KR20180096651A - 정제된 재조합 콜레라 독소 B(rCTB)를 제조하는 신규한 방법 및 그의 제제 - Google Patents

정제된 재조합 콜레라 독소 B(rCTB)를 제조하는 신규한 방법 및 그의 제제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 비브리오 콜레라균(Vibrio cholera) 및 장독성 대장균(Enterotoxigenic Escherichia coli:ETEC)과 같은 다양한 박테리아에 의해 유발되는 설사에 대한 보호를 제공하는 정제된 재조합 콜레라 독소 B(recombinant cholera toxin B: rTCB)를 제조하는 신규한 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은 현저히 더 높은 수율 및 더 높은 순도를 갖는 rCTB를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 비브리오 콜레라균에 대한 상승 보호 및 장독성 대장균(Enterotoxigenic Escherichia coli:ETEC)에 대한 교차 보호를 갖는 백신 제제에 관한 것이다.

Description

정제된 재조합 콜레라 독소 B(rCTB)를 제조하는 신규한 방법 및 그의 제제
본 발명은 비브리오 콜레라균(Vibrio cholera) 및 장독성 대장균(Enterotoxigenic Escherichia coli:ETEC)과 같은 다양한 박테리아에 의해 유발되는 설사에 대한 보호를 제공하는 정제된 재조합 콜레라 독소 B(recombinant cholera toxin B: rTCB)를 제조하는 신규한 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은 현저히 더 높은 수율 및 더 높은 순도를 갖는 rCTB를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 전체세포의 불활성화된 콜레라 균주와 함께 제제화될 때 상승 효과를 갖는, 비브리오 콜레라균 및 장독성 대장균(ETEC)에 대한 정제된 rCTB 백신 제제를 개시한다.
설사병은 공중 보건에 대한 지속적인 세계적 위협이다. 설사의 주요 원인은 특정 박테리아, 바이러스 또는 기생충, 음식물 불내성(food intolerance) 등을 포함한다. 유아 및 성인 설사의 주요 원인 중 하나는 비브리오 콜레라균이다.
비브리오 콜레라균은 상피로 침입하지 않으면서 소장에 서식하고 급성 장 콜레라 감염을 유발하는 그람 음성 박테리아이다. 비브리오 콜레라균의 200개 이상의 혈청군(serogroup)이 확인되었지만, 콜레라 대부분은 2개의 혈청군, O1 및 O139에 의해 유발된다. 이 질병은 비브리오 콜레라균이 오염된 음식물 또는 식수를 통해 섭취되었을 때 유발된다. 인간에게만 영향을 미치는 콜레라는, 장내 비브리오 콜레라균에 의해 분비되고 소화관 점막 세포에 작용하여 심각한 탈수 및 쇼크를 유발할 수 있는 다량, 무통, 물설사를 유발하는, 콜레라 독소(cholera toxin: CT)에 의해 매개된다. 이것이 만약 치료되지 않고 방치된다면, 수 시간 내에 사망에 이를 수 있다. 매년 콜레라에 의한 사망자(mortality)는 28,000명 내지 142,000명이고, 이환자(morbidity)는 140만 내지 430만 명인 것으로 추정된다. 자연적이거나 인공적인 재해로 인해 그것은 유행성으로 발생하며, 또한 많은 개발도상국에서 풍토병이다. 그러한 재앙에서 그리고 풍토병인 국가에서, 깨끗한 식수 및 적절한 위생은 이용할 수 없고 따라서 백신의 개입이 필수적이다. 2010년, WHO는 콜레라가 풍토병인 국가 및 콜레라 유행 국가 모두에 다른 통제 수단과 함께 경구 콜레라 백신 사용을 권고했다[Cholera - fact sheet N107. World Health Organization. 2012, pp. Cholera - fact sheet N107].
