FI115840B - Entsymaattisten koostumusten käyttö ja menetelmiä kivipestyn ulkonäön tuottamiseksi indigovärjätylle denimkankaalle - Google Patents

Description

115840

Entsymaattisten koostumusten käyttö ja menetelmiä kivipestyn

ULKONÄÖN TUOTTAMISEKSI INDIGOVÄRJÄTYLLE DENIMKANKAALLE

RISTIVIITTAUS liittyviin hakemuksiin Tämä patenttihakemus on jatkohakemus US-patenttihakemukselle sar-5 janro 08/075 657, jätetty 11. kesäkuuta 1993, joka on jatkohakemus US-patenttihakemukselle sarjanro 07/897 721, jätetty 12. kesäkuuta 1992.

KEKSINNÖN ALA

Tämä keksintö koskee koostumusten käyttöä ja menetelmiä vähentää tai estää sinisen indigovärin takaisinvärjäystä denimille denimkankaan ja -10 vaatteiden kivipesun aikana sellulaasientsyymejä käyttäen.

KEKSINNÖN TAUSTA

Denim on puuvillakangasta, joka on värjätty, tavallisesti siniseksi, indi-govärillä. Yksi indigovärjätyn denimkankaan haluttava ominaispiirre on värjättyjen lankojen vuorottelu valkoisten lankojen kanssa, mikä normaalissa käytössä ja ku-15 lutuksessa antaa denimille ulkonäön, jossa on valkoista sinisellä. Eräs denimin suosittu ulkonäkö on kivipesty vaikutelma. Perinteisesti kivipesu on suoritettu pesemällä denimmateriaali hohkakiven läsnä ollessa, mistä on tuloksena kangas, jolla on haalistunut tai kulunut ulkonäkö edellä kuvatulla valkoinen-sinisellä-kontrastivaikutelmalla. Tämä kivipesty ulkonäkö koostuu pääasiassa vä-: · : 20 rin poistumisesta tavalla, joka antaa tulokseksi materiaalia, jossa oli alueita, jotka :,,ovat väriltään vaaleampia säilyttäen halutun valkoinen-sinisellä-kontrastin, ja ma-: Γ: teriaalia, joka on rakenteeltaan pehmeämpää.

; Denimkankaan käsittelyssä käytetään nykyisin entsyymejä, erityisesti ; . sellulaaseja. Erityisesti sellulaaseja on käytetty hohkakivien korvikkeena tai yhdis- * * · 25 telmänä hohkakivien kanssa perinteiseen "kivipesu"-prosessiin, jota käytetään ’ haalistuneen ulkonäön antamiseksi denimille. Entsyymien käytön suosio kivi- pesussa on kasvanut, koska kivien yksinään käytöllä on useita haittoja. Proses-:. I : sissa käytetyt kivet aiheuttavat esimerkiksi koneiston kulumista ja rikkoutumista, i * i ne aiheuttavat ympäristöllisiä jäteongelmia muodostuneesta kivijauhosta johtuen, : i·, 30 ja aiheuttavat korkeat työkustannukset, jotka liittyvät kivien manuaaliseen pois- toon vaatteiden taskuista. Näin ollen kivien vähentäminen tai poistaminen pesus-•; ‘ * sa voi olla toivottavaa.

"·: Vastakohtana hohkakivien käytölle entsyymit (erityisesti sellulaasit) •: · · ovat turvallisia koneelle, aiheuttavat vähän tai ei lainkaan jäteongelmaa ja vähen- 115840 2 tävät työkustannuksia drastisesti. Sen vuoksi voi olla eduksi käyttää kivipesuun entsyymejä. Vaikka entsyymien, kuten sellulaasin, käyttö voi olla edullista kivien yksinään käyttöön verrattuna, liittyy entsyymien tähän tarkoitukseen käyttöön kuitenkin joitain ongelmia. Esimerkiksi yhtä joidenkin sellulaasien, kuten Trichoder-5 masta olevien sellulaasien, ongelmaa voitaisiin kuvata värin epätäydellisenä poistona, jota aiheuttaa jonkin suuruisen värimäärän "uudelleenkerrostuminen" tai "ta-kaisinvärjäys" (molempia käsitteitä käytetään tässä keskenään vaihdettavasta kankaalle entsymaattisen kivipesuprosessin aikana. Sellainen uudelleenkerrostus tai takaisinvärjäys aiheuttaa pinnalle sini värjäystä, mistä on seurauksena vähäi-10 sempi sinisten ja valkoisten lankojen välinen kontrasti ja hankauspisteitä (ts. sinis-tä-sinisellä-ulkonäkö edullisen valkoinen-sinisellä-ulkonäön sijasta). Katso julkaisua American Dyestuff Reporter, syyskuu 1990, s. 24 - 28.

Uudelleenkerrostus tai takaisinvärjäys on vastenmielistä eräille käyttäjille. Vaikka Trichoderma-sellulaaseilla tapahtuu takaisinvärjäystä, ne ovat edulli-15 siä verrattuna Humicola-sellulaaseihin, joilla ei yleensä ole takaisinvärjäystä, johtuen Trichoderma-sellulaaseilla nähdystä suuremmasta spesifisestä aktiivisuudesta denimmateriaalilla. Lisäksi keksinnössä voivat olla eduksi korkeamman puhtausasteen omaavat sellulaasit. Korkeasta spesifisestä aktiivisuudesta tai korkeasta puhtaustasosta voi myös olla seurauksena korkeampi hankausaste merkit-20 tävästi lyhyemmissä käsittelyajoissa, ja ne ovat sen vuoksi denimkankaan valmistajien suosiossa.

