FI62539B - Foerfarande foer framstaellning av proteastoxoid som anvaends vid framstaellning av mot pseudomonas aeruginosainfektioner verkande trekomponentvaccin - Google Patents

Description

Iirarm r„, /4.. KUULUTUSJULKAISU

3BV W <") utlAgonimcsskrift 62 5 3 9 •SeSJHJ C Patentti myönnetty 10 01 19^3 (45) Patent rr.oudclafc 0 0? G 7/00, (51) Kv.ik. /Intel. A 61 K 39/104 770169 SUOM I —FI N LAN D (21) Ewnttltakumm — Nrtnttiwaiwini (22) Htkamlipilvl — Aneöknlnjtdtj 20.01.77 (23) Alkupilvl —GlMghutadtg 20.01.77 (41) Tullut (ulkhakal — Wlvlt off«ncll| 06.08.77

Patentti- j» rekisterihallitus (44) Nihuviiuipwtoo |a kuuL|uiiuiMin pvm.— 30.09.82

Patanfe och rtf isterstyrelsen ' 7 Antekan uttagd oeh wl.»krifun pubitnrad (32)(33)(31) PyydMty «uoikuu*—»«jtrt prior*·* 05.02.76

Japani-Japan(JP) IO838/76 (71) Shionogi & Co., Ltd., No. 12, 3-chome, Dosho-machi, Higashi-ku, Osaka,

The Kitasato Institute, No. 5-9-1, Shirogane, Minato-ku, Tokyo Pref.,

Japani-Japan (JP) (72) Yuzuru Homma, Tokyo Pref., Kazuyuki Morihara, Osaka Pref.,

Japani-Japan(JP) (lk) Leitzinger Oy (5^) Menetelmä valmistaa proteaasitoksoidia, jota käytetään Pseudomonas aeruginosa-infektion vastaisen kolmikomponenttirokotteen valmistamiseksi - Förfarande för framställning av proteastoxoid, som använes vid framställning av mot Pseudomonas aeruginosa-infektioner verkande trekomponentvacc in

Keksinnön kohteena on menetelmä valmistaa proteaasitoksoidia, jota käytetään Pseudomonas-aeruqinosa-infektion vastaisen kolmekomponent- tirokotteen valmistamiseksi, jolla proteaasitoksoidilla on seuraavat.

ominaisuudet: 1) molekyylipaino: 63.000 (geelisuodatus), 2) UV-absorptiospektri: maksimi 280 mp (e|®^ = 9,27, 0,1 M KC1), minimi 250 mp, 3) isoelektrinen piste: pH 5,2 (fokaalinen elektroforeesi), 4) ulkonäkö: väritön jauhe, 5) aminohappokoostumus: aminohapporyhmät (g/100 g proteiinia); asparagiinihappo (15,6), treoniini (5,0), seriini (7,6), glu-tamiinihappo (9,5), proliini (2,1), glysiini (7,7), alaniini (8,5), väliini (5,0), isoleusiini (3,9), leusiini (8,7), tyrosiini (6,9), fenyylialaniini (5,9), lysiini (4,1), histi-diini, (1,9), arginiini (2,3), tryptofaani (2,3), ammoniakki (1,4) (yhteensä 98,5 g), 6) proteaasiaktiivisuus: ei 7) antigeeniaktiivisuus: havaittu.

62539

Sekä lääketieteessä että eläinlääketieteessä P. aeruginosa aiheuttaa erilaisia tärkeitä ongelmia tyypillisenä patogeeninä opportunistisissa infektioissa, jotka ovat kiinnittäneet yhä enemmän huomiota lääketieteellisen hoidon edistyessä merkittävästi.

P. aeruginosan aiheuttamia infektioita, erityisesti vakavalaatuisia, tapahtuu herkästi vastasyntyneessä lapsessa, kun immuniteetti on fysiologisesti riittämätöntä, potilaissa, joiden immuniteetti on pienentynyt syövän, leukemian, kudossiirrosten ja palovammojen johdosta, ja kun immuniteetti on heikentynyt lääkityksen johdosta.

Eläinlääketieteessä P. aeruginosan aiheuttama verenvuotokeuhkokuume minkeillä ja P. aeruginosan aiheuttama utaretulehdus karjalla ovat vakava taloudellinen ongelma elintarviketeollisuudessa.

