DK144753B

DK144753B - Fremgangsmaade til fremstilling af en blandingsvaccine mod infektioner af pseudomonas aeruginosa

Info

Publication number: DK144753B
Application number: DK49677AA
Authority: DK
Inventors: Y Homma; K Morihara
Original assignee: Shionogi & Co
Priority date: 1976-02-05
Filing date: 1977-02-04
Publication date: 1982-06-01
Also published as: DE2704766A1; FI62539C; SU784796A3; US4157389A; SE425213B; FR2340099A1; DK144753C; DK49677A; FI62539B; NL7701266A; JPS5296729A; FR2340099B1; JPS6133010B2; SE7701038L; CA1082595A; FI770169A7; DE2704766C2; GB1546035A

Description

(φ

(19) DANMARK

:fc

lp oz) FREMLÆGGELSESSKRIFT od 1U4753B

DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Ansøgning nr. ^96/77 (51) IntCI.3 A 61 K 39/10A

(22) Indleveringsdag ^977 (24) Løbedag ^ · f ^ 977 (41) Aim. tilgængelig 6. aug· 1977 (44) Fremlagt 1 · jun. 19^2 (86) International ansøgning nr. ” (86) International indleveringsdag “ (85) Videreførelsesdag “ (62) Stamansøgning nr. "

(30) Prioritet 5· fet. 1976* IO858/76* JP

(71) Ansøger SHI0N0GI & CO. LTD., Osaka, JPi THE KITAS ATO INSTITUTE, Tokyo

Pref., JP.

(72) Opfinder Yuzuru Homma, JP: Kazuyuki Morihara, JP.

(74) Fuldmægtig Th. Ostenfeld Patentbureau A/S.

(54) Fremgangsmåde til fremstilling af en blandingsvaccine mod infektioner af Pseudomonas aeruginosa.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af en tre-komponent blandingsvaccine mod infektioner forårsaget af Pseudomonas aeruginosa. Den omhandlede tre-komponent blåndingsvaccine er værdifuld til forebyggelse og behandling af infektioner forårsaget af P. aeruginosa i mennesker og dyr.

Såvel indenfor den humane som veterinære medicin forår-® sager P. aeruginosa forskellige store problemer som det typiske -) pathogen for opportunistiske infektionssygdomme, der har til- trukket sig stadig større opmærksomhed med den medicinske be-J- handlings betydelige fremskridt.

3 144753 2

Infektioner, især af alvorlig grad, som forårsages af P. aeruginosa, har tilbøjelighed til at optræde hos nyfødte børn med fysiologisk immunitetsutilstrækkelighed, hos cancer-, leu-kemi-, transplantations- og skoldningspatienter med nedsat immunitetsfunktion samt ved tilfælde af nedsat immunitetsfunktion på grund af medicinbehandling med steroider, imuran og lignende.

Inden for den veterinære medicin frembyder hæmoragisk pneumonia i minke forårsaget af P. aeruginosa og mammitis i køer forårsaget af P. aeruginosa et alvorligt økonomisk problem i avlen.

Visse antibiotika mod P. aeruginosa er fornylig blevet udviklet, men de udøver næppe nogen virkning i tilfælde af immu-nitetsutilstrækkelighed eller nedsat immunitetsfunktion hos levende væsener. Endvidere er det med hensyn til de ovenfor omtalte af P. aeruginosa inden for veterinærmedicinen fremkaldte infektioner i praksis umuligt og ikke kommercielt attraktivt at foretage en behandling med antibiotika på dyr, der i antal kan variere fra mange tusinde til tifold af tusinde. Problemet med mammitis i kvæg eksisterer under næsten tilsvarende omstændigheder. Der er derfor et stort behov for en immunoterapi i stedet for kemoterapien eller for en kombineret behandling ved hjælp af disse.

I henseende til immunoterapi er et fælles antigen,

Originalt Endotoxin Protein (OEP), som beskytter mod alle infektioner forårsaget af P. aeruginosa, uanset stammens art med hensyn til serotype (der kendes i dag 13 eller flere arter) allerede blevet isoleret og en anvendelse i praksis påbegyndt af Homma et al. (J.Y. Homma et al., Japan. J. Exp. Med., 45, 355 - 360 (1975); J.Y. Homma et al., Japan. J. Exp. Med., 42, 23 - 34 (1972); J.Y. Homma, Microbial Drug Resistance, Tokyo University Press, Tokyo, 267 - 279 (1975); J.Y. Homma, The Fourth International Congress of Animal, Plant and Microbial Toxins, Plenum Publisher, London (1975)).