WHO 사전 인증된 현재 이용 가능한 경구 콜레라 백신이 3개 존재한다:
1. 전체세포 성분 및 재조합 콜레라 독소 B-서브유닛(recombinant cholera toxin B-subunit: rCTB)을 포함하는 Dukoral®: 및
2. rCTB는 없지만 O1 혈청군에 더하여 O139 혈청군의 비브리오 콜레라균 균주를 포함하는 Shanchol®/Euvichol®.
rCTB를 포함하지 않는 전체세포 사백신(killed vaccine)에 비해 rCTB를 포함하는 전체세포 사백신이 더 나은 보호를 제공한다는 것이 잘 알려져 있다. 열민감성 장독소(heat labile enterotoxin: LTB)에 대한 항-CTB 항체의 교차 반응성으로 인해, rCTB를 포함하는 전체세포 사백신(Dukoral) 또한 장독성 대장균(ETEC)에 대해 효율적이다[Lucas M.E, Deen J.L, Von Seidlein L, Wang X.Y, Ampuero J, Puri M, Ali M, Ansaruzzaman M, Amos J, Macuamule A, et al. 'Effectiveness of mass oral cholera vaccination in Beira, Mozambique.' N. Engl. J. Med. 2005, 352, 757-767.]. Shanchol은 rCTB 성분이 없으며 따라서 단기 ETEC 교차 보호, 상승 보호 효과(항-박테리아 + 항독소 면역), 조기 및 장기 보호 등과 같은 장점이 없다. 따라서, 경구 콜레라 백신에 rCTB가 포함되는 것이 더 낫다.
rCTB는 산 민감성이며 따라서 Dukoral 백신은, 5세 이하뿐 아니라 성인에게도 투여를 어렵게 하는 백신 투여에 앞서 75-150mL의 중탄산(bicarbonate) 버퍼와 함께 투여되어야 한다. 또한, Dukoral에서 상기 버퍼 주머니는 개봉되어야 하고 그 내용물에 유리 바이알의 백신을 첨가하고 혼합한 후 필요한 양의 물에 용해시켜야 한다. 이러한 추가적인 복용 준비 단계는 백신을 사용하기에 불편하고 성가시게 한다.
Dukoral의 복용량 당 가격이 $45 이상, Sahcnol의 복용량 당 가격이 $5인 Dukoral/Sanchol의 비교에서 분명히 알 수 있듯이, 경구 콜레라 백신에 있어서 rCTB의 부가는 백신 비용의 증가로 이어질 수 있다. rCTB를 포함하는 경구 콜레라 백신의 비용 효율이 높아질 수 있는 한 가지 방법은 쉽고 효율적인 정제 방법을 사용하여 높은 배양물 OD 및 높은 rCTB 수율을 제공하는 rCTB 발효 및 정제 방법을 개발하는 것이다.
rCTB의 제조 및 정제에 관한 많은 특허 및 비특허 공개가 존재한다. 비특허 공개 논문 'Recombinant system for overexpression of cholera toxin B subunit in Vibrio cholerae as a basis for vaccine development', PNAS, 1989, Vol 86, Pg 481-485는, 친화도 크로마토그래피 컬럼을 이용하여 수득되는 가장 좋은 수율은 제조 관점에서 전혀 비용 효율이 높지 않은 75ug/ml이었다고 개시하고 있다. 다음의 제목을 갖는 다른 비특허 문헌 'Cholera Toxin B: One Subunit with Many Pharmaceutical Applications,' Toxins 2015, 7, 974-996은 rCTB 제조에 사용되는 발현 시스템 모드와 날짜 및 사용된 정제 방법까지 완전한 목록을 개시하고 있다. 이 데이터는 현재까지 1gm/Lt 이상의 rCTB 수율이 현재까지 달성되지 못했음을 나타낸다.
상기 선행기술에 비추어볼 때, 이 분야에서의 진정한 공헌은 현저하게 더 높은 수율 및 높은 순도를 갖는 재조합 콜레라 독소 B의 생산 및 정제 방법을 개발하는 것이다. 또한, 내열성이고, 버퍼 투여 필요성을 제거하고 백신 전달을 용이하게 하는 제제 및 제형을 개발할 필요성이 있다.
