DK157170C

DK157170C - Koncentrat af den anti-hæmofile Faktor VIII samt fremgangsmåde til fremstilling deraf

Info

Publication number: DK157170C
Application number: DK549483A
Authority: DK
Inventors: Mirella Ezban Rasmussen; Ole Nordfang
Original assignee: Nordisk Insulinlab
Priority date: 1983-05-09
Filing date: 1983-12-01
Publication date: 1996-08-12
Also published as: DK549483A; DK64684A; DK157170B; DK64684D0; DK549483D0

Description

i

DK 157170 C

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde af den i krav l's indledning angivne art. til fremstilling af et koncentrat af den anti-hæmofi le Faktor VIII, også kaldet AHF.

Det er kendt, at blodets evne til at koagulere styres af et system af koagulationsproteiner, hvoraf AHF eller Faktor VIII er en vigtig komponent.

Personer med hæmofili-A eller blødersygdom har helt eller delvis mistet evnen til at producere AHF. Til behandling af denne sygdom injiceres AHF-holdige præparater, og det har derfor betydning at råde over præparater indeholdende passende høje koncentrationer af AHF og med lavest muligt indhold af andre proteiner, såsom fibrinogen og immunglobuliner.

Især ved behandling af inhibitorpatienter, d.v.s. patienter, der producerer antistoffer mod AHF, og som derfor skal have præparatet tilført i overskud, med høje doser af AHF, er det vigtigt, at den specifikke aktivitet (enh. AHF/mg protein) er høj, idet en tilførsel af "andre proteiner" i større mængder kan fremkalde uønskede bivirkninger. Ved 1 AHF enhed forstås faktor VIII aktiviteten af 1 ml normalt blodplasma. Bivirkninger ved AHF-behand-ling forårsaget af immunglobuliner er f.eks. beskrevet af Tilsner et al., Munch. Med. Wschr. 124 (1982) nr.

22, p. 553-557.

AHF udvindes normalt af det såkaldte kryopræcipitat, der hovedsageligt består af fibrinogen, albumin, IgG og IgM, mens AHF udgør mindre end 1¾ af den totale proteinmængde. Den specifikke aktivitet af et kryopræcipitat er typisk 0,1 - 0,3 enh. AHF/mg protein.

Det er kendt, at man kan fjerne en del af det unødvendige 2

DK 157170 C

protein ved fældning med glycin eller po1yethylengiyco1 (PEG). Eventuelt kan fældning udføres flere gange, først med det ene og derefter med det andet fældningsmidde-i.

Det har således længe været kendt at fælde AHF med ca.

5 2 M glycin ved lav temperatur, jfr. Webster et al., se Arner. J. Med. Sc. 250, nr. 6, p. 643-650 (1965).

Webster anvendte et kryopræcipitat, som opløstes i vand og fraktioneredes ved lav temperatur (< 10°C) med stigende koncentrationer af glycin indtil 2,3 molær. Ved denne 10 type fældning udnyttes, at AHF i kulden udfældes sammen med fibrinogen ved tilsætning af glycin. Herved opnås en specifik aktivitet på 0,3 - 0,5 enh. AHF/mg protein.

Fra beskrivelsen til EP patentskrift nr. 32655, er det 15 kendt, at man ved at gennemføre fraktioneringen af genop løst kryopræcipitat med 2M glycin som fældningsmiddel ved højere temperaturer, såsom 30-45°C, først får udfældet en stor del af de andre proteiner, såsom fibrinogen, således at AHF forbliver i supernatanten, hvorfra det 20 kan udvindes.

Når PEG anvendes som fældningsmiddel, foretages hyppigst en fraktioneret PEG-fældning, hvor hovedparten af fibrino-genet og noget IgM fjernes ved fældning med lav PEG-koncentration (2-6S), hvorefter AHF udfældes fra den 25 albuminholdige supernatant med høj PEG-koncentration (5-15¾). Sådanne PEG/PEG-fældninger er beskrevet af bl.a. Newman et al., Br i t, 3 , Haema t o logy 2_1 , 1972, p.

1; US patentskrift nr. 3.652.530; DK patentskrift, nr.

