FI62540C - Foerfarande foer framstaellning av elastastoxoid som anvaends vid framstaellning av mot pseudomonas aeruginosa-infektion verksam trekomponentvaccin - Google Patents

Description

62540

Menetelmä valmistaa elastaasitoksoidia, jota käytetään Pseudomonas aeruginosa-infektion vastaisen kolmikomponenttirokotteen valmistamiseksi - Förfarande för framställninq av elastastoxoid som används vid framställning av mot Pseudomonas aeruginosa-infektion verksam trekomponentvaccin

Jakamalla erotettu patenttihakemuksesta 770169 Avdelad ur patentansökan 770169

Oheisen keksinnön kohteena on menetelmä valmistaa elastaasitoksoidia, jota käytetään pseudomonas aeruginosa-infektion vastaisen kolmikomponenttirokotteen valmistamiseksi, jolla elastaasitoksoidilla on seuraavat ominaisuudet: 1) molekyylipaino: 47.000 (geelisuodatus), 2) UV-absorptiospektri: maksimi 278 mμ (E^7| = 21,2, 0,1 M KC1), minimi 252 mp, 3) isoelektrinen piste: pH 6,5 (elektroforeesi asetaatti-kalvolla), 4) ulkonäkö: väritön jauhe, 5) aminohappokoostumus: aminohapporyhmät (g/100 g proteiinia); asparagiinihappo (14,2), treoniini (5,0), seriini (5,6), glu-tamiinihappo (6,5), proliini (2,9), glysiini (5,6), alaniini (5,8), väliini (4,9), metioniini (2,9), isoleusiini (2,7), leusiini (4,3), tyrosiini (9,9), fenyylialaniini (7,0), lysiini (3,9), histidiini, (2,6), arginiini (6,5), kystiini/2 (1,2), tryptofaani (2,3), ammoniakki (0,9) (yhteensä 94,7 g), 6) elastaasiaktiivisuus: ei 7) antigeeniaktiivisuus: havaittu

Sekä lääketieteessä että eläinlääketieteessä P. aeruginosa aiheuttaa erilaisia tärkeitä ongelmia tyypillisenä patogeeninä opportunistisissa infektioissa, jotka ovat kiinnittäneet yhä enemmän huomiota lääketieteellisen hoidon edistyessä merkittävästi.

2 62540 P. aeruginosan aiheuttamia infektioita, erityisesti vakava-laatuisia, tapahtuu herkästi vastasyntyneessä lapsessa, kun immuniteetti on fysiologisesti riittämätöntä, potilaissa, joiden immuniteetti on pienentynyt syövän, leukemian, kudossiirrosten ja palovammojen johdosta, ja kun immuniteetti on heikentynyt lääkityksen johdosta.

Eläinlääketieteessä P. aeruginosan aiheuttama verenvuotokeuhko-kuume minkeillä ja P. aeruginosan aiheuttama utaretulehdus karjalla ovat vakava taloudellinen ongelma elintarviketeollisuudessa .

Viime aikoina on kehitetty muutamia antibiootteja P. aeruginosaa vastaan, mutta ne voivat tuskin olla tehokkaita, kun immuniteetti on riittämätöntä tai sen toiminta on pienentynyt elävässä ruumissa. Mitä taas tulee edellä mainitunlaisiin P. aeruginosan aiheuttamiin infektioihin eläinlääketieteessä, minkkejä on käytännössä mahdotonta ja kaupallisesti kannattamatonta hoitaa antibiooteilla antamalla antibioottia useille tuhansille ja jopa useille kymmenille tuhansille eläimille. Utaretulehdus ongelma karjalla omaa melkein samanlaiset olosuhteet. Tämän vuoksi on mitä toivottavinta voida käyttää immunoterapiaa kemoterapian asemesta tai yhdistettyä hoitoa niillä.

