FI77472B - Stabiliserad komposition och testanordning foer paovisande av socker i ett testprov. - Google Patents

Description

77472

Stabiloitu koostumus ja testiväline sokerin toteamiseksi testinäytteestä

Keksintö koskee koostumusta ja testivälinettä glu-5 koosin toteamiseksi testinäytteestä.

Testinäytteiden analysoimisella sokerin toteamiseksi on käyttöä monilla toisistaan kaukana olevilla aloilla. Niinpä käsiteltävänä oleva keksintö liittyy varsin erilaisiin teknologioihin kuten panimoteollisuuteen, biokemialli-10 seen tutkimukseen ja lääketieteelliseen diagnostiikkaan.

Esim. panimoteollisuudessa tärkkelys muutetaan sokeriksi, mm. maltoosiksi, ennen varsinaista fermentointia. Siksi maltoosipitoisuutta tarkkaillaan huolellisesti lähtöaineena käytetyn viljan muuttamiseksi mahdollisimman tarkoin.

15 Monet biokemialliset systeemit tarvitsevat soluenergia- lähteenään glukoosia tarkoin kontrolloituina konsentraati-oina ja tällaisten systeemien tutkiminen edellyttää näiden konsentraatioiden huolellista tarkkailua. Käytännön lääketieteessä suoritetaan paljon sokerianalyysejä määrättyjen 20 sairauksien kuten diabetes mellituksen diagnostisoimiseksi ja hoitamiseksi. Näille sairauksille on ominaista veren ja virtsan epänormaalin suuret glukoosikonsentraatiot.

Sokerianalytiikan historian silmiinpistävimpiä piirteitä lienevät vuosien mittaan tapahtuneet dramaattiset 25 muutokset, jotka liittyvät sekä käytettyyn peruskemiaan että muutosten laajuuteen. Suurin osa tämän analyytikan menetelmistä voidaan määritellä hapettaviksi systeemeiksi. Pelkistyessään nämä käynnistävät reaktiotapahtuman, jonka seurauksena on todettavissa oleva vaste, esim. värinmuutos 30 tai systeemin absorboiman tai heijastaman ultraviolettivalon aallonpituuden muutos. Esim. pelkistävät sokerit 2 77472 muuttavat hopeaoksidin metalliseksi hopeaksi ja tiputtaessa sokeriliuosta hopeaoksidilla kyllästetylle suodatinpaperille kehittyy musta täplä. F.Feigl, Chem. Ind., Voi. 57, s. 1161, London (1938). Vastaavasti o-dinitrobentseeni 5 ja dinitroftaalihapon 3,4- ja 3,5-isomeerit aiheuttavat herkän värireaktion (violetin vivahduksia) kuumennettaessa pelkistävien sokerien kera natriumkarbonaattiliuoksessa. T.Momose et ai., Chem. Pharm. Bull. Tokyo, Voi. 12, s. 14 (1964)} F.Feigl, Spot Tests in Organic Analysis, 7th Edi-10 tion, s. 338-339, Elsevier Pubi. Co., New York (1966).

Mutta jo 1849 tiedettiin, että pelkistävät sokerit saostavat kuparisulfaatin emäksisestä liuoksesta keltaisesta punaiseen vaihtelevaa kupari (I)oksidia (eli oksihyd-raattia). H.Fehling, Ann., Voi. 72 (1849), ks. myös 15 B.Herstein, J.Am.Chem. Soc., Voi. 32, s. 779 (1910). Tämä varhainen virstanpylväs, joka tunnetaan Fehlingin kokeena, oli sysäyksenä paljon herkemmän testin eli ns. Tollensin reagenssin kehittämiselle, jossa käytetään hopeaoksidia ammoniakissa. Tämä reagoi helposti pelkistimien kanssa ja 20 muodostuu metallisen hopean sakka, joka usein muodostaa peilin reaktioastian lasiseinämälle. B.Tollens, Ber., Voi. 14, s. 1950 (1881); Voi. 15, s. 1635, 1828 (1882).

Koska diabetes mellitus on suhteellisen yleinen ja siihen liittyy vakavia kliinisiä seurauksia, sekä biologit 25 että lääkärit ovat olleet erittäin kiinnostuneita löytämään uusia tekniikkoja virtsan ja veren glukoosipitoisuuksien analysoimiseksi. Tämä vilkas mielenkiinto on johtanut useiden uusien menetelmien kehittämiseen, jotka dramaattisesti poikkeavat märkäkemiallisista edeltäjistään.