Viime aikoina on kehitetty muutamia antibiootteja P. aeruginosaa vastaan, mutta ne voivat tuskin olla tehokkaita, kun immuniteeetti on riittämätöntä tai sen toiminta on pienentynyt elävässä ruumissa. Mitä taas tulee edellä mainitunlaisiin P. aeruginosan aiheuttamiin infektioihin eläinlääketieteessä, minkkejä on käytännössä mahdotonta ja kaupallisesti kannattamatonta hoitaa antibiooteilla antamalla antibioottia useille tuhansille ja jopa useille kymmenille tuhansille eläimille. Utaretulehdus ongelma karjalla omaa melkein samanlaiset olosuhteet. Tämän vuoksi on mitä toivottavinta voida käyttää immuno-terapiaa kemoterapian asemesta tai yhdistettyä hoitoa niillä.

Immunoterapiassa on jo eristetty normaali antigeeni Original Endotoxin Protein, josta seuraavassa käytetään lyhennystä OEP, joka suojaa kaikkia P. aeruginosan aiheuttamia infektioita vastaan riippumatta serotyypin mukaisesta kannan laadusta (tällä hetkellä tunnetaan 13 laatua tai enemmän). Homma et ai.on alkanut soveltaa tätä antigeeniä käytäntöön (J. Y. Homma et ai., Japan. J. Exp. Med., 45, 355 - 360 (1975); J.Y. Homma et ai., Japan. J. Exp. Med., 42, 23 - 34 (1972); J. Y. Homma, Microbial Drug Resistance, Tokyo University Press, Tokyo, 267 - 279 (1975); J. Y. Homma, The Fourth International Congress of Animal, plant and Microbial Toxins,

Plenum Publisher, London (1975)).

3 62539

Pseudomonas aeruginosa muodostaa proteaasia, elastaasia ja muita aineita bakterisolun ulkopuolelle. Näiden kahden entsyymin on osoitettu toimivan patogeenisinä tekijöinä (K. Kawaharajo et ai.,

Japan. J. Exp. Med., £5, 79 - 88 (1975); K. Kawaharajo et ai.,

Japan. J. Exp. Med., 45, 515 (1975); K. Kawaharajo et ai., Japan.

J. Exp. Med., 44, 435 - 442 (1974); J. Y. Homma et ai., Japan.

J. Exp. Med., £6, 245 - 246 (1976)). Tämä käy riittävän hyvin ilmi siitä seikasta, että potilaiden, jotka kärsivät p. aeruginosan aiheuttamasta kroonisesta hengitysteiden infektiosta, ja karjan, joka kärsii P. aeruginosan aiheuttamasta utaretulehduksesta, seerumissa on todettu korkeat proteaasin ja elastaasin antigeeniarvot sekä OEP-arvot (J. Y. Homma, Japan. J. Exp. Med,, £5, 361 - 366 (1975); Tomiyama et ai., Japan. J. Exp. Med., 43, 185 - 189 (1973)).

Eläinkokeilla on osoitettu, että hyvin pieni määrä proteaasia tai elastaasia voi aiheuttaa ihokuolioita ja sarveiskalvon haavaumia ja aiheuttaa huomattavia patogeenisiä muutoksia sisäelimiin (K. Kawaharajo et ai., Japan. J. Exp. Med., 4J5, 79 - 88 (1975); K. Kawaharajo et ai., Japan. J. Exp. Med., £5, 515 (1975); K. Kawaharajo et ai., Japan. J. Exp. Med., ££, 435 - 442 (1974); K. Kawaharajo et ai., Japan. J. Exp. Med., £5, 89 - 100 (1975)).

Edelleen on osoitettu, että kun bakteereita, jotka muodostavat pro teaasia ja elastaasia, ja bakteereita, jotka eivät näitä entsyymejä muodosta, siirrostetaan hiiren sarveiskalvoon, edelliset bakteerit aiheuttavat haavaumien muodostumista, kun taas jälkimmäiset eivät tätä tee. Tämä osoittaa, että näiden kahdenlaisten bakteereiden patogeenisissä ominaisuuksissa on ilmeinen ero (J. Y. Homma et ai., Japan. J. Exp. Med., £5, 515 (1975). Samanlaisia tuloksia saadaan suolistoon kohdistuvissa vertailukokeissa.