Immunoterapiassa on jo eristetty normaali antigeeni Original Endotoxin Protein, josta seuraavassa käytetään lyhennystä OEP, joka suojaa kaikkia P. aeruginosan aiheuttamia infektioita vastaan riippumatta serotyypin mukaisesta kannan laadusta (tällä hetkellä tunnetaan 13 laatua tai enemmän). Homma et ai on alkanut soveltaa tätä antigeeniä käytäntöön (J. Y. Homma et ai., Japan. J. Exp. Med., 45, 355 - 360 (1975); J.Y. Homma et ai., Japan. J. Exp. Med., £2, 23 - 34 (1972); J. Y. Homma, Microbial Drug Resistance, Tokyo University Press, Tokyo, 267 - 279 (1975); J. Y. Homma, The Fourth International Congress of Animal, Plant and Microbial Toxins, Plenum Publisher, London (1975)).

3 62540

Pseudomonas aeruginosa muodostaa proteaasia, elastaasia ja muita aineita bakterisolun ulkopuolelle. Näiden kahden entsyymin on osoitettu toimivan patogeenisinä tekijöinä (K. Kawaharajo et ai., Japan. J. Exp. Med., £5, 79 - 88 (1975); K. Kawaharajo et ai., Japan. J. Exp. Med., 45, 515 (1975); K. Kawaharajo et ai., Japan. J. Exp. Med., 44, 435 - 442 (1974); J. Y. Homma et ai., Japan. J. Exp. Med., £6, 245 - 246 (1976)). Tämä käy riittävän hyvin ilmi siitä seikasta, että potilaiden, jotka kärsivät P. aeruginosan aiheuttamasta kroonisesta hengitysteiden infektiosta, ja karjan, joka kärsii p. aeruginosan aiheuttamasta utaretulehduksesta, seerumissa on todettu korkeat proteaasin ja elastaasin antigeeniarvot sekä OEP-arvot (J. Y. Homma, Japan.

J. Exp. Med., £5, 361 - 366 (1975); Tomiyama et ai., Japan.

J. Exp. Med., 43, 185 - 189 (1973)).

Eläinkokeilla on osoitettu, että hyvin pieni määrä proteaasia tai elastaasia voi aiheuttaa ihokuolioita ja sarveiskalvon haavaumia ja aiheuttaa huomattavia patogeenisiä muutoksia sisäelimiin (K. Kawaharajo et ai., Japan. J. Exp. Med., £5, 79 - 88 (1975); K. Kawaharajo et ai., Japan. J. Exp. Med., 45, 515 (1975); K. Kawaharajo et ai., Japan. J. Exp. Med., £4, 435 - 442 (1974); K. Kawaharajo et ai., Japan. J. Exp. Med., £5, 89 - 100 (1975)).

Edelleen on osoitettu, että kun bakteereita, jotka muodostavat proteaasia ja elastaasia, ja bakteereita, jotka eivät näitä entsyymejä muodosta, siirrostetaan hiiren sarveiskalvoon, edelliset bakteerit aiheuttavat haavaumien muodostumista, kun taas jälkimmäiset eivät tätä tee. Tämä osoittaa, että näiden kahdenlaisten bakteereiden patogeenisissä ominaisuuksissa on ilmeinen ero (J. Y. Homma et ai., Japan. J. Exp. Med., £5, 515 (1975). Samanlaisia tuloksia saadaan suoliston vertailukokeissa.

Sen vuoksi jotta immunoterapia olisi riittävän tehokasta, meta-boliittien myrkyllinen vaikutus on neutraloitava ja bakteereiden kasvu on estettävä normaalilla infektiolta suojaavalla OEP anti- 62540 geenillä. Tämän saavuttamiseksi immunisointi on suoritettava proteaasi- ja elastaasitoksoideilla.

Vaikkakin OEP-rokotetta pidetään tehokkaana suojana P. aerugi-nosan aiheuttamia infektioita vastaan, laajan tutkimuksen avulla on yritetty löytää tehokkaampi rokote. Tutkimuksen seurauksena on havaittu, että kolmikomponenttinen sekarokote, joka on valmistettu sekoittamalla P. aeruginosasta saatua OEP:tä P. aerugi-nosasta saadun elastaasitoksoidin ja P. aeruginosasta saadun proteaasitoksoidin kanssa, omaa merkittävän tehon estettäessä ja hoidettaessa P. aeruginosan aiheuttamia infektioita verrattuna yksinkertaiseen rokotteeseen, joka sisältää pelkästään OEP:tä. Tämä keksintö perustuu edellä olevaan havaintoon.