발명의 목적
본 발명의 주 목적은 정제된 재조합 콜레라 독소 B(rCTB)를 제조하는 신규한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 현저하게 높은 수율 및 높은 순도를 갖는 정제된 재조합 콜레라 독소 B(rCTB)를 수득하는 발효 및 정제 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 단순하고 효율적인 방법에 의해 매우 짧은 시간 동안 원하지 않는 불순물은 제거하면서 정제된 재조합 콜레라 독소 B(rCTB)를 수득하기 위한 발효 및 정제 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 확장 가능하고, 시간이 덜 들고, 비용 효율이 높고, 환경친화적이고 저렴한 정제된 재조합 콜레라 독소 B(rCTB)를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 비브리오 콜레라균에 대한 신규한 백신 제제에 사용될 수 있는 정제된 재조합 콜레라 독소 B(rCTB)를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 비브리오 콜레라균에 대한 조기, 장기 및 상승 보호 및 ETEC에 대한 교차 보호를 제공하는 경구 콜레라 백신에 사용될 수 있는 신규한 백신 제제를 제공하는 것이다.
발명의 요약
따라서, 본 발명은 현저하게 높은 수율 및 높은 순도를 갖는 정제된 재조합 콜레라 독소 B(rCTB)를 제조하는 신규한 방법을 제공한다. 본 발명의 rCTB의 제조 방법은 확장 가능하고, 시간이 덜 들고, 박테리아 균주가 발효조 내에서 불활성화되어 환경을 오염시킬 가능성을 최소화하기 때문에 환경친화적이다.
본 발명은 또한 비브리오 콜레라균 전체세포 사백신을 갖는 rCTB의 백신 제제 및 상기 제제의 환자 순응에 적합한 내열성 제형에 관한 것이다.
본 발명의 방법은 하기의 비제한적 예시에 의해 설명된다.
상시적으로 또는 유도성으로 rCTB를 과발현하는 재조합 O1 비브리오 콜레라균 균주는 스웨덴 고텐버그(Gothenberg) 대학의 Jan Holmgren 교수의 실험실에서 제조되었으며 기정의된 배지의 마스터 및 워킹(working) 세포 은행을 제조하기 위해 사용되었다.
본 발명에서, 상기 선별된 균주는 기정의된 조건에서 유지된 발효조에 가해진다. 발효 배지는 글루코스 공급원 및 기타 공지된 배지 구성을 포함한다. 발효조는 기결정된 pH 및 온도를 유지하면서 18-22시간 동안 작동되도록 허용된다. 결과물인 발효된 배양물은 불활성화된 세포, 변성된 단백질 및 rCTB를 포함하는 수확물(harvest)을 수득하도록 열에 의한 불활성화를 위해 기결정된 온도 범위로 처리된다. 수확물은 상온에서 기결정된 rpm에서 원심분리된다. 결과물인 상청액이 산 석출(acid precipitation) 및 초미세여과(ultrafiltration) 처리되어 정제된 rCTB를 수득한다. 수득된 여과물이 정용여과(diafiltration)되고 나서 멸균여과(sterile filtration)되어 정제 및 멸균된 rCTB를 수득한다.
결과물인 정제 및 멸균된 rCTB는 특징분석 및 정량화된다. 원하는 순도를 HPLC로, 수율을 GM1 ELISA 및 SDS-PAGE로 확인한 후, 정제 및 멸균된 rCTB는 원하는 제형으로 제제화되는 데 사용된다.
rCTB를 정제하는 데 사용된 본 발명의 방법은, 선행기술에 비해 현저히 높은 수율 및 높은 순도와 같은 많은 장점을 나타낸다. 본 발명은 또한 rCTB를 제조하고 정제하는 강력하고 신속한 방법을 제공한다. 상기 방법은 단위 조작의 수를 줄이고 rCTB를 정제하기 위한 비싼 컬럼 크로마토그래피의 사용을 피하기 때문에 비용 효율이 높다. 추가적인 장점은 상기 방법이 산업적으로 확장가능하다는 것이다. rCTB의 존재로 인해 상기 백신 제제는 또한 비브리오 콜레라균에 대한 상승 보호 작용을 제공한다. rCTB가 전체세포 불활성된 콜레라 균주와 함께 제제화될 때, 백신 제제는 ETEC에 대한 교차 보호를 제공한다.