30 Näissä uusissa menetelmissä käytetään monimutkaisia biokemiallisia systeemejä, jotka voidaan liittää kuiviin "kasta ja lue" välineisiin, käyttää liuos- tai suspensio-tekniikoissa tai spektrometrien ja muiden laitteiden yhteydessä.

Il 3 77472 Näiden uusien tekniikkojen joukossa käsiteltävänä oleva keksintö lukeutuu entsymaattiseksi systeemiksi, jossa analysoitava aine on määrätyn entsyymin substraattina. Muodostuneet reaktiotuotteet pystyvät synnyttämään havait-5 tavissa olevan vasteen indikaattoriyhdisteryhmän kanssa, josta käytetään nimeä "bentsidiinityyppiset indikaattorit". Nämä yhdisteet muuttavat väriään vetyperoksidin ja entsyy-miperoksidaasin läsnäollessa. Tunnettua tekniikkaa kuvaava esimerkki on glukoosi/glukoosioksidaasisysteemi, jossa 10 glukoosi hapetetaan glukonihapoksi ja samalla muodostuu vetyperoksidia seuraavasti: 15 CHjOH CHjOH ίΗ2°Η0Η 20 h/ \Ph glukoosiaksidaasi^ / \_n / Jr® \ hot/

H OH F AD FADH? H OH H OH

V_yl°2 25 tl |1 ^ ~ D - glukoosi O - glukonolaktoni D-glukonihappo

Juuri vetyperoksidin samanaikainen muodostuminen 2q mahdollistaa seuraavat indikaattoriin liittyvät vaiheet, jotka johtavat havaittavan värin muodostumiseen tai muuhun havaittavissa olevaan vasteeseen. Niinpä bentsidiini-tyyppinen indikaattori reagoi vetyperoksidin ja peroksi-daasin läsnäollessa muuttamalla kykyään absorboida valoa.

4 77472 Tällä hetkellä tätä tekniikkaa sovelletaan glukoo-sianalytiikassa "kasta ja lue" reagenssiliuskojen muodossa, jollaisia markkinoi Ames Division of Miles Laboratori- p es, Inc. kauppanimellä Clinistix sekä muut. Ne muodostu-5 vat lähinnä muoviliuskasta ja sen toiseen päähän kiinnitetystä imevästä paperiosasta, joka on kyllästetty asianmukaisilla entsyymeillä, indikaattoriyhdisteellä ja puskureilla päätehoaineina. Niitä käytetään siten, että reagenssia sisältävä pää kastetaan testinäytteeseen, vedetään pois 10 ja paperiin muodostunutta väriä verrataan eri glukoosipi-toisuuksille kalibroituun standardivärikarttaan.

Joskaan ei varmuudella tunneta mekanismia, jonka avulla bentsidiinityyppiset indikaattorit synnyttävät värin vetyperoksidin ja peroksidaasin läsnäollessa, tiede-15 tään syntyvän kaksi peräkkäistä värimuotoa: ensin sininen ja sitten ruskea väri. Koska sininen väri pyrkii muuttumaan vaihtuen lopulta ruskeaksi on välttämätöntä tarkkailla värinmuutosta säädetyn ajan. Muussa tapauksessa värinmuu-tokseen ei voi luottaa,koska terävän, helposti erottuvan 20 sinisävyn tilalle tulee vaikeammin tulkittavissa oleva ruskea sävy. Mitä suurempi testinäytteen sokeripitoisuus on, sitä hankalammaksi tämä ongelma tulee, koska suurien sokeripitoisuuksien alueella havaittavuus on rajoitettu. Siten on helposti ymmärrettävissä, että on erittäin edul-25 lista pitkittää sinisten värisävyjen kestoa, jolloin so-kerikonstraatiot ovat pareimin erotettavissa toisistaan ja havaittavissa olevien konsentraatioalueiden ylärajat kohoavat.

Lisäksi on huomattava, että koska analyyttisiä väli-30 neitä kuten reagenssiliuskoja ei käytetä välittömästi valmistuksen jälkeen, vaan niitä varastoidaan tavallisesti pitkähköjä aikoja ja koska liian pitkä valmistuksen ja käytön välinen aika voi johtaa tehonhukkaan, parempi varastoin-tikestävyys merkitsee selvää etua eli mitä parempi varas-35 tointikestävyys on, sitä luotettavampia ovat analyysitulokset.

Il 77472 5

Esillä oleva keksintö perustuu edellä kuvattuun ent-syymibentsidiinityyppiseen indikaattorisysteemiin. Keksinnön etu tunnettuun systeemiin nähden ilmenee siinä, että se parantaa välivaiheena syntyvän sinivärin pysyvyyttä ja 5 mahdollistaa varastoinnin, so. parantaa varastointikestä-vyyttä.