Oheisissa kokeissa käytetty infektiolta suojaava normaali antigeeni OEP on tunnettu. Tällaisen OEP:n fysikaaliset ja kemialliset ominaisuudet sekä valmistusmenetelmä on kuvattu seuraavassa kirjallisuudessa: Japanilainen patenttijulkaisu (ei-tutkittu)

No. 40925/1973; J. Y. Homma et ai., Japan. J. Exp. Med., 42, 23 - 34 (1972); J. Y. Homma, Microbial Drug Resistance, Tokyo University press, 267 - 279 (1975); J. Y. Homma et al., Abstracts of Lectures at The 22nd Toxoid Symposium, 45 - 50 (1975).

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista se, että Pseudomonas aeruginosa-elastaasi deaktivoidaan formaldehydillä tai oksimetaanisulfiinihapolla ja dialysoidaan ja lyofilisoidaan.

Lähtöaineena käytetty elastaasi on tunnettu. Sen ominaisuuksia ja valmistusmenetelmää on kuvattu seuraavissa julkaisuissa; japanilainen patenttijulkaisu No. 27315/1965; K. Morihara et ai., J. Biol. Chem., 240, 3295 - 3304 (1965); K. Morihara, J. Bacteriol., 88, 745 - 757 (1964); K. Morihara et ai.,

Arch. Biochem. Biophys., 123, 572 - 588 (1968); K. Morihara et ai., Agr. Biol. Chem., 39, 1123 - 1128 (1975).

5 62540

Seuraavassa esimerkissä kuvataan elastaasitoksoidin valmistusta. Esimerkki

Puhdistettu elastaasiliuos (sisältää 10-15 mg entsyymiprote-iini/ml £50 mPU (proteinaasi yksikköä)/mg entsyymiproteiiniaj, 5 M natriumkloridia, 10 mM natriumasetaattia, 2 mM kalsium-kloridia ja 0,1 mM sinkkikloridia) laimennetaan boraattipus-kurilla (pH 9) entsyymikonsentraatioon 2-5 mg/ml (boraatin lopullinen konsentraatio noin 0,1 M), ja tähän lisätään formaliinia tai vaihtoehtoisesti oksimetaanisulfiinihappoa tai sen suolaa niin, että lopulliseksi konsentraatioksi saadaan 1 % (til./til.). Seos pidetään huoneen lämpötilassa. Deakti-vointi on melkein täydellinen yhden päivän kuluttua. Näin deaktivoitu elastaasiliuos dialysoidaan vettä vasten ja lyofilisoidaan toksoidiksi.

Edellä käytetty nimitys "mPU" tarkoittaa seuraavalla menettelyllä määritettyä proteinaasiaktiivisuutta:

Kaseiinia (2 % (til./til.); pH 7,4) (1 ml) sekoitetaan sopivalla tavalla laimennetun entsyymiliuoksen kanssa. Reaktion annetaan tapahtua 10 minuutin ajan 40°C:ssa, minkä jälkeen lisätään välittömästi reaktion pysäyttävää liuosta (sisältää 0,1 M trikloo-rietikkahappoa, 0,2 M etikkahappoa ja 0,2 M natriumasetaattia) (2 ml). Seos pidetään samassa lämpötilassa 20 minuuttia reagoimattoman kaseiinin saostamiseksi täydellisesti ja sen jälkeen seos suodatetaan. Suodoksesta (1 ml) määritetään tyrosiini Folinen menetelmällä. Tyrosiinin ly suuruinen kasvu 1 minuuttia kohti osoittaa proteinaasiaktiivisuutta 1 mPU.

Seuraavissa esimerkeissä A ja B on havainnollistettu keksinnön mukaan valmistetun toksoidin käyttöä kolnAkomponenttirokotteissa .