Sen vuoksi jotta immunoterapia olisi riittävän tehokasta, metaboliit-tien myrkyllinen vaikutus on neutraloitava ja bakteereiden kasvu on estettävä normaalilla infektiolta suojaavalla OEP antigeenillä. Tämän saavuttamiseksi immunisointi on suoritettava proteaasi- ja elas-taasitoksoideilla.

62539

Vaikkakin OEP-rokotetta pidetään tehokkaana suojana P. aeruginosan aiheuttamia infektioita vastaan, laajan tutkimuksen avulla on yritetty löytää tehokkaampi rokote. Tutkimuksen seurauksena on havaittu, että kolmikomponenttinen sekarokote, joka on valmistettu sekoittamalla P. aeruginosasta saatua OEP:tä P. aeruginosasta saadun elas-taasitoksoidin ja P. aeruginosasta saadun proteaasitoksoidin kanssa, omaa merkittävän tehon estettäessä ja hoidettaessa P. aeruginosan aiheuttamia infektioita verrattuna yksinkertaiseen rokotteeseen, joka sisältää pelkästään OEP:tä. Tämä keksintö perustuu edellä olevaan havaintoon.

Oheisissa kokeissa käytetty infektiolta suojaava normaali antigeeni OEP on tunnettu. Tällaisen OEP:n fysikaaliset ja kemialliset ominaisuudet sekä valmistusmenetelmä on kuvattu seuraavassa kirjallisuudessa: Japanilainen patenttijulkaisu (ei-tutkittu) No. 40925/1973; J. Y. Homma et ai., Japan. J. Exp. Med., 42, 23 - 34 (1972); J. Y. Homma, Microbial Drug Resistance, Tokyo University Press, 267 - 279 (1975); J. Y. Homma et al., Abstracts of Lectures at The 22nd Toxoid Symposium, 45 - 50 (1975).

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista se, että Pseudomonas aeruginosa-proteaasi deaktivoidaan formaldehydillä tai oksimetaanisulfiinihapolla ja dialysoidaan ja lyofilisoidaan.

Lähtöaineena käytetty proteaasi on tunnettu ja sen ominaisuuksia ja valmistusmenettelyä on kuvattu seuraavassa kirjallisuudessa: japanilainen patenttijulkaisu No. 27315/1965; K. Morihara et ai., Biochem. Biophys., Acta, 73, 113 - 124, 125 - 131 (1963); K. Morihara et ai., Biochem. Biophys. Acta, 92, 351 - 360, 361 - 366 (1964); K. Morihara et ai., Arch. Biochem. Biophys., 114, 158 - 165 (1966); K. Morihara et ai., Biochem. Biophys. Acta, 309, 414 - 429 (1973); K. Morihara et ai., Agr. Biol. Chem., 38, (3), 621 - 626 (1974).

Seuraavassa esimerkissä kuvataan proteaasitoksoidin valmistusta.

Esimerkki P. aeruginosasta saatuja proteaasikiteitä (100 mg) liuotetaan ? 62539 0,1 M Na2HPO^ liuokseen (noin 20 ml), joka sisältää 0,2 M lvsiiniä, ja tähän lisätään formaliinia tai vaihtoehtoisesti oksimetaanisul-fiinihappoa tai sen suolaa niin, että lopulliseksi konsentraatioksi tulee noin 8 % (til/til). Seoksen annetaan seistä paikallaan huoneen lämpötilassa 3 päivää tai enemmän ja sen jälkeen seosta dialysoidaan vettä vasten ja lopuksi lyofilisoidaan toksoidiksi.

Seuraavissa esimerkeissä A ja B on havainnollistettu keksinnön mukaan valmistetun toksoidin käyttöä kolmikomponenttirokotteissa.

