703 yksikköä/ml ja ominaisvaikutus on 27 yksikköä/mg.
Esimerkki 7 Tässä esimerkissä tutkitaan, voidaanko glysiinin sisään-suolaustehoa parantaa lisättäessä ionitehoa omaavaa NaCl:a, jolloin NaCl, joka on tunnettu sisäänsuolausaine, jo yksin omaa PEG-saostuksessa tarpeellisen sisäänsuolaustehon saadakseen aikaan keksinnön mukaisen konsentraatin.
Prosessiolosuhteiden edelleenmuuntamiseksi saostus suoritettiin matalassa lämpötilassa (6-9°C).
Il 13 80382 50 g kryosakkaa liuotettiin 200 ml:aan vettä huoneen lämpötilassa. Lisättiin 12,3 ml 1,3 %:sta AI2O3 ja 7,9 g PEG 3000:ta (3%). pH säädettiin arvoon 6,7 käyttämällä IM HAc:a ja seos jäähdytettiin 9°C:een. Jäähdytyksen jälkeen sakka poistettiin sentrifugoimalla 15 min 9°C:ssa. Lisättiin vielä 8 % PEGia, 2M glysiiniä (13 %) ja 14 % NaCl, jonka jälkeen pH säädettiin arvoon 5,7 ja seos jäähdytettiin 6°C:een.
Sakka eristettiin sentrifugoimalla 15 min 6°C:ssa ja uudel-leenliuotettiin 50 ml (1/5 kryotilavuutta) 5MM sitraattia, 0,13 M NaCl:a, ja 0,1 M glysiiniä, pH 7,3.
Uudelleenliuotetun konsentraatin FVIII- ja proteiinipitoisuus olivat pienet. Siksi tutkittiin eri NaCl- ja glysiini-pitoisuuksilla riippuiko sisäänsuolaus odotetulla tavalla glysiinistä. Kuten ilmenee alla olevasta taulukosta, FVIII:a saostui ainoastaan vähän ilman NaCl:a. Pelkän natriumklori-din lisääminen ei kuitenkaan lisää proteiinisaostusta (niin kuin PEG-lisäys). Sitä vastoin NaCl vaikuttaa suuresti sisäänsuolaavasti. Käytetyssä alhaisessa lämpötilassa gly-siini myötävaikuttaa FVIII:n saostamiseksi, mutta parantunutta ominaisvaikutusta ei saavuteta ilman NaCl-lisäystä.
Seuraavassa taulukossa esitetään siis glysiinin ja eri NaCl-konsentraatioiden vaikutus.
80382 14 %
NaCl + 13 % glysiini - glysiini mg* % FVIIIsC- Ominais- mg* % FVIIIjC- omin.
pro- saanto vaikutus pro- saanto vaik.
teiini yks./mg teiini yks./mg 0 5,86 5 0,22 6,50 14,4 0,58 5 3,96 26 1,74 10 2,26 58 6,73 3,89 15,9 1,07 12 2,18 41 4,90 14 0,88 17 5,02 2,82 5,2 0,49
Kryosakka 100 0,58 3 % PEG/ AI2O3 super- natantti 73 0,77 * määritetty Essoina
Esimerkki 8 (tekijä VIIIiRP-sisällön määritys) US-patenttijulkaisusta 4 361 509 ilmenee, että tekijä VIII-kompleksin molempien komponenttien erottamiseksi täytyy käyttää erityisiä puhdistusmenetelmiä, kuten immunoadsorp-tiota tai ioninvaihtokromatografiaa.
Edellä esitetyissä esimerkeissä, joissa lähtöaineena käytetään (liuotettua) kryosakkaa, joka siten sisältää tekijä VIII-kompleksia, ei missään vaiheessa käytetä tällaisia puhdistusmenetelmiä, joten se on alan ammattimiehelle selvää, että esimerkeissä saadut tekijä VIII-pitoisuudet varmasti sisältävät sekä koagulaatioaktiivista tekijä VIII:C:a että ns. von Willebrand-tekijää VIII:RP.
