FI76246B - Foerfarande foer blandning av ett laekemedel i en roekbar tobaksprodukt. - Google Patents

Description

76246

Menetelmä lääkeaineen sekoittamiseksi poltettavaan tupakkatuotteeseen

Keksinnön kohteena on menetelmä lääkeaineen sekoit-5 tamiseksi poltettavaan tupakkatuotteeseen. Tässä menetelmässä tuotteeseen lisätään ulkonaisesti interferonia tai sen biologisesti aktiivisia osasia tai ainetta, joka indusoi interferonin tuotannon ihmiskehossa.

Useissa julkaisuissa kuvataan menetelmiä, joilla 10 savukkeisiin sekoitetaan lääkeaineita yleensä (US-patent-tijulkaisut 977 635, 1 974 242, 2 418 296 ja 4 021 364, DE-hakemusjulkaisut 2 148 485 ja 2 124 574, JP-hakemusjulkaisu 55-79319 sekä julkaisu J.M. Lande, Alien Property Custodian, 10. maaliskuuta 1939), vitamiineja (US-patentti-15 julkaisut 2 198 188, 2 890 973, 3 244 180, 3 339 558 ja 3 667 478) tai sähkövarauksia (US-patenttijulkaisu 3 240 212). Tarkemmin määriteltyjen lääkeaineiden lisäämistä tupakkatuotteisiin on edelleen kuvattu FI-patenttijulkaisussa 31 345 (antihistamiini), GB-patenttijulkaisussa 1 255 007 20 (Ginseng-juuri), FR-patenttijulkaisussa 2 167 382 (anaboliset steroidit) ja US-patenttijulkaisuissa 3 256 889 (poly-peptidit) ja 4 022 224 (orgoteiinit). US-patenttijulkaisujen 3 041 211 ja 3 389 706 mukaan tupakkatuotteisiin lisätään pyraanijohdannaisia tuotteen maustamiseksi (so. tuok-25 sun, maun ja aromien parantamiseksi). GB-patenttijulkaisussa 1 517 547 kuvataan tiettyjä lämmön vaikutuksesta geeliy-tyviä 1,3-glukaanityyppisiä polysakkarideja joko ainoana poltettavana materiaalina tai poltettavan aineen osittain korvaavana materiaalina, jolloin tuotteen poltto-ominaisuuk-30 sien esitetään paranevan. Myös syövänvastaisena aineena tunnetun retinoiinihapon lisääminen tupakkatuotteisiin on tunnettua (EP-hakemusjulkaisu 3 604).

Edellä mainittujen julkaisujen kuvaamien lääkelisäys-ten esitetään olevan sinänsä hyödyllisiä tai tehokkaita 35 neutraloimaan tai vähentämään tupakoitsijoiden sisäänhengit-tämän savun myrkyllisiä vaikutuksia kuten kasvun heikenty- 2 76246 mistä, hengityksen vajavuutta, heinänuhaa, syöpää, emfy-seemaa ja sydänvikoja. Kuvatut menetelmät tarjoavat ilmeisesti keinon tupakansavun vaikutuksesta kuluneiden biologisten yhdisteiden määrän lisäämiseksi. Julkaisuissa ei 5 kuitenkaan esitetä, että näin saataisiin aikaan tehokkaampi lääkitys kuin mikä saavutetaan lääkeaineen erillisellä antamisella.

Ottaen huomioon nämä aikaisemmin saavutetut tulokset on tultu siihen käsitykseen, että merkittävästi parem-10 pia tuloksia voitaisiin saavuttaa käyttämällä lääkeainetta, jonka vaikutus tehostuu tupakan savun vaikutuksesta. Tällainen tehostuminen aikaansaadaan tämän keksinnön mukaisesti yhdistämällä savukkeisiin interferonia tai sen biologisesti aktiivisia osasia tai ainetta, joka indusoi interfe-15 ronin tuotannon ihmiskehossa. On havaittu, että interferonin aktiivisuus paranee poltto-olosuhteiden vaikutuksesta ja se kohdistuu savun vaikutuksesta häiriintyneisiin soluihin .

Interferonia luonnehdittiin aluksi voimakkaaksi vi-20 ruksenvastaiseksi aineeksi (Isaacs ja Lindenmann, Proceedings Royal Society London, Series B. Volume 147, sivut 258-276, 1957) ja sittemmin sillä on havaittu olevan kasvunvas-taisia (syövänvastaisia) vaikutuksia (Paucker et ai., Virology, Volume 17, sivut 324-334, 1962) (selostanut Taylor-25 Papadimitriou julkaisussa Interferon, toimittajana Gresser, Volume 2, sivut 13-46, 1981). Interferoni aktivoi myös kasvain-immuuni- järjestelmän (Trinachieri et ai., Journal of Experimental Medicine, Volume 147 sivut 1299-1305, 1978). Ensin pääteltiin, että interferoni sopivissa pitoisuuksissa 30 voi itse asiassa muuttaa tietyt pahanlaatuiset solut normaa-lisoluiksi prosessilla, jota nimitetään "differentioimisek-si" (erilaistamiseksi) tai solun kypsyttämiseksi (Carter et ai., luovutettu hakemusasiakirja P01CA29545, jätetty heinäkuussa 1980; Gillespie ja Carter, Texas Reports in Biology 35 and Mecine, painossa, 1981). Gillerpie'n ja Carter'in (ibid) esittämä kokeellinen todistusaineisto tukee johtopäätöksiä, 3 7 6 2 4 6 että interferoni pystyy poistamaan syövän sen varhaisvaiheessa, jos kasvainsolut altistetaan interferonille sellaiseksi ajaksi, että kasvainsolut ohjautuvat uudelleen muuttumaan normaaleiksi kypsymällä tai normaalilla kehitysproses-5 silla. Tämä havainto merkitsee todella, että kasvainsolut poistuvat kun ne ilmaantuvat ihmiskehoon, jos on suunniteltu tehokas menetelmä, jolla interferonia sijoitetaan toistuvasti ja tehokkaasti kehon paikkoihin, joista pahanlaatuisten solujen ensimmäiset pienet pesäkkeet ilmaantuvat.

10 Jos tällaiset kasvainpesäkkeet jätetään tarkistamatta, ne tavallisesti leviävät paikallisten rajojen yli johtaen mahdollisesti oireelliseen sairauteen ja kuolemaan. Lisäksi on saatu näyttöä siitä, että keuhkosyövän vaivaamilla yksilöillä on puutos immuunivalvontajärjestelmissään, mikä to-15 dennäköisesti osaksi tai kokonaan on seuraus interferonien riittämättömästä valmistumisesta heidän kehojärjestelmissään (Strayer, Carter, et ai., painossa, 1982).

Tämän keksinnön mukaisesti interferoni yhdistetään tuotteiden kanssa, joiden vahingolliset vaikutukset inter-20 feroni saattaa estää, stabiloituna siten, että sen biologinen aktiivisuus säilyy tuotteen valmistuksen, varastoinnin ja käytön aikana.

Tärkeänä esimerkkinä tämän keksinnön kohteena on inter feroniproteiinin yhdistäminen tupakanpolttoapuneuvojen 25 kanssa, joita yhteisesti nimitetään "savukkeiksi". Tällainen yhdistelmä on synergistinen. Se on synergistinen, koska interferonin vaikutus kasvaa niissä soluissa, joita tupakansavu lämmittää,esim. Heron 1 in ja Berg 1 in keksimä hypo-terminen vaikutus (Nature 274: 508-510, 1978). Tässä työs-30 sä osoitettiin, että niinkin pieni ympäristön lämpötilan nousu kuin 2-3° C voi toimia auttamaan interferonin pienten annosten vaikutusta imukudoskasvainsolujen kasvun estämisessä n. 800 %. Äskettäin Delbruck et ai. (Biomedicine 33: 239-241, 1980) osoittivat interferonin kyvyn tappaa 35 luusarkoomasoluja 100-kertaisen tehostumisen nostamalla lämpötilaa ainoastaan 2°C, 37°C:sta 39°C:seen. Koska sa- 76246 4 vukkeesta tulevan savun lämpötila on 40-50°C (report of the Surgeon General, Department of Health, Education and Welfare, 1979, sivu 14:36), suuontelon, kurkun ja mahdollisesti keuhkon solujen pinnat lämpenevät huomattavasti ja 5 näihin soluihin tuodun interferonin vaikutus tehostuu.