도 1: 균주 MS1012의 발효 동안의 생장 곡선
도 2: rCTB의 시차 주사 열량측정법(Differential scanning calorimetry: DCS)
도 3: 정제된 rCTB의 HPLC 프로파일
도 4: 정제의 다른 단계에서의 끓인(boiled) rCTB 샘플의 SDS PAGE
도 5: (A) 끓인 또는 끓이지 않은 rCTB 샘플의 SDS-PAGE
(B) rCTB의 웨스턴 블롯
도 6: rCTB의 정량화를 위한 농도 측정 결과
도 7: rCTB 발효 및 정제 배치(batch)의 일정성 실행을 위한 SDS PAGE
도 8: 발효 및 정제의 개략도
발명의 상세한 설명
따라서, 본 발명은 1.5-2.5gm/L 범위의 높은 수율 및 >95%의 순도를 갖는 재조합 콜레라 독소 B를 제조하는 방법에 관한 것이다. rCTB를 과발현하는 재조합 비브리오 콜레라균 균주 MS1012는 스웨덴의 Gotovax AB에 의해 개발되었다. 상기 균주는 스웨덴 Gotovax AB 및 MSD Wellcome Trust Hilleman Laboratories Pvt. Ltd의 공동 작업의 일부로서 Hilleman Labs에 의해 수령되었다. 방법 개발, 상기 균주로부터의 rCTB의 정제, 정량화 및 특징분석은 Hilleman Labs에 의해 수행되었다.
본 발명의 바람직한 구현예의 설명에 앞서, 본 발명은 다양할 수 있기 때문에, 설명된 특정 물질에 제한되지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 또한 본 발명에 사용된 용어는 특정 구현예만을 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범위를 어떤 식으로든 제한하려는 의도가 아니라는 것이 이해되어야 한다.
본 명세서에서 사용된 단수 형태 “하나(a)”, “하나(an)”, 및 “그(the)”는 문맥상 명확하게 달리 지시하지 않는 한 복수 형태를 포함한다는 것을 유의해야 한다.
rCTB를 과발현하는, 선별된 재조합 비브리오 콜레라균 균주 MS1012는 기정의된 배지에서 배양되고 기정의된 조건에서 하룻밤 동안 인큐베이션된다. 상기 선별된 균주는 그리고 나서 글루코스 공급원의 존재 하에 7.2 내지 7.5 범위 내의 pH 및 35℃ 내지 37℃ 범위 내의 온도를 유지하면서 18-22시간 동안 발효되며, 그 이후 발효된 배양물을 60℃ 내지 70℃ 범위 내의 고온으로 30분 동안 가열한다.
결과물인 발효된 배양물은 그리고 나서 불활성화된 세포 및 변성된 단백질을 제거하기 위해 원심분리된다.
결과물인 상청액은 그리고 나서 초미세여과 처리된다. 그렇게 수득된 여과물을 500Kda 초미세여과막을 이용하여 초미세여과한다. 잔여물은 폐기되고 투과물은 수집된다. 그렇게 수득된 투과물은 헥사메타인산나트륨(sodium hexametaphosphate)의 존재 하에 산 석출 처리된다. 수득된 석출물은 원심분리된다. 상청액은 폐기되고 그렇게 형성된 펠렛은 수집되어 버퍼 용액, 바람직하게는 pH 7.4의 인산 버퍼에 용해된다. 결과물인 펠렛 버퍼 용액은 배지 구성을 제거하기 위해 추가로 10Kda 막을 이용하여 초미세여과된다. 잔여물은 수집되고 0.22μm 막에 의해 멸균여과된다. 결과물인 정제 및 멸균된 rCTB는 rCTB의 특징분석 및 정량화 처리된다.