Tämän tekijän VIII:RP pitoisuutta ei kuitenkaan mitattu eikä esimerkkeihin siten ole voitu lisätä niitä koskevia arvoja.
On kuitenkin suoritettu joukolle keksinnön mukaiselle AHF-preparaatille tekijöiden VIII:C ja VIIIsRP määrityksiä, 11 is 80382 joille preparaateille on annettu rekisterimerkki "NORDIOC-TO®". Nämä preparaatit on valmistettu analogisesti esimerkin 5 kanssa, siis 1000 tekijä VIIIsC (i 20 %) yksikköannoksina.
Saatiin seuraavat tulokset.
Preparaatti FVIIIiRP. vks./annos FVIII:C, yks./annos 44102 727 847 44203 936 1028 44301 825 1161 44302 942 1109 44401 566 909 44402 808 1034 FVIII-RP on määritetty raketti-immunoelektroforeesin avulla DAKO-vasta-aineella (A 082). Standardina on käytetty normaalia plasmapoolia (/vl yksikkö FVIII-RP/ml).
FVIIIsC on määrätty askelkoagulaatioanalyysillä. Standardina on käytetty normaalia plasmapoolia (/vl yksikköä FVIII:C/ml).
Claims (8)
1. Menetelmä antihemofiilitekijä VIIIsn (AHF) konsentraatin valmistamiseksi, joka on käytännöllisesti katsoen vapaa denaturoituneesta AHF:stä ja muista konsentraatin lähtöaineessa olevista plasman proteiineista, muttei tekijästä VIII:RP, joka konsentraatti on lyofilisoitavissa ilman proteiinin lisäystä ja jonka liukoisuus vesipitoiseen injek-tioväliaineeseen on välillä 45-500 yksikköä AHF/ml ja jonka ominaisaktiivisuus on välillä 3,85-50 yksikköä AHF/mg konsentraatin lähtöaineesta peräisin olevaa proteiinia, jossa menetelmässä veriplasman kryosakan tai muun faktori-VIII-pitoisen verifraktion liuos puhdistetaan protrombiinin poistamiseksi ja sitten fraktioidaan polyetyleeniglykolin, PEG, avulla vaiheessa, jossa fibrinogeenin pääosa saostetaan 2-6 paino-%:lla PEG 200-20 000sa ja sitä seuraavassa vaiheessa saostetaan AHF, tunnettu siitä, että ensimainitun PEG-saostuksen sakan päällä oleva neste saostetaan 6-20 paino-%:lla PEG 200-20 000:a sellaisen sisäänsuolaavan aineen läsnäollessa, joka on aminohappo, edullisesti emäksinen aminohappo, hiilihydraatti tai sokerialkoholi, jonka jälkeen otetaan talteen sakka, jossa on konsentroitunut AHF-pitoisuuS.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sisäänsuolaavana aineena käytetään lysiini-HCl:a tai arginiini-HClsa.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sisäänsuolaavana aineena käytetään hiilihydraattia, edullisesti mono- tai disakkaridia.
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sisäänsuolaavana aineena käytetään sakkaroosia.
5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ensimmäisen vaiheen saostuksessa lisätään PEGsa aina konsentraatioon noin 4 paino-% liuoksesta. Il 17 80382
6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että toisessa saostusvaiheessa lisätään PEGsa, joka vastaa kokonaiskonsentraatiota noin 12 paino-%.
7. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lisätään lysiini-HClsa tai arginiini-HClsa määrinä, jotka vastaavat lysiini- tai arginiinikonsentraa-tiota, joka on välillä 0/1-0,9, edullisesti 0,3-0,8 moolia/-litra.
8. Jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ensimmäisen saostusvaiheen pH on välillä 6,0-8,5, edullisesti 6,2-6,6, ja edullisimmin noin 6,4, ja toisen saostusvaiheen pH on välillä 5,0-8,5, edullisesti 6,0-6,6, ja edullisimmin noin 6,3. ie 80382
Applications Claiming Priority (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK127483A DK127483D0 (da) | 1983-05-09 | 1983-05-09 | Fremgangsmade til fremstilling af et koncentrat af den anti-hemofile faktor viii |
| DK127483 | 1983-05-09 | ||
| DK549483A DK157170C (da) | 1983-05-09 | 1983-12-01 | Koncentrat af den anti-hæmofile Faktor VIII samt fremgangsmåde til fremstilling deraf |
| DK549483 | 1983-12-01 | ||
| DK64684 | 1984-02-14 | ||
| DK64684A DK64684A (da) | 1983-05-09 | 1984-02-14 | Fremgangsmaade til fremstilling af et koncentrat af den anti-haemofile faktor viii |
| PCT/DK1984/000019 WO1984003628A1 (en) | 1983-05-09 | 1984-03-20 | A concentrate of the antihemophilic factor viii and a process for producing it |
| DK8400019 | 1984-03-20 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI844557A0 FI844557A0 (fi) | 1984-11-20 |
| FI844557L FI844557L (fi) | 1984-11-20 |
| FI80382B FI80382B (fi) | 1990-02-28 |
| FI80382C true FI80382C (fi) | 1990-06-11 |
Family
ID=27220842
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI844557A FI80382C (fi) | 1983-05-09 | 1984-11-20 | Foerfarande foer framstaellning av ett koncentrat av antihemotilfaktorn. |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4650858A (fi) |
| EP (1) | EP0148843B2 (fi) |
| DE (1) | DE3481109D1 (fi) |
| FI (1) | FI80382C (fi) |
| NO (1) | NO169875C (fi) |
| WO (1) | WO1984003628A1 (fi) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK525384D0 (da) * | 1984-11-05 | 1984-11-05 | Nordisk Insulinlab | Praeparat paa basis af faktor viii til behandling af haemofili a inhibitorpatienter samt fremgangsmaade til fremstilling af et saadan praeparat |
| SE8501050D0 (sv) * | 1985-03-05 | 1985-03-05 | Kabivitrum Ab | Biologically active fragments of human antihemophilic factor and method for preparation thereof |
| GB8505882D0 (en) * | 1985-03-07 | 1985-04-11 | Central Blood Lab Authority | Purification of blood coagulation factor viii |
| DE3625090A1 (de) * | 1986-07-24 | 1988-01-28 | Behringwerke Ag | Mittel zur therapie faktor viii-resistenter haemophilie a und verfahren zu seiner herstellung |
| EP0321835B1 (en) * | 1987-12-21 | 1994-09-28 | Miles Inc. | Gel filteration of factor VIII |
| EP0399321B1 (en) * | 1989-05-24 | 1993-06-23 | Miles Inc. | Gel filtration of heat treated factor viii |
| DE4111393A1 (de) * | 1991-04-09 | 1992-10-15 | Behringwerke Ag | Stabilisierte faktor viii-praeparationen |
| WO1993022336A1 (en) * | 1992-04-30 | 1993-11-11 | Alpha Therapeutic Corporation | Improved solubilization and stabilization of factor viii complex |
| US5330974A (en) * | 1993-03-01 | 1994-07-19 | Fibratek, Inc. | Therapeutic fibrinogen compositions |
| GB9424732D0 (en) * | 1994-12-08 | 1995-02-08 | Common Services Agency | Heat treated blood plasma proteins |
| US5659017A (en) * | 1995-11-07 | 1997-08-19 | Alpha Therapeutic Corporation | Anion exchange process for the purification of Factor VIII |
| BR0008405B1 (pt) | 1999-02-22 | 2014-04-22 | Baxter Int | Composição de fator viii formulada sem a adição de albumina, uso de uma composição de fator viii, e, método de liofilizar uma formulação farmacêutica aquosa |
| CN1767857A (zh) * | 2003-02-26 | 2006-05-03 | 尼克塔治疗亚拉巴马公司 | 聚合物－因子ⅷ部分共轭物 |