Se on myös tehostunut, koska hydrofobisesti stabiloitu interferoni yhdistyy savun aineosien kanssa, esimerkiksi hydrofobisiin karsinogeeneihin, kuten 3,4-bentsopyreeniin ja osasiin, joilla on tätä syöpää synnyttävää ainetta ja 10 interferoni kohdistuu niin muodoin erityisesti soluihin, jotka ovat häiriintyneet savun karsinogeeneistä, mahdollisiin syöpäsoluihin. Lisäksi, kuten Horoszewic et ai., (Science 206:1091-1093, 1979) ovat osoittaneet, se on tehostunut koska interferoni on ensisijaisesti vuorovaikutuk-15 sessa kasvainsolujen, esim. niiden kanssa, jotka ovat aiheutuneet aikaisemmasta polttamisesta. Lopuksi yhteisvaikutus kasvaa, koska interferonia annetaan samanaikaisesti ja paikallisesti savukesavun kanssa. Voidaan havaita, että interferonimäärä, jonka polttaja saa sisäänsä, on suorassa 20 suhteessa poltettujen savukkeiden määrään, ts. altistukseen syöpää aiheuttaville aineille. Polttaja ei myöskään voi olla muistamatta tätä interferonitäydennystä ennen polttamista, koska interferoni on olennaisena osana polttoväli-neessä. Siten, vaikka on ilmeistä, että interferoni on te-25 hokas parannusaine savukkeenpoltosta aiheutuneelle syövälle annettuna joko peräkkäin tai samanaikaisesti, yhteisvaikutus, joka tässä on keksitty interferonin ja savukkeiden välillä, ei ole ilmeinen ja sopiva keino interferonin sta-biloimiseksi sillä yhdistäminen savukkeiden kanssa ei ole 30 itsestään selvää.

Ilmassa leijuvat ympäristön saastuttajat, savukkeen savu mukaan lukien, voivat lisätä keuhkosyövän ja mahdollisesti muiden syöpien mahdollisuutta, mutta piilevä jakso on pitkä ja tähän asti on ollut mahdotonta pysäyttää tai hävit-35 tää tehokkaasti tuloksena oleva syöpä varhaisessa vaiheessa. Monet ihmissyövät näyttävät olevan seuraus yksilöllä, jolla on kehollinen taipumus (joko peritty tai hankittu) tähän

II

5 76246 sairauteen ja joka toistuvasti altistetaan toiselle tapahtumalle, jota nimitetään ympäristölliseksi laukaisijaksi (ks. katsaus julkaisussa U.S. Department of Research, 1971-1981, 1981). Keksinnön mukaisella menetelmällä val-5 mistetun tupakkatuotteen avulla voidaan parantaa kumpikin keuhkosyövän kehittymiseen liittyvistä tiloista, kun: (1) ulkopuolisesti valmistettua interferonia tuodaan kehon kudoksiin korvaamaan mahdolliset puutokset (joko perinnölliset tai hankitut) sen tuotannossa itse kehossa 10 (palauttaen siten kehon immuunipuolustuksen syöpää vastaan) ja edelleen (2) vahingollisten syöpää synnyttävien aineiden syöpää edistäviä vaikutuksia, jotka monissa tapauksissa voittavat kehon puolustusjärjestelmän, heikennetään ja poistetaan lopuksi varastoidun interferonin ylimää-15 räisillä paikallisesti kohdistetuilla vaikutuksilla, nimittäin sen lisätyllä kyvyllä suoraan muuttaa pahanlaatuinen solu normaaliksi "differentioimis"-prosessin kautta.

Keksinnön tavoitteena on käyttää hyväksi savukkeen polton säännöllistä käytäntöä helpottamaan tämän luonnolli-20 sen kehon aineen, jolla on useita hyödyllisiä vaikutuksia, siirtämällä kehon erikoisosiin.

Interferonin vieminen tupakkatuotteisiin antaa täten uuden keinon kuljettaa interferonia tehokkaasti vaikutukselle altistettuun onteloon, keuhkoihin ja nenän aukkoihin, 25 jolloin aikaansaadaan paikallisesti erilaiset interferoni-vaikutukset, mukaan luettuna interferonin antamat erilaiset suojaukset, joiden tulisi kollektiivisesti poistaa syöpäsolut, kun niitä ilmaantuu pitkitetyn altistusajan jälkeen joukolle erilaisia ilmassa leijuvia ympäristösaasteita mah-30 dollisesti syöpää aiheuttavat aineet mukaan lukien. Siten voidaan vähentää erilaisten syöpien esiintymistiheyttä, erityisesti niiden, joita esiintyy keuhkoissa, kurkussa tai suuontelossa. Keksinnön mukaisesti valmistettua tupakkatuotetta on myös testattu kehon kokonaisvastustuskyvyn lisää-35 misen suhteen muita sairauksia vastaan, kuten niitä, jotka ovat seurauksena vieraan osasmaisen aineen pitkäaikaisesta 6 76246 sisäänhengittämisestä (liittyy emfyseeraan ja kroonisen keuhkoputkentulehduksen kehittymiseen) ja ilmassa leijuvien tarttuvien ihmisvirusten sisäänhengittämisestä (liittyy erilaisiin tarttuviin tauteihin, kuten keuhkokuumee-5 seen, influenssan oireisiin, vilustumisiin jne.). Näiden in vitro-testien tulokset (ks. esimerkit) osoittavat, että tällaisten savuketuotteiden säännöllisestä polttamisesta saattaisi olla seurauksena suuri joukko hyödyllisiä vaikutuksia kehoon, esim. vähentyneet syöpätapaukset, vä-10 hentyneet emfyseema-/krooniset keuhkoputkentulehdustapauk-set sekä myös yleensä parempi terveys kun samanaikaisesti virus- ja tartuntataudit vähenevät. Vähentynyttä alttiutta tietyn tyyppisille verisuonitaudeille, joiden ajateltiin lisääntyvän runsaasti polttavilla, saattaa myös esiintyä, 15 koska interferonin tiedetään vastustavan tiettyjä tekijöitä, jotka myötävaikuttavat verisuonien seinien sulkeutumiseen (tukkeumaan).

Näiden lukuisten hyödyllisten vaikutusten toteuttamiseksi keksintö tarjoaa menetelmän kaiken tyyppisten in-20 terferonien ja kaiken tyyppisten interferonia indusoivien aineiden (aineiden, jotka laukaisevat interferonituotannon kehossa) yhdistämiseksi savukkeisiin.

Ihmisinterferonit ovat luonnossa kuitenkin ryhmä proteiineja ja proteiinien biologinen aktiivisuus on usein 25 epävakaa (tuhoutuu) tietyissä olosuhteissa (esimerkiksi lämpötilan muutokset, muutokset happamessa/alkalisessa ympäristössä, pyörretila ja/tai leikkausvaikutukset Zpyörtei-nen pyöriminen? jne.). Interferonien biologisen aktiivisuuden epävakaisuuden vähentämiseksi on tässä lisäksi esitetty 30 interferonien uusi luokka, joka on palasien (komponenttien tai erikoisten aminohapposekvenssien) valmistaminen joko luonnon tai synteettisistä interferoneista molekyylipysy-vyyden aikaansaamiseksi haluttujen biologisten vaikutusten ylläpitämiseksi monissa erilaisissa ympäristöolosuhteissa. 35 Fragmenttien tai palasten pituus voi tyypillisesti olla n. 10-15 % interferonien normaalisti molekyylipituudesta,

II

7 76246 ollen pituudeltaan yli tai alle 25-45 aminohappoa mieluummin kuin tavallisia likimääräisesti 162 komponentin aminohappoja. Näiden olennaisten aminohappo-osasten (tai sekvenssien) määrittäminen ihmisinterferonien koko pituudes-5 ta tehtiin mahdolliseksi alueiden uudella analyysillä (tietokone apuvälineenä) monista eri interferoneista, jotka ovat säilyneet selkärankaisten evoluution aikana. Haluttujen fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien lisäksi ovat interferonipalaset tai -sekvenssit hyödyllisiä myös 10 kustannussyistä ja tehokkuuden kannalta sikäli, että niiden pieni koko sallii niiden suurmittakaavaisen tuottamisen murto-osalla kokonaisten interferonimolekyylien kustannuksista sekä valikoimalla valmistustapoja, kuten yhdis-telmä-DNA-tekniikalla, kiintofaasisynteesillä jne.