146 895, FR patentskrift nr. 2.460.305, DK patentansøgning 30 nr. 3602/81. Ved disse metoder opnås et AHF-koncentrat med en specifik aktivitet på 1 - 3 enh./mg protein.

Ifølge US patentskrift nr. 4 027 013 (Bick et al.) befries en blanding indeholdende koagulerbart fibrinogen og Faktor VIII, der ud fra eksemplerne må antages at være genopløst 3

DK 157170 C

kryopræcipitat, for 90 % af fibrinogenindholdet ved fældning med en b1okcopo1ymer af "Pluronic" ® typen, idet man i en mindre foretrukken udførelsesform,-der fører til væsentligt lavere udbytter, også kan anvende PEG.

Supernatanten fra den første fibrinogenfældning behandles derpå med højere koncentrationer af "Pluronic" ® til udfældning af faktor VIII og residualt fibrinogen.

Det faktor V 111-holdige bundfald genopløses i mere koncentreret form og behandles derpå med et thrombinmimeti sk enzym, der angiveligt specifikt koagulerer den totale mængde residual fibrinogen, men ikke i væsentlig grad påvirker faktor V111's biologiske aktivitet. Dette sidste er dog ikke nærmere dokumenteret.

Det er vigtigt at bemærke, at Bick for at stabilisere faktor VIII under den efterfølgende 1yofi 1isering tilsætter albumin, hvilket ikke er tilfældet ved lyofilisering af koncentratet fremstillet ifølge opfindelsen.

Processer med flertrinsfældninger, hvor mere end et fældningsmiddel anvendes, er ligeledes kendt. F.eks. kan glycinfældning ved lav temperatur udføres før eller efter PEG/PEG-fældninger, evt. kan glycinfældninger udføres både før og efter PEG/PEG-fældningerne. Dette er beskrevet i US patentskrift nr. 3 682 881 og US patentskrift 3.631.018. Almindeligvis opnås herved præparater med en specifik aktivitet på 1 - 3 enh./mg protein.

Når der i denne sammenhæng fældes med glycin ved lav temperatur, udnyttes det AHF-holdige bundfald, d.v.s. at der ved efterfølgende PEG-fældninger på genopløst AHF-holdigt præcipitat kun er en lav koncentration af glycin i opløsningen.

DK 157170 C

k

Anvendes glycin ved høj temperatur i forbindelse med PEG-fældning, udføres først en glycinfældning, der efterlader AHF i supernatanten, hvor koncentrationen -af glycin er høj, og derefter fældes AHF derfra med en PEG-fældning 5 ved høj PEG-koncentrati on. Herved kan opnås en specifik aktivitet på 1 - 3 enh./mg protein.

Det ved denne type glycin/PEG-fældning opnåede koncentrat ligner et koncentrat opnået ved PEG/PEG-fældning. Som det fremgår af tabel 1, indeholder 1. fældningssuperna-10 tant mere IgM og IgG efter en varm fældning med 2 M

glycin end efter en fældning med lav PEG-koncentration (4¾). Efter slutfældningen med høj PEG-koncentration (9¾) indeholder koncentratet fra glycin/PEG-fældningen imidlertid mindre IgM og IgG end koncentratet fra PEG/-15 PEG-fældningen.

TABEL 1

Sammenligning mellem PEG/PEG- og varm qlycin/PEG- fældning af AHF fra genopløst kryopræcipitat Fraktion » AHF ¾ IgM S IgG Kr yopræcipi tat 100 100 100 1. PEG, 4 ?0, supernatant 72 38 55 PEG/PEG, 4¾. 9¾ koncen-t ra t 40 24 15 2M glycin supernatant 68 76 79 2M qlycin/PEG, 9S, koncentrat 36 18 8

Arsagen hertil er ikke tidligere erkendt, men det må antages, at den polære aminosyre i giycinsupernatanten virker indsaltende, især på basiske proteiner, således at IgM og IgG ikke så let udfældes med PEG alene. Det 20 ved glycin/PEG-fældningen opnåede koncentrat har dog stadig et uønsket højt indhold af fibrinogen, IgG og IgM, jfr. tabel 2 nedenfor.