* 62540

Esimerkki A

(1) Proteaasitoksoidin-potaska-alunaliuos: proteaasitoksoidia (100 mg) liuotetaan fosfaattipuskuroituun natriumkloridin vesi-liuokseen (M/15, pH 7,4) (PBS) (24,R ml) ja tähän lisätään 10 %:sta potaska-alunan CK2AI2(S04)4·24H2OJ liuosta (2,5 ml). Saatuun liuokseen lisätään edelleen 20 %:sta Na2HP04·lPHpO liuosta (2,5 ml) ja pH säädetään 6,5:een tävdellistä saostumista varten. Lopuksi tähän lisätään antiseptisenä aineena 1 %:sta timerosaliliuosta (0,3 ml) (1 mg proteaasitoksoidia /0,3 ml).

(2) Elastaasitoksoidi-potaska-alunaliuos: valmistus suoritetaan samalla tavoin kuin edellä, mutta proteaasitoksoidin asemesta käytetään elastaasitoksoidia.

(3) OEP-potaska-alunaliuos: OEP:tä (100 mq) liuotetaan 0,01 N NaOH-liuokseen (5 ml) ja tähän lisätään PBS:ä (2R ml). Saatuun liuokseen lisätään peräkkäin 10 %:sta potaska-alunaliuosta (3,3 ml) ja 20 %:sta Na2HP04 liuosta (3,3 ml) ja lopuksi lisätään 1 %:sta timerosaliliuosta (0,4 ml) (1 mg OEP/0,4 ml).

(4) Välittömästi ennen käyttöä sekoitetaan keskenään edellä valmistettu proteaasitoksoidi-potaska-alunaliuos, elastaasi-toksoidi-potaska-alunaliuos ja OEP-potaska-alunaliuos. 0,5 ml tätä yhdistettyä liuosta sisältää 500Jf proteaasitoksoidia, 500y elastaasitoksoidia ia 500 OEPrtä.

Esimerkki B

Esimerkissä A kuvatulla tavalla valmistetaan käyttämällä 10 %:sen potaska-alunaliuoksen asemesta 10 %:sta alumiinihvdroksidiliuosta proteaasitoksoidi-alumiinihydroksidiliuosta, elastaasitoksoidi-alumiinihydroksidiliuosta ja OEP-alumiinihydroksidiliuosta.

7 62540

Edellä valmistetut kolme liuosta sekoitetaan yhteen välittömästi ennen käyttöä.

Jäljempänä esitettyjen kokeiden tulosten perusteella on ilmeistä, että keksinnön mukainen kolmikomponenttinen sekarokote ehkäisee paljon tehokkaammin P. aeruginosan aiheuttamia infektioita kuin yksinkertainen rokote, joka sisältää vain OEP:tä.

Koe 1 PHA (passiivinen hemaglutinaatio) arvo minkkien seerumissa, kun minkit on immunisoitu yksinkertaisella rokotteella, joka sisältää pelkästään OEP:tä, tai kolmikomponenttisella sekarokotteella, joka sisältää OEP:tä, proteaasitoksoidia ja elastaasitoksoidia, sekä suojaamisteho infektiota vastaan: (1) Menetelmä:

Eläimet: 5-6 kuukautta vanhoja naarasminkkejä (safiiri).

Rokotteen antamistapa: Ihonalainen tai lihaksensisäinen injektio.

Rasituskoe: käytetään P. aeruginosan kantaa n:o 5, joka tuottaa sekä proteaasia että elastaasia. Infektoiminen elävillä bakteereilla suoritetaan kaatamalla bakteeriliuosta (0,5 ml) nenäonte-loon vinyyliputken kautta eetterinukutuksessa.

PHA-arvon määrittäminen: proteaasi PHA-arvo ja elastaasi PHA-arvo mitataan J. Y. Homman et ai. kuvaamalla menetelmällä Japan.

J. Exp. Med., 4jj, 361 - 365 (1975). OEP-PHA arvo mitataan T. Tomiyaman et ai. kuvaamalla menetelmällä Japan. J. Exp. Med., 43, 185 - 189 (1973) .

OEP-rokote: 0,01 N natriumhydroksidiliuokseen, johon oli liuotettu OEP:ta lisättiin M/15 fosfaattipuskuria (pH 7,4). 10 %:sta 62540 KAI(S04)2*12H20-liuosta lisättiin 10:1 - tilavuussuhteessa ja tämän jälkeen lisättiin 20 %:sta Na2HP04-liuosta kunnes koko-liuoksen pH oli 6,5.