On myönnetty useita edellä kuvattuun systeemiin liittyviä patentteja. US-patentissa 2 848 308 kuvataan perusentsyymikemiaa, jossa käytetään glukoosioksidaasia, 10 peroksidaasia ja bentsidiinityyppistä indikaattoria rea-genssiliuskassa glukoosin määrittämiseksi virtsasta tai muusta kehon nesteestä. US-patentissa 3 753 863 kuvataan alempi-alkaanipolyolien käyttöä bentsidiinityyppisten in-dikaattoriliuosten stabiloimiseksi.

15 US-patentissa 4 071 317 kuvataan piiloverenvuodon suhteen herkän koostumuksen stabilointia käyttämällä määrättyjä sulfoni-, sulfoksidi- ja amidiyhdisteitä laimenti-mina koostumuksen valmistuksessa. Tämä jälkimmäinen koostumus muodostuu orgaanisesta vetyperoksidiyhdisteestä ja 20 indikaattoriyhdisteestä, joka on esim. bentsidiinityyppiä.

Yhteenvetona tekniikan tasosta suhteessa käsiteltävänä olevaan keksintöön todettakoon, että sokereiden toteamiseksi käytettäviä kemiallisia menetelmiä ryhdyttiin soveltamaan jo 19. vuosisadan kesivaiheilla Fehlingin liu-25 oksen ja Tollensin reagenssin myötä. Useimmat tämän jälkeen tulleet "puhtaasti kemialliset" systeemit on suuressa määrin korvattu biokemiallisilla systeemeillä ja erityisesti sellaisilla, jotka muodostuvat sokerioksidaasis-ta, peroksidaasista ja peroksidille reagoivasta bentsidii-30 nityyppisestä indikaattorista. On väitetty näiden jälkimmäisten indikaattoriyhdisteiden stabiloituvan alempi-al-kyylipolyolien läsnäollessa. Lopuksi on esitetty, että virtsassa esiintyvän piiloverenvuodon suhteen reaktiivinen koostumus voidaan stabiloida, jos se formuloidaan mää-35 rättyjen sulfoni-, sulfoksidi- ja/tai amidiyhdisteiden läsnäollessa.

77472 6

Esillä oleva keksintö koskee koostumusta glukoosin toteamiseksi testinäytteestä, jolloin koostumus sisältää peroksidaasia, glukoosioksidaasia ja väriä synnyttävänä yhdisteenä o-tolidiinia. Koostumukselle on tunnusomaista, 5 että se lisäksi sisältää intensifioimisyhdistettä, jonka kaava on fl s R1R2S-*0, °*“s~>0» R'-C tai R1R2R3N~*° 10 ^ XNR^ di d joissa kaavoissa R1 ja R, tarkoittavat toisistaan riippu-matta alempaa alkyyliä, R? ja R~ tarkoittavat toisistaan riippumatta alempaa alkyyliä tai r“ ja R^ muodostavat yh-15 dessä rikkiatomin kanssa, johon ne ovat liittyneet, tyydyttyneen renkaan, jossa on 3-5 hiiliatomia, R^ ja R^ tarkoittavat toisistaan riippumatta vetyä tai alempaa alkyyliä, joka voi olla substituoitu hydroksilla, R' on vety, amino tai alkyyli- tai alkenyyliryhmä, jossa on 1-20

j j J

20 hiiliatomia, ja R?, R~ ja R^ tarkoittavat toisistaan riip- ^ ^ d d d pumatta alempaa alkyyliä tai R°, R^ ja R3 muodostavat yhdessä typpiatomin kanssa, johon ne ovat liittyneet, pyri-diinirenkaan, joka voi olla substituoitu alemmalla alkyy-lillä, hyroksilla tai halogeenilla.

25 Keksintö koskee myös glukoosin toteamiseksi testi- näytteestä, jolloin testiväline käsittää kantajamatriisin, johon on sisällytetty peroksidaasia, glukoosioksidaasia ja väriä synnyttävänä yhdisteenä o-tolidiinia. Testiväli-neelle on tunnusomaista, että kantajamatrlisiin on lisäk-30 si sisällytetty edellä kuvattua intensifioimisyhdistettä.

Il 7 77 472

Termi "alempi alkyyli" tarkoittaa 1 - n. 6 hiili-atomia sisältävää alkyyliryhmää, esim. metyyliä, etyyliä, propyyliä, isopropyyliä, syklopropyyliä, butyyliä, isobu-tyyliä, tert.-butyyliä, suklobutyyliä, pentyyliä tai hek-5 syyliä tai niiden isomeerejä.