. Värin uudelleenkerrostumisen ongelma kivipesun aikana on denim- φ^ kankaanvalmistajien eräs huolenaihe. Aikaisempia yrityksiä ongelman ratkaisemi- ;;;* seksi ovat mm. ylimääräisten uudelleenkerrostuksenestokemikaalien, kuten sur- • * ♦ ]·’ 25 faktanttien, tai muiden aineiden lisääminen sellulaasipesuun irronneen indigovä- : rin dispergoimisen auttamiseksi ja uudelleenkerrostumisen vähentämiseksi. Li- · säksi denimkankaanvalmistajat ovat kokeilleet denimiä kohtaan vähemmän spesi- :‘i‘: fisen aktiivisuuden omaavien sellulaasien käyttöä yhdessä ylimääräisten huuhte lujen kanssa. Tästä on tuloksena lisää kemikaalikustannuksia ja pitemmät käsitte-: 30 lyajat. Erääseen toiseen menetelmään, jolla uudelleenkerrostusongelmaa yrite- tään ratkaista, sisältyy lievän valkaisuaineen tai tahranpoistoaineen lisääminen prosessiin. Tämä menetelmä vaikuttaa vaatteen lopulliseen värisävyyn ja pidenin : tää käsittelyaikaa.

: “": Vaikka nämä menetelmät auttavat jossain rajallisessa asteessa uudel- • . 35 leenkerrostuksen vähentämisessä, eivät menetelmät ole täysin tyydyttäviä, ja jon- * # » » · kin verran ei-hyväksyttävää takaisinvärjäystä tapahtuu edelleen. Entsyymien ja ki- 115840 3 vien käyttö yhdessä voi olla edullista tämän uudelleenkerrostumisongelman voittamiseksi; valmistajalle jää kuitenkin joitain kivien yksinään käyttöön liittyviä ongelmia.

Uudelleenkerrostuksen vähentämiseksi tai estämiseksi aikaisemmin 5 yritettyjen menetelmien heikkouksien perusteella on tarvetta ympäristöllisesti suotuisammille ja kustannustehokkaammille menetelmille kivipesukäsittelyn aikaisen värin uudelleenkerrostus- tai takaisinvärjäyskysymyksen ratkaisemiseksi.

Niinpä olisi toivottavaa keksiä entsymaattinen koostumus tai menetelmä, joka lisäisi värin poistoa kivipesun aikana käytettäessä uudelleenkerrostavia 10 tai takaisinvärjääviä sellulaaseja, joilla, vaikka tapahtuu takaisinvärjäystä, on korkea spesifisen aktiivisuuden aste denimmateriaalilla.

PIIRUSTUKSET

Kuviossa 1 esitetään kaavio suhteellisen heijastuskyvyn mittauksista kivipesusta uudelleenkerrostavalla sellulaasilla ja erilaisilla lisätyillä proteaaseilla, 15 esimerkeissä 1, 2 ja 3 kuvatulla tavalla verrattuna kontrolliin uudelleenkerrostavalla sellulaasilla.

Kuviossa 2 esitetään kaavio suhteellisen heijastuskyvyn mittauksista kivipesusta uudelleenkerrostavalla sellulaasilla ja erilaisilla lisätyillä proteaaseilla verrattuna kontrolliin uudelleenkerrostavalla sellulaasilla, esimerkissä 4 esimerk-20 kinä kuvatulla tavalla.

;: · KEKSINNÖN YHTEENVETO

Keksinnön hakijat ovat keksineet, että indigovärjätyn puuvilladenim-: : : kankaan käsittely tehokkaalla määrällä uudelleenkerrostumisen tai takaisinvärjäy- j tymisen estävää koostumusta, joka käsittää uudelleenkerrostavaa sellulaasikoos- : 25 tumusta ja lisättyä proteaasia, jota on ylimäärä verrattuna määriin, joita on luon- ' · nollisesti läsnä luonnollisen organismin tuottamassa uudelleenkerrostavassa sel- lulaasivalmisteessa, on parannus verrattuna uudelleenkerrostavaan sellulaasiin yksinään menetelmänä väritiheyden vaihtelujen lisäämiseksi indigovärjätyn de-: : nimkankaan pinnalle. Sellaisella koostumuksella käsittelyn tulos on valkoisten ja 30 sinisten lankojen välisen kontrastin paraneminen saavuttaen värin täydellisem-: män poiston (enemmän hohkakivillä saavutetun tuloksen tyyppinen). Kontrastin paraneminen johtuu värin uudelleenkerrostuksen vähenemisestä antaen tulok-‘;' seksi hankauspisteitä, jotka ovat selväpiirteisempiä ja joilla on suurempi valkois- '·*" ten ja sinisten rihmojen välinen kontrasti, antaen ylivoimaisen kivipestyn ulko- •: · ·: 35 näön. Tässä kuvattuihin koostumuksiin tai menetelmiin voidaan mahdollisesti lisä- 115840 4 tä pieni prosenttiosuus pinta-aktiivista kemiallista surfaktanttia. Pinta-aktiivista ainetta lisättäessä sitä voidaan lisätä joko sellulaasin ja proteaasin kanssa pesussa tai proteaasin kanssa jälkikäsittelyhuuhteluna proteolyyttisen vaikutuksen parantamiseksi.