15 Pysyvien, bioaktiivisten interferoniosasten valmis taminen ja testaaminen aiheuttaa kuitenkin viivytyksiä tämän keksinnön toteuttamisessa. Sen vuoksi kehitettiin yksinkertainen ja taloudellinen keino luonnon interferonin stabiloimiseksi rajoittamalla vaihtoehtoisten tilojen luku-20 määrää, jotka molekyyli voi omaksua. Tämä suoritettiin muodostamalla heikot hydrofobiset vuorovaikutukset interferonin ja jonkin toisen aineen, tavallisesti proteiinin välille.

Tämän keksinnön mukaisesti yhdistetään interferoni tupakkatuotteisiin, savukkeet mukaan lukien. Kuvataan tar-25 peelliset ja uudet keinot interferonien stabiloimiseksi käyttämällä "interferoniosasia” ja yhdistämällä interferoni tiettyihin kantimiin - biologisen aktiivisuuden säilyttämiseksi altistettaessa korkeille lämpötiloille, hajottaville kemikaaleille ja pitkitetylle varastoinnille. Jonkin ver-30 ran stabiloitua interferonia yhdistyy savuosasiin ja on siten tähdätty häiriintyneisiin soluihin, antaen tehostetun vaikutuksen interferonin ja savukkeen savun välille, mikä ei ole mahdollista antamalla interferonia erikseen, esim. sumuttimella.

35 Interferonia ja sen stabilointia koskevan tekniikan suhteen viitataan seuraaviin julkaisuihin: 8 76246

Carter, W.A., 1979, Life Sciences 25: 717-728; Gillerpie ja Carter, 1982 a, Handbook of Experimental Pharmacology of Interferon, painossa; Derynk et al., 1980, Nature 285: 542-547; Gillespie ja Carter, 1982 b, Texas Rep.

5 Biol. Med., painossa; Carter, W.A., Handbook of

Experimental Pharmacology on Interferon, painossa, 1982; Strayer, D.R., Carter, W.A., et al., 1982, Abstracts of 13th International Cancer Congress, painossa; Carter, W.A. et al., 1980. Program Grant Proposal P01CA29545 to the 10 National Cancer Institute; Carter, W.A. ja Horoszewicz, J.S., 1980, Pharmacology and Therapeutics 8: 359-377;

Isaacs ja Lindenmann, Proceedings Royal Society London,

Series B Volume 147 s. 258-267 (1957); Paucker et al., Virology Volume 17 s. 324-334 (1962); Taylor Papadimitriou, 15 julkaisussa "Interferon" (Gresser, ed.,) Volume 2 s. 13-46 (1981); Derynk et al., Nature, Volume 285 s. 542-547 (1980); Goeddel et al., Nature, Volume 290 s. 20-26 (1980); Shepard et al., Nature, Volume 294 s. 563-565 (1981).

20 Seuraavassa kuvataan menetelmiä ja yhdistelmiä inter- feroniosasten, joilla on biologinen aktiivisuus ja parantunut pysyvyys, muodostamiseksi ja puhdistamiseksi. Keksinnön mukaisella menetelmällä interferoniosasia tai interferoni (tai interferonia indusoivia aineita) voidaan yhdistää sa-25 vukkeisiin sillä tavalla, että tehdään mahdolliseksi toimittaa parantunut interferoniaktiivisuus soluihin, jotka ovat alttiina savukkeen savulle. Näin saavutetaan joukko haluttuja ja hyödyllisiä tuloksia, kuten: (1) Interferoni ja savukkeen poltto toimivat syner-30 gistisesti mahdollisesti ilmaantuvia syöpäsoluja, tartuttavia hengitysviruksia jne. vastaan. Interferonin biologiset vaikutukset näiden lääkinnällisten vaikutusten synnyttämiseksi lisääntyvät kasvavien lämpötilojen vaikutuksesta tupakan savussa (hyperterminen vaikutus, jonka ovat keksineet 35 Heron ja Berg, Nature 274: 508-510, 1978).

(2) Savukkeen polttajalla esiintyvät syöpää synnyt-

II

9 76246 tävät vaikutukset voidaan voittaa kohdissa, joissa ne tulevat eri ihmiskudoksiin, koska interferoni, joka kulkeutuu otaksuttujen terveydelle vaarallisten aineiden (joko haihtuvan aineen tai osasmaisen aineen) mukana ihmisen 5 kohdesoluihin, stimuloi solut tulemaan normaaleiksi mie luummin kuin jatkamaan pahanlaatuista kehitystään.

(3) Vieraan osasmaisen aineen (alkuainehiiliosasten, jne.) jokainen keuhkoputkea vahingoittava vaikutus vähenee tai poistuu täydellisesti keksinnön osoitetulla kyvyllä li- 10 sätä solujen (makrofagien) tehokkuutta, jotka normaalisti palvelevat keuhkoja puhdistamalla, syömällä ja muulla tavalla tuhoamalla terveydelle vaarallisen vieraan osamaisen aineen keuhkon mikroympäristössä estäen siten tällaisen heikentymisen muodostumisen ja sairaalloisia tauteja, kuten 15 kroonista keuhkoputken tulehdusta, emfyseemaa jne.

(4) Kaikki paikallistetut immunologiset puutokset keuhkossa, joiden katsotaan johtuvan matalista interferoni-tasoista, korjautuvat ja lisäksi voidaan perustellusti olettaa, että immuunisolut (jotka muodostavat osan kehon koko 20 immuunijärjestelmästä) , joiden teho on lisääntynyt niiden kulkiessa keuhkon läpi ja altistuessa lyhytaikaisesti suuremmille interferonimäärille, voivat siten kiertää kehon muihin osiin. Tällä tavalla interferonin, vaikka se on annettu paikallisesti, hyödylliset vaikutukset voivat monin-25 kertaistua ja se voi lopuksi jakautua kehon muihin eri osiin (mitä nimitetään systeemiseksi vaikutukseksi). Tällaisiin etuihin voisi liittyä muita toivottuja systeemisiä vaikutuksia, kuten verihiutaleiden kasvutekijän inaktivoi-minen, komponentin kokonaisprosessissa, joka tukkii valti-30 moita ja verisuonia patologisella prosessilla.

(5) Altistus virusaineille ihmisen koko hengitystiessä (nenä, suu, kurkku, henkitorvi, keuhkot jne.) kohdataan suuresti kasvaneella kudosvastustuskyvyllä, mikä johtuu kautta koko kehon jakautuneiden interferonimolekyylien vi- 35 rusvastaisista vaikutuksista. Aina kun poltetaan keksinnön mukaisesti valmistettua tupakkatuotetta, hengityskudoksilla 10 76246 oleva interferoni, joka on menettänyt biologisen aktiivisuutensa, korvautuu säännöllisesti tuoreilla, aktiivisilla interferonimolekyyIillä.

Keksinnön mukaan interferoni yhdistetään tupakka-5 tuotteisiin, savukkeet mukaan lukien. Interferonit voidaan stabiloida käyttäen "interferonin palasia" ja yhdistämällä interferoni tiettyjen kantimien kanssa - biologisen aktiivisuuden säilyttämiseksi kohdattaessa korkeita lämpötiloja, hajottavia kemikaaleja ja pitkitettyä varastoimista. Jon-10 kin verran stabiloidusta interferonista yhdistyy savuhiuk-kasten kanssa ja kohdistuu siten häiriintyneisiin soluihin antaen tehostuneen vaikutuksen interferonin ja savukkeen savun välille, mikä ei ole mahdollista antamalla interferonia erikseen, esim. sumuttimella.