5

DK 157170 C

Formålet med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe et højrent, direkte lyofiliserbart AHF-koncentrat, der har en så høj opløselighed og specifik aktiv i-t et, at det kan indgives intravenøst i injektionsdoser på 1000 enheder opløst i 2-5 ml injektionsmedium, og som indeholder faktor V111-kompleksets anden bestanddel faktor VIII: RP, der virker stabiliserende på den koagulationsaktive faktor V111:C.

Dette opnås ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, der er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del anførte.

Det bemærkes, at der ikke er en entydig sammenhæng mellem et AHF-koncentrats specifikke aktivitet og dets opløselighed, idet sidstnævnte afhænger af arten af øvrige proteiner, især fibrinogen, men at en høj specifik aktivitet alt andet lige også vil indebære en høj opløselighed.

Fra US patentskrift nr. 4 361 509 (Zimmermann et al.) kendes ganske vist et faktor V111:C præparat, fremstillet ud fra plasma eller kommercielle faktor VIII koncentrater og som er befriet for faktor VIII:RP ved direkte immunadsorption på en søjle af agarosegel, hvortil der er koblet monoclonale antistoffer, der udviser høj affinitet over for faktor VIII:RP, men dog binder såvel faktor V111:C som VIIIrRP, og efterfølgende desorption af faktor V 111;C med en calciumholdig buffer. Zimmermann's Faktor V111;C koncentrat udviser en meget høj specifik aktivitet (ca. 2300 enh./mg) og en meget høj opløselighed (545-1172 enh./mg) i vandige injektionsmedier, men er som nævnt til forskel fra koncentratet ifølge opfindelsen også befriet for faktor VIIIrRP.

6

DK 157170 C

Opfindelsen er baseret på den overraskende erkendelse, at man kan opnå et særlig rent AHF-præparat, indeholdende såvel faktor V111:C som VIII:RP, men som i det væsentlige er befriet for andre proteiner, især immung1 obu 1 i -ner, ved at fraktionere et kryopræcipitat med PEG på en sådan måde, at der først udfældes en væsentlig del, fortrinsvis mindst 80 %, af fibrinogenet, og at der i et efterfølgende trin fældes med mere PEG i nærværelse af et indsaltningsmiddel. Tilsætningen af indsalt-ningsmidlet medfører ikke i sig selv udfældninger, men på grund af tilstedeværelsen af indsaltningsmidlet modificeres betingelserne under den efterfølgende PEG-fæld-ning, således at der opnås en skarpere fraktionering, dvs. et renere AHF-koncentrat med en høj specifik aktivitet, jfr. Tabel 2 nedenfor. Den høje renhed bevirker at præparatet har en opløselighed på 200-500 enheder faktor VIII : C (AHF) pr. ml. Da en normal injektionsdosis er 1000 enheder, kan man således nøjes med ca. 2-5 ml injektionsmedium. Da opløseligheden af de bedste på markedet værende AHF-præparater angives at være 40-50 enheder pr. ml svarende til et injektionsvolumen på 25-20 ml, medfører præparatet fremstillet ifølge opfindelsen således en meget betydelig lettelse for patienten.

7

DK 157170 C

TABEL 2

Effekt af g 1yc inti 1sætn inq under PEG/PEG-fældninq fra qenoplost kryopræcipitat

Proces AHF enh./mq % IqG % IqM % F i b r Kryopræcipitat 0,32 100 100 100 4% PEG/9?ό PEG 2,53 15 24 1 2M glycin/9?é PEG 2,27 Θ 18 2 4» PEG/12 % PEG + 2M glycin 4,36 4 13 0,5 Ved fældningen ifølge opfindelsen er glyci n således anvendt som indsaltninqsmiddel, idet det stabiliserer de uønskede proteiner ved at holde dem i opløsning, hvorimod de hidtil kendte metoder udnytter glycins udsal-5 tende effekt på fibrinogen/AHF. Ved anvendelse af ind- saltningsmiddel under en PEG/PEG-fældning i henhold til krav 1 opnås altså en mere selektiv udfældning af AHF .

Uden at ville være bundet til nogen bestemt teori antages 10 det, at indsaltningsmidlets virkning beror på, at det forøger forskellen i overfladeladning mellem Faktor VIII og de øvrige proteiner, navnlig IgG.