rCTB의 순도는 HPLC 및 Novex Tris-Glycine Gels 14% 상의 SDS-PAGE에 의해 확인된다. HPLC 프로파일(도 3)은 95% 이상의 순도를 확인한다.
rCTB의 추가적인 특징분석은 LT39 단일클론 항체를 이용한 웨스턴 블롯에 의해 수행된다. rCTB의 정량화는 GM1 ELISA에 의해 수행된다. ELISA 및 SDS-PAGE 농도 측정 결과는 서로를 뒷받침했다. rCTB의 전체 수율은 1.5 내지 2.5 gm/L였다.
원하는 순도 및 수율 달성 후, 정제 및 멸균 여과된 rCTB는 제제화 단계에 적용되었다.
정제된 rCTB는 자연적으로 분리된 불활성화된 전체세포 O1 비브리오 콜레라균 균주와 Ogawa Inaba 혈청형 또는 Ogawa 및 Inaba를 동시에 발현하는 재조합적으로 제조된 Hikojima 균주와 혼합되어 1.5ml의 불활성화된 비브리오 콜레라균 박테리아 현탁액 당 1mg의 rCTB를 생산한다. 결과물인 현탁액은 수크로스 존재 하에 바이알 또는 트레이에서 동결 건조된다. 동결 건조 사이클은 28시간이다. 압력 제어를 동시에 유지하면서 보관 온도를 30℃ 내지 50℃에서 유지한다. 동결 건조된 물질은 트레이에서 질소 챔버 내의 밀폐용기로 옮겨지고 사용될 때까지 4℃에서 저장된다.
결과물인 동결 건조된 물질은 원하는 제형, 더욱 바람직하게는 정제(tablet)로 제제화될 수 있다. rCTB는 사멸된 전체세포 비브리오 콜레라균과 조합되어 특히 소장(small intestine; GI tract)의 덜 산성인 영역에서 rCTB & 불활성화된 전체세포 비브리오 콜레라균을 용해 및 방출시키는 내산성 보호 중합체로 장용 코팅된 정제로 제제화된다. 장용 코팅은 섭식 또는 절식 상태에 관계없는 위(stomach)의 산성 환경으로부터 보호하면서 rCTB를 소장에서 방출되도록 허용한다. 상기 제제는 5세 이상의 콜레라 풍토병 또는 전염병 지역의 여행자 또는 대상자에게 블리스터/스트립(blister/strip) 포장 내의 고체 제형으로 설계 및 포장 및 판매된다.
따라서, 본 발명은 현저하게 높은 수율 및 높은 순도를 제공한다. 상기 방법은 총 시간을 줄이고 rCTB를 정제하는 데 필요한 비싼 크로마토그래피 매트릭스의 사용을 피하기 때문에 비용 효율이 높다. 본 발명은 또한 ETEC에 대한 교차 보호 및 비브리오 콜레라균에 대한 상승 효과를 제공하는, 바람직하게는 고체 제형, 더욱 바람직하게는 정제 형태인, 제형의 신규한 백신 제제를 제공한다. 도 8에 발효 및 정제의 개략도가 나타나 있다.