5 KEKSINNÖN YKSITYISKOHTAINEN KUVAUS

Denimkankaalla, joka on kivipesty lisäämällä sellulaasikäsittelyn aikana tehokas määrä lisättyä proteaasia uudelleenkerrostavan sellulaasin kanssa, nähdään takaisinvärjäystason dramaattinen aleneminen ja valkoisten ja sinisten lankojen välisen kontrastin näkyvä kasvu, ts. täydellisempi kivipesuvaikutus. 10 Vaikka keksinnön hakija ei tahdo pitäytyä mihinkään erityiseen teoriaan, tämän yksi mahdollinen selitys voisi olla, että määrätyt komponentit, jotka ovat läsnä uudelleenkerrostavan sellulaasin koostumuksissa (katso alla olevaa määritelmää), jotka käsittävät seoksia useista entsyymeistä, voivat sitoutua lujasti denimkankaan pinnalle. Nämä komponentit voivat myös sitoa värillä värjättyjä sellulaasifragment-15 teja ja/tai itse väriä sitoen siten värilliset materiaalit tai värin takaisin kankaaseen. Lisätyn proteaasin lisäys poistaa tehokkaasti sellulaasiproteiineja tai estää sellu-laasiproteiineja tehokkaasti sitomasta värillisiä partikkeleita takaisin denimkankaan pinnalle ja silti se ei, hämmästyttävästi, vaikuta haitallisesti tulokseksi saatuun, sellulaasin vaikutuksen aiheuttamaan hangattuun ulkonäköön.

20 Ennen keksinnön yksityiskohtaisempaa käsittelyä määritellään seu- raavat käsitteet.

. *: ·. Käsite "lisätty proteaasi" viittaa proteaasin differentiaaliseen määrään • · · .',.t mikro-organismin luonnollisesti tuottamaan määrään verrattuna. Tämä differenti- aalinen määrä antaa tulokseksi takaisinvärjäyksen vähenemisen lisättäes- ‘ 25 sä uudelleenkerrostavaan sellulaasikoostumukseen kivipesuprosessin aikana.

: Edullisesti sellainen differentiaalinen määrä on ainakin 1 %:n enemmän kuin ko- ·,· j konaisproteaasiproteiinimäärä, joka luonnollisesti esiintyy uudelleenkerrostavaa sellulaasikoostumusta tuottavassa mikro-organismissa. Lisätyn proteaasin määrän määräävät useat tekijät, kuten esimerkiksi lisätyn proteaasin puhtaus, aktiivi-: , . 30 suus ja spesifisyys. Tämän vuoksi lisätyn proteaasin differentiaalinen määrä vaih- telee uudelleenkerrostavan sellulaasikoostumukseen lisätyn proteaasin tyypin mukaan.

: ; *: "Lisätty proteaasi" tässä käytettäessä voi olla peräisin joko ulkoisista tai sisäisistä lähteistä. Lisätty ulkoinen proteaasi viittaa niihin proteiineja hajotta-• . 35 viin proteaaseihin, jotka on johdettu tai kehitetty ulkopuolisesti mikro-organismin » V « t t ' sellulaasikoostumuksessa luonnollisesti läsnä olevista proteaaseista. Vaihtoeh- 115840 5 toisesti lisätty proteaasi voi olla sisäistä. Tässä tapauksessa lisätyt sisäiset prote-aasit viittaavat uudelleenkerrostavassa sellulaasikoostumuksessa olevaan prote-aasin määrään, joka on suurempi kuin mikro-organismin luonnollisesti tuottama luonnollisesti esiintyvää proteaasia koodittavan geenin yliekspressiolla. Prote-5 aasia koodittavan geenin yliekspressiolla tuotettu lisääntyneen proteaasin määrä on määrä, joka antaa tulokseksi takaisinvärjäyksen estymisen tai vähenemisen ki-vipesuprosessissa. Edullisesti lisäys on ainakin 1 %:n suurempi kuin mikro-organismissa luonnollisesti esiintyvä proteaasin määrä.

Proteaaseja on saatavissa useista lähteistä, joita ovat mm. mikrobiaa-10 liset-, kasvi- ja eläinlähteet, ja ne on kirjallisuudessa hyvin dokumentoitu. Joitain tärkeitä kaupallisia proteolyyttisiä lähteitä ovat mm. Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis ja Aspergillus oryzae. Keksintöä varten sopivia proteaaseja ovat esimerkiksi seriini-, metallo- ja happoproteaasit, samoin kuin endo- ja eksoproteaasit. Subtilisiinit ovat seriiniproteaaseja, jotka toimivat yleensä proteiinien ja peptidien 15 sisäisiä peptidisidoksia katkaisten. Metalloproteaasit ovat ekso- tai endoprote-aaseja, jotka vaativat aktiivisuutta varten metallikofaktoria. Yksi edullisista seriini-proteaaseista on subtilisiini. Erityisen edullisia proteaaseja, jotka ovat keksinnössä käyttökelpoisia, ovat proteaasit, jotka saadaan mikro-organismista, jota on modifioitu geneettisesti tavoilla, jotka kuvataan US-patenttijulkaisussa 4 760 025 ja 5 20 185 258, jotka molemmat liitetään tähän viitteeksi.