| US20100168018A1 (en) * | 2008-11-07 | 2010-07-01 | Baxter International Inc. | Factor viii formulations |
| NZ597022A (en) | 2009-06-09 | 2014-05-30 | Prolong Pharmaceuticals Llc | Hemoglobin compositions |
| CN103797023B (zh) * | 2011-09-16 | 2020-04-10 | 通用电气医疗集团生物工艺研发股份公司 | 通过序贯多元酸沉淀进行的血浆蛋白分级分离 |
Family Cites Families (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3652530A (en) * | 1967-08-28 | 1972-03-28 | American Nat Red Cross | Antihemophilic factor prepared from blood plasma using polyethylene glycol |
| US3631018A (en) * | 1970-05-01 | 1971-12-28 | Baxter Laboratories Inc | Production of stable high-potency human ahf using polyethylene glycol and glycine to fractionate a cryoprecipitate of ahf concentrate |
| US3682881A (en) * | 1970-10-02 | 1972-08-08 | Baxter Laboratories Inc | Fractionation of plasma using glycine and polyethylene glycol |
| US4069216A (en) * | 1975-06-16 | 1978-01-17 | Edward Shanbrom, Inc. | Simplified methods for preparation of very high purity Factor VIII concentrate |
| US4027013A (en) * | 1976-01-22 | 1977-05-31 | William L. Wilson | Clottable fibrinogen free factor VIII and albumin product and process |
| JPS52125609A (en) * | 1976-04-09 | 1977-10-21 | Green Cross Corp:The | Purification of agglutination factor viii |
| DE2916711A1 (de) * | 1979-04-25 | 1980-11-06 | Behringwerke Ag | Blutgerinnungsfaktoren und verfahren zu ihrer herstellung |
| FR2460305A2 (fr) * | 1979-06-29 | 1981-01-23 | Merieux Inst | Procede de preparation d'un concentre de facteur viii |
| SE448945B (sv) * | 1979-12-20 | 1987-03-30 | Blombaeck E G B | Forfarande for rening och /eller koncentrering av faktor viii-komplexet |
| US4289691A (en) * | 1980-01-18 | 1981-09-15 | The Canadian Red Cross Society | Method of obtaining intermediate purity factor VIII |
| US4386068A (en) * | 1980-02-26 | 1983-05-31 | Cutter Laboratories, Inc. | Antihemophilic factor concentrate and method for preparation |
| AT369263B (de) * | 1980-08-27 | 1982-12-27 | Immuno Ag | Verfahren zur herstellung eines faktor viii(ahf) -hochkonzentrates |
| DE3279292D1 (en) * | 1981-04-08 | 1989-01-26 | Atomic Energy Authority Uk | Blood fractionation improvement |
| US4435318A (en) * | 1981-05-22 | 1984-03-06 | Ionics, Incorporated | Electrodialysis preparation of purified AHF concentrate |
| JPS5874617A (ja) * | 1981-10-28 | 1983-05-06 | Green Cross Corp:The | 人由来血液凝固第７因子含有水溶液の加熱処理方法 |
| US4361509A (en) | 1981-12-14 | 1982-11-30 | Scripps Clinic And Research Foundation | Ultrapurification of factor VIII using monoclonal antibodies |
| US4495175A (en) * | 1982-08-05 | 1985-01-22 | University Of Rochester | Preparation of highly purified human antihemophilic factor |
| US4478825A (en) * | 1983-10-14 | 1984-10-23 | Armour Pharmaceutical Company | Warm ethanol method for preparation of low fibrinogen antihemophilic factor |
| US4508709A (en) * | 1983-12-05 | 1985-04-02 | Armour Pharmaceutical Company | Process for purifying factor VIII:C |
| US4486410A (en) * | 1984-02-09 | 1984-12-04 | Armour Pharmaceutical Company | Heat defibrinogenation of AHF preparation |
| US4543210A (en) * | 1984-10-04 | 1985-09-24 | Miles Laboratories, Inc. | Process for producing a high purity antihemophilic factor concentrate |
-
1984
- 1984-03-20 EP EP84901337A patent/EP0148843B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-03-20 US US06/673,753 patent/US4650858A/en not_active Expired - Fee Related