상기 방법의 상세한 설명은 다음의 비제한적 실시예에 의해 설명된다:
실시예 1: 재조합 콜레라 독소 B(rCTB)의 발효 및 정제
MS 1012 균주는 Luria Bertini, MS 배지(카사미노 산(Casamino acid), 20gm; 수크로스, 2.5gm; Na2HPO4.2H2O, 6.27gm; K2HPO4, 5gm; NH4Cl, 1gm; Na2SO4, 0.089gm; MgCl2.6H2O, 42mg; MnCl2.4H2O, 4mg; FeCl3.6H2O, 5mg) VCG 배지 (카사미노 산, 30gm; 효모 추출물, MgSO4.7H2O, 0.02gm; L-트립토판, 0.05gm; KH2PO4, 0.13gm; Na2HPO4.2H2O, 0.87gm; 수크로스, 3.4gm), rCTB 제조 배지(카사미노 산, 30gm; 수크로스, 2.5gm; Na2HPO4.2H2O, 6.27gm; K2HPO4, 5gm; NH4Cl, 1gm; Na2SO4, 0.089gm; MgCl2.6H2O, 42mg; MnCl2.4H2O, 4mg; FeCl3.6H2O, 5mg) 등과 유사한 배지의 1.5% 한천 평판 상에서 워킹 시드 로트(working seed lot)로부터 재사용되었고 하룻밤 동안 37℃에서 인큐베이션되었다.
이 플레이트로부터 3개의 콜로니가 Luria Bertini, MS 배지, VCG 배지, rCTB 제조 배지 등과 유사한 35ml의 배지에 옮겨지고 배양물을 37℃에서 흔들면서(180 rpm) OD600까지 중기 대수증식기(mid-log phase) 또는 0.9-1.5/ml로부터 성장시킨다. 이 배양물의 35ml는 5리터 발효조 내에서 카사미노 산, 30gm; 수크로스, 2.5gm; Na2HPO4.2H2O, 6.27gm; K2HPO4, 5gm; NH4Cl, 1gm; Na2SO4, 0.089gm; MgCl2.6H2O, 42mg; MnCl2.4H2O, 4mg; FeCl3.6H2O, 5mg;를 포함하는 rCTB 제조 배지 2.5리터를 접종하는 데 사용된다. 발효조는 7.2 ± 1 내지 7.4 ± 1의 pH 범위, 37℃의 온도, 2 반응 부피/분의 에어레이션(aeration), 600rpm의 교반 조건 하에 유지되며 pO2가 30% 이하로 떨어지는 시점인 5시간의 발효 후 1M 글루코스 & rCTB 제조 배지를 포함하는 공급원이 0.3ml/분의 공급 속도로 주어진다. MS1012 균주의 발효된 배양물은 10-12 시간 내에 8-10의 OD600에 도달했다(도 1). 30%로 물에 희석된 Antifoam 204 (Sigma)는 거품을 조절하는 데 사용된다. 배양은 20시간 후 중단되고 발효조의 온도는 30분간 65℃로 상승되어 원하지 않는 박테리아 단백질을 석출한다. rCTB는 74℃까지 열 변성에 저항성을 가지며 따라서 석출되지 않는다(DSC, 도 2). 열처리된 발효 배양물은 상온에서 90분간 8000rpm으로 원심분리된다. 잔해를 폐기하고 상청액을 수집하여 500Kda 접선유동여과(tangential flow filtration: TFF) 처리하고, 잔여물을 폐기하고 투과물을 수집한다. 투과물은 2.5gm/lt 농도의 헥사메타인산나트륨 존재 하에, 6M HCl 다음 3M HCl을 이용하여 pH 4.5에 도달할 때까지 산 석출 처리된다. 이 산 처리된 500Kda 투과물은 2-8℃에서 60분간 8000rpm으로 원심분리된다. 상청액은 폐기되고 펠렛은 pH 7.4, 20mM 인산 버퍼 500-600ml에 용해되고, 그리고 나서 5X 10Kda TFF 처리되어 헥사메타인산나트륨 및 배지 구성을 펠렛으로부터 제거한다. 잔여물은 수집, 여과되어 0.22마이크론 필터로 멸균된다.
이것은 정제 및 멸균된 rCTB이다. 상기 개략도에 나타난 것과 같은 발효 및 정제 과정이 수행된다. rCTB 발효 및 정제를 위한 3회 일관된 실행이 상기 설명된 방법에 의해 수행된다.