Det er vigtigt at fjerne hovedparten af fibrinogenet i første trin, fordi AHF-præparatet ellers ville være 15 stærkt forurenet med fibrinogen, og fordi tilstedeværelsen af fibrinogen i andet trin vil modvirke indsa1tnings-effekten og hindre en selektiv udfældning af Faktor VIII.

Som indsaltningsmiddel ved fremgangsmåden ifølge opfin-20 delsen benyttes hensigtsmæssigt en aminosyre, især basiske aminosyrer, fortrinsvis lysin eller arginin tilsat i form af hydrochlori det. Andre anvendelige aminosyrer er f.eks. histidin, samt polære aminosyrer, såsom serin, glutaminsyre, glycin og £-aminohexansyre. Andre anvendelige 8

8DK 157170 C

indsa1tningsmidler er kulhydrater, fortrinsvis monoeller disaccharider f.eks. glucose, og saccharose, men også oligosaccharider samt sukkeralkoholer, f.eks. snr-bitol og glycerol.

5 En oversigt er givet i Tabel 3.

TABEL 3

Effekt af indsaltninqsmidler på PEG/PEG-fældninq af AHF fra qenopløst kryopræcipitat

Indsaltningsmiddel Spec. aktivitet S udbytte af _enh ♦ /mg_AHF fra plasma

Intet 2,53 18 2M glycin 4,36 17 0,5M lysin, HC1 00 O 18 0,5M arginin, HC1 7,0 14 1,0M £. -aminohexansyre 5,0 10 1,5M glucose 3,85 18 1, OM saccharose 3,35 20

Det foretrukne indsaltningsmiddel er lysin-HCl. På tegningen er vist lysins indflydelse på PEG/PEG-fældning af AHF udtrykt som henholdsvis enh. AHF/mg protein (fig. 1) og % udbytte i forhold til kryopræcipitatet ved for-10 skellige lysinkoncentrationer (fig. 2). Lysin tilsættes fortrinsvis i koncentrationer på 0,1 - 0,9, især 0,3 - 0,8, helst 0,5 - 0,7 mol/1.

Som det fremgår af fig. 1 er der proportionalitet mellem tilsat lysinmængde og specifik aktivitet af slutproduk-15 tet, men selv små lysinmængder har en klar effekt. Som det ses af fig. 2 falder udbyttet af AHF ved den anvendte PEG-koncentration imidlertid, hvis der anvendes mere end 0,75M lysin, idet denne mængde lysin også virker indsaltende på AHF.

9

DK 157170 C

Et andet foretrukket indsaltningsmiddel er arginin-HCl hvis indflydelse på PEG/PEG-fældningen af AHF fremgår af nedenstående tabel 4, hvoraf det ses, at tilfreds stillende udbytter opnås ved koncentrationer på 0,2 5 - 0,8. Under hensyn til udbyttet er den foretrukne mængde 0,3 - 0,5, især 0,4 mol/1.

TABEL 4

Arqinins i ndflydelse på PEG/PEG- fældninq af AHF arqinin/1 % udbytte fra plasma enh. AHF/mq protein 0 20 2,3 0,2 20 4,9 0,4 17 6,4 0,6 14 6,1 o 00 4 4,6

De anvendte koncentrationer af PEG og indsaltningsmiddel samt pH under fældningen afhænger især af det anvendte indsaltningsmiddel, idet det som generel regel kan siges, 10 at de mere ladede indsaltningsmidler kan anvendes i mindre koncentrationer. Den valgte indsaltningsmiddelkon-centration hviler på et kompromis, idet man ved høje koncentrationer kan reducere IgG-mængden næsten fuldstændigt, men samtidig indsaltes også en del Faktor VIII, 15 hvorved udbyttet reduceres.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendes PEG med en molekylvægt på 200-20.000, fortrinsvis 2.000-12.000, især 3.000-6.000, men PEG 3000 foretrækkes. PEG-koncen-trationen i det første fældningstrin er 2-6 vægt-Si, 20 fortrinsvis ca. 4 vægt-X og i det andet trin 6-20 vægt-50, fortrinsvis ca. 12 vægt-ϊί. pH under første fældningstrin kan være 6,0 - 8,5, fortrinsvis 6,2 - 6,6, især ca.

6,4, og under andet trin 5,0 - 8,5, fortrinsvis 6,0 - 6,6, især ca. 6,3.