Kuten edellä esitetystä ilmenee, voi koostumuksen intensifioimisyhdisteellä olla neljä perusrakennetta. Näistä yhdisteistä voidaan erityisen sopivina pitää dimetyy-lisulfonia, dimetyylisulfoksidia, pentametyleenisulfoksi-10 dia, formamidia, Ν,Ν-dimetyyliformamidia, asetamidia, Ν,Ν-dimetyyliasetamidia, N,N-di-(β-hydroksietyyli)-asetamidia, kookosdietanoliamidia, mäntyöljydietanoliamidia, talidetanoliamidia, trimetyyliamiinioksidia, pyridiini-1-oksidia, 3-hydroksipyridiini-l-oksidia, 4-metyylipyri-15 diini-l-oksidia ja 2-klooripyridiini-l-oksidia.

"Kookosdietanoliamidilla" tarkoitetaan amidia, jonka muodostavat dietanoliamiini ja rasvahapposeos, joka on saatavissa kauppanimellä Ninol 2012 Extra, valmistaja Stepan Chemical Company of Northfield, Illinois.

20 "Mäntyöljydietanoliamidilla" tarkoitetaan dietanoliamii- nin ja nimellä Ninol 1301 saatavan mäntyöljyn amidia ja "talidietanoliamidilla" tarkoitetaan dietanoliamiinin ja nimellä Ninol 201 saatavan taliöljyn amidia. Molempia kauppanimiä myy Stepan Chemical Company.

25 Glukoosianalyysi voidaan käsiteltävänä olevalla koostumuksella suorittaa monin tavoin. Voidaan käyttää koostumuksen liuosta tai suspensiota vedessä tai muussa sopivassa liuottimessa, jolloin osa testinäytteestä voidaan lisätä liuokseen tai suspensioon. Vaihtoehtoisesti 30 osa koostumuksesta voidaan lisätä määritettävää testi- näytettä sisältävään täpläkoekuppiin.

Keksinnön mukainen testiväline muodostuu tavallisesti pitkänomaisesta muoviliuskasta, jonka toiseen päähän on kiinnitetty koostumusta sisältävä kantajamatriisi- 8 77472 osuus liuskan toisen pään toimiessa kädensijana. Muovi-liuskan tavallinen koko on n. 8 x 0,5 cm kantajamatriisi-osan koon ollessa n. 0,5 x 0,5 cm, joskaan nämä mitat eivät mitenkään ole kriittisiä.

5 Testivälineessä käytetyn kantajamatriisin muoto voi vaihdella. Niinpä US-patentissa 3 846 247 on kuvattu huovan, huokoisten keraamisten liuskojen ja lasikuitukankaan tai -panamakudoksen käyttöä. Lisäksi US-patentissa 3 552 928 on esitetty puutikkujen, kankaan, sienimäisen 10 materiaalin ja saviaineiden käyttöä. Synteettisten muo-viharsojen ja lasikuituhuopien käyttöä kantajamatriisina on ehdotettu GB-patentissa 1 369 139. Toisessa GB-paten-tissa 1 349 623 ehdotetaan käytettäväksi ohuiden filament-tien muodostamaa valoa läpäisevää verkkorakennetta alla 15 olevan paperimatriisin suojana. FR-patentissa 2 170 397 on esitetty polyamidikuitujen käyttöä. Kantajamatriisina pääasiassa käytetty käsiteltävänä olevassa keksinnössä erityisen sopiva materiaali on nestettä imevä paperi, esim. suodatinpaperi. On siis useita mahdollisuuksia va-20 Iita kantajamatrlisiksi asianmukainen materiaali ja matriisin fysikaalinen muoto voi vaihdella.

Testikoostumus ja kantajamatriisi voidaan yhdistää monin keinoin. Eräs tapa on syöttää kantajamatriisimate-riaalin muodostama raina testikoostumusaineosia sisältä-25 vän kyllästyskylvyn läpi siten, että kyllästysliuos kyllästää perusteellisesti matriisin. Sitten kyllästetty matriisi kuivataan esim. ilmakuivausuunissa 50°C:ssa, jolloin saadaan testikoostumuksen ja matriisin yhdistelmä.

Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä.

I! 77472 9

Esimerkit 1-12

Erilaisia intensifioimisyhdisteitä ja niiden vaikutus glukoosille reagoivaan reagenssisysteemiin.

Suoritettiin kokeita glukoosille reagoivalla rea-5 genssisysteemillä, joka muodostui glukoosioksidaasista, peroksidaasista ja o-tolidiinista vedessä. Tämän seoksen määräosiin lisättiin yhtä suuria painomääriä erilaisia intensifioimisyhdisteitä yhden määräosan toimiessa kontrollina.