Nogle stammer af Pseudomonas aeruginosa producerer protease, elastase og andre stoffer uden for bakteriecellen. Disse to enzymer viste sig at virke som pathogene faktorer (K. Kawa-harajo et al., Japan).

3 144753 J. Exp. Med., 45, 79 - 88 (1975); K. Kawaharajo et al., Japan. J. Exp. Med., £5, 515 (1975); K. Kawaharajo et al., Japan. J.

Exp. Med., £4, 435 - 442 (1974); J. Y. Homma et al., Japan. J.

Exp. Med., £5, 89 - 100 (1975); K. Okada et al., Japan. J. Exp. Med., £6, 245 - 246 (1976)). Dette er tilstrækkeligt begrundet i det forhold, at høje antigenværdier af protease og elastase samt OEP kan påvises i sera fra patienter med kronisk infektion i aspirationskanalen af P. aeruginosa og tilsvarende hos kvæg med mammitis forårsaget af P. aeruginosa (J. Y. Homma, Japan.

J. Exp. Med., £5, 361 - 366 (1975); T. Tomiyama et al., Japan.

J. Exp. Med., £3, 185 - 189 (1973)).

Det er i virkeligheden ved dyreforsøg påvist, at en meget ringe mængde protease eller elastase kan bevirke hudnekrose og corneal ulcus samt give betydelige pathologiske ændringer i indre organer (K. Kawaharajo et al., Japan. J. Exp. Med., 45, 79 - 88 (1975); K. Kawaharajo et al., Japan. J. Exp. Med., 45, 515 (1975); K. Kawaharajo et al., Japan. J. Exp. Med., ££, 435 -442 (1974); K. Kawaharajo et al., Japan. J. Exp. Med., £5, 89 -100 (1975)). Det er endvidere påvist, at bakterier (P.aeruginosa), som producerer protease og elastase, ved indpodning i muse-cornea bevirker ulcus-dannelse, mens bakterier (P. aeruginosa), som ikke producerer disse enzymer, ved tilsvarende indpodning i muse-cornea ikke har denne virkning, hvilket viser en åbenbar forskel i den pathogene egenskab mellem disse to bakterietyper (J.Y.

Homma et al., Japan. J. Exp. Med., £5, 515 (1975)). Tilsvarende var ved intestinale læsioner den såkaldte "De-test" positiv i kaniner podet intra-intestinalt med den protease- og elastase-producerende stamme af P. aeruginosa, mens den var negativ hos sådanne, der var podet med ikke-producerende stammer.

For at sikre en tilstrækkelig virkning af immunoterapien er en neutralisering af den giftige virkning af metaboliterne samt hæmning af bakterievækst af det fælles infektionsbeskyttende antigen OEP derfor nødvendig. Til dette formål skal immuniseringen foretages med toxoider af protease og elastase.

Selvom OEP-vaccine betragtes som effektiv til beskyttelse mod infektioner forårsaget af P. aeruginosa, har omfattende 4 146753 studier været udført med henblik på at finde en mere effektiv vaccine. Som resultat heraf har det vist sig, at en tre-komponent blandingsvaccine, som fremstilles ved blanding af OEP opnået fra p. aeruginosa med et elastase-toxoid opnået fra P. aeruginosa og et protease-toxoid opnået fra P. aeruginosa, udviser bemærkelsesværdig virkning ved forebyggelse og behandling af infektioner forårsaget af P. aeruginosa i forhold til den simple vaccine, som alene omfatter OEP. Den foreliggende opfindelse er baseret på denne iagttagelse.

I overensstemmelse med den foreliggende opfindelse tilvejebringes således en fremgangsmåde til fremstilling af en tre-komponent blandingsvaccine mod infektioner forårsaget af P. aeruginosa, og denne fremgangsmåde er ejendommelig ved, at en elastase produceret af P. aeruginosa omdannes til et elastase-toxoid, at en protease produceret af P. aeruginosa omdannes til et protease-toxoid, og at de således opnåede elastase- og protease-toxoider blandes med et infektions-beskyttende fælles antigen OEP, opnået fra P. aeruginosa.