Esimerkki A

(1) Proteaasitoksoidin-potaska-alunaliuos: proteaasitoksoidia (100 mg) liuotetaan fosfaattipuskuroituun natriumkloridin vesiliuokseen (M/15, pH 7,4) (PBS) (24,8 ml) ja tähän lisätään 10 %:sta potaska-alunan IK2AI2(SO^)4·24H2OJ liuosta (2,5 ml). Saatuun liuokseen lisätään edelleen 20 %:sta Na2HP04*I2H2O liuosta (2,5 ml) ja pH säädetään fi,5:een täydellistä saostumista varten. Lopuksi tähän lisätään antiseptisenä aineena 1 %:sta timerosaliliuosta (0,3 ml) (1 mg proteaasitoksoidia /0,3 ml).

(2) Elastaasitoksoidi-potaska-alunaliuos: valmistus suoritetaan samalla tavoin kuin edellä, mutta proteaasitoksoidin asemesta käytetään elastaasitoksoidia.

(3) OEP-potaska-alunaliuos: OEP:tä (100 mg) liuotetaan 0,01 N NaOH-liuoksen (5 ml) ja tähän lisätään PBS:ä (28 ml). Saatuun liuokseen lisätään peräkkäin 10 %:sta potaska-alunaliuosta (3,3 ml) ia 20 %:sta Na2HP04 liuosta (3,3 ml) ja lopuksi lisätään 1 %:sta timerosaliliuosta (0,4 ml) (1 mg OEP/0,4 ml).

(4) Välittömästi ennen käyttöä sekoitetaan keskenään edellä valmistettu proteaasitoksoidi-potaska-alunaliuos, elastaasitoksoidi-potaska-alunaliuos ja OEP-potaska-alunaliuos. 0,5 ml tätä yhdistettyä liuosta sisältää 500y proteaasitoksoidia, 500y elastaasitoksoidia ja 500y OEP:tä.

6 62539

Esimerkki B

Esimerkissä A kuvatulla tavalla valmistetaan käyttämällä 10 %:sen potaska-alunaliuoksen asemesta 10 %:sta alumiinihydroksidiliuosta proteaasitoksoidi-alumiinihydroksidiliuosta, elastaasitoksoidi-alumiinihydroksidiliuosta ja OEP-alumiinihydroksidiliuosta.

Edellä valmistetut kolme liuosta sekoitetaan yhteen välittömästi ennen käyttöä.

Jäljempänä esitettyjen kokeiden tulosten perusteella on ilmeistä, että keksinnön mukainen kolmikomponenttinen sekarokote ehkäisee paljon tehokkaammin P. aeruginosan aiheuttamia infektioita kuin yksinkertainen rokote, joka sisältää vain OEPrtä.

Koe 1 PHA (passiivinen hemaglutinaatio) arvo minkkien seerumissa, kun minkit on immunisoitu yksinkertaisella rokotteella, joka sisältää pelkästään OEP:tä, tai kolmikomponenttisella sekarokotteella, joka sisältää OEPitä, proteaasitoksoidia ja elastaasitoksoidia, sekä suo-jaamisteho infektiota vastaan: (1) Menetelmä:

Eläimet: 5-6 kuukautta vanhoja naarasminkkejä (safiiri).

Rokotteen antamistapa: Ihonalainen tai lihaksensisäinen injektio.

Rasituskoe: käytetään P. aeruginosan kantaa n:o 5, joka tuottaa sekä proteaasia että elastaasia. Infektoiminen elävillä bakteereilla suoritetaan kaatamalla bakteeriliuosta (0,5 ml) nenäonteloon vinyy-liputken kautta eetterinukutuksessa.

PHA-arvon määrittäminen: proteaasi PHA-arvo ja elastaasi PHA-arvo mitataan J. Y. Homman et ai. kuvaamalla menetelmällä Japan. J. Exp. Med., £5, 361 - 365 (1975). OEP-PHA arvo mitataan T. Tomiyaman et ai. kuvaamalla menetelmällä Japan. J. Exp. Med., 4_3, 1R5 - 189 (1973).

7 62539 OEP-rokote: 0,01 N natriumhydroksidiliuokseen, johon oli liuotettu OEP:ta lisättiin M/15 fosfaattipuskuria (pH 7,4). 10 %:sta KAI(SO^)2*12H20-liuosta lisättiin 10:1 - tilavuussuhteessa ja tämän jälkeen lisättiin 20 %:sta Na2HP04-liuosta kunnes kokonais-liuoksen pH oli 6,5.

Proteaasi- ja elastaasitoksoidien rokotteet: molempien toksoidien M/15 fosfaattipuskuriliuoksiin lisättiin 10 %:sta KAI(S04)2*12H20-liuosta ja tämän jälkeen 20 %:sta Na2HP04*12H20-liuosta kunnes liuoksen lopullinen pH oli 6,5. Sekarokotteita valmistettiin sekoittamalla OEP-liuosta elastaasitoksoidiliuoksen ja proteaasitoksoidi-liuoksen kanssa.

Seuraavassa taulukossa 1 on annettu immunointiaika, käytetyt annokset, infektointiaika ja ruumiinavausaika.

Taulukko I

Eläin Antigeeni Immunisointipäivä Infektointi Ruumiin- __päivä__avaus ___9/8 23/8 9/9__21/9__4/10

Ryhmä A OEP c c 10% KA1(S04) 2 200y 300 y 500/ c C ! ——————— In 1 ' 1 Ή ·Η

Ryhmä B Proteaasitoksoidi S -h 1 % ka1(so4)2 200/ 300y sooy § £ --- , , —— - ....... I m

Ryhmä C Elastaasitoksoidi -h -S

1 % KA1(S04)2 200y 3001 500/ g g

Ryhmä D OEP 200/ 300/ 500/ g g

Proteaasitoksoidi 200/ 300/ 500/ -h .'h

Elastaasitoksoidi :(0 1 % kai(so4)2 200/ 300/ sooy > a c 1,1......... :«J (U :!β o

Ryhmä E 1 % KAl(SO.), * ml $ ml $ ml __Z__cn :<0 ^ :nj I _ h -n rH -n

Ryhmä F Immunoimaton____ 62539 8

Kokeiden tulokset: 12 päivän kuluttua viimeisestä immunoinnista suoritettiin infektointikannalla n:o 5 käyttämällä hakteeripitoisuuksia välillä 10 3 - 103-8. Tulokset on esitetty taulukossa II.

Taulukko II

Rokotetut Bakteerien PHA-arvo1 Minkkien lukumäärä elä- ryhmät määrä (elä- _ _ vien solu vien solujen OEP Proteaasi- infek- eloon jen luku-_lukumäärä)_toksoidi toituja jääneet määrä 1.5 x 106 768 <80 5 2 A 1,5 x 107 1024 <80 5 3 (OEP) 1,5 x 108 1280 <80 5 0 $7,5 x TO6 1.5 x 109 2560 <80 4 0 _1,5 x 1010 4095_<_80_5_0__ 1.5 x 104 144 2304 5 5 1.5 x 105 64 1408 5 5 B 1,5 x 106 40 1792 5 5 >1,2 x 109 (Proteaa- 1,5 x 107 i 32 1400 5 5 sitoksoi- 1,5 x 108 <40 1536 5 4 di)_1,5 x 109 < 40_4096_5_3 _ 1.5 x 104 160 <80 5 5 1.5 x 105 80 <32 5 5 C 1,5 x 106 80 s 80 5 42

(Elastaa- 1,5 x 107 S 64 <80 5 5 >7,5 x 10R

sitoksoi- 1,5 x 108 <80 <80 5 4 di)_1,5 x 109 < 80_<_80_5_2_ D 1,5 x 106 288 1280 5 4 (OEP, 1,5 x 107 384 1920 5 4

Proteaasi & 1,5 x 108 1088 1664 5 3 <1,9 x 108

Elastaasi- 1,5 x 109 2304 1792 4 1 toksoidi 1,5 x 1010 2304_4352_5_0________ 1.5 x 103 % 32 <80 5 42 E 1,5 x 104 < 80 <80 5 1 (Potaska- 1,5 x 105 <80 <80 5 1 $1,2 x 104 aluna) 1,5 x 106 <80 <80 5 1 _1,5 x 107 < 80_<_80_5_0 _ 1.5 x 103 112 <80 5 1 F 1,5 x 104 < 80 <80 5 2 (Immunoi- 1,5 x 10^ <80 < 80 5 2 $7,5 x 103 maton) 1,5 x 108 <80 <80 5 1 _1,5 x 107 < 80_<_80_5_0 _ PHA-arvo minkkiseerumissa ennen infektointia 2

Yksi viidestä minkistä kuoli ilman verenvuotoja.

P. aeruginosaa ei voitu viljellä kuolleiden minkkien veressä. Elastaasitoksoidin PHA-arvoja ei mitattu 9 62539

Suoritettujen kokeiden tulokset osoittavat, että immunoimattomassa ryhmässä F ja potaska-alunalla immunoidussa ryhmässä E LD50-arvo oli noin 7,5 x 103 ja 1,2 x 104. OEP-liuoksella rokotetussa ryhmässä A LD5Q-arvo oli pienempi kuin 7,5 x lO*’ ja näin ollen selvästi eroaa edellä mainituista vertailuryhmistä E ja F. Ryhmissä B ja O, joissa immunointiin käytetään pelkästään joko proteaasitoksoidia tai elas-taasitoksoidia, LD^Q-arvo oli suurempi kuin 1,2 x 10° tai suurempi kuin 7,5 x 10®. Ryhmässä D, jossa käytettiin kolmikomponenttiroko-

Q

tetta LD5Q-arvo oli alle 1,9 x 10 . Näin voidaan siis sanoa, että ryhmien B, C ja D LDgg-arvot ovat suurinpiirtein saman suuruisia ja arvot olivat huomattavasti suurempia kuin ryhmän A arvo, jossa siis käytetään pelkästään OEP-rokotetta.

Koe 2

Hiirten sarveiskalvoinfektion hoito antiseerumilla ja 3',4'-dideoksi-kanamysiini B:llä (DKB): (i) Menetelmä:

Antiseerumi: Erilaisia antiseerumeja saadaan käyttämällä kaniineja. Käytettyjen antiseerumien laadut ja PHA-arvot on esitetty taulukossa 3.

Taulukko 3

Antiseerumi__OEP-PHA__Proteaasi-PHA

OEP-seerumi__2560__-_

Proteaasitokso- idiseerumi____32__5120_

Normaali kanii- nin seerumi___-__-_

Infektio: Liuosta (0,01 ml), joka sisältää 10^ elävää pseudomonas aeruginosa bakteeria, tiputetaan haavalliseen sarveiskalvoon .

10 62539

Antiseerumin ja DKB:n antaminen:

Pelkästään DKBrtä: DKB-liuosta, jonka konsentraatio vaihtelee (800 - 12,5 y/0,2 ml), injektoidaan (0,2 ml) lihaksensisäisesti jokaiseen hiireen (6 viikon vanhoja, naaraita) välittömästi ennen infektiota.

DKB + antiseerumi: Antiseerumia (0,1 ml) injektoidaan ihonalaisesti jokaiseen hiireen 18 tuntia ennen infektiota. Senjälkeen DKB liuosta (0,2 ml), jonka konsentraatio vaihtelee, injektoidaan lihaksensisäisesti välittömästi ennen infektiota.

Vertailuryhmässä käytetään natriumkloridin vesiliuosta DKB:n ja antiseerumin asemesta.

Sarveiskalvon tarkkailu:

Infektion aiheuttamaa sarveiskalvon vahingoittumista tarkkaillaan 6 päivän ajan injektoinnin jälkeen. Arviointi suoritetaan sarveiskalvon opasiteetin ja tulehduspesäkkeen ja haavauman muodos-tumisasteen perusteella.

(ii) Tulokset: Esitetty taulukossa 4.

62539 I ·Η •h g

P 3 c P

<0 Φ o Φ cc

+ CO

O

CQ (X

« ω .. o o :ro --- H *------- * i—I I (0

·· <0 -rl | P

CC, Ό Ρ Ή | 4J

x: c co -p 3 Q 3 (0 <0 Ό ·ρ 3 ω (0 ·-< e -* (0 w -f 0) o 3 oo m -v

·(—l 3 p CO P CC 'f O

3 B O i ¢) « » £ «j .* irf Ρ O <U O O 0)

H ·* C O4 P CO 4J

|—I o -—----"" ——— — ρ x: i ro

g Φ -H -rl P

3 -P I -H e CO

P P C 3 •H

Φ O <0 P > 0) C -5C 0) ·* (0 0) O i—I O ·Ρ

•H + ·Ρ CO CO CO O P

-P iH * * - -P

C CQ (0 C Ή i—i i—I 0} (0 W (0 ·Ρ o Ω E C 04 __________

^ rH P

rH CQ O H O', CO (0 O Ή ^ O Γ" <X> Γ" > j£pp ·> » * (0

Λί ·Ρ CO rH Ι-H O P

3 ·η P

rH -H

3 o (0 o en

E- p O —* O

•p m -p OOP ·“< Ä W -h

-p uo in o o C

CCX3 o t" oo o (N -p O ·· \ Oi rH rP <ί IC 3 h CQ - -* p t*; JC Q ~ p 0) 3 ---------j> C | I C 3

•p ·Ρ | JC ·Ρ rH

I :<a p 3 I *p O C

C -p :(0 C P -P E P *p P

O ρρ(θοω3·ρ·ρ (fl > C rH 0) Pö p CO C g rH (0:(0-,03(00)(0(0 £ mai (0nj-pp(D(0J< o

JCC >, .ρ ·ρ Ό CO (0 CO 0) P

ω .p p co g -p (C ·ρ i p c 3 •P (0 p30rHgd40-P 3 φ φΦΡ(0Φ3ωΡ·Η 03

> 3 p j* φ J* I Ρ O O, ·ρ <fl C

Ρ ρ (0ΟΦΟ·ρΦ|ΙΕ«0 :Λ5 (0 ·ρ ·ρ ·η to ρ ρ Φ -ρ ·ρ 3 £ :co *

03 Ο <Ό l-PCCOPPPP C

ρ χ;·.Ρ4ω<Β·Ρ00Φ0 -ρ JC >1 -Ρ ω (0 <Ό (0 (0 Φ C ·Ρ C0 ο Φ ΕΟ<0(0·η coEjc-p Ρ + 3 ! Φ ·γο Ο Η- + ·Ρ + 3 >ί Ε C p.ppco ΌΡ Ο M PQ Φ Ρ O flJCfflffl-pBlliB 3 ^Φ3Ρ·Ρθθ£;ί>ίΟί>ίΦ5«5 Κ __Q CO (g Οι E Ρ' Q Q CO Q C0 ο 12 62539

Taulukon 4 perusteella on ilmeistä, että proteaasitoksoidi, elas-taasitoksoidi ja OEP antiseerumi ovat paljon tehokkaampia kuin DKB yksinään.

Edellä esitetystä havaitaan, että keksinnön mukaan valmistettu proteaasitoksoidi soveltuu erityisen hyvin kolmikomponenttisen sekarokotteen valmistamiseksi.

Liuotin voi olla mikä tahansa liuotin, joka sopii ihmisten ja eläinten rokotteisiin. Esimerkkejä ovat tislattu vesi, fysiologinen nat-riumkloridiliuos, fosfaattipuskuroitu natriumkloridiliuos jne..

Apuaineena voidaan käyttää mitä tahansa tavanomaista apuainetta kuten alumiinihydroksidia, alumiinifosfaattia, kalsiumfosfaattia, alunaa tai Freundin epätäydellistä apuainetta. Apuaineen määrä voidaan valita sopivalla tavalla niin, että se riittää immunoaktiivisuuden lisäämiseen. Antiseptinen aine voi olla myös mikä tahansa tavanomainen aine kuten esimerkiksi timerosali, fenoli, karbolihappo tai formaliini .

Kolmikomponenttisen sekarokotteen komponenttien suhdetta voidaan halutulla tavalla muuttaa tehokkaalla alueella sen suojaavan tehon lisäämiseksi rokotteena. Kunkin komponentin tehokas määrä vaihtelee suuresti riippuen immunisointikertojen määrästä ja immunisointivälistä. Se vaihtelee myös rokotteen käyttötarkoituksesta riippuen (s.o. ehkäisevä käyttö tai terapeuttinen käyttö).

Seuraavassa on annettu joitakin esimerkkejä antigeenien suositelluista annoksista ja suhteista: (i) Käyttö ihmisillä (myös karjalla):

Kun immunisointi suoritetaan 2-3 kertaa viikossa (ilman apuainetta) seuraavia suhteita suositellaan: OEP, 0,1 JVpaino-kg - 10 ^/pai-no-kg; proteaasitoksoidi, 1 ^/paino-kg - 50 //paino-kg? elastaasi-toksoidi, 1 J//paino-kg - 50 ^/paino-kg. Immunisointiasteesta riippuen määriä voidaan sopivalla tavalla lisätä.

13 62539 (ii) Käyttö minkeillä: a) Ehkäisevä rokote

Kun immunisointi suoritetaan kaksi kertaa (käyttämällä apuainetta), seuraava suhde on suositeltu: OEP, 10 //eläin - 2000 //eläin; proteaasitoksoidi, 10 jr/eläin - 2000 //eläin; elastaasitoksoidi, 10 //eläin - 2000 f/e lain.

Kun immunisointi suoritetaan yhdellä kertaa seuraava suhde on suositeltu: OEP, 500 //eläin - 2000 //eläin; proteaasitoksoidi, 500 //eläin - 4000 //eläin; elastaasitoksoidi, 500 //eläin -4000 //eläin.

b) terapeuttinen rokote:

Kun immunisointi suoritetaan kaksi - kolme kertaa yhden viikon välein (käyttämällä apuainetta tai ilman) seuraavaa suhdetta suositellaan: OEP, 0,1 //eläin - 100 //eläin; proteaasitoksoidi, 10 //eläin -12 //eläin; elastaasitoksoidi, 10 //eläin - 2000 //eläin.

Kolmikomponenttinen sekarokote voidaan antaa eläimille ja ihmisille lihaksen sisäisesti, ihonalaisesti tai ihonsisäisesti.

Kolmikomponenttisen sekarokotteen komponenttien toksisuudet ovat seuraavat: OEP:n toksisuus: intraperitoneaalinen injektio hiirille annoksina 100 mg/kg aiheuttaa väliaikaista heikkoutta, mutta eläimet eivät kuole.

OEP:n kuumetta aiheuttava ominaisuus: tavallisessa kuumekokessa kaniineilla havaitaan positiivinen vaikutus annoksella 0,3 mg/kg.

Yleisesti sanoen OEP:n toksisuus endotoksiinina on erittäin pieni verrattuna LPS-(lipopolysakkaridi) ja OEP-LPS kompleksiin.

Elastaasitoksoidin ja proteaasitoksoidin ja toksisuus: intraperitoneaalinen antaminen hiirille annoksena 1 mg/hiiri ei aiheuta akuuttia toksisuutta, pienin tappava proteaasiannos on 0,2 mg/hiiri (i.p.) ja pienin tappava elastaasiannos on 0,125 mg/hiiri (i.p.).

Claims (2)

14 62539 Patenttivaatimus Menetelmä valmistaa proteaasitoksoidia, jota käytetään Pseudomonas aeruginosa-infektion vastaisen kolmikomponenttirokotteen valmistamiseksi, jolla proteaasitoksoidilla on seuraavat ominaisuudet: 1. molekyylipaino: 63.000 (geelisuodatus),

2. UV-absorptiospektri: maksimi 280 mp (e|®| = 9,27, 0,1 M KC1), minimi 250 mp, 3. isoelektrinen piste: pH 5,2 (fokaalinen elektroforeesi), 4. ulkonäkö: väritön jauhe, 5. aminohappokoostumus: aminohapporyhmät (g/100 g proteiinia); asparagiinihappo (15,6), treoniini (5,0), seriini (7,6), glu-tamiinihappo (9,5), proliini (2,1), glysiini (7,7), alaniini (8,5), väliini (5,0), isoleusiini (3,9), leusiini (8,7), tyrosiini (6,9), fenyylialaniini (5,9), lysiini (4,1), histi-diini, (1,9), arginiini (2,3), tryptofaani (2,3), ammoniakki (1,4) (yhteensä 98,5 g), 6. proteaasiaktiivisuus: ei 7. antigeeniaktiivisuus: havaittu. tunnettu siitä, että Pseudomonas aeruginosa-proteaasi deaktivoidaan formaldehydillä tai oksimetaanisulfiinihapolla ja dialysoidaan ja lyofilisoidaan.