Käsite "sellulaasikoostumus" käsittää yhtä tai useaa luonnollisesti esiintyvän mikro-organismin tuottamaa ekso-sellobiohydrolaasi- (CBH), endoglu-konaasi- (EG) ja β-glukosidaasi (BG) -komponenttia, jolloin kutakin näistä kom-';;;' ponenteista esiintyy mikro-organismin luonnollisesti tuottamassa suhteessa, ja jo- I i « v * 25 ta tässä toisinaan kutsutaan "täydelliseksi tai luonnolliseksi sellulaasikoostumuk- : seksi".

: : : Otetaan huomioon, että keksinnön mukaisessa käytössä sellu- : Ί ’: laasikoostumukset voivat sisältää myös sellulaasikoostumusta, joka on saatu mik- ro-organismista, jota on modifioitu geneettisesti, jotta se ylituottaisi, alituottaisi tai : , ·, 30 olisi tuottamatta yhtä tai useaa sellulaasin CBH-, EG- ja/tai BG-komponenteista.

• ·

Muut modifioidut sellulaasikoostumukset voivat sisältää katkaistuja sellulaasipro- * ·;·’ teiineja, jotka sisältävät CBH:iden tai EG:iden joko sitoutumisdomeenin tai ydin- domeenin, tai sen osan tai johdannaisen. Muut esimerkit modifioiduista sellu-laasikoostumuksista voivat sisältää sellulaasien tai katkaistujen sellulaasien pri-• t 35 maarisen sekvenssin glykosyloitumisasteen muutoksia tai aminohap(p)o(je)n kor- ' ‘ vauksen(ia).

115840 6 "Uudelleenkerrostuva tai takaisinvärjäävä sellulaasi" viittaa tässä käytettäessä niihin sellulaaseihin, esimerkiksi Trichoderma-, joilla on denimkankaan entsymaattisessa kivipesussa taipumus värjätä kangas uudelleen johtaen epätäydelliseen kivipesuun verrattuna pesuun yksistään kivillä tai sellulaaseilla, joilla ei 5 ole takaisinvärjäystä, kuten Humicolasta olevilla sellulaaseilla. Uudelleenkerros-tavat tai takaisinvärjäävät sellulaasit ovat peräisin mikro-organismeista, kuten sie-nimikro-organismista Trichoderma sp. tai mistä hyvänsä muusta mikro-organismista, joka tuottaa sellulaaseja, joilla on kivipesuprosessissa denimkan-kaaseen takaisinvärjäys- tai uudelleenkerrostumisvaikutusta.

10 Keksinnön mukaisissa menetelmissä denimkangas saatetaan kontak tiin osittaista tai täydellistä entsymaattisesti kivipesemistä varten lisätyn proteaa-sin kanssa, jota on riittävä määrä takaisinvärjäyksen vähentämiseksi ja siten sinisten ja valkoisten kuitujen välisen kontrastin lisäämiseksi. Proteaasi voidaan sekoittaa yhdessä sellulaasin kanssa ja lisätä sitten pesuun, joka sisältää indigovär-15 jättyä denimkangasta, tai molemmat voidaan lisätä erikseen ja suoraan pesuun, tai proteaasi voidaan lisätä sellulaasipesun jälkeen huuhtelusyklissä. Vaihtoehtoisesti proteaasi voidaan lisätä pesusykliin ennen sellulaasin lisäämistä samaan pesusykliin. Olisi huomattava, että sellulaasikivipesukylpy voi sisältää tai olla sisältämättä nestettä aikaisemmasta liisterinpoistovaiheesta.

20 Keksinnön mukaisessa käytössä uudelleenkerrostumista tai takaisin värjäystä estävät koostumukset sisältävät lisättyjä proteaaseja ja uudelleenkerros- , ·; , tav(a/i)a sellulaas(ia/ej)a. Eräässä erityisessä suoritusmuodossa keksinnön mu- • » · !,, kaisesti käytettävä uudelleenkerrostumista tai takaisinvärjäystä estävä koostumus sisältää uudelleenkerrostavaa- tai takaisinvärjäävää sellulaasia ja lisättyä prote-*·’ ' 25 aasia suhteessa noin 5 ppm kokonaisproteiinia uudelleenkerrostavassa sellulaa- : sissa: 1 000 ppm kokonaisproteiinia lisätyssä proteaasissa - 1 000 ppm koko- : naisproteiinia uudelleenkerrostavassa sellulaasissa: 1 ppm kokonaisproteiinia li- sätyssä proteaasissa. Eräässä edullisemmassa suoritusmuodossa suhde on noin 10 ppm kokonaisproteiinia uudelleenkerrostavassa sellulaasissa: 200 ppm koko-: f# 30 naisproteiinia lisätyssä proteaasissa - 200 ppm kokonaisproteiinia uudelleenker-

» I

rostavassa sellulaasissa: 1 ppm kokonaisproteiinia lisätyssä proteaasissa. Koko-;· naissellulaasi- ja proteaasiproteiini voidaan mitata ereilaisilla alalla tunnetuilla ; ’: määritysmenetelmillä. Tässä edullisesti käytetty määritys on kaupallisesti saatava ; biuret-Lovvry-määritys, jota myy yhtiö Sigma Company, käyttäen vertailustandar- * , 35 dina naudan seerumialbumiinia (BSA).