Proteaasi- ja elastaasitoksoidien rokotteet:

Molempien toksoidien M/15 fosfaattipuskuriliuoksiin lisättiin 10 %:sta KAI(S04)2*12H20-liuosta ja tämän jälkeen 20 %:sta NajHPO^j* 12H20-luosta kunnes liuoksen lopullinen pH oli 6,5. Sekarokotteita valmistettiin sekoittamalla OEP-liuosta elastaasi-toksoidiliuoksen ja proteaasitoksoidiliuoksen kanssa.

Seuraavassa taulukossa 1 on annettu immunointiaika, käytetyt annokset, infektointiaika ja ruumiinavausaika.

Taulukko I

Eläin Antigeeni Immunisointipäivä Infektointi Ruumiin- _päivä__avaus ___9/8 23/8 9/9 21/9__4/10

Ryhmä A OEP c 10% ka1(so4)2 200¾ 300y sooy c -5

----H C

Ryhmä B Proteaasitoksoidi S o l % KAl(S04)2 200¾ 300y 500y | £ ___g g c

Ryhmä C Elastaasitoksoidi h -h 1 % KA1(S04)2 200y 300y 500y g g ___w w •H Ή

Ryhmä D OEP 200y 300y 500y <| o

Proteaasitoksoidi 200y 300y 500^ !|lj '.h

Elastaasitoksoidi 1 % kakso4)2 20oy 300y sooy > G > c ----— at <1> :«0 0)

Ryhmä E 1 % KA1(S04)2 § ml $ ml $ ml «N at ---— i-H -n rH -o

Ryhmä F Immunoimaton____ 62540

Kokeiden tulokset: 12 päivän kuluttua viimeisestä immunoinnista suoritettiin infektointikannalla n:o 5 käyttämällä bakteeripitoisuuksia välillä 103 - 10^8. Tulokset on esitetty taulukossa II.

Taulukko II

Rokotetut Bakteerien FHA-arvo1 Minkkien lukumäärä ID50 e^“ ryhmät määrä (elä- _ ___ vien solu vien solujen OEP Proteaasi- iniek- eloon jen luku-_lukumäärä)_toksoidi_toituja jääneet määrä_ 1.5 x 106 768 < 80 5 2 A 1,5 x 107 1024 <80 5 3 (OEP) 1,5 x 108 1280 <80 5 0 57,5 x 106 1.5 x 109 2560 <80 4 0 __1,5 x 1010 4095_<_80_5_0__ 1.5 x 104 144 2304 5 5 1.5 x 105 64 1408 5 5 B 1,5 x 106 40 1792 5 5 2l,2 x 109 (Proteaa- 1,5 x 107 5 32 1400 5 5 sitoksoi- 1,5 x 108 < 40 1536 5 4 di)__1,5 x 109 < 40_4096_5_3_ 1.5 x 104 160 < 80 5 5 1.5 x 105 80 <32 5 5 C 1,5 x 106 80 5 80 5 42 (Elastaa- 1,5 x 107 S 64 <80 5 5 |7,5 x 108 sitoksoi- 1,5 x 108 <80 <80 5 4 di)__1,5 x 109 < 80_<_80_5_2______ D 1,5 x 106 288 1280 5 4 (OEP, 1,5 x 107 384 1920 5 4

Proteaasi s 1,5 x 108 1088 1664 5 3 51,9 x 108

Elastaasi- 1,5 x 109 2304 1792 4 1 toksoidi 1,5 x 1010 2304_4352_5_0_ 1.5 x 103 5 32 <80 5 42 E 1,5 x 104 < 80 <80 5 1 (Potaska- 1,5 x 105 <80 <80 5 1 $1,2 x 104 aluna) 1,5 x 106 <80 <80 5 1 __1,5 x 107 < 80_<_80_5_0 _ 1.5 x 103 112 <80 5 1 F 1,5 x 104 < 80 <80 5 2 (Imnunoi- 1,5 x 105 <80 <80 5 2 17,5 x 103 maton) 1,5 x 106 <80 <80 5 1 _ 1,5 x 107 <80_<_80_5_0 ______ PHA-arvo minkkiseerumissa ennen infektointia 2

Yksi viidestä minkistä kuoli ilman verenvuotoja.