10 Perusreagenssisysteemi sisälsi seuraavat aineosat: o-tolidiinidihydrokloridia 0,50 g polyvinyylipyrrolidonia (10 paino-% vedessä) 60,0 ml ON 870 polyetoksyloitua rasva-alkoholia (General Aniline & Film Corp.) 0,50 g 15 etanolia(denaturoitu 5 ml:11a metanolia/ 100 ml) 36,0 ml tris-puskuria 47,0 ml + ) _

Seos, jossa on vettä 208,0 ml 20 tris-hydroksimetyyliaminometaania (Fisher Scientific) 22,5 g trinatriumsitraattia 27,2 g glutamiinihappoa 27,0 g sitruunahappoa 6,16 g 25 Gantrez AN-139:ää (maleiinianhydridin ja vinyylieetterin sekapolymeeri, valmistaja G.A.F. Corp.) (10 paino-% vedessä) 15,0 ml askorbiinihappoa(10 paino-% vedessä) 0,5 ml glukoosioksidaasia vedessä (5000 KY/ml, valmistaja Marschall Division of Miles 2q Laboratories, Inc.) 15,0 ml piparjuuriperoksidaasia(68 KY/mg,valmistaja

Miles Laboratories, Inc.) 0,50 ml tislattua vettä 26,5 mg 10 77472

Muodostunut seos jaettiin kahdeksitoista määräosaksi, 19 ml kussakin, ja yhteentoista näistä määräosista lisättiin vastaavasti 0,1 g taulukosta I ilmeneviä määrättyjä intensifioimisyhdisteitä kahdennentoista määräosan 5 toimiessa kontrollina.

Lisättiin täpläkoelevyn erillisiin syvennyksiin 1,0 ml kustakin valmistetusta määräosasta ja intensifioi-misyhdistettä sisältämättömästä kontrollista. Sitten jokaiseen annokseen lisättiin pieni määrä glukoosin vesiliuosta 10 (1,0 paino-% vedessä) siten, että ensin lisättiin luulin annos, merkittiin muistiin mahdollinen värinmuodostus ja sen ilmestymiseen kulunut aika, ja jatkettiin glukoosin lisäämistä siten, että voitiin määrittää tarvittava kokonaismäärä ruskean värin kehittymiseksi täplälevysyvennyk-15 sessä. Glukoosi lisättiin kalibroidulla ruiskulla (Hamilton Series Nro 700, tilavuus lO^ul, luulin määrä lisättiin nopeasti. Sitten ei lisätty glukoosia ennen kuin sinivä-rin muodostumiseen kulunut aika oli merkitty muistiin. Kaikissa tapauksissa glukoosin loppumäärä lisättiin vä-20 hemmässä kuin 60 sekunnissa.

tl 11 77 472 ä +j

3 O

O) O Ή Φ M 3 = = = = = = = = = = tn 3 \

P P

§tn o oooooooom es m oo on r-'criror-'ioinooro ^ ^ es 4J ιβ afl P > P Φ 3 :3 X P :3 3 P g

3 -H -H -H -H

OJ > CO 3 P p P

i 3 -P tn tn 3 •H O -P tn :3 :3 3

P 3 -P :3 g g -P

atJ g 3 6 =0 :θ -P

> — H :θ P P G

P 3 I) 3+J4J-P P

C-PrHtn^-P-P-H 3 •h tn h m p tn ρ p tn 3 λ; tn o -h tn tn p :3 :3 tn tn tn G g S :3 o > >00 tn 3 P rotu o >10 ρ ρ r» r» m > p CP ml il in 3 -rl 3 1 1 1 1 1 1 -P tn O) 3 tn :3 :3 :3 tn tn O Ρ Φ 3 3 P 3 Ρ P 3 3 3 3 33

00 33tT>rHPPPPPP P tT> P

Ό Λ! 3pP3 0i3 0iQiS3 3 3 3 3 0 3 Φ 3 P φ :3 ρ :3 :3 Ρ P -H -H o -h §p mpOPPOiPPOiDjO. Λ P Oi tn tn M tn P -rl