10

10DK 157170 C

Temperaturen i det første fældningstrin kan være 6 -22 °C, fortrinsvis 18 - 22 °C. I andet fældningstrin er temperaturen også fortrinsvis 18 - 22 °C (stuetemperatur).

Ved udvindingen af det omhandlede Faktor VIII koncentrat kan man anvende kryopræcipitat fra humant blodplasma eller andre Faktor VIH-holdige blodfraktioner, ligesom man kan anvende plasmafraktioner fra dyrearter, eksempelvis svin.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen skal i det følgende forklares nærmere ved hjælp af nogle eksempler, der også illustrerer oparbejdningen af koncentratet. Til præparatfremsti 11 ing kan AHF-opløsningen om ønsket underkastes en varmebehandling i 10 timer ved 60°C i nærværelse af en passende stabilisator såsom en blanding af glycin og saccharose for at opnå en hepatitissikring og/eller om ønsket 1yofi 1 i se res.

EKSEMPEL 1

Kryopræcipitat fra 600 ml human blodplasma indeholdende 240 enheder Faktor VIII:C genopløses i 28 ml citrat/glu-cosepuffer og befries for prothrombinkomplex ved adsorption med A^Oj. Derefter tilsættes 4 vægt-% PEG 3000. pH indstilles til 6,4 med 0,5 M HC1, og blandingen inkuberes 30 minutter ved stuetemperatur. Udfældet protein fjernes ved centrifugering, og lysin-HCl tilsættes til en koncentration på 0,55 mol/1. Yderligere 8 vægt-?é PEG 3000 tilsættes, og pH justeres til 6,3 med 0,1 M NaOH. Efter inkubation 45 minutter ved stuetemperatur isoleres bundfaldet ved centrifugering og genopløses i c itrat/g 1ucose-NaC1, pH 7,8. Det genopløste bundfald, der indeholdt 112 enheder faktor V11 I:C og 9 mg total-protein, har således en specifik aktivitet på 12 enheder Faktor V11 I:C (AHF) pr. mg protein, og udbyttet af Faktor 11

DK 157170 C

fra plasma er 20?ί. Der blev ikke foretaget opløselig-hedsbestemmelse, men det må antages at opløseligheden er mindst 200 enheder Faktor VIII:C/ml, jvf. eksempel 5 og 6.

5 Disse resultater er optaget i nedenstående tabel 5 sam men med resulater fra sammenligningsforsøg uden lysintil-sætning. Tabellen viser, at der ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan opnås en væsentlig forøgelse i specifik aktivitet og en reduktion af indholdet af immunglobulin 10 Gi forhold til PEG/PEG fældninger uden tilstedeværelse af indså 1tningsmiddel.

EKSEMPEL 2 30 ml kryoopløsning opnået analogt med eksempel 1 og adsorberet med A^Oj, tilsættes 4 vægtprocent PEG 3000.

13 pH indstilles til 6,4 med 0,5 M HC1, og blandingen inku beres 30 minutter ved stuetemperatur. Udfældet protein fjernes ved centrifugering, og "indsaltningsmiddel" tilsættes. Herefter tilsættes yderligere 8 vægt-% PEG 3000, og pH justeres til 6,3 med 0,1 M NaOH. Efter inku-20 bation 45 minutter ved stuetemperatur isoleres bundfaldet ved centrifugering og genopløses i citrat/glucose-NaCl, pH 7,8.

Tabel 6 angiver de opnåede resultater for forskellige indsaltningsmidler. Der blev ikke foretaget opløselig-25 hedsbestemmelser, men det antages at opløseligheden er mindst 200 enheder Faktor VIII:C/ml, jvf. eksempel 5 og 6.