P. aeruginosaa ei voitu viljellä kuolleiden minkkien veressä. Elastaasitoksoidin PHA-arvoja ei mitattu 10 62540

Suoritettujen kokeiden tulokset osoittavat, että immunoimatto-massa ryhmässä F ja potaska-alunalla immunoidussa ryhmässä e LD50-arvo oli noin 7,5 x 103 ja 1,2 x 104. OEP-liuoksella rokotetussa ryhmässä A LD50-arvo oli pienempi kuin 7,5 x 106 ia näin ollen selvästi eroaa edellä mainituista vertailuryhmistä E ja F. Ryhmissä B ja C, joissa immunointiin käytetään pelkästään joko proteaasitoksoidia tai elastaasitoksoidia, LD^g-arvo oli suurem-pi kuin 1,2 x 10^ tai suurempi kuin 7,5 x 10 . Ryhmässä D, jossa käytettiin kolmikomponenttirokotetta LD^-arvo oli alle 1,9 x

O

10°. Näin voidaan siis sanoa, että ryhmien B, C ja D LD^-arvot ovat suurinpiirtein saman suuruisia ja arvot olivat huomattavasti suurempia kuin ryhmän A arvo, jossa siis käytetään pelkästään OEP-rokotetta.

Koe 2

Hiirten sarveiskalvoinfektion hoito antiseerumilla ja 3' ,4'-dideoksikanamysiini B:llä (DKB): (i) Menetelmä:

Antiseerumi: Erilaisia antiseerumeja saadaan käyttämällä kaniineja. Käytettyjen antiseerumien laadut ja PHA-arvot on esitetty taulukossa 3.

Taulukko 3

Antiseerumi__OEP-PHA__Elastaasi-PHA

OEP-seerumi__2560__-_

Elastaasitokso- idiseerumi__-__2560_

Normaali kanii- nin seerumi__-__-_ 62540

Infektio: Liuosta (0,01 ml), joka sisältää 10^ elävää Pseudomonas aeruginosa bakteeria, tiputetaan haavalliseen sarveiskalvoon.

Antiseerumin ja DKBsn antaminen:

Pelkästään DKB:tä: DKB-liuosta, jonka konsentraatio vaihtelee (800 - 12,5 ^/0,2 ml), injektoidaan (0,2 ml) lihaksensisäisesti jokaiseen hiireen (6 viikon vanhoja, naaraita) välittömästi ennen infektiota.

DKB + antiseerumi: Antiseerumia (0,1 ml) injektoidaan ihonalaisesti jokaiseen hiireen 18 tuntia ennen infektiota. Senjälkeen DKB liuosta (0,2 ml), jonka konsentraatio vaihtelee, injektoidaan lihaksensisäisesti välittömästi ennen infektiota.

Vertailuryhmässä käytetään natriumkloridin vesiliuosta DKB:n ja antiseerumin asemesta.

Sarveiskalvon tarkkailu:

Infektion aiheuttamaa sarveiskalvon vahingoittumista tarkkaillaan 6 päivän ajan injektoin-nin jälkeen. Arviointi suoritetaan sarveiskalvon opasiteetin ja tulehduspesäkkeen ja haavauman muodostumisasteen perusteella.

(ii) Tulokset: Esitetty taulukossa 4.

12 62540

•H

η ε 4-1 3

C H

ro ro o ro oo + m *.