실시예 2: 재조합 콜레라 독소 B의 순도, 특징분석 & 정량화
rCTB의 순도는 HPLC 및 SDS-PAGE에 의해 확인된다. 샘플은 TSKgel PWXL 보호 컬럼(6.0 X 40 mm, TOSOH)과 TSKgel 5000 PWXL(7.8 X 300 mm, 입자 크기 7 μm, TOSOH) 및 TSKgel 4000 PWXL(7.8 X 300 mm, 입자 크기 7 μm, TOSOH) 상에서 HPLC-SEC에 의해 분석된다. 이동상은 0.1M NaNo3, pH 7.2, 30분간 등용매 조건에서 유속 1.0 ml/분이다. 공극 및 총 컬럼 부피는 각각 덱스트란, MW 5,000,000-40,000,000 (HIMEDIA) 및 산화중수소(deuterium oxide; D2O, Merck)으로 결정되었다. 단백질 피크는 280 nm에서 탐지되었다. HPLC 프로파일(도 3)은 이 정제 과정이 >95% 순수한 rCTB를 제공했음을 나타낸다.
정제된 rCTB는 또한 Novex Tris-Glycine Gels 14% 상의 SDS-PAGE에 의해 확인되고 Gel Doc Imager를 사용하여 밴드 탐지가 수행된다(도 5A 및 도 5B). 겔은 12Kda의 주 밴드 하나만이 존재한다는 것을 분명히 나타낸다(도 5B). rCTB 순도의 결과는 하기의 표 1에 나타난 것과 같이 EMEA 설명서의 rCTB와 완전히 일치한다.
Figure pct00001
rCTB의 특징분석은 1:100 희석된 LT39 단일클론 항체 및 1:2000 희석된 염소 항-마우스 IgG-HRP를 이용한 웨스턴 블롯에 의해 수행되었다. 웨스턴 블롯을 위해, 끓인 또는 끓이지 않은 샘플이 SDS-PAGE에 가해졌다. 끓임으로 인해 60Kda 오량체 rCTB가 12Kda 단량체로 쪼개진다. 웨스턴 블롯 항체는 오량체만 인식하기 때문에, 웨스턴 블롯에서 60KDa의 오량체에 대한 밴드만 관찰되고 단량체의 밴드는 관찰되지 않는다(도 5(B)).
rCTB의 정량화는 앞서 설명된 것처럼 GM1 ELISA에 의해 수행된다[Identification of Escherichia coli　heat-labile enterotoxin by means of a ganglioside immunosorbent assay (GM1-ELISA) procedure. Curr. Microbio. 1978; 1: 19-23]. 간략하게, 0.3nmol/ml의 GM1이 ELISA 플레이트에 코팅된다. 샘플의 3배 희석이 이루어진다. 0.5ug/ml 농도의 정제된 CTB가 대조군으로 사용된다. 1:100 희석된 LT39 단일클론 항체가 1차 항체로 사용된다. 1:4000으로 희석된 염소 항-마우스 IgG-HRP가 2차 항체로 사용된다. rCTB 정량화는 또한 농도 측정에 의해 이루어지며, 그 결과는 도 6에 나타나 있다. ELISA 및 농도 측정 결과 모두 서로를 뒷받침했다. rCTB의 전체 수율은 1.5 내지 2.5gm/L이다. 3회 일관된 실행에서 rCTB의 수율은 2gm/L, 1.7gm/L 및 2.25gm/L이다(도 7).