Det ud fra P. aeruginosa opnåede infektions-beskyttende fælles antigen OEP, som anvendes ved den omhandlede fremgangsmåde er kendt. Således er de fysiske og kemiske egenskaber samt fremstillingen af sådant OEP beskrevet i følgende litteratursteder: Japansk patent nr. 856.996; J.Y. Homma et al., Japan. J. Exp.

Med., 42, 23-34(1972); J.Y. Homma, Microbial Drug Resistance,

Tokyo University Press, 267-279 (1975); J.Y. Homma et al., Abstracts of Lectures at The 22nd Toxoid Symposium, 45-50 (1975).

Elastase-toxoidet kan fremstilles ud fra en af P. aeruginosa produceret elastase ved omdannelse deraf til toxoidet i henhold til en fremgangsmåde, der konventionelt er tilpasset fremstilling af toxoider af protein-toxiner, f.eks. behandling med formaldehyd eller oxymethansulfinsyre. Udgangs-elastasen er kendt, og dens egenskaber og fremstillingsmåde er beskrevet i japansk patent nr. 479.828; K. Morihara et al., J. Biol. Chem., 240, 3295-3304 (1965); K. Morihara, J. Bacteriol., 8£, 745-757 (1964); K.

5 1A A 7 5 3

Morihara et al„f Arch. Biochem. Biophys., 123, 572 - 588 (1968); K. Morihara et al., Agr. Biol. Chem., 1123 - 1128 (1975).

Det følgende er et typisk eksempel på fremstilling af elastase-toxoidet:

En renset elastaseopløsning (indeholdende 10-15 mg en-zymprotein/ml (50 mPU (proteinase enhed)/mg enzymprotein) 5 M natriumchlorid, 10 mM natriumacetat, 2mM calciumchlorid og 0,1 mM zinkchlorid) fortyndes med en borat-puffer (pH 9) til dannelse af en enzymkoncentration på 2 - 5 mg/ml (slutkoncentrationen af borat er ca. 0,1 M), og formalin sættes hertil til opnåelse af en slutkoncentration på 1% (v/v). Blandingen holdes ved stuetemperatur. Næsten fuldstændig deaktivering opnås på 1 dag.

Den således deaktiverede elastaseopløsning dialyseres mod vand og lyofiliseres til opnåelse af toxoidet.

Det her anvendte udtryk "mPU" henviser til proteinase-aktivitet bestemt ved hjælp af følgende metode:

Kasein (2% (v/v); pH 7,4) (1 ml) blandes med en passende fortyndet opløsning af enzymet, og efter reaktion ved 40 °C i 10 minutter tilsættes straks en reaktionsstandsende opløsning (indeholdende 0,1 M trichloreddikesyre, 0,2 M eddikesyre og 0,2 M natriumacetat) (2 ml). Blandingen holdes ved samme temperatur i 20 minutter til fuldstændig udfældning af uomsat kasein og filtreres dernæst. Filtratet (1 ml) underkastes tyrosinbestem-melse ved hjælp af Folin«s metode. En stigning på 1γ tyrosin pr. minut viser en proteinaseaktivitet på 1 mPU.

De fysiske og kemiske egenskaber af det således fremstillede elastase-toxoid er følgende: 1. Molekylvægt: 47,000 (gelfiltrering).

2. Ultraviolet absorptionsspektrum: maksimum 278 my 278 (E^£ = 21,2, 0,1 M KC1), minimum 252 my.

3. Isoelektrisk punkt: pH 6,5 (elektroforese med acetatfilm).

4. Udseende: farveløst pulver.

144753 6 5. Aminosyresammensætning: aminosyrerester (g/100 g protein): asparaginsyre (14,2), threonin (5,0), serin (5,6), glutaminsyre (6,5) prolin (2,9), glycin (5,6), alanin (5,8), valin (4,9) methionin (2,9), isoleucin (2,7), leucin (4,3), tyrosin (9,9), phenylalanin (7,0), lysin (3,9), histidin (2,9), arginin (6,5), cystin/2 (1,2), tryptophan (2,3), ammoniak (0,9) (ialt 94,7 g).

' 6. Elastaseaktivitet: ingen.