15 On määritetty, että tietyt suuret väestöryhmät ovat normaalia alttiimpia syövälle ja muille pelätyille taudeille, kuten niille, jotka liittyvät joukkoon erilaisia viruksia. Näiden ryhmien vaara on suurempi, mikä johtuu geneettisistä (synnynnäisistä) puutteista, jotka muodostavat li-20 sääntyneen taipumuksen syöpään. Nämä puutteet ovat erityisen selvät, kun tällaiset väestöryhmät altistetaan ympäristöllisesti tietyille ilmalla leijuville syöpää synnyttäville aineilla tai viruksille. Yksilöillä, joilla on suurempi vaara (suurempi kuin väestöllä yleensä) syövälle tai viruk-25 sille, immuunivalontasolut ovat usein puutteellisia. On määritetty, että tällaisten solujen normaalin lyhyaikaisen kulun aikana keuhkokudosten läpi niiden lyhyt altistus interferonille (joka on aikaisemmin toimitettu ja talletettu käyttämällä keksinnön mukaisesti valmistettuja tupakkatuot-30 teitä) on riittävä korjaamaan puutteellisen solun aktiivisuus ja palauttamaan elinvoimainen syöpää estävä toiminta.

Käsitettä "interferoni" ja "interferonin biologisesti aktiiviset osaset" käytetään erotuksetta käsittämään luonnolliset interferonimolekyylit sekä myös kaikki varian-35 tit polypeptidi- ja hiilihydraattiosien modifikaatioineen, jollaisia syntyy ihmissoluissa ja myös ei-ihmissoluissa, 11 76246 kuten bakteereissa, hiivassa, apinan soluissa jne. Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetään luonnon interferonin ja sen johdannaisia edullisesti stabiloituina siten, että vaihtoehtoisten tilojen lukumäärää, jotka nämä molekyylit 5 voivat omaksua, on rajoitettu esim. kiinnittämällä interferoni tai johdannaiset hydrofobiseen kantimeen.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytettävän interferonin tai sen osasten esikäsittely sisltää seuraavat vaiheet: 10 I. Interferonialueiden tunnistaminen II. Interferoniosasten valmistus, joilla on valikoidut alueet III. Interferonin stabiloiminen kantimilla I. Interferonialueiden tunnistaminen 15 Geenejä, jotka koodaavat interferonia, on kloonattu (esim. Derynk, et ai., Nature, Volume 285, s. 542-547, 1980). Nämä geenit on sekvenssoitu (Goeddel et ai., Nature, Volume 290, s. 20-26, 1980; Derynk, et ai., Nature, Volume 285, s. 542-547, 1980) ja erilaisista interferoneista on 9 pri-20 maarinen rakenne määritetty. Käyttäen tietokoneohjelmia on tässä päätelty alueita, jotka ovat tarpeen interferonijärjestelmän tiettyjä biologisia ominaisuuksia varten (Gillespie ja Carter, Handbook of Experimental Pharmacology of Interferon, painossa) ja valmistettu aineet liikkumattomaksi te-25 kernistä varten savukkeissa.

Interferonin, joka on olennainen, mutta ei välttämättä riittävä biologisten vasteiden, kuten virusvastaisen ja syövänvastaisen vasteen, synnyttämiseksi soluissa, antavat aminohapot 25-40 ja 115-141 (kuvio 1). Koska kaikki interfe-30 ronit synnyttävät sekä virusvastaisia että kasvaimenvastai-sia vasteita, tämän alueen sijainti on päätelty tämän alueen primaarisen aminohapposekvenssin säilymisen perusteella yhdessä interferonilajista toiseen, erityisesti kun tätä säilymistä ei voida selittää mRNA:n (lähetti-RNA) tai proteii-35 nimuodon säilymisellä. Biologinen vastealue voidaan altistaa ulkoiselle ympäristölle (kuvio 2 ja Gillespie ja Carter, 12 7624 6 1982), helpottaen siten vuorovaikutusta muiden soluaine-osien kanssa. Streuli et ai., (Proceedings National Academy of Science, U.S.A., Volume 78, s. 2848-2852, 1981) ehdottivat, että interferonimolekyylin molemmat päät tarvittiin 5 synnyttämään biologinen aktiivisuus isäntäsolujen kirjossa.

Interferonialue, jonka pääteltiin olevan olennainen mutta ei välttämättä riittävä sitoutumista varten spesifisiin solureseptoreihin, käsittää aminohapot 115-141 (Gillespie ja Carter, 1982). Tämän alueen sijainti päätel-10 lään vastaavuudesta kolera-toksiinin (lai, Journal Biol.

Chem. Volume 252, s. 7249-7256, 1977), aineen, joka kilpailee interferonin kanssa sitoutumisesta solureseptoreihin, B-alayksikön alueen kanssa.

Ainakin kaksi interferonipalasta ovat käyttökelpoi-15 siä biologisen valvonnan antamiseksi savukkeelle. Toinen palanen on itse biologinen vastealue, joko puhtaana tai sidottuna toiseen osaan sisäänpääsyn alttiisiin soluihin helpottamiseksi. Toinen pala käsittää biologisen vastealueen, joka on reseptorisitomisalueen vieressä. Interferonin muut 20 palaset, kuten koko polypeptidi ja korvaavat ryhmät sekä lisäykset niihin tai poisjätöt niistä tai kummatkin tai niiden muunnokset voivat myös olla käyttökelpoisia.

Lisäksi keksinnön mukainen menetelmä voidaan toteuttaa jollakin luonnossa esiintyvistä tai synteettisisesti 25 (bakteeri tai hiiva) tuotetuista kokonaisista interferoni-molekyyleistä, joita yleisesti nimitetään alfa- (leukosyyt-tityyppi), beta- (fibroblastityyppi) tai gamma- (immuuni-tyyppi) interferoneiksi. Interferonipalasten etuja ovat: pysyvyys, siirtämisen helppous savukkeesta keuhkoihin (pie-30 mästä molekyylipainosta johtuen), mahdollisesti parempi kudokseen tunkeutuminen ja pieni antigeenisyys.

II. Interferoniosasten valmistus, joilla on valikoidut alueet

Interferoniosasia voidaan valmistaa useilla tavoil-35 la. Valaisutarkoitukseen selostetaan yksi sopiva menetelmä. Muut keinot, kuten luonnon interferonin kemiallinen modifi-

II

76246 13 oiminen tai kloonatun (synteettisen) kokonaisen interferonin, interferonia indusoivien aineiden jne. kemiallinen modifioiminen ovat myös käyttökelpoisia.

Kloonattuja interteronigeenejä voidaan leikata spe-5 sifisistä kohdista spesifisillä restriktioendonukleaaseil-la (kuvio 3). Syntynyt interferonigeeniosanen, joka koodaa pätkää interferonipolypeptidistä, voidaan yhdistää ekspres-sointivektorin kanssa, joka sisältää RNA-polymeraasipromoot-torin, ribosomin sitomiskohdan, aloituskodonin ja mitkä talo hansa muut tarvittavat signaalit. Tämä yhdistelmä-DNA voidaan viedä sopiviin isäntäsoluihin tarkoituksena syntetisoida interferonipalanen.

Erityisesti, 5 ,,ug geeniä ihmisinterferonia Beta varten, kun se "varustettiin polyA.dT-hännällä" ja kloonat-15 tiin pBR322:ssa, inkuboitiin 37°C:ssa kaksi tuntia 50 yksikön kanssa EndoR*Pst 1 20 mM tris:issa, pH 7,4, 10 mM MgC^, 50 mM (NH^^ SO^ 100 mg/ml varten naudan seerumialbumiinia interferonigeenin pilkkomiseksi, jättämään yksisäikeinen pää emäksistä 203-206 (kuvio 3). DNA tehtiin 0,3 M:ksi ka-20 1iumasetaatissa ja säestettiin etanolista. DNA liuotettiin 100 ml jaan 50 mM kaliumfosfaattia, pH 7,4, 6,7 mM MgCl2, 1 mM merkaptoetanolia, 35 mM deoksiadenosiinia ja deoksisy-tidiiniä ja 25 yksikköä Escherichia coli DNA-polymeraasin Klenow-osasen päätä. DNA tehtiin 0,3 mM:ksi kaliumasetaatissa 25 ja saostettiin etanolista. Sakka liuotettiin 100 ml:aan 30 mM natriumasetaattia, pH 4,6, 50 mM NaCl, 1 mM ZnSO^, 5 % glyserolia ja 25 yksikköä Sl-nukleaasia ja inkuboitiin 37°C:ssa yksi tunti. Tämä antoi interferonigeeniosasen, jolla oli tylppä pää, täydellinen nukleotidiin 204 asti, ensimmäinen 30 perustui koodisanaan leusiinille asemassa 45 (kuviot 1 ja 3). Natriumasetaattia lisättiin 0,3 M:ksi ja DNA saostettiin etanolista.