H >i3C:3c::3:3CG3 3 33 O

3 3 Ρ Λί Φ Ρ Φ Ρ Ρ Φ Φ φ φ φφ 3 o tn rH 3 3 33333333 G G G p

M tn 3 Φ P 3 -H -rl -rl -rl -H -H P P -H P -H rH

·* 3 \ >3 33333333 3 33 H

3 rH rH > O O *H *H *H H -H *H Ή ·Η P -rl Ή M

ή a,'— 3Tjvotn333tntntn3 3 3tn 3 3 Ό

Eh rH

Φ •rl φ ·Η I -H 4Η

3 Ό Ρ ) rH xs XS

ρ ρ 3 Ρ I I Ή Ρ 3 g -H O I -η Ρ 3 Ρ :3 —, 3 Ό Ρ -Η 3 I Μ Ο 3 + g Ρ Ρ 3 -rl -rl ο Ζ •H 3 H Ρ 3 3 -rl Ρ 3 -rl Ρ Ρ O 3 Λ! 3 Ρ Ό P O "* 3 P lp O O Ρ Ό Ρ Ρ P >1 Ρ X p MH tp 3 p Ρ Ό p 3 E r-'W ΡΡΡΦΡ >1 P g 3 Ρ + >ι33Φ>ι0ιΡ3 Oi O P CN >1 M tn P O» P >1 P g

Ρ P OP Ρ Ρ P >1 P 3 Oi P O

P p m o φρρρρλ;ρ >1 U

p rH PCS g >1 >1 Φ >1 O P >1 3 O P >1 >1 g >ιΡ Ρ O p P p 3 p pp 'ϋΡΡίυΡΌ'α οόφ 3

φ Ρ 003ΙΦΦΡΦΡ>ιΡΡΡΕ O

P 3 33ΦΖ6§Ρ63Χ!3Λ!3Ρ P

3 O ΡΡΡ^ΡΡΦΙΛίΙ^ΐΛίΡ g H M ggOjZ'O'OP'tfOf’nocNOP Φ Λ

U

3 P 3 a Λ! Φ

P P

Φ CO

g ρ (Nro^rmior^ootn o p <n P P i—I P + 3 w 12 77472

Taulukosta I ilmenevät keksinnön mukaisen koostumuksen yhdentoista formuloinnin ja kontrollin suoritusarvot. Jokainen testattu intensifioimisyhdiste aiheutti selvän parannuksen glukoosin standardimääritysformuloin-5 tiin verrattuna. Niinpä alussa esimerkit 2-12 (käsiteltävänä oleva keksintö) aiheuttivat sinivärin ensimmäisen glukoosimäärän lisäyksen jälkeen jo 0-10 sekunnin kuluttua (poikkeuksena urean vaatima 60 sekuntia, ks. esimerkkiä 4). Lisäainetta sisältämättömässä esimerkissä 1 (kontrolli) 10 siniväri muodostui alussa vasta 60 sekunnin kuluttua. Arvot osoittavat, että intensifioimisyhdisteet parantavat selvästi kontrollisysteemin herkkyyttä pienien glukoosi-konsentraatioiden suhteen.

Taulukosta I ilmenee edelleen maita odottamattoman 15 edullisia tuloksia, o-tolidiinin aiheuttaman ruskean vä rin muodostumiseen liittyvät arvot (oikeanpuoleinen sarake) osoittavat, että tämä indikaattorin aiheuttama ei-toivottu ilmiö voidaan dramaattisella tavalla torjua ennalta lisäämällä intensifioimisyhdistettä. Kontrollin ar-20 vot osoittavat ruskettumisen tapahtuvan suhteellisen pie nen glukoosimäärän lisäyksen jälkeen. Niinpä esimerkissä 1 (kontrolli) tapahtui ruskettumista, kun oli lisätty 20 yul glukoosiliuosta. Esimerkeissä 2-12 tapahtui ruskettumista vasta, kun oli lisätty 30 - 90 yul glukoosi-25 liuosta.

Yhteenvetona esimerkkien 1-12 merkittävyydestä todettakoon, että intensifioimisaineet paransivat nykyistä tekniikan tason glukoosimääritysreagenssia a) nopeuttamalla alussa sinivärin muodostumista, mikä merkitsee pa-30 rempaa herkkyyttä pienille glukoosikonsentraatioille,ja b) hidastamalla ei-toivotun ruskean värin muodostuksen alkamista paljon suurempien glukoosimäärien lisäämiseen saakka. Intensifioimisaineet paransivat kontrolliformu-loinnin vastetta sekä suurien että pienien glukoosikonsent-35 raatioiden suhteen.

11 77472 13

Esimerkit 13-24

Esimerkkien 1-12 koostumuksista valmistettuja testi-välineitä.