7. Antigenaktivitet: iagttaget.

Protease-toxoidet kan fremstilles ud fra en af P. aeruginosa produceret protease ved omdannelse til toxoidet, f.eks. ved behandling med formaldehyd eller et oxymethansulfinat i nærværelse af en aminosyre (f.eks. lysin). Udgangsproteasen er kendt, og dens egenskaber og fremstilling er beskrevet i japansk patent hr. 479.828; K. Morihara et al., Biochem. Biophys. Acta, 73., 113 - 124, 125 - 131 (1963); K. Morihara et al., Biochem. Biophys. Acta, 92, 351 - 360, 361 - 366 (1964); K. Morihara et al., Arch.

• Biochem. Biophys., 114, 158 - 165 (1966); K. Morihara et al., Biochem. Biophys. Acta, 309, 414 - 429 (1973); K. Morihara et al., Agr. Biol. Chem., ^8, (3), 621 - 626 (1974).

Det følgende ér et typisk eksempel på fremstilling af protease-toxoidet:

Krystaller af proteasen fra P. aeruginosa (100 mg) opløses i en 0,1 M Na2HP0^-opløsning indeholdende 0,2 M lysin (ca. 20 ml), og der tilsættes hertil formalin til en slutkoncentration på ca.

8% (v/v). Blandingen henstår ved stuetemperatur i 3 dage eller mere og underkastes dernæst dialyse mod vand og dernæst lyofi-lisering til opnåelse af toxoidet.

De fysiske og kemiske egenskaber af det således fremstillede protease-toxoid er følgende: 1. Molekylvægt: 63,000 (gelfiltrering).

2. Ultraviolet absorptionsspektrum: maksimum 280 my (E^® = 9,27, 0,1 M KC1), minimum 250 my.

7 144753 3. Isoelektrisk punkt: pH 5/2 (fokal elektroforese).

4. Udseende: farveløst pulver.

5. Aminosyresairanensætning: Aminosyrerester (g/100 g protein): asparaginsyre (15,6), threonin (5,0), serin (7,6), glutaminsyre (9,5), prolin (2,1), glycin (7,7), alanin (8,5), valin (5,0), iso-leucin (3,9), leucin (8,7), tyrosin (6,9), phenyl-alanin (5,9), lysin (4,1), histidin (1,9), arginin (2,3), tryptophan (2,3), ammoniak (0,9) (ialt 94,7 g).

6. Proteaseaktivitet: ingen.

7. Antigenaktivitet: iagttaget.

Til fremstilling af tre-komponent blandingsvaccinen kan det infektions-beskyttende fælles antigen OEP, elastase-toxoidet og protease-toxoidet opløses i et opløsningsmiddel i et ønsket forhold. Om nødvendigt kan et hjælpemiddel og/eller et antiseptisk middel sættes til den resulterende opløsning.

Opløsningsmidlet kan være et vilkårligt, som er egnet til vacciner for mennesker og dyr. Specifikke eksempler er destilleret vand, fysiologisk natriumchloridopløsning og en fosfat-for-pufret natriumchloridopløsning.

Som hjælpemiddel kan anvendes et hvilket som helst konventionelt, såsom aluminiumhydroxid, aluminiumfosfat, calciumfosfat, alun eller Freund's ufuldstændige adjuvans. Mængden af hjælpemidlet kan vælges passende ud fra de mængder som er nødvendige og tilstrækkelige til at forøge immunoaktiviteten. Det antiseptiske middel kan også være et vilkårlig konventionelt, såsom thimerosal, phenol, carbolsyre eller formalin.

Forholdet mellem komponenterne i tre-komponent blandingsvaccinen kan efter ønske varieres inden for intervallet af effektive mængder for at forøge den beskyttende virkning som en forebyggende vaccine. Den effektive mængde af hver komponent af- 144753 8 hænger i betydelig grad af antallet af immuniseringer og immuniseringsintervallet. Den varierer også med formålet for vaccinens anvendelse (dvs. forebyggende brug eller terapeutisk brug).

Det følgende er eksempler på foretrukne doser og mængdeforhold af antigenerne: (i) For mennesker (og kvæg): Når immuniseringen foretages 2 til 3 gange pr. uge (uden hjælpemiddel) foretrækkes følgende forhold: OEP 0,1 γ/kg legemsvægt til 10 γ/kg legemsvægt; protease-toxoid ] γ/kg legemsvægt til 50 γ/kg legemsvægt; elastase-toxoid 1 γ/kg legemsvægt til 50 γ/kg legemsvægt. Afhængig af immuniseringstilstanden kan mængderne passende forøges.