Erikseen inkuboitiin 5 ^,ug geeniä ihmisinterferonil-le Beta (joka oli varustettu polydA-dT-hännällä ja kloonat-35 tu pBR322:ssa) 37°C:ssa kaksi tuntia 50 yksikön kanssa

Endo R MboII 10 mM tris:issa, pH 7,9, 6 mM KC1, 10 mM MgCl^, 14 76246 1 mM ditiotreitoli ja 100 mg/ml naudan seerumialbumiinia.

DNA saostettiin etanolista ja käsiteltiin Sl-nukleaasilla, kuten edellä selostettiin. 288 emäsparin, tylppäpäinen osanen/ joka sisälsi interferonigeenin nukleotidit 401-688, 5 puhdistettiin sähköforeesilla 3-%:isen agaroosin läpi.

0,25 mg:n tasaosa tästä osasesta yhdistettiin 5 ^,ug:n kanssa Pst 1 - käsitelty, DNA-polymeraasi - käsitelty Sl-nuk-leaasi - käsitelty DNA.

Sakka, joka koostui kahdesta DNA-osasesta, liuotet-10 tiin 10 ml:aan 10 mM tris, pH 8,0, joka sisälsi 10 yksikköä bakteeri-alkalifosfaattia ja inkuboitiin 37°C:ssa kaksi tuntia. Liuos laimennettiin sitten 100 ml:ksi 2,3 M natrium-asetaatilla, pidettiin 65°:ssa 30 minuuttia, uutettiin kerran CHCl^tlla ja saostettiin sitten etanolista. Sakka liuo-15 tettiin 10 ml:aan 70 mM tris, pH 7,5, 100 mM KC1, 10 mM

MgC^, 5 mM ditiotreitolia, 300 mM riboadenosiini-trifos-faattia ja yksi yksikkö polynukleotidi-kinaasia ja 10 yksikköä T4 DNA-ligaasia ja inkuboitiin 37°:ssa kaksi tuntia.

Näin muodostettu yhdistelmä-DNA sisälsi interferoni-20 geenin, josta puuttuivat nukleotidit 205-400 ja joka koodaa interferonipolypeptidiä, josta puuttuvat aminohapot 46-111.

Seuraavissa esimerkeissä tätä ainetta nimitetään "interferonifragmenttipolypeptidiksi".

Tämä yhdistelmäinterferonifragnentti voidaan liittää 25 moniin sopiviin vektoreihin ekspressoimista varten bakteeri-tai nisäkässoluissa käyttäen tavanomaisia menetelmiä. Interferoni tai interferonin palaset voidaan puhdistaa stan-darditekniikalla, vaikka keksintö voidaan toteuttaa interferoneilla, joiden puhtaus on alle 1 %, edellyttäen, että 30 läsnä ei ole muutoin haitallisia aineita. Esimerkiksi proteiinit liuoksissa, jotka sisältävät interferonia, sidotaan Cibachrom blue -sepharoseen etyleeni- tai propyleeniglykolin poissa ollessa. Pylväs pestään valikoimalla liuoksia, jotka poistavat useimmat proteiinit interferonia lukuun ottamatta 35 ja interferoni eluoidaan liuoksilla, jotka sisältävät etyleeni- tai propyleeniglykolia tai muita sopivia eluoimisai- I! 15 76246 neita (Carter et al., Pharmacology and Therapeutics, Volume 8, s. 359-377, 1980). Jos halutaan, voidaan Cibachrom blue -fraktioiden tai muun aineksen enempi puhdistaminen suorittaa viemällä interferonia sisältäviä liuoksia pylväsmatrii-5 sien läpi, jotka sisältävät anti-interferoni-vasta-aineita, käyttäen tavanomaisia olosuhteita sitomista ja eluointia varten.

Edellä selostettu yhdistelmä-DNA voidaan valmistaa käyttäen joitakin tai kaikkia samoja entsyymejä samanlai-10 sissa olosuhteissa tai erilaisissa sarjoissa käyttäen edellä esitettyjen entsyymien tai interferonigeenien muunnoksia.

Muita sopivia yhdistelmä-DNA’itä voidaan muodostaa käyttäen muita entsyymejä ja muita muistiinpanoja. Lopuksi yhdistel- ^ mä-DNA:n käyttö interferoniosasten saamiseksi on pelkäs-15 tään kuvaava keinosta interferoniosasen kehittämiseksi.

Samanarvoisesti voidaan käyttää muita keinoja, kuten synteesiä kiinteässä tilassa, koskemattoman aineksen proteolyyt-tistä pilkontaa tai geneettisesti kloonattua interferonia, joka on valmistettu bakteereissa ja hiivassa.

20 III. Interferonin stabilointi kantimilla

Interferoni, samoin kuin muut proteiinit, on suhteellisen epävakaa kemikaali. Sen liukoisuus vesipitoisiin liuoksiin ja biologinen aktiivisuus (ks. kuviot 1 ja 2) riippuvat sen eri lineaarisesti järjestäytyneiden aminohappojen hyvin 25 spesifisestä kolmiulotteisesta suuntautumisesta. Erityisesti interferonimolekyylin alueiden, jotka vastaavat sitoutumisesta soluihin ja monimutkaisten biologisten vasteiden synnyttämisestä, täytyy olla oikein altistetut ja järjestäytyneet. Kuitenkin suuri joukko vaihtoehtoisia ei-funktionaa-30 lisiä suuntauksia on myös mahdollinen ja voi vapaasti muodostua. Näitä vaihtoehtoisia tiloja edistävät lämpö, tietyt ulkopuoliset kemikaalit ja pitkitetty varastointi.

Eräs ratkaisu inaktiivisten vaihtoehtoisten tilojen muodostumisen estämiseksi on rakentaa interferonimolekyyle-35 jä, joilla on rajoitettu lukumäärä vaihtoehtoisia tiloja, ts. osassa II kuvattuja interferoniosasia. Toinen ratkai- 1Ä 7624 6

1 O

su on rajoittaa vaihtoehtoisten tilojen muodostumista tekemällä interferoni liikkumattomaksi kanninmolekyylillä tai -rakenteella.

Aktiivisia entsyymejä löytyy usein kompleksirakentei-5 den osana, liittyneinä solumembraaneihin, nukleiinihappoihin, proteiineihin jne., ja entsyymit ovat tavallisesti pysyvämpiä kompleksoidussa tilassa. Tällaisen yrityksen toteutettavuuden arvioimiseksi rakennettiin useita pylväsmatriise-ja, jotka sisälsivät erilaisia ligandeja, jotka voisivat olio la tehokkaita stabiloimisaineita (ks. kuvio 2, Carter, W.A., ja Horoszewicz, J.S., 1980, Pharmac. Ther. 8:359-377). Pylväälle oli ominaista, että siihen oli liitetty albumiinia. Otettiin dialysoimaton interferonivalmiste, 100 ml, joka sisälsi 11 500 yksikköä ja 0,99 mg proteiinia/ml ja levi- 15 tettiin se pylvääseen peristaltiikkapumpun avulla virtaus- 2 nopeudella 60 ml/cm /h. Albumiinipylväs tasapainotettiin 0,02 M natriumfosfaatilla (pH 7,4), joka sisälsi 0,14 M NaCl. Pylväästä tuleva eluentti jaettiin virtauksenjakolait-teella suhteessa 1:9. Eluentin 10 %:n annos koottiin 20 1 ml:aan 1-%:ista naudan seerumialbumiiniliuosta, joka si sälsi 0,02 M natriumfosfaattia ja 0,15 M NaCl ja käytettiin interferoniaktiivisuuden määrittämiseen. 90 %:n annos elu-entista käytettiin proteiinipitoisuuden mittaamiseen. Läpimurtojakeet sisälsivät n. 98 % levitetystä proteiinista 25 ja vähemmän kuin 1 %:n levitetystä interferoniaktiivisuu-desta. Pylvään lisäeluointi tehtiin 50-%:isella (tilav./ tilav.) etyleeniglykolilla ja 50-%:isella 0,04 M fosfaatilla, (pH 7,4) ja 0,30 M NaCl:lla. Loput (86 %) interferoni-aktiivisuudesta otettiin talteen hyvin pienen määrän (alle 30 2 %:n) kanssa alkuperäistä proteiinia. Joitakin näistä ko keiluista julkaistiin äskettäin (Carter, W.A., 1982,

Methods in Enzymology 78:576-582, 1981).