115840 7

Uudelleenkerrostumista tai takaisinvärjäystä estävät koostumukset voivat sisältää lisäksi erilaisia ammattimiesten tuntemia apuaineita. Esimerkiksi surfaktantti (anioninen tai ioniton), joka on yhteensopiva uudelleenkerrostavan sellulaasin ja lisätyn proteaasin kanssa, olisi keksinnön mukaisesti käyttökelpois-5 ta. Edullisia surfaktantteja ovat ionittomat, kuten polyoksietyloidut alkoholit, joita on surfaktanttien TRITON®-sarjassa (ionittomat oktyylifenoksipolyetoksietanoli-surfaktantit), jotka ovat kaupallisesti saatavissa yhtiöstä Union Carbide. Katso esimerkiksi US-patenttijulkaisua 5 006 126 näiden yhteensopivien surfaktanttien näytettä varten. Olisi huomattava, että surfaktantin sisällyttäminen voi lisätä kivi-10 pesuvaikutusta edelleen yhdistelmänä uudelleenkerrostavan sellulaasin ja lisätyn proteaasin kanssa. Haluttaessa voidaan koostumuksen kanssa käyttää tai siihen sisällyttää myös muita materiaaleja, mukaan lukien kiviä, täyteaineita, liuottimia, puskuroimisaineita, pH-arvon kontrollointiaineita, entsyymin aktivoijia, runkoaineita (builders), entsyymin stabilointiaineita, muita uudelleenkerrostumista vastusta-15 via aineita, ja vastaavia.

Takaisinvärjäystä estävä koostumus voidaan formuloida kiinteäksi tuotteeksi, jossa kiintoaine voi olla rakeista, suihkukuivattua tai agglomeroitua. Esimerkiksi entsyymiä sisältäviksi rakeiksi, joissa kerros voi sisältää yhtä tai useaa entsyymiä, mukaan lukien sellulaaseja, proteaaseja, amylaaseja ja muita prote-20 iineja, kuten kuvataan US-patenttihakemuksessa sarjanro 07/957 973, jätetty 7. lokakuuta 1992, joka on jatkohakemus US-patenttihakemukselle sarjanro 07/772 510, jätetty 7. lokakuuta 1991. Nämä patenttihakemukset liitetään tähän kokonai-,. suudessaan viitteeksi. Sellulaasilla, proteaasilla ja amylaasilla päällystetyn partik- kelin yksi ajateltu käyttösovellutus on yhdistää liisterinpoisto- ja kivipesukäsittely : 25 yhdessä ainoassa pesusyklissä.

i.j : Vaihtoehtoisesti takaisinvärjäystä estävät koostumukset voidaan for- : : muloida nestegeeli- tai tahnatuotteeksi. Tässä erityisessä suoritusmuodossa uu- delleenkerrostavaa sellulaasia sekoitetaan lisätyn proteaasin kanssa suhteessa noin 5 ppm kokonaisproteiinia uudelleenkerrostavassa sellulaasissa: 1 000 ppm • 30 kokonaisproteiinia lisätyssä proteaasissa - 1 000 ppm kokonaisproteiinia uudel- leenkerrostavassa sellulaasissa: 1 ppm kokonaisproteiinia lisätyssä proteaasissa.

Edellä olevan seoksen stabiilin vesipohjaisen formulaation valmistamiseksi on :myös lisättävä stabiloivia valmistusaineita, jotka käsittävät happea sisältäviä, vesi-• · · ' ·'. liukoisia orgaanisia liuottimia puskurissa pH-arvossa välillä 4-6. Edullisesti sorbi- • t 35 toli ja glyseroli ovat suositeltavia stabiloivia valmistusaineita.

I > M I > · 115840 8

Eräässä edullisessa suoritusmuodossa edellä olevaa nesteformulaa-tioseosta inkuboidaan korotetuissa lämpötiloissa alueella noin 30 - 60 °C noin 1 tunnin - 2 viikon ajan ennen denimkankaalle levittämistä. Edullisimmassa suoritusmuodossa käytetään lämpötilaa noin 37 °C ja inkubointioaikaa noin 120 tuntia.

5 Ammattimies ymmärtää inkubointiajan määrän riippuvan seoksen valmistukseen valitusta lämpötilasta. Edelleen ammattimies ymmärtää, että voidaan käyttää alhaisempia lämpötiloja; koostumuksessa käytetyistä sellulaaseista ja proteaaseista riippuen voidaan kuitenkin vaatia pitempiä reaktioaikoja. Edelleen otetaan huomioon, että esikäsitelty nesteformulaatio voidaan muuttaa kiinteäksi, ts. rakeiseen 10 muotoon, koostumuksen stabiiliuden säilyttämiseksi.

Keksinnön mukaisessa käytössä voidaan lisätyt proteaasit lisätä kivi-pesukylpyyn yhdessä uudelleenkerrostavan sellulaasin kanssa, tai kumpikin voidaan lisätä kivipesusellulaasikylpyyn erikseen. Vaihtoehtoisesti proteaasi voidaan lisätä erillisessä syklissä joko ennen sellulaasikylpyä tai seuraavassa huuhtelukä-15 sittelyliuoksessa. Kaikissa edellä huomioon otetuissa menetelmissä uudelleenker-rostus vähenee noin 5 %:lla, edullisesti noin 10 %:lla, käsiteltyjen vaatteiden taus-tapuolen heijastuskyvyn mittauksella verrattuna kivipesuun yksistään sellulaasin kanssa. Heijastuskyvynmittausarvo kuvataan täydelisemmin tämän hakemuksen kokeellisessa osassa. Olisi kuitenkin huomattava, että heijastuskyvylle mitatut ar-20 vot puristuvat kokoon verrattuna visuaalisiin eroihin, jotka nähdään verrattaessa käsiteltyä kangasta käsittelemättömään. Näköhavainto on herkempi kivipesuvai-kutuksen osoitin. Täten takaisinvärjäyksen näköhavainto vaatteen taustapuolelta « » · ;,. paljastaa käsitellyn ja käsittelemättömän kankaan välillä suuremmat erot reflekto- ‘* metrillä määritettyihin mittauksiin verrattuna.