0

ft CU

x ω

·· ft O

:ro H * · ή i ro

·· CJ ·Η | 4J

ft Ό 44 -H | 44 « jr c m --4 d D s ro ro tj ·η 3 m ro -h e a: ro c/2 + 4J o 3 r- n1 a: •n 3 oi oi u o vc o 3 ft ro a; ro » jz ro a uc ph o ro h o ro

rH A O ro 4-> 01 4J

m o------ •h .c i m E ro *r4 -H 44 3 4J | ·Η g tn

H U C 3 -A

ro o ro »-) > ro c a: ro -h 03 ro o h σ -h h + ·η 03 cc ro r- 4-i

4-> i—I * * -A

C ft (0 C Ή rH O 03 ro « ro ·η o q ε c a :ro_____

*3* ·—I 4J

iH ft o H m ro ro O ·η fcO o r'- ro r- > a: >4 o ·« ro

A -H ro r4 rH O 4J

3 "H 44

rH SZ *H

3 O

ro o o:

En 44 O —· O

•H in ·Η

O Q U rH

•C U Ή •h m o o o c

c G JZ O r-rOOCM-H

O ·· \ CTS HCN^fl03

H ffi A

4J «

AD— 4J

ro______3 U4 > C I I C 3

•H *r4 | A *H <—I

1 :ro 4J 3 I -HO C

C -H :ro C U -H ε 4-> -H 4J

o 4J 4J ro ro ro 3 -h -h ro > CiHroronwc ε iH ro :ro * 03 ro roro ro ε roro o) ro -h 4-> roro ro

AC >ι -H ·Η Ό 03 <0 03 44 H

03 ·Η 4J 03 ε -H ro ·Η | 03 C 3 nro 4J30rHEf^ro-H 3 ro rorowiosroscdiHrH tn > 3 4->AroAii4oro-H(c c h 4J oi o ro o 4 ro i ι ε ro :ro -- ro *H ·Η -ro 01 4-> 4-> ro Ή ·Η 3 ε :<C *

tn O Ό | -H C 03 4-> 4J H H C

4J x:«>fto3ro-HCcroo -h a >, ·η ω ro ό ro ro ro c -h tn o ro ε o ro ro -h tn E aj ·η ή + 3 i ro ·γο o + + ·η + 3 >i ε

C 14 -i4 4-1 03 Ό U O

m mro4-)oroAftft-Hmroffl 3 «rocu-HOjajiicoberoiic; κ

_Q03roCUE4->QQ03O03 D

13 62540

Taulukon 4 perusteella on ilmeistä, että elastaasitoksoidi, proteaasitoksoidi ja OEP antiseerumi ovat paljon tehokkaampia kuin DKB yksinään.

Edellä esitetystä havaitaan, että keksinnön mukaan valmistettu elastaasitoksoidi soveltuu erityisen hyvin kolmikomponenttisen sekarokotteen valmistamiseksi.

Liuotin voi olla mikä tahansa liuotin, joka sopii ihmisten ja eläinten rokotteisiin. Esimerkkejä ovat tislattu vesi, fysiologinen natriumkloridiliuos, fosfaattipuskuroitu natriumkloridiliuos jne..

Apuaineena voidaan käyttää mitä tahansa tavanomaista apuainetta kuten alumiinihydroksidia, alumiinifosfaattia, kalsiumfosfaattia, alunaa tai Freundin epätäydellistä apuainetta. Apuaineen määrä voidaan valita sopivalla tavalla niin, että se riittää immunoaktiivisuuden lisäämiseen. Antiseptinen aine voi olla myös mikä tahansa tavanomainen aine kuten esimerkiksi timerosali, fenoli, karbolihaopo tai formaliini.

Kolmikomponenttisen sekarokotteen komponenttien suhdetta voidaan halutulla tavalla muuttaa tehokkaalla alueella sen suojaavan tehon lisäämiseksi rokotteena. Kunkin komponentin tehokas määrä vaihtelee suuresti riippuen immunisointikertojen määrästä ja immunisointivälistä. Se vaihtelee myös rokotteen käyttötarkoituksesta riippuen (s.o. ehkäisevä käyttö tai terapeuttinen käyttö).

Seuraavassa on annettu joitakin esimerkkejä antigeenien suositelluista annoksista ja suhteista: 14 62540 (i) Käyttö ihmisillä (myös karjalla):

Kun immunisointi suoritetaan 2-3 kertaa viikossa (ilman apuainetta) seuraavia suhteita suositellaan: OEP, 0,1 y/paino-kg - lo y/paino-kg; proteaasitoksoidi, 1 y/paino-kg - 50 y/paino-kg; elastaasitoksoidi, 1 y/paino-kg - 50 y/paino-kg. Immunisointiasteesta riippuen määriä voidaan sopivalla tavalla lisätä.