12DK 157170 C

η = 3 (middeltal af 3 Enheder mg protein deraf IgG % faktor Specifik Proces forsøg) Faktor V111 : C i slutpro- mg V/111 : C aktivitet i slutprodukt produkt fra plasma enheder/ _______mg protein

so oco <r <r CM CM

Os CO O *"H I CM

ΓΛ O O O f—i KS

C •H O \ to •H -U U. 4-> L_ • Ή 0) o Ή X) u O •*H to α o -L> X α c σ LO CD ω E

CD E U CO O CD Jj (J H J* ·· D. CD *-h L. H (D HH U > C- CD CT>

CD U 0) CPX E

O Os o CM •s •s •v •K ·> 20 SO

Os CO Os

CM CM

SO OK u _J -j Q.4-1 u o OJ ω u D Z> < G. X CO O CO CO o- Os cn u o *-H ΓΆ Γ-» ε •H CL· i—1 CM CJ 4J «· JC HH D HH X HH O > u o u, Cl <-H ω u HJ X! O D II ω -U «-Η Os <r CM .c J* CO CO CM O o »-H c CD o O eH •"H H O LJ Li- •iH *-H «“Ί έ® 00 r-i CM LJ CD «—1 O U CJ CO H CL· X CM ω CD CD 1 O X) o? LJ U c o XJ CM CL O. -*H •*H \ rø X ε ^H £? > 0) U) CM CM *-H > er CO e-H c X .u •H C | 1 tA E C ♦*H ιΛ 0) 4J u CD CD CD HJ «“H >N LJ LJ U O CO CO -L> Q_ CL· Q_ Q) CO \ ω CP X jO XI HJ δΐ έ? to c O c X E K t—1 ε ♦H CM lA CM CJ X i C •H CO

CM Os CM -H

la

Os A* CM

,0M saccharose 123 , 35M arqinin_108

O

13

DK 157170 C

EKSEMPEL 3

Kryopræcipitat fra 2,5 1 plasma genopløses i 100 ml c itrat/g 1ucosepuffer og befries for prothrombinkomplex ved adsorption med Al^O^. Der tilsættes 4 vægt-5K PEG 5 3000. pH indstilles til 6,4 med 0,5M HC1, og blandingen inkuberes 30 minutter ved stuetemperatur. Udfældet protein fjernes ved centrifugering, og arginin-HCl tilsættes til en koncentration på 0,40 mol/1. Yderligere 8 vægt-% PEG 3000 tilsættes, og pH justeres til 6,3 med 0,1M 10 NaOH. Efter inkubation 45 minutter ved stuetemperatur isoleres bundfaldet ved centrifugering og genopløses i 20 ml citrat/saccharose/NaC1, pH 7,8. Koncentratet indeholder 360 enheder Faktor V111:C og 52 mg protein (specifik aktivitet 7 enh./mg). Der blev ikke foretaget 15 bestemmelse af opløseligheden af koncentratet, men der antages at være mindst 200 enheder/ml jvf. eksempel 5 og 6.

EKSEMPEL 4

Kryopræcipitat fra 2,5 1 plasma genopløses i 100 ml 20 c itrat/glucosepuffer og befries for prothrombinkomplex ved adsorption med Al^O^. Der tilsættes 4 vægt-K PEG 3000. pH indstilles til 6,4 med 0,5M HC1, og blandingen inkuberes 30 minutter ved stuetemperatur. Udfældet protein fjernes ved centrifugering, og lysin-HCl tilsættes til 25 en koncentration på 0,55 mol/1. Yderligere 8 vægt-* PEG 3000 tilsættes, og pH justeres til 6,3 med 0,1M NaOH. Efter inkubation 45 min. ved stuetemperatur isoleres bundfaldet ved centrifugering og genopløses i 5 ml citrat /saccha rose/NaC 1 , pH 7,8. Koncentratet indeholder 30 460 enh. Faktor V111 : C og 30 mg protein (specifik aktivi tet 15 enh./mg). Der blev ikke foretaget bestemmelse af opløseligheden af koncentratet, men der antages at være mindst 200 enheder/ml jvf. eksempel 5 og 6.

14

14DK 157170 C

EKSEMPEL 5

Kryopræcipitat fra 80 kg plasma genopløses i 2500 ml c itrat-puffer og befries for prothrombinkomplex ued adsorption med A^Oj. Der tilsættes 4 vægt-X PEG 3000. pH indstilles til 6,4 med 0,5 M HC1, og blandingen inkuberer 30 minutter ved stuetemperatur. Udfældet protein fjernes ved centrifugering, og lysin- HC1 tilsættes til en koncentration på 0,55 mol/1. Yderligere 8 vægt-X PEG 3000 tilsættes, og pH justeres til 6,3 med 0,1 M NaOH. Efter inkubation på 45 min. ved stuetemperatur isoleres bundfaldet ved centrifugering og genopløses i 60 ml citrat/saccharose/NaCl. Opløsningen sterilfiltreres og dispenseres i 15 hætteglas. Efter frysning og frysetørring indeholder hvert hætteglas 1000 enh.