' 25 Keksinnön eräässä suoritusmuodossa uudelleenkerrostavaa sellu- * laasia ja lisättyä proteaasia on läsnä suhteessa noin 5 ppm kokonaisproteiinia uudelleenkerrostavassa sellulaasissa: 1 000ppm kokonaisproteiinia lisätyssä proteaasissa - 1 000 ppm kokonaisproteiinia uudelleenkerrostavaa sellulaasia: 1 ppm kokonaisproteiinia lisätyssä proteaasissa. Eräässä edullisemmassa suori- ; t ·, 30 tusmuodossa suhde on noin 10 ppm kokonaisproteiinia uudelleenkerrostavaa sei- » · ’ lulaasia: 200 ppm kokonaisproteiinia lisätyssä proteaasissa - 200 ppm kokonais- ;·’ proteiinia uudelleenkerrostavassa sellulaasissa: 1 ppm kokonaisproteiinia lisätys- : sä proteaasissa.

:"Ammattimies ymmärtää, että lisätyn proteaasin tehokas määrä vaihte-• . 35 lee riippuen joukosta hyvin ymmärrettyjä parametrejä, joita ovat mm. käytetyn uu- • lilt ‘ ’ delleenkerrostavan sellulaasin määrä ja puhtaus, samoin kuin ilman proteaasia » * » * I » » 115840 9 tapahtuvan uudelleenkerrostuksen määrä, kontaktiaika, kivipesun aikana irronneen värin määrä, uudelleenkerrostavan sellulaasin ja/tai lisätyn proteaasin spesifinen aktiivisuus, kivipesuprosessin pH-arvo ja lämpötila, tuotteen formulaatio (nestemäistä vai rakeista) ja vastaavat seikat. Alalla on hyvin tunnettua, että lisä-5 tyn proteaasin ja/tai uudelleenkerrostavan sellulaasin spesifistä aktiivisuutta voidaan modifioida käsittelemällä kantaa yhdistelmä-DNA-tekniikalla kiinnostuksen kohteena olevien komponenettien muuttamiseksi tai modifioimiseksi. Esimerkiksi määrättyjen sellulaasikomponenttien yliekspressio osoitetaan US-patenttihakemuksessa 07/770 049, joka liitetään tähän viitteeksi. Entsyymiaktiivi-10 suuden tai -spesifisyyden modifioimiseen voidaan myös käyttää proteiini nmuok-kaustekniikoita, katso esimerkiksi US-patenttijulkaisua nro 4 760 025, joka liitetään tähän viitteeksi.

On yksinkertaista titrata lisätty proteaasi useilla pesuilla ja tarkastaa tulokseksi saadut denimkangasnäytteet visuaalisesti, jotta saataisiin tehokas mää-15 rä, joka antaa tulokseksi takaisinvärjäyksen vähenemisen. Olisi kuitenkin huomattava, että takaisinvärjäyksen vähentämiseen vaikuttavan proteolyyttisen vaikutuksen ja kulumisen vähentämiseen vaikuttavan proteolyyttisen vaikutuksen välillä on olemassa tasapaino. On löydettävä uudelleenkerrostavan sellulaasin optimisuh-den lisättyyn proteaasiin, jotta saavutettaisiin uudelleenkerrostuksen vastainen 20 vaikutus ilman haitallisesti vaikuttavaa hankausta.

Samoin heijastuskykyarvoja voidaan käyttää uudelleenkerrostusasteen ... seuraamiseen vaatteen taustapuolella, mutta se ei heijasta tarkasti vaatteiden etupuolelta hankautuneiden kuitujen välistä kontrastia. Visuaalisesti määritetyt *···* uudelleenkerrostuksen erot ovat selvempiä kuin heijastuskykyarvojen erot, mutta ·.· · 25 heijastuskykyarvot eivät näytä vaikutusta vähäisemmässä laajuudessa.