- 1984-03-20 DE DE8484901337T patent/DE3481109D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1984-03-20 WO PCT/DK1984/000019 patent/WO1984003628A1/en active IP Right Grant
- 1984-11-20 FI FI844557A patent/FI80382C/fi not_active IP Right Cessation
- 1984-11-20 NO NO84844610A patent/NO169875C/no unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI844557A0 (fi) | 1984-11-20 |
| NO169875B (no) | 1992-05-11 |
| EP0148843A1 (en) | 1985-07-24 |
| EP0148843B1 (en) | 1990-01-24 |
| FI80382B (fi) | 1990-02-28 |
| FI844557L (fi) | 1984-11-20 |
| WO1984003628A1 (en) | 1984-09-27 |
| EP0148843B2 (en) | 1994-05-04 |
| NO169875C (no) | 1992-08-19 |
| DE3481109D1 (de) | 1990-03-01 |
| US4650858A (en) | 1987-03-17 |
| NO844610L (no) | 1984-11-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI80382C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av ett koncentrat av antihemotilfaktorn. | |
| EP0077870B1 (en) | Process for heat treatment of aqueous solution containing human blood coagulation factor viii | |
| EP0638091B1 (en) | Improved solubilization and stabilization of factor viii complex | |
| US4495175A (en) | Preparation of highly purified human antihemophilic factor | |
| US4203891A (en) | Method of collecting anti-hemophilic factor VIII from blood and blood plasma using heparin or sodium heparin | |
| CA1219211A (en) | Stabilized gamma globulin concentrate | |
| JPH07103044B2 (ja) | Ｃ１不活性化剤を含有する医薬の調製方法 | |
| EP0469985B1 (en) | Process for manufacturing von Willebrand factor having a very high purity | |
| US4670544A (en) | Process for the manufacture of the cold insoluble globulin and pharmaceutical preparation containing it | |
| EP0428758A1 (en) | Albumin preparation and method of producing the same | |
| FI72653C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av ett faktor viii(ahf)-koncentrat. | |
| US4562072A (en) | Process for the pasteurization of antihemophilic cryoprecipitate (AHC) and antihemophilic cryoprecipitate prepared thereby | |
| US4814435A (en) | Method of producing a factor VIII (AHF) containing fraction | |
| CA2265936C (en) | Process for producing a plasma protein-containing medicament | |
| US4739039A (en) | Method for preparing antihemophilic factor (AHF) by cold precipitation and for improving solubility of recovered AHF product | |
| CA2017039C (en) | Gel filtration of heat treated factor viii | |
| MXPA02010017A (es) | Preparacion activa hemostaticamente, que contiene el factor de von willebrand y metodo para la produccion de la misma. | |
| KR20040030369A (ko) | Ｖｉｉｉ:ｃ 인자 함유 폰 빌레브란트 인자의 농축물 및이의 제조방법 | |
| EP0702960A1 (en) | Liquid globulin composition for intravenous injection, process for producing the same, and method of inhibiting globulin dimer increase in said composition | |
| FI95440B (fi) | Menetelmä plasmaperäisen C3b-inaktivaattoriliuoksen valmistamiseksi, joka ei sisällä oleellisesti tekijä B-aktiivisuutta eikä infektoivan viruksen aktiivisuutta | |
| EP0076870B1 (en) | Process for the preparation of highly purified antihemophilic factor | |
| CA1164344A (en) | Process for the preparation of highly purified antihemophilic factor | |
| JPS5867627A (ja) | 高純度抗血友病性因子の製造法 | |
| DK157170B (da) | Koncentrat af den anti-haemofile faktor viii samt fremgangsmaade til fremstilling deraf | |
| RU99107632A (ru) | Способ получения лекарственного средства, содержащего протеин плазмы |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM | Patent lapsed | ||
| MM | Patent lapsed |
Owner name: NORDISK INSULINLABORATORIUM |