(ii) Käyttö minkeillä: a) Ehkäisevä rokote

Kun immunisointi suoritetaan kaksi kertaa (käyttämällä apuainetta), seuraava suhde on suositeltu: OEP, 10 y/eläin - 2000 y/eläin; proteaasitoksoidi, 10 y/eläin - 2000 y/eläin; elastaasitoksoidi, 10 y/eläin - 2000 y/eläin.

Kun immunisointi suoritetaan yhdellä kertaa seuraava suhde on suositeltu: OEP, 500 y/eläin - 2000 y/eläin; proteaasitoksoidi, 500 y/eläin - 4000 y/eläin; elastaasitoksoidi, 500 y/eläin - 4000 y/eläin.

b) terapeuttinen rokote:

Kun immunisointi suoritetaan kaksi - kolme kertaa yhden viikon välein (käyttämällä apuainetta tai ilman) seuraavaa suhdetta suositellaan: OEP, 0,1 y/eläin - 100 y/eläin; proteaasitoksoidi, 10 y/eläin - 12 y/eläin; elastaasitoksoidi, 10 y/eläin - 2000 y/eläin.

62540

Kolmikomponenttinen sekarokote voidaan antaa eläimille ja ihmisille lihaksen sisäisesti, ihonalaisesti tai ihonsisäisesti.

Kolmikomponenttisen sekarokotteen komponenttien toksisuudet ovat seuraavat: OEP:n toksisuus: intraperitoneaalinen injektio hiirille annoksina 100 mg/kg aiheuttaa väliaikaista heikkoutta, mutta eläimet eivät kuole.

OEP:n kuumetta aiheuttava ominaisuus: tavallisessa kuumekokessa kaniineilla havaitaan positiivinen vaikutus annoksella 0,3 mg/kg.

Yleisesti sanoen OEP:n toksisuus endotoksiinina on erittäin pieni verrattuna LPS-(lipopolysakkaridi) ja OEP-LPS kompleksiin.

Elastaasitoksoidin ja proteaasitoksoidin ja toksisuus: intraperitoneaalinen antaminen hiirille annoksena 1 mg/hiiri ei aiheuta akuuttia toksisuutta, pienin tappava proteaasiannos on 0,2 mg/hiiri (i.p.) ja pienin tappava elastaasiannos on 0,125 mg/hiiri (i.p.).

Claims (2)

16 62540 Patenttivaatimus Menetelmä valmistaa elastaasitoksoidia, jota käytetään Pseudomonas aeruginosa-infektion vastaisen kolmikomponentti-rokotteen valmistamiseksi, jolla elastaasitoksoidilla on seuraavat ominaisuudet: 1. molekyvlipaino: 47.000 (geelisuodatus),

2. UV-absorptiospektri: maksimi 2^8 ταμ (E^7^ = 21,2, 0,1 M KC1) minimi 252 mp, 3. isoelektrinen piste: pH 6,5 (elektroforeesi asetaatti-kalvolla), 4. ulkonäkö: väritön jauhe, 5. aminohappokoostumus: aminohapporyhmät (g/100 g proteiinia); asparagiinihappo (14,2), treoniini (5,0), seriini (5,6), qiu_ tamiinihappo (6,5), proliini (2,9), glysiini (5,6), alaniini (5,8), väliini (4,9), metioniini (2,9), isoleusiini (2,7), leusiini (4,3), tyrosiini (9,9), fenyylialaniini (7,0), lysiini (3,9), histidiini, (2,6), arginiini (6,5), kvstiini/2 (1,2), tryptofaani (2,3), ammoniakki (0,9) (yhteensä 94,7 q), 6. elastaasiaktiivisuus: ei 7. antigeeniaktiivisuus: havaittu tunnettu siitä, että Pseudomonas aeruqinosa-elastaasi deaktivoidaan formaldehydillä tai oksimetaanisulfiinihapolla ja dialysoidaan ja lyofilisoidaan.