AHF, med en specifik aktivitet på 37 enh./mg protein.

Da de i alt 15.000 enheder AHF er udvundet af 60 ml opløsning, kan det fastslås, at opløseligheden er mindst 250 enheder/ml.

EKSEMPEL 6

Kryopræcipitat fra 13 1 plasma genopløses i 525 ml ci-trat/glucosebuffer og befries for prothrombinkomplex ved adsorption med Al^O^. Der tilsættes 4 vægt-% PEG 3000. pH indstilles til 6,4 med 0,5M HC1 og blandingen inkuberes 30 minutter ved stuetemperatur.Udfældet protein fjernes ved centrifugering og lysin-HCl tilsættes til en koncentration på 0,55 mol/1. Yderligere 8 vægt-?i PEG 3000 tilsættes og pH justeres til 6,3 med 0,1 M NaOH. Efter inkubation 45 min ved stuetemperatur isoleres bundfaldet ved centrifugering og genopløses i 2,1 ml citrat/saccharose/NaCl, pH 7,8. Koncentratet, som er på 3,1 ml, indeholder 2180 enh. FVIII.-C og 81 mg protein opløseligheden er således 703 enh/ml og den specifikke 15

DK 157170 C

aktivitet 27 enh/mg. EKSEMPEL 7 I dette eksempel undersøges det, hvorvidt den indsaltede virkning af glycin kunne forbedres ved tilsætning af 5 NaCl, der hæver ionstyrken, og hvorvidt NaCl, der er et kendt indsaltningsmiddel, alene har tilstrækkelig ind-saltende virkning under en PEG-fældning til at føre til et koncentrat af den her omhandlede art.

For yderligere at variere procesbetingelserne valgtes 10 det at gennemføre fældningen ved lav temperatur (6-9 °C).

50 g kryopræcipitat genopløses i 200 ml dest. h^O ved stuetemperatur. 12,3 ml 1,3 % A^O^ °9 9 PEG 3000 (3 %) tilsættes. pH justeres til 6,7 med 1M HAc og blandingen nedkøles til 9 °C. Efter nedkøling fjernes bundfald 15 ved centrifugering 15 min ved 9 °C. Yderligere 8¾ PEG, 2M glycin (13 %) og 14 % NaCl tilsættes, hvorefter pH justeres til 5,7 og blandingen nedkøles til 6 °C. Bundfaldet isoleres ved centrifugering i 15 min ved 6 °C og genopløses i 50 ml (1/5 kryo vol.) 5mM citrat, 0,13 20 M NaCl, 0,1 M glycin pH 7,3.

Γ V11 I og proteinindholdet i det genopløste koncentrat var lav. Derfor blev det med varierende NaCl- og glycin-koncentrationer undersøgt, om indsaltningen som forventet skyldes glycin. Som det fremgår af nedenstående 16

DK 157170 C

tabel, udfældes F V/1 I I kun i ringe grad uden NaCl. NaCl tilsætning alene medfører imidlertid ikke øget proteinudfældning (som PEG tilsætning). Tværtimod virker Natl i høj grad indsaltende. Ved den lave temperatur medvir-5 ker glycin til at fælde FVIII, men den høje specifikke aktivitet kan ikke opnås uden NaCl tilsætning.

Effekt af glycin og varierende NaCl koncentration O' /0 NaCl + 13 % glyci n -glycin mg* % FVIII:C Spec. akt. mg* S FVIII.-C spec.akt. protein udbytte enh/mg protein udbytte enh/mg 0 5,86 5 0,22 6,50 14,4 0,58 5 3,96 26 1,74 10 2,26 58 6,73 3,89 15,9 1,07 12 2,18 41 4,90 14 0,88 17 5,02 2,82 5,2 0,49

Kryopræc. 100 0,58 3» PEG/ A^Oj super natant 73 0,77

* bestemt som E28O

EKSEMPEL 8 (Bestemmelse af faktor VI11:RP-indholdet)

Det fremgår af Zimmermann, US patentskrift nr. 4 361 509 10 at der for at opnå en adskillelse af de to komponenter i Faktor VIII komplexet må tages tilflugt til specifikke rensningsmetoder, såsom immunadsorption eller ionbytningskromatografi .