:, · I Samalla kun keksinnön mukaisessa käytössä uudelleenkerrostumista : tai takaisinvärjäystä estävät koostumukset, jotka on tarkoitettu denimkangaskivi- * * $ · pesuliuoksiin lisättäviksi (joko kiinteänä aineena tai nesteenä) sisältävät uudel-leenkerrostavia sellulaas(i/ej)a ja lisätty(j)ä proteaas(i/ej)a, ne voivat edelleen si-30 sältää muita apuaineita, kuten surfaktantteja, täyteaineita, dispergoimisaineita, ;/ puskuriaineita tai pH-arvon kontrollointiaineita, entsyymiaktivaattoreita, runkoai neita, entsyymin stabilointiaineita tai muita uudelleenkerrostumisenestovalmistus-aineita. Ammattimies voi helposti verrata eri yhdisteiden ja liuosten suhteiden tu- » > . ” ·. loksia sellaisten koostumusten valittujen komponenttien optimoimiseksi. Keksin- • 35 nön hakijat ovat kuitenkin keksineet, että käytettyjen entsyymien tyypistä ja edellä : : mainittujen valittujen valmistusaineiden erityisestä seoksesta riippuen entsyymi- » » 115840 10 valmistusaineiden suhde on edullisesti alueella noin 5 ppm kokonaisproteiinia uudelleenkerrostavassa sellulaasissa: 1 000 ppm kokonaisproteiinia lisätyssä proteaasissa - 1 000 ppm kokonaisproteiinia uudelleenkerrostavassa sellulaasissa: 1 ppm kokonaisproteiinia lisätyssä proteaasissa, kuten aikaisemmin määritel-5 tiin. Eräässä edullisemmassa suoritusmuodossa suhde on noin 10 ppm kokonaisproteiinia uudelleenkerrostavassa sellulaasissa: 200 ppm kokonaisproteiinia lisätyssä proteaasissa - 200 ppm kokonaisproteiinia uudelleenkerrostavassa sellulaasissa: 1 ppm kokonaisproteiinia lisätyssä proteaasissa. Tähän suhteeseen sopivat sekä uudelleenkerrostavan sellulaasin että lisätyn proteaasin spesifisen ak-10 tiivisuuden erilaiset yhdistelmät, molempien suuresta spesifisestä aktiivisuudesta molempien alhaiseen aktiivisuuteen ja näiden välisiin variaatioihin, joissa yhdellä entsyymillä on suhteellisen suuri spesifinen aktiivisuus ja toisella suhteellisen alhainen. Lisäksi tähän suhteeseen sopivat eri puhtauden omaavien entsyymien erilaiset yhdistelmät, molempien suuresta puhtaudesta molempien alhaiseen puh-15 tauteen ja näiden välisiin variaatioihin, joissa yksi entsyymi on suhteellisen puhdasta ja toisella on suhteellisen alhainen puhtaus.

Kun koostumukseen sisällytetään surfaktanttia, sitä on noin 5-85 % joko nestemäisen tai kuivan koostumuksen kokonaispainosta. Ammattimies voi kuitenkin alentaa surfaktantin konsentraation esimerkkien pohjalta määriin alle 20 5 %:iin nestemäisen tai kuivan koostumuksen kokonaispainosta keksinnön suoja- alasta poikkeamatta. On myös mahdollista lisätä komponentit erikseen, kaikki ker-• ralla, tai peräkkäin (mukaan lukien erillisissä huuhtelusykleissä). Denimkankaan käsittelyyn käytetty koostumuksen määrä riippuisi kuitenkin denimsubstraatilla ak-tiivisten entsyymien määrästä ja niiden spesifisestä aktiivisuudesta tuolla sub-v ; 25 straatilla, halutusta kivipesuvaikutuksen määrästä ja muista ammattimiesten tun- i > :. j * ternistä parametreistä.

i : ’: Seuraavat esimerkit kuvaavat keksinnön mukaisesti käytettävien koos- ; Ίtumusten ja menetelmien tehokkuutta, eikä niitä ole tarkoitettu rajoittaviksi. Lisätyn proteaasin tai uudelleenkerrostavan sellulaasin, samoin kuin pesuolosuhteiden, 30 kuten konsentraation, mittauksen, pH-arvon, lämpötilan ja vastaavien, muut valin-',: nat ilmenevät ammattimiehelle tässä olevien opetusten pohjalta.

KOKEELLINEN OSA

»

Esimerkki 1 ‘ : Käytetään 22,7 kg:n (50 Ib.) Unimac-värjäys/pesukonetta. Koneeseen ; · j 35 lisättiin noin 3,8 kg (10 Ibs.) haluttuja testidenimvaatteita. Kone täytettiin 38 l:lla „ 115840 kuumaa vettä ja lämmitettiin 55 °C:seen. Nestesuhde oli 10:1 (kg vaatetta:! nestettä). Neste puskuroitiin happamaan pH-arvoon -4,9 käyttämällä 44 g sitruunahap- pomonohydraattia ja 100 g kaksiemäksistä natriumfosfaattia.

pH-arvon vakiinnuttua lisättiin uudelleenkerrostavaa sellulaasientsyy-5 miä INDIAGE® 44L (Trichoderma-sellulaasikoostumusta, saatavissa kaupallisesti yhtiöstä Genencor International, Inc.) nopeudella noin 0,5 ml tuotetta/l pesunestettä (62,5 ppm kokonaisproteiinia). Sitten lisättiin proteaasientsyymiä, GC899 (seriiniendopeptidaasia Bacillus subtiliksesta, saatavissa yhtiöstä Genencor International, Inc.) noin 2,5 ml tuotetta/l pesunestettä (163 ppm kokonaisproteiinia). 10 Tämä antoi tulokseksi annossuhteen noin 1:2,6 kokonaisproteiinin pohjalta. Vaatteita pestiin 60 minuutin ajan nopeudella 36 r/min. Tämän jälkeen neste laskettiin kylvystä.

Sitten vaatteet huuhdottiin standardisoidun protokollan mukaan puh-distusnesteen kolmessa peräkkäisessä syklissä. Huuhtelu nro 1 = 91,2 I (24 gals.) 15 kuumaa vettä, noin 50 °C, plus -100 g standardidetergenttiä WOB (laitoksesta

American Association of Textile Chemists and Colorists [AATCC], WOB = ilman avivoimisaineita). Sekoitettiin 12 minuutin ajan nopeudella 36 r/min. Neste laskettiin kylvystä. Huuhtelu nro 2 = 91,2 I (24 gals.) lämmintä vettä, -40 °C, ilman lisä- detergenttejä, sekoitettiin 5 minuutin ajan. Neste laskettiin kylvystä. Huuhtelu nro 20 3 = 91,21 (24 gals.) kylmää vettä, -30 °C, detergenttejä lisäämättä, sekoitettiin 5 minuutin ajan. Neste laskettiin kylvystä. Vaatteet uutettiin ja kuivattiin standar-. . disähkövaatekuivurissa.