Edellä esitetty koe osoitti, että interferoni voitiin kytkeä seerumialbumiiniin samalla kun usempia muita 35 soluproteiineja ei voitu kytkeä. Kokeet muilla liikkumattomiksi tehdyillä proteiineilla, kuten cytochrome C:lla, osoittivat, että interferonilla on yleinen ominaisuus yh- li 17 76246 distyä proteiinien kanssa. Oli otaksuttu, että interferonin voimakkaasti hydrofobinen luonne pakottaa vuorovaikutuksiin muiden proteiinien tavanomaisesti sekvestrattujen hydrofobisten taskujen kanssa ja tämä koe johdatti mieleen 5 tämän hypoteesin tarkkuuden. Olipa mekanismi mikä tahansa, edellä esitetty koe rohkaisi kompleksien kehittämistä proteiinien kanssa interferonin stabiloimiseksi.

Tässä yhteydessä kehitetty menetelmä tätä tarkoitusta varten on seuraava: ihmisinterferonia voidaan valmistaa 10 jollakin tavanomaisella tavalla jostakin biologisesta lähteestä - ihmissoluista, yhdistelmämikro-organismeista jne. Puhdistamisen jälkeen voidaan lisätä ihmisen seerumialbu-miinia tai muuta proteiinipitoista kanninta ylimäärin, tavallisesti 3 mg/ml. Liuos voidaan dialysoida fosfaatil-15 la puskuroitua suolaliuosta tai jotakin muuta sopivaa puskuria vastaan, sittenaines voidaan pakastekuivata. Eräässä tyypillisessä esimerkissä pakastekuivattiin 1 miljoona yksikköä puhdistettua interferonia 3,46 mg:n kanssa natriumfosfaat-tia. Tällaisen valmisteen pysyvyys on esitetty esimerkis-20 sä 5.

Tämän menettelytavan erilaiset muunnokset ovat hyväksyttäviä tällä nopeasti muuttuvalla alueella. Myös muut kanninproteiinit kuin albumiini tai cytochrome C ovat hyväksyttäviä. Myös muut kanninmolekyylit tai -rakenteet ovat 25 hyväksyttäviä, kuten lipidit, pienet hydrofobiset ligandit, membraanifragmentit tai jopa kiinteät osaset. Muut liittämismenetelmät, kuten ioni- tai kovalenttiset sidokset ovat sopivia niin kauan kuin tulos on stabiloida interferoniak-tiivisuus samalla vielä sallien sen yhdistäminen savukkei-30 siin. Muut suolat tai puskurit tai muut suolan tai puskurin väkevyydet (suolan tai puskurin puuttuminen mukana lukien) ovat hyväksyttäviä; näissä parametreissä variantteja ei ole tutkittu. Joissakin tapauksisas dialyysi voi olla tarpeeton .

35 Interferoniosasten lisääminen tupakkatuotteisiin

Seuraavassa osassa "interferoni" edustaa kokonaista interferonia ja "interferoniosasia", kuten aikaisemmin mää- 18 76246 riteltiin ja kääntäen, käsite "interferoniosaset", kuten sitä tässä osassa käytetään, on tarkoitettu käsittämään kokonaisia molekyylejä.

Interferonin kaikkia tunnettuja ihmisessä esiinty-5 viä tyyppejä valmistettiin keksijän laboratorioissa hyväksytyillä standardimenetelmillä (ks. luonnon fibroblasti-Z>eta7 interferonille, Carter ja Horoszewicz, Pharmacology and Therapeutics, Volume 8, s. 359-377, 1980; luonnon leukosyytti- /älfa7 interferonille, Mogensen ja Cantell, Phar-10 macology and Therapeutics, Volume I, s. 369-381, 1977; luonnon immuuni- /]gamma7 interferonille, Mizarhi, O'Malley, Carter, et ai., Journal oc Biological Chemistry, Volume 23, s. 7615, 1978).

Interferonimolekyylit täytyy lisätä tupakkatuottei-15 siin tavalla, joka säilyttää interferonin biologisen aktiivisuuden ja sallii interferonin siirtymisen suuontelon läpi ja keuhkoihin sisäänhengitetyn tupakansavun mukana. Yh-distämismenetelmän yksityiskohtien täytyy maksimoida halutun biologisen aktiivisuuden mahdollisuus, esim. kasvain-20 vastaiset, immunologiset ja virusvastaiset vaikutukset, huulilla, suuontelossa ja keuhkoissa.

Monet menetelmät interferonin osasten lisäämiseksi tupakkatuotteisiin täyttävät nämä kriteerit. Eräs tyypillinen esimerkki annetaan seuraavassa, mutta sitä ei millään 25 tavalla tule pitää menetelmän ainoana sopivana muotona.

Interferonin osasia ja kokonaisia molekyylejä valmistettiin kuten esimerkeissä on osoitettu edellä kappaleissa II ja III tai muutoin ja lyofiloitu hienoksi, kuivaksi jauheeksi käyttäen tavanomaisia menetelmiä ja lait-30 teistoa. Interferoni, jonka puhtaus on 0,01 - 100 % on sopiva. Tavallisesti on seosta, jossa on yksi osa interferonia ja 99 osaa ihmisalbumiinia, fraktio V, lyofiloitu yhdessä antamaan osasia, joilla on haluttu kuohkeus ja kon-sistenssi ilman ei-toivottuja biologisia vaikutuksia. Muut 35 seokset ovat mahdollisia ja katsotaan samanarvoisiksi, kuten interferonin yhdistäminen kantimien, kuten selluloosa-

II

19 76246 osasten ja tavallisten suolojen jne. kanssa, niin kauan kuin edellä mainitut tunnuspiirteet (konsistenssi, teho ja sivuvaikutusten puuttuminen) ovat yhtäpitäviä lopputuotteen tavoitteiden kanssa. Interferonia sisältävä jauhe voi-5 daan puhaltaa ennalta valmistetun savukkeen suodatinpäähän käyttäen lyhytaikaisia ilmapuhalluksia, jotka siirtävät ennalta määrätyn määrän interferonijauhetta matkan, joka ei olennaisesti ylitä etäisyyttä suodattimeen plus itse suodattimen pituutta (kuvio 4). Interferoniosaset sekoittuvat löy-10 hästi ja upottuvat suodattimiin, jotka on tehty selluloosa-asetaatista, aineesta, joka ei muulla tavalla pidätä osasia vahvoin sidoksin. Menetelmä ei kuitenkaan rajoitu selluloo-sa-asetaatti-suodattimilla varustettuihin savukkeisiin, vaan on suoraan sopiva mille tahansa suodattimille, jotka eivät 15 kemiallisesti vedä puoleensa interferonia pysyvällä tavalla ja joita voidaan modifioida lisäämällä selluloosa-asetaattia tai jotakin muuta esisuodatinta käsittämään savukkeet, jotka sisältävät jonkin toisenlaisen suodattimen. Menetelmä voidaan sopeuttaa suodattimettomille savukkeille, sikareil-20 le, piipuille ja muille polttovälineille sisällyttämällä laitteen savuvirtaan matriisi, kuten selluloosasta, selluloosa-asetaatista jne., sekoitettuna interferoniosas-ten kanssa. Itse polttamistapahtuma edustaa suunnan muutosta ilmavirralle, jota käytettiin interferonipalasten yhdistämä-25 seen savukkeeseen ja vetää interferoniosaset savuun vieden interferonin soluihin, jotka ovat alttiina savukkeen savulle.