Yllä kuvattua kaksitoista määräosaa, jotka muodostuivat esimerkeissä 1-12 kuvatuista liuoksista, käytet-5 tiin testivälineiden valmistuksessa. Yksittäinen väline muodostui Trycite'stä (polystyreenistä) valmistetusta liuskasta, koko n. 8 x 0,5 cm, jonka toiseen päähän oli kiinnitetty neliömäinen, 0,5 x 0,5 cm oleva Faton and Di-keman 204-suodatinpaperipala. Tämä paperikantajamatriisi 10 kiinnitettiin Trycite-liuskaan Double-Stick'illä, joka on kaksipuolinen teippi, valmistaja 3M Company. Näin valmistettu yksittäinen liuskasarja kastettiin esimerkkien 1-12 vastaaviin liuoksiin ja kuivattiin 50°C:ssa ilmakuivaus-uunissa n. 10 minuuttia. Tällä tavoin muodostui yksi kont-15 rollitestivälinesarja (esimerkin 1 reagenssi) ja 11 käsi teltävänä olevan keksinnön testivälinesarjaa (esimerkkien 2-12 reagenssit).

Sitten kutakin reagenssia sisältävää välinesarjaa testattiin kastamalla vastaavasti niiden reagenssipäät 20 vaihtelevia glukoosimääriä sisältäviin testiliuoksiin. Tällä tavoin määritettiin glukoosikonsentraatioiden kynnysarvot, joilla o-tolidiinireagenssin aiheuttamat siniset ja ruskeat värimuodot ilmestyivät. Käytettiin glukoosin vesiliuoksia, joiden glukoospitoisuudet olivat 25 0, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 250, 500, 1000, 2000 ja 5000 mg/dl. Eri testivälinesarjojen suoritusarvot ilmenevät taulukosta II.

14 77472

Π} I

(β \ \ \

MO Cl G G

-g > <u cu cu

G M —' G G G

G) <tJ <Η ·Η Ή Ή

tn eifl G G G

G >ι\ Ή H -H i—I Ή H

O G O' CO Ό CO Ό CO Ό

Ai G g G '— G \ G \ H >i—e tO tji :0 tr «D tr» CO X — >i g ^ ^ ^ ^ >,g — —. >, g —

O G O O -H O O O O -H O O -H O

O <U o ΟΛίοοοοοΛίοοοΛίοο M G X o o cnooooo cnooo tooo

Goto H m QjocNCMincN cd o m m cu o rl rl -h G --- —^in-"

O -G M

I G

G -H M cu

O -G G G

•MG CO -H G -M G G

-g cu o co cu g cu a)

tel G -X G -H GG G

(0 -H -H G -H CO G G CU Ή -H

MG CU <Ö G G CU CU G G G G G

-G -H A (U -H O G G -M -H O) 0) -H

ti tn ri co J4-H-HG co G G co

CU G te G G G -M -H -M

toi -H 10 G G.* -M -H to G G G G

cl > > ce (U G to to I Id-H-M id

00 >1 O G -H -H -H rl CU CO CO CU

X > A G Ή -H *1 * M <Ö rl -rl -H rl •HM -H (0 G Ή CO C0 >1 OjrHH (0 co HJ T -rG> ttJ -H ·Η Cl) Cl) O td :rtj :id «3 H O CO rl o CU ΪΗ > C0MMMM >>> >

H o >1-0 ro G A

X G X I Ή ~ — ^ r- rs ^ -r r, ^ rs O GG&iOCogo ooooo o o o o

H >1 fc (N -H (N H) (N CNCNCNCNCN CO ΓΟ CO CO

^ o a: — -—to g — — — — — — — — — —

rH

G

Id E-·

•H

H T) Ό Ή Ή H to Ό

CO 1¾ H

X o to

H O I M -H

T3 -H I rl O Ό

H G rl I | -H

g -HO I -H rl CO

0) td Ό Ή -H G I X

G g -H rl G -H -H O

•H G M -H CO G -H -H G -H

G M O G A! to -H Ό -H G

to -G MH O O -H Ό -H -H -H

•H X -H Ή Ή G ·Η M Ό ·Η g W rlrlrl<DM>1‘Hg •H >1 G G 0) >iQiM id

O rl CN >1 CO to rl Ol’H^l’H

•H -H O rl +J -H -H >1 -H to Qi ή 4-1 H ro O β) i—| rl 4-> rH ,Χ ·Η >1 •H rl rl (N g >i IM 0) ΪΜ O M >1