(ii) Mink: a) Forebyggende vaccine: Når immuniseringen foretages to gange (under anvendelse af et hjælpemiddel) foretrækkes følgende forhold: OEP 10 γ/dyr til 2000 γ/dyr; protease-toxoid 10 γ/dyr til 2000 γ/dyr; elastase-toxoid 10 γ/dyr til 2000 γ/dyr.

Når immuniseringen udføres på én gang anbefales følgende forhold: OEP 500 γ/dyr til 2000 γ/dyr; protease-toxoid 500 γ/dyr til 4000 γ/dyr; elastase-toxoid 500 γ/dyr til 4000 γ/ b) Terapeutisk vaccine: Når immuniseringen udføres to til 3 gange ved et mellemrum på 1 uge (med eller uden hjælpemiddel) foretrækkes følgende forhold: OEP 0,1 γ/dyr til 100 γ/dyr; protease-toxoid 10 γ/dyr til 2000 γ/dyr; elastase-toxoid 10 γ/dyr til 2000 γ/dyr.

Den her omhandlede tre-komponent blandingsvaccine kan administreres til dyr eller mennesker ad den intramuskulære subkutane eller intrakutane vej.

9 144753

Toksiciteten af hver komponent i tre-komponent blandingsvaccinen er som følger:

Toksicitet af OEP: intraperitoneal injektion i mus med en dosis på 100 mg/kg fremkalder temporær asthenia, men dyrene dør ikke.

Pyrexia-inducerende egenskab af OEP: ved en sædvanlig pyrexiatest i kaniner iagttages en positiv effekt med en dosis på 0,3mg/kg.

I almindelighed er toksiciteten af OEP som endotoxinet ekstremt ringe i forhold til LPS (lipopolysaccharid) og OEP-LPS kompleks.

Toksicitet af elastase-toxoid og protease-toxoid: intraperitoneal administrering i mus ved en dosis på 1 mg/mus viser ingen akut toksicitet, den minimale dødelige dosis af protease er 0,2 mg/mus (i.p.) og for elastase er den 0,125 mg/mus (i.p.)·

Ved immunisering med den her omhandlede tre-komponent blandingsvaccine forøges beskyttelseseffekten mod infektioner forårsaget af P. aeruginosa betydeligt i forhold til immuniseringen med den simple vaccine, der alene omfatter OEP. Den her omhandlede tre-komponent blandingsvaccine er derfor særlig velegnet til forebyggelse og behandling af infektioner forårsaget af P. aeruginosa i dyr og mennesker.

Sidste trin af fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses nærmere i de følgende eksempler.

ίο 144753

Eksempel 1.

(1) Protease-toxoid-kaliumalun-opløsning: Protease-toxoid (100 mg) opløses i en fosfat-forpufret vandig natrium-chloridopløsning (M/15, pH 7,4) (PBS) (24,8 ml) og der tilsættes hertil en 10% kaliumalunopløsning [I^A^ (SO^) ^,24^0] (2,5 ml).

Til den resulterende opløsning sættes yderligere 20% Na^PO^, ^^O-opløsning (2,5 ml), og pH-værdien indstilles på 6,5 for at bevirke fuldstændig udfældning. Endelig sættes hertil 1% thimerosalopløsning (0,3 ml) som antiseptisk middel (1 mg protease-toxoid/0,3 ml).

(2) Elastase-toxoid-kaliumalun-opløsning: Fremstillingen foretages på samme måde som nævnt ovenfor men ved anvendelse af elastase-toxoid i stedet for protease-toxoid.

(3) OEP-kaliumalun-opløsning: OEP (100 mg) opløses i 0,01 N NaOH-opløsning (5 ml), og PBS (28 ml) tilsættes hertil.

Til den resulterende opløsning sættes i rækkefølge 10% Kalium-alun-opløsning (3,3 ml) og 20% Na2HPO^-opløsning (3,3 ml) og endelig tilsættes 1% timerosalopløsning (0,4 ml) (1 mg OEP/0,4mL).