Esimerkinomaisesti on kuviossa 4 esitetty laite interf eroniosasten yhdistämiseksi savukesuodattimiin tai esi-30 suodattimiin. Puhallusilmaa syötetään tavanomaisella ilma-lähteellä - kompressorilla, ahdinpyörämoottorilla, turpiinin ohjauspyörällä jne. Ilmaa johdetaan pitkin putkea ja se virtaa interferonia jakavan laitteen, esimerkiksi kammion ohi, jota sekoitetaan tai käsitellään muulla tavalla tai 35 joka on suunniteltu pitämään ilmassa leijuvien interferoni-osasten tasainen tiheys ja joka jakaa tunnetun määrän si- 20 76246 säilöstään putkeen. Kuviossa 4 on kuvattu mäntälaite, mutta mikä tahansa laite on sopiva niin kauan kuin se pystyy toimittamaan sopivat määrät interferonihiukkasia putkeen. Ennalta määrätty tilavuusmäärä ilmassa leijuvia osasia tuo-5 daan putkeen juuri ennen ilmavirran kehittämistä. Ilmapu-halluksen aikana interferoniosaset kulkeutuvat määrätylle etäisyydelle savukkeeseen, joka oli valmistettu tavanomaisin menetelmin. Ilman puhallus lopetetaan ja interferoniosaset asettuvat suodatusainekselle. Putki siirretään sit-10 ten seuraavaan savukkeeseen (tai savukkeita siirretään) ja prosessi toistetaan. Edellä esitetty menetelmä esitettiin yksityiskohtaisesti ainoastaan esimerkkinä. Muut keinot ovat mahdollisia interferoniosasten, jotka on valmistettu lyofiloimalla, yhdistämiseksisuodattimiin, kuten kerrosta-15 maila interferoniosaset suodattimelle painovoiman avulla, ruiskuttamalla, pölyttämällä tai muulla tavalla osasen liikkeen aikaansaamiseksi tai sähkövetovoimalla, magneettisella vetovoimalla tai muilla päällystys- tai verhousmenetel-millä. Nämä ja muut vaihtoehtoiset menetelmät ovat käyttö-20 kelpoisia keksinnön toteutusmuotoja. Lisäksi interferoni- osasia voidaan yhdistää suodattimiin suodattimen valmistuksen jossakin vaiheessa, edellyttäen, että ei käytetä mitään jälkeentulevaa vaihetta, johon liittyy suodattimen sisuksen kuumentaminen yli 850°C:seen (lämpötila, joka vaaditaan 25 tuhoamaan peptidisidos). Interferoni voidaan yhidstää tupakkaan suodattimeen yhdistämisen asemesta tai voidaan yhdistää esisuodattimeen, joka myöhemmin kiinnitetään savukkeeseen. Interferoni voidaan tallettaa nestemäisenä liuoksena tai puolikiinteänä tai kolloidina jne. suodatusaineksel-30 le, tupakalle tai esisuodattimelle samanlaisin tuloksin, vaikka siirron tehokkuus on paljon pienempi. Kaikki näistä muunnoksista ja tulevat mukauttamiset tältä muutosalueelta katsotaan osaksi keksintöä.

Interferonia indusoivien aineiden/aktivaattorien 35 lisääminen tupakkatuotteisiin

Synteettisiä kemikaaleja, jotka stimuloivat kehon i; 21 76246 omia interferonivarastoja, nimitetään tavallisesti interferonia indusoiviksi aineiksi tai interferonia indusoiviksi /aktivoiviksi aineiksi (ks. katsaus julkaisussa "Selective Inhibitors of Viral Functions", toimittanut VJ.A. Carter, 5 Chemical Rubber Company, 1973). Tällaiset indusoivat aineet koostuvat kemiallisesti sekalaisista luokista yhdisteitä käsittäen kaksirihmaisen RNA:n (ribonukleiinihapon) tai erilaisia pienmolekyylipainoisia kemikaaleja, kuten polyanio-neja, pyraani-kopolymeerejä jne. (ks. myös "Interferon", 10 toimittanut I. Gresser, 1981). Tämä keksintö voidaan toteuttaa jollakin edellä esitetyistä kemikaalien ja/tai biokemiallisten aineiden erilaisista ryhmistä, edellyttäen, että ne siirtyvät yhtäpitävästi savukkeesta ja jatkavat tehonsta osoittamista laskeuduttuaan hengitystiloihin ja pysyvät va-15 paina ei-toivotuista sivuvaikutuksista.

Niiden tehokkuuden osoittamiseksi levitettiin kahta indusoivaa ainetta, poly I*C ja Ampligen (vakiinnuttamaton tavaramerkki indusoivalle aineelle, joka koostuu epäsovite-tuista RNA-kierukoista), laskettiin lyofilisoidussa muodossa 20 savukesuodattimille pirskottamalla jauhetta kevyesti savukkeen suodatinpäälle. Kuviossa 4 esitettyä esimerkkilaitetta voidaan myös käyttää indusoivilla osasilla tai jonkin yhdistelmän valmistamiseksi indusoivan aineen osasista ja inter-feroniosasista. Näiden kahden aineen yhdistelmä, eri tes-25 teissä, jotka suoritettiin kehon ulkopuolella, antoivat tavallisesti tulokseksi korostuneempia tai tehostuneempia haluttuja biologisia vaikutuksia.

Esimerkkejä Esimerkkien tausta 30 Ihmisen keuhko ja sitä ympäröivät kudokset on moni mutkainen elin, joka koostuu monista erityyppisistä soluista, jotka reagoivat ulkopuolisten ympäristöllisten aineiden hyökkäyksille välttämättömän kaasujen vaihtoprosessin aikana (happea vastaanotetaan poistetun hiilidioksidin tilalle). 35 Keksinnön hyödyllisten tulosten arvioimiseksi on valittu hengityspuolustusjärjestelmän komponenttien tutkiminen kehon 22 76246 ulkopuolella käyttämällä erilaisia eläviä ihmissoluja, joita pidetään kehon ulkopuolella pienissä kudosviljelyastioissa, petrimaljoissa tai syvennyksissä. Tällaisissa maljoissa tai muissa laitteissa ihmisen solukasvua varten savua voidaan 5 puhaltaa eläville soluille tavalla, joka jäljittelee joitakin vuorovaikutustyypeistä, joita tapahtuu ihmiskehossa.

Esimerkki 1

Vapaaehtoinen ihminen hengitti sisään savua jokaisesta ryhmästä suodattimena (selluloosa-asetaatti) varustettuja salt) vukkeita, joihin oli aikaisemmin lyofiloidussa muodossa levitetty 100 000 kansainvälistä vertailuyksikköä (International Reference Units, IRUs) vastaava määrä joko luonnon fibroblasti-(beta) interferonia (savuke A) tai 100 000 000 IRUs luonnon beta-interferonifragmenttipeptidiä, kuten osas-15 sa II selostettiin (savuke B) tai 10 mikrogrammaa epäsovi-tettua RNA-interferonia indusoivaa ainetta (ks. Carter et ai. Journal of Molecular Biology, Volume 70, sivu 567, 1972) (savuke C). Tarkalleen imettyään savun, joka oli kulkenut suodattimien läpi, jotka oli kyllästetty lyofiloiduilla in-20 terferonikomponenteilla, vapaaehtoinen puhalsi suuontelonsa ja nenänsä kautta savun suoraan avoimelle petrimaljalle, joka sisälsi normaaleja eläviä ihmisen fibroblastisoluja, joita oli pidetty seerumilla täydennetyssä väliaineessa RPMI 1640. Petrimaljat palautettiin sitten hiilidioksidia (5 %) 25 ja nestemäistä väliainetta sisältävään ympäristöön 12 lisätunniksi antamaan aikaa interferonin vaikutuksen vaikuttaa, minkä jälkeen interferonin virusvastainen aktiivisuus fibroblasisoluissa määritettiin viruksen aiheuttaman syto-paattisen vaikutuksen standardiestomäärityksellä; ks.

30 Armstrong, J.A., Applied Microbiology, Volume 21, s. 723-725, 1979. Rakkulainen stomatitis-virus on haastajavirus. Kaikissa maljoissa, jotka olivat saaneet savua, joka jäljestäpäin kulki interferonilla kyllästetyn suodattimen läpi ja siitä vapaaehtoisen polttajan suuontelon kautta, havaittiin 35 vahvaa näyttöä virusvastaisesta tilasta pysyvissä fibro-blasti-soluissa. Samanlaisessa kokeessa, jossa käytettiin li 23 7624 6 vertailusavuketta, josta puuttui interferonilla käsitelty suodatin, ei virusvastaisia vaikutuksia ollut havaittavissa, mikä osoittaa, että savukkeen savu sinänsä ei anna suojaa ihmiskudoksille haastajaviruksia vastaan.