I de foregående eksempler hvor der som udgangsmateriale 15 anvendes (opløst) kryopræcipitat, der således indeholder 17

DK 157170 C

Faktor V111-komplexet, foretages der på intet tidspunkt sådanne rensninger, og det er derfor evident for gennemsnits fagmanden, at de i eksemplerne opnåede Faktor VIII koncentrater stadig indeholder såvel koagulationsaktivt 5 Faktor VIII:C som von Wi1lebrand-faktoren Faktor VIII:RP.

Imidlertid blev der ikke gennemført målinger af Faktor VI11:RP-indholdet og det er derfor ikke muligt at indføje talværdier herfor i de eksisterende eksempler.

10 11

Der er imidlertid gennemført Faktor VIII:C og Faktor VIIIrRP bestemmelse på en række AHF-præparater ifølge opfindelsen, der forhandles under betegnelsen "N0RDI0CT og som er fremstillet analogt med eksempel 5, altså i enhedsdoser på 1000 enheder Faktor VIII:C (+ 20¾).

Der opnåedes følgende resultater:

Præparat FV111 :RP, Enh/dosis FVIII:C, Enh/dosis 44102 727 847 44203 936 1028 44301 825 1161 44302 942 1109 44401 566 909 44402 808 1034 FVIII-RP er bestemt ved raketimmunelektroforese med antistof fra DAKO (A 082). Som standard er anvendt en pool af normal plasma (<υ1 Enh F VII I-RP/ml).

15 FV111:C er bestemt ved et-trinskoagulationsassay. Som standard er anvendt en pool af normal plasma (V1 Enh FVIII:C/ml) .

20

Claims

18 DK 157170 C

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et koncentrat af den antihæmofile faktor VIII (AHF) i det væsentlige fri for denatureret AHF og andre i udgangsmaterialet for koncentratet tilstedeværende plasmaproteiner, men ikke for faktor VIII:RP og som udviser en opløselighed i et vandigt injektionsmedium på 200-500 enheder AHF/ml og en specifik aktivitet på 3,85-50 enheder AHF/mg protein stammende fra udgangsmaterialet for koncentratet, hvorved en opløsning af et kryopræcipitat fra blodplasma eller en anden faktor VIII-holdig blodfraktion renses til fjernelse af pro-thrombin og dernæst fraktioneres med polyethylenglycol, PEG, omfattende et trin til udfældning af hovedparten af fibrinogen ved hjælp af 2-6 vægt-% PEG 200-20.000 og et efterfølgende trin til udfældning af AHF, kendetegnet ved, at supernatanten fra den førstnævnte PEG-fældning fældes med 6-20 vægt-% PEG 200-20.000 i nærværelse af et indsaltningsmiddel valgt blandt aminosyrer, fortrinsvis basiske, kulhydrater og sukkeralkoholer, hvorpå det udskilte bundfald med koncentreret indhold af AHF udvindes.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der som indsaltningsmiddel anvendes lysin-HCl eller arginin-HCl.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der som indsaltningsmiddel anvendes et kulhydrat, fortrinsvis et mono- eller disaccharid.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at der som indsaltningsmiddel anvendes saccharose.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1-4, kendetegnet ved, at der ved fældningen i første trin tilsættes PEG 19 DK 157170 C til en koncentration på ca. 4 vægt-% af opløsningen.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1-5, kendetegnet ved, at der i andet fældningstrin tilsættes PEG svarende til en totalkoncentration på ca. 12 vægt-%.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at der tilsættes lysin-HCl eller arginin-HCl i en mængde svarende til en lysin- eller arginin-koncentration på 0,1-0,9, fortrinsvis 0,3-0,8 mol/1.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 1-7, kendetegnet ved, at pH under første fældningstrin er 6,0-8,5, fortrinsvis 6,2-6,6, især ca. 6,4, og under andet fældningstrin er 5,0-8,5, fortrinsvis 6,0-6,6, især ca. 6,3.