(4) Umiddelbart før brugen sammenblandes den således fremstillede protease-toxoid-kaliumalun-opløsning, elastase-toxoid-kaliumalun-opløsning og OEP-kaliumalun-opløsning. 0,5 ml af denne blandede opløsning indeholder 500 γ protease-toxoid, 500 γ elastase-toxoid og 500 γ OEP.

Eksempel 2.

Analogt med Eksempel 1 bortset fra at der anvendes 10% aluminiumhydroxidopløsning i stedet for 10% kaliumalunopløsning, fremstilles en protease-toxoid-aluminiumhydroxid-opløsning, elastase-toxoid-aluminiumhjdroxid—opløsning og OEP-aluminium-hydroxidopløsning.

Umiddelbart før brugen blandes de 3 således fremstillede opløsninger sammen.

Det fremgår tydeligt af de nedenfor refererede forsøgsresultater, at den her omhandlede tre-komponent blandingsvaccine ud- 144753 11 viser en langt højere virkning for forebyggelse af infektioner forårsaget af P.aeruginosa end den simple vaccine, som alene indeholder OEP.

Forsøg 1.

PHA-værdi (passiv hemaglutinering) i sera hos minke immuniseret med simpel vaccine indeholdende OEP alene eller trekomponent blandingsvaccinen indeholdende OEP, protease-toxoid og/eller elastase-toxoid samt beskyttelsesvirkning mod infektion: (1) Metode:

Dyr: 5 til 6 måneder gamle hunminke (sapphire).

Applikation af vaccine: subkutan eller intramuskulær injektion.

Angrebstest: Der anvendes stamme nr. 5 af P.aeruginosa, som producerer både protease og elastase. Infektion af levende bakterier foretages ved at hælde bakterieopløsningen (0, 5 ml) i nasal-kaviteten ved hjælp af et vinylformstofrør under ether-anæstesi.

Bestemmelse af PHA-værdi: Protease PHA-værdi og elastase PHA-værdi måles i henhold til den metode, der er beskrevet i J. Y. Homma et al., Japan. J. Exp. Med., 4j>, 361 - 365 (1975).

OEP-PHA-værdi måles i henhold til den metode, der er beskrevet i T. Tomiyama et al., Japan. J. Exp. Med., £3, 185 - 189 (1973).

Infektion og immunisering: Immuniseringstidspunkt, dosis, infektionstidspunkt og autopsitidspunkt er vist i Tabel I.

144753 12

Tabel I.

immuniseringsdato angrebs- autopsi- , . *) tidspunkt tidspunkt

Dyr Antigen 18/8 30/8 18/9 grup- OEP 500 γ 500 γ 1000 γ 19. dag 13. dag efter efter an- PS A injek- 3reb tion til immunisering grup- OEP 500 γ 500 γ 1000 γ 19. dag 13. dag _ o , efter efter an- pe B + -i * injek- greb prote- tion ase- 1000 γ 500 γ 1000 γ til immu- toxoid nisering + elasta- 1000 γ 500 γ 1000 γ se- toxoid

Note: *) Den simple og tre-komponent blandingsvaccinen indeholder 1% kaliumalunopløsning som hjælpemiddel.

(2) Resultater:

Der henvises til tegningen hvor, fig. 1 viser ændringen i OEP-PHA-værdien i sera fra minke immuniseret med OEP-vaccinen eller tre-komponent blandingsvaccinen, og fig. 2 viser protease-PHA-værdien og elastase-PHA-værdien i sera fra minke immuniseret med tre-komponent blandingsvaccinen.

(i) I de i fig. 1 viste resultater er gruppe A immuniseret med OEP og gruppe B immuniseret med 3-komponent vaccinen. Antistof-værdien er målt d. 17. august, dagen før podningen, og det ses, at OEP-PHA-værdierne i sera på den 31. dag og den 49. dag efter påbegyndelse af immuniseringen er næsten identiske (32 - 256). Ingen væsentlig forskel iagttages mellem grupperne A og B.

13 1U753 (ii) Som det tydeligt fremgår af fig. 2 forøges protease-PHA-værdien betydeligt og forbliver på det høje niveau indtil tidspunktet for angrebet med levende bakterier. Elastase-PHA-værdien er endnu ikke steget den 31. dag efter påbegyndelsen af immuniseringen hos ca. 2/3 af minkene, men er noget forøget den 49. dag hos ca. halvdelen af minkene.