5 Esimerkki 2

Vapaaehtoinen toisti edellä selostetun menettelyn samalla tavalla valmistetuilla savukkeilla A, B, C ja D, jotka sisälsivät 100 000 IRUs luonnollista ihmisen immuuni-interferonia (gamma), joka oli valmistettu, kuten aikaisem-10 min selostettiin (Mizrahi et ai., ibid, 1978). Gamma-interferoni sisälsi 100 000 IRUs mg:aa kohti proteiinia, sen arvioidun puhtauden ollessa siten n. 1 %. Tässä tapauksessa savu ohjattiin suoraan syvennyksiin, jotka sisälsivät ihmisen immuuni-systeemin luonnollisia tappajasoluja (NK-soluja) , jotka oli eris-15 tetty standardimenetelmin, joissa käytettiin Ficoll-Hypaque-gradientteja käyttäen soluja terveiden ihmiskohteiden verestä (ks. Zarling, Carter, et ai., Journal of Immunology, Volume 123, sivut 63-70, 1979 ja ibid, Volume 124, s. 1852-1857, 1981). Petrimaljoja inkuboitiin sitten uudelleen kah-20 deksan tuntia, minkä jälkeen NK-solut eristettiin uudelleen standardimenetelmin ja testattiin kyvyn suhteen tappaa ihmisen kasvainkohdesoluja K562 (edellä esitetyt kirjallisuusviitteet; ks. myös Marx, Science, Volume 210, s. 624-626, 1981). NK-solujen tappamiskyky eli yhtäpitävästi lisäänty-25 nyt n. 30-100 %:lla seurauksena altistamisesta savukkeiden A, B, C ja D savulle. Vertailusavukkeiden savu ei osoittanut lisääntyneitä kykyjä, mikä osoittaa, että vaikutus ei ollut ei-spesifinen vaikutus, vaan oli todella peräisin interferonia sisältävistä komponenteista ja interferonia in-30 dusoivista aineista, jotka oli tarkoituksellisesti lisätty savukkeisiin.

Esimerkki 3

Vapaaehtoinen toisti edellä esitetyn kokeen käyttäen nyt erilaisia kohdesoluja ja laajennettua valikoimaa käsi-35 teltyjä savukkeita. Tässä tapauksessa kohdesolut käsittivät ihmisen makrofageja (määritettynä niiden tarttuvuudella muo- 7624 6 viseen petrimaljaan), jotka olivat peräisin soluista, jotka kiertävät normaalien yksilöiden veressä (Zarling, ibid; ks. myös Schultz ja Chirigos, Cancer Research, Volume 38, s. 1003-1007, 1978). Tässä tapauksessa NK-solut, jotka eivät 5 tarttuneet pintoihin, hylättiin ensin ja makrofagit, jotka jäivät jäljelle, voitiin pitää elävässä tilassa väliaineessa RPMI 1640, joka oli täydennetty naudan sikiöseerumilla. Laajennettu valikoima interferonisavukkeita käsitti edellä mainitut (savukkeet A, B, C ja D) sekä savukkeet E, jotka 10 sisälsivät 100 000 IRUs lyofiloitua synteettistä (bakteereilla tuotettua) ihmisen leukosyytti-interferonia, joka on nimetty klooniksi (ks. myös Goeddel, D.V. et ai., Nature, Volume 290 s. 20-26, 1981). Makrofagi-aktivaattori mitattiin rautaosasten laajenemisella 12 tuntia savulle altistamisen 15 jälkeen. Väliaikana soluja pidettiin kosteutetussa, 5 % CO,, O ^ sisältävässä kammiossa 37 C:ssa. Kuten esimerkeissä 1 ja 2, kaikki makrofagi-preparaatit, jotka oli altistettu savulle interferonia sisältävistä savukkeista, olivat yhtäpitävästi aktivoituneet, kun taas savulla vertailusavukkeista ei ol-20 lut vaikutusta.

Esimerkki 4

Vapaaehtoinen toisti kokeen 3 (savukkeet A, B, C, D ja E) käyttäen uusia kohdekudosviljelysyvennyksiä, jotka sisälsivät ihmisen kasvain-HL60-soluja. HL60-solut ovat hyvin 25 pahanlaatuisia leukamiakasvainsoluja, kuten niiden alkeel-keellinen solurakenne antaa ymmärtää; suoraan altistettuina interferonille osassa soluista tapahtuu kuitenkin morfologisia muutoksia, mikä osoittaa kypsymistä ja palautumista normaaliin solun ulkonäköön ja toimintaan (Carter, luo-30 vutettu hakemus P01CA295445 ja siinä esitetyt kirjallisuusviitteet) . Altistamisen jälkeen yksittäisille savuvirroille petrimaljoja, jotka sisälsivät HL60-soluja, pidettiin kosteutetussa 5 % CC>2 sisältävässä kammiossa 37°C:ssa väliaineessa MEM. Joka 48. tunti seuraavan 5-10 päivän aikana so-35 lut altistettiin toistuvasti interferonia sisältävälle savulle ja inkuboitiin sitten uudelleen C02_kammioissa. 7. päivästä alkaen kokeen alkamisen jälkeen ja jatkuen 14. päi- li 25 76246 vään asti interferonilla käsitellyt HL60-viljelyt (altistettu savulle, joka oli ensin imetty interferonisuodattimien läpi savukkeissa A-E) osoittivat kehittyviä merkkejä kypsymisestä ja normaalista kehityksestä verrattuna vertailuvil-5 jelyihin. Todistusaiheet kypsymisestä ja palautumisesta normaaliin käsittivät: solutumien edistyvä jakautuminen, tumajyvästen asteittainen häviäminen ja tumakoon pieneneminen, näyttö alkulimarakeistumisesta ja näyttö erilaistumisesta kypsäksi liuskatumaiseksi leukosyytiksi, kuten sello laisiksi, joita tyypillisesti havaitaan normaalin ihmisen ääreisveressä.

Esimerkki 5

Interferonia, joka oli valmistettu albumiinin kanssa tai ilman, kuten edellä kappaleessa III selostettiin ja pa-15 kastekuivattu, rehydratoitiin 100 ml:ssa tislattua vettä ja varastoitiin sitten eri lämpötiloissa polyprolyleenisäiliös-sä. Väliajoin otettiin tasaosia ja interferonin virusvastai-nen aktiivisuus mitattiin. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa 1: 20

Taulukko 1

Ihmis- Varastoi- Aktiivi- Aktiivi- Aktiivi- Aktiivi- albu- mislämpö- suus* 24 suus* 1 suus* 1 suus 1 vuo- miini tila h:n jälk. vk:n kul. kk:n kul. den kuluttua 25 + +22°C 99 79 37 0** 75 16 0,1 0** + 4° ja ma- 100 100 95 30 talampi - + 97 85 38 0** 30 + +22°C+ 100 100 100 100 * = prosenttia alkuaktiivisuudesta ** = ei havaittavissa + =

Liuoksessa oleva interferoni stabiloitui selvästi 35 albumiinin vaikutuksesta. Kuiva interferoni oli pysyvä yli yhden vuoden huoneen lämpötilassa albumiinin läsnä ollessa.

Claims (7)

26 7624 6

1. Menetelmä lääkeaineen sekoittamiseksi poltettavaan tupakkatuotteeseen, tunnettu siitä, että tä- 5 hän tuotteeseen ulkonaisesti lisätään interferonia, sen biologisesti aktiivisia osasia tai ainetta, joka indusoi interferonin tuotannon ihmiskehossa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että interferoni stabiloidaan.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että stabiloituminen on tulos interferonin liittämisestä kantajaan.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kantaja on seerumialbumiini tai syto- 15 kromi C.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tuote on savuke, sikari tai piipputupakka .

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n -20 n e t t u siitä, että tuotteeseen lisätään interferonin tuotannon indusoivaa ainetta, joka valitaan ryhmästä, joka käsittää kaksirihmaisen RNA:n, pyraani-kopolymeerejä, poly-anioneja ja lymfokiineja.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, t u n -25 n e t t u siitä, että tuote on savuke, sikari tai piipputupakka . I!