Otettiin heijastuskykylukemia vaatteiden taustapuolelta Hunter Color * · · · ’ Difference Meter -laitetta (reflektometri) käyttämällä. Heijastuskyky mitattiin heijas- v : 25 tuskyky-prosenttina (tai valon käsitellystä kankaasta lähetyksenä), jolloin L = •, * I 100 yksikköä on valkoinen ja L = 0 yksikköä on musta. Pelkästään uudelleenker- : rostavalla sellulaasilla käsittelyyn (uudelleenkerrostussellulaasikontrolli = 0,5 ml :INDIAGE® 44L-tuotetta/l pesunestettä) verrattuna uudelleenkerrostavalla sellulaasilla plus lisätyllä proteaasilla käsitellyt vaatteet antoivat tulokseksi merkittäväs-. t 30 ti vähentyneen takaisinvärjäyksen samanlaisilla hankaustasoilla (heijastuskykyar- ,: vot 39,07 [uudelleenkerrostussellulaasikontrolli] verrattuna 42,87:ään [uudelleen- kerrostava sellulaasi ja lisätty proteaasij). Nämä heijastuskykyarvot varmistivat vi-*: suaaliset havainnot. Lisätyllä proteaasilla käsittely antoi tulokseksi paremman •. hangatun kokonaiskontrastin. Katso kuviota 1.

» Λ | ! * 12 1 1 5840

Esimerkki 2 Tämä testi oli oleellisen samanlainen kuin esimerkki 1 käyttäen samaa uudelleenkerrostavan sellulaasin tyyppiä ja määrää, mutta eri määrällä samaa lisättyä proteaasia. Tämä oli noin 0,5 ml tuotetta/l pesunestettä (33 ppm kokonais-5 proteiinia) lisättyä proteaasia. Tämä antoi annossuhteen noin T.0,5 kokonaispro-teiinin pohjalta. Kaikki muut käsittelyparametrit olivat samat.

Uudelleenkerrostussellulaasikontrolliin verrattuna heijastuskykyluke-mat olivat kahden käsittelyn välillä merkittävän erilaiset, mutta hankaustaso ei ollut. Sellulaasikontrolli = 39,07 verrattuna sellulaasiin ja proteaasiin = 41,21. Lopul-10 lisella hangatulla ulkonäöllä oli parempi kontrasti lisätyllä proteaasilla käsitellyillä vaatteilla verrattuna käsittelemättömään (ei proteaasia) kontrolliin, lisätyllä proteaasilla käsittely esimerkissä 1 oli kuitenkin parempi kuin esimerkissä 2 osoittaen lisätyn proteaasin titrausvaikutuksen. Katso kuviota 1.

Esimerkki 3 15 Käsittely uudelleenkerrostavalla sellulaasilla oli sama kuin esimerkissä 1, mutta lisättyä proteaasia lisäämättä. Neste laskettiin pois kylvystä ja aloitettiin standardihuuhtelusykli esimerkissä 1 kuvatulla tavalla seuraavalla poikkeuksella: huuhtelun nro 1 alussa lisättiin 1 ml GCS99-proteaasia/l huuhtelunestettä. Käytettiin yhteensä 100 ml lisättyä proteaasituotetta (65 ppm kokonaisproteiinia). Kaikki 20 muut olosuhteet pysyivat samoina.

. ^ Lisätyn proteaasin käyttö detergentin kanssa huuhtelusyklissä antoi tu lokseksi merkittävästi vähentyneen takaisinvärjäyksen verrattuna sellulaasikont-’* ;* rolliin, jota huuhdottiin pelkästään detergentillä. Heijastuskykyarvo oli 40,66 lisä- : tyn proteaasin huuhtelulla verrattuna arvoon 39,07 standardihuuhtelulla ilman li- t * ·.* - 25 sättyä proteaasia. Hankausaste oli molemmilla käsittelyillä sama, vaikka lisätyllä I proteaasilla huuhdotuilla vaatteilla nähtiin parempi kokonaiskontrasti kuin stan- ; dardihuuhtelulla ilman lisättyä proteaasia. Katso kuviota 1.

Esimerkki 4 : Seuraavat lisätyn proteaasin tuotteet testattiin esimerkissä 1 kuvattua 30 sellulaasinpesuprotokollaa käyttämällä yhdessä 0,5ml:n kanssa tuotetta/l pe-•. sunestettä uudelleenkerrostavaa sellulaasientsyymiä (62,5 ppm kokonaisproteii- ‘ nia) INDIAGE® 44L (Trichoderma-sellulaasikoostumus, saatavissa kaupallisesti yhtiöstä Genencor International, Inc.): : 1. MULTIFECT™ P64 (bakteriaalinen proteaasi, joka on peräisin Bacil- i 35 lus licheniformisista ja jota on saatavissa kaupallisesti yhtiöstä Genencor Intema- 115840 13 tional, Inc.), jota annosteltiin tasolla noin 5 g tuotetta/l pesunestettä (71 ppm ko-konaisproteiinia), jolloin saatiin annossuhde noin 1:1 kokonaisproteiinin pohjalta; 2. MULTIFECT™ P53 (bakteriaalinen proteaasi, joka on peräisin Bacillus subtilisista ja jota on saatavissa kaupallisesti yhtiöstä Genencor International, 