CO O ·Η >i >i g >i M O -G

G M rl rl O-G-Gid-GOOd) a) -G O O (tJltUOM d)>irl g

•G G G G CU 2 g g -G £ A X -H

G O -H -H M - -H -H CU III M

H X 2 2 G2rOrO-G t* ro cn -G

•H

Ai

-X

M ro *}· m mi— to m o rl cn ro -o·

CU rH rl rl rl rl rl rl (N (N N (N CM

g

•H

CO

W

II

77472 15

Taulukon II arvot osoittavat selvästi, että käyttämällä kyseisiä intensifioimisaineita saadaan huomattavasti parannettu glukoosille reagoiva testiväline. Esimerkin 13 kontrollitestivälineellä saatiin vaivoin havaitta-5 vissa oleva sininen värisävy kastettaessa liuokseen, jossa oli 20 mg/dl glukoosia ja väri alkoi ruskistua glukoo-simäärän ollessa 1000 mg/dl. Kaikki muut testivälinesar-jat (esimerkit 14 - 24) toimivat paremmin. Esim. lisättäessä formulointiin Ninol 2012 Extraa, 2-klooripyridiini-10 1-oksidia ja tetrametyleenisulfonia (vastaavasti esimerkit 15, 23 ja 20) ruskeaa väriä ei koskaan muodostunut edes glukoosikonsentraatiolla 5000 mg/dl. Lisäksi esimerkkien 14 - 24 testivälineillä alussa muodostuva siniväri oli poikkeuksetta tummempi kuin esimerkissä 13 eli kont-15 rollilla saatu väri. Kaikissa tapauksissa, joissa reagens-siformulointi sisälsi intensifioimisainetta, muodostunut testiväline oli herkempi pienille glukoosikonsentraatioil-le, sen synnyttämä siniväri oli pysyvämpi suurilla glu-koosikonsentraatioilla tai saavutettiin molemmat edut.

Claims (2)

16 77472

1. Koostumus glukoosin toteamiseksi testinäyttees-tä, jolloin koostumus sisältää peroksidaasia, glukoosi- 5 oksidaasia ja väriä synnyttävänä yhdisteenä o-tolidiinia, tunnettu siitä, että se lisäksi sisältää intensi-fioimisyhdistettä, jonka kaava on Rb K1 0

10 RfR§S-?0, 0£-S-*0/ R'-C* tai R^R^R^N^ O ib XNRjR§ K2 joissa kaavoissa R^ ja R2 tarkoittavat toisistaan riippumatta alempaa alkyyliä, Rb ja Rb tarkoittavat toisistaan 15 riippumatta alempaa alkyyliä tai Rb ja Rb muodostavat yhdessä rikkiatomin kanssa, johon ne ovat liittyneet, tyydyttyneen renkaan, jossa on 3-5 hiiliatomia, R^ ja R2 tarkoittavat toisistaan riippumatta vetyä tai alempaa alkyyliä, joka voi olla substituoitu hydroksilla, R' on vety, : 20 amino tai alkyyli- tai alkenyyliryhmä, jossa on 1-20 hii liatomia, ja R^, R2 ja R^ tarkoittavat toisistaan riippu-: : matta alempaa alkyyliä tai R^, R2 ja R3 muodostavat yh dessä tyypiatomin kanssa, johon ne ovat liittyneet, pyri-diinirenkaan, joka voi olla substituoitu alemmalla al-25 kyylillä, hydroksilla tai halogeenilla.

2. Testiväline glukoosin toteamiseksi testinäyt-teestä, jolloin testiväline käsittää kantajamatriisin, johon on sisällytetty peroksidaasia, glukoosioksidaasia ja väriä synnyttävänä yhdisteenä o-tolidiinia, tun- 30. e t t u siitä, että kantajamatriisiin on lisäksi si- säilytetty intensifioimisyhdistettä, jonka kaava on Rb ,1 ^0 RfR2S->0, 0<^S^0, R'-C^ tai R^R^R^N^O R2 \rJr^ 35 11 17 77472 joissa kaavoissa R^ ja R2 tarkoittavat toisistaan riippumatta alempaa alkyyliä, R^ ja R^ tarkoittavat toisistaan riippumatta alempaa alkyyliä tai R^ ja R-, muodostavat yhdessä rikkiatomin kanssa, johon ne ovat liittyneet, 5 tyydyttyneen renkaan, jossa on 3-5 hiiliatomia, R^ ja R2 tarkoittavat toisistaan riippumatta vetyä tai alempaa alkyyliä, joka voi olla substituoitu hydroksilla, R' on vety, amino tai alkyyli- tai alkenyyliryhmä, jossa on 1-20 hiiliatomia, ja R^, R^ ja R3 tarkoittavat toisis-10 taan riippumatta alempaa alkyyliä tai R^, R^ ja R3 muodostavat yhdessä typpiatomin kanssa, johon ne ovat liittyneet, pyridiinirenkaan, joka voi olla substituoitu alemmalla alkyylillä, hydroksilla tai halogeenilla. 18 77472