실시예 3: 제제 및 타겟 산물 프로파일(Target Product Profile: TPP)
포르말린-사멸된 전체세포 비브리오 콜레라균 제제 및 rCTB(1.5ml의 포르말린-사멸된 비브리오 콜레라균 당 1mg)는 수크로스(2.5mg/ml) 존재 하에 동결 건조된다. 동결 건조 사이클은 28시간이다. 보관 온도는 40℃로 설정되고 압력은 922mbar로 조정된다. 동결 건조된 물질은 트레이에서 질소 챔버 내의 밀폐용기로 옮겨지고 사용될 때까지 4℃에서 저장된다. 이 제제의 TPP는 정제이다. 백신 정제 하나는 열-사멸된 전체세포 비브리오 콜레라균 및 rCTB(정제 당 100-150mg)의 활성 약학적 화합물을 포함했다. 정제에 사용되는 부형제는 미세결정 셀룰로스(25%-30%), 녹말(25%-30%), 마그네슘 스테아르산(0.5%-0.7%), 콜로이드 이산화규소(0.5%-1%)이다. 모든 재료의 혼합물은 정제 프레스기에서 직접 압축된다. 정제는 OPA dry(3-5%)로 밀봉 코팅되고 최종적으로 EUDRAGITL30D55/Acryl-EZEII(8-12%)로 장용 코팅된다.

Claims (11)

  1. 비브리오 콜레라균(Vibrio cholera)으로부터 정제된 재조합 콜레라 독소 B(recombinant cholera toxin B: rTCB)를 제조하는 신규한 방법으로서, 상기 방법은
    - rCTB를 발효하여 발효된 배양물을 수득하는 단계;
    - 발효된 배양물을 열 불활성화하여 수확물을 수득하는 단계;
    - 상기 수확물을 정제하여 정제된 rCTB를 수득하는 단계;
    를 포함하고, 상기 방법은 산업적으로 확장 가능하고, 비용 효율이 높으며, 고순도의 정제된 rCTB를 고수율로 수득하는 것인, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 수율은 1.5-2.5gm/L의 범위 내에 있고, 상기 순도는 95%보다 높은(>95%) 것인, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 발효 단계는
    (a) 비브리오 콜레라균의 선별된 균주를 기정의된 조건에서 발효조에 가하는 단계;
    (b) 기결정된 pH 및 온도에서 기결정된 시간 동안 발효조를 가동시켜 발효된 배양물을 수득하는 단계;
    를 포함하는 것인, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 기정의된 조건은 1M 글루코스(glucose) 공급원을 rCTB 배지에 첨가하는 것인, 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 기정의된 pH는 7.2-7.5의 범위 내에 있고, 상기 기정의된 온도는 35-37℃의 범위 내에 있고, 상기 기결정된 시간은 18-22 시간 범위 내에 있는 것인, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 발효된 배양물의 열 불활성화는 65℃± 5 ℃의 온도 범위에서 30 ± 15분 동안 수행되는 것인, 방법.
  7. 제1항의 백신 제제로서, 상기 백신 제제는 1.5ml의 불활성화된 전체 세포 천연형(natural) 또는 재조합 비브리오 콜레라균 당 1mg의 상기 정제된 rCTB를 포함하고; 25% 내지 30% 범위의 미세결정 셀룰로스, 25% 내지 30% 범위의 녹말, 0.5% 내지 0.7% 범위의 마그네슘 스테아르산, 0.5% 내지 1%의 콜로이드 이산화규소와 같은, 그러나 이에 제한되지는 않는 공지된 부형제를 포함하는 것인, 신규한 백신 제제.
  8. 제7항에 있어서, 상기 불활성화된 비브리오 콜레라균은 천연적으로 발생하거거나 재조합된 것인, 백신 제제.
  9. 제7항에 있어서, 상기 백신 제제는 비브리오 콜레라균에 대한 조기, 장기 및 상승 보호 및 ETEC에 대한 교차 보호를 제공할 수 있는 것인, 백신 제제.
  10. 제7항에 있어서, 상기 제제는 OPA dry(3%-5%)로 밀봉 코팅(seal coat)되고 최종적으로 EUDRAGIT L 30 D55/Acryl-EZE II (8%-12%)로 장용 코팅되는 것인, 백신 제제.
  11. 제7항에 있어서, 상기 백신 제제는 내열성이고 버퍼 투여 필요성을 제거하는 것인, 백신 제제.
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