(iii) Minkene underkastes levende bakterieinfektion (angrebstest) for at undersøge immuniseringseffekten af OEP-vaccinen og tre-komponent blandingsvaccinen. Resultaterne er vist i Tabel II.

144753

I i l I I I 1 1 1 I I I I I

J8- u 0)

4J

0

P

ft

+ (D

n tn

Pi -H

H _j

C> H

·· Ό Ρ Π

2 19 - M

5 B n <U Ό 0 u i ,2 u.

3 h <d v > 'Ο m _ ih ™ tD G 3 . irt m S 5» , * “ g

1 iS . 5 "o' Ά S

5 - + I Η H (0

» rn 4- *P

^ «+ H Η X Ρ H

(DO * G 2 -P ft-H 1 1 + + <n (d (0 rj ft 0 I · ^ Λ ** , ®

m Ο M I I 1-1 Η Η Ρ P

1 It i ! ! “ + * 29 6 p p -a M g ω 2 -------------—--<u ό p •f ' _ . (0 3 0 1 m ni u Η Ρ &1

Hr a · g a) ^ u <d <d ρ p

m rrt Ρ Μ G P

Ο Φ H O' 0 ° 5 to <D <D Ό m — 0) > P _ 2 m cm P (D (D 3

.5 m — G Η Λ P

μ Η I I + (DPP

2 £ A ~ — P (ϋ Ό

2 c Η n n /-. id > (D P

f A + + +^.HPpil· Η Λ ! I H Η H VO 0(D3^ Η ο ι — — ^ ο οκ «β μ ° I + + +H3>,fi(D0 »I ι f£ » ^-s. ·"—» **->· 0) -Ρ Øj ^ \/

Π3 Η CN] Ή Η *—I X !^1 S

Λ1 --- w w s—' W Γ"I Λ ·Ρ

ρ ft + + + + +^.51ii<uP

V* Πι «*-»*. «—s. s Π I Ό fli

φ 3 Η ΟΙ Η Η HH HS

Ρ Οι + + + + + V|1 sLjj ^ Ί5 ® G~< % Ρ^ ^ £Ρ§ ^ _;--.--------------0) G ρ ·θ· η m - 3 (Di»g

SjP JK Ρ ft G Ρ λ.

mm 3 (0 tn 0 2 S Η η Ό <D Ρ Π •Η Η —. . — Ο 3 Ή Ρ nj cj cj<D r- cm rr cm H Η Ό. P (D (D ^ 3 Sq. — — — — — Oil) Λ l?j Ι Λ S- . + + + + + * ut

5 fl)d s ^ H§-HrO

Η Λ M CM Η Η Η H

w w ^ ^ w ΝΌΗ-Ρη + + + + + m><HHPh

______:_______(DP Ρ P

Λ Ό o PC C -r* . (DO + P ¥ rfr H HP inmOvor^r'eooocnc^ H P P oooooooo-oo

r4 <ΰ X HH HHHHHPPP o(D

ω Ρ4ίΗΡ X X X X X X X x x X cTo § ^ΛΡΡ- CM VO CM VO CM O CM O CM VO iP g 6 l ... .........ρ---- 144753 15 I tilfældet OEP alene (gruppe A), er LDg^-værdien 3,6 x ΙΟ** eller mindre. Ved gruppe B, som er immuniseret med trekomponent blandingsvaccinen er LD5Q-værdien derimod større end 1,9 x 10^ og således oplagt forskellig fra gruppe A. I den ube- 3 handlede gruppe er LD5Q-værdien 3,4 x 10 . Ved immunisering med OEP er LD^-værdien sædvanligvis omkring 100 til 1000 gange mængden af levende bakterier i forhold til den ubehandlede gruppe. Ved anvendelse af tre-komponent blandingsvaccinen indeholdende protease-toxoid og elastaser toxoid udover OEP opnår 4 5 de immuniserede dyr resistens overfor ca. 10 til 10 gange mængden af levende bakterier i forhold til LD^^-værdien for den ubehandlede gruppe.

På grundlag af resultaterne af dette forsøg kan det antages, at 3-komponent blandingsvaccinen er en nærmest ideel vaccine til forebyggelse af infektioner forårsaget af P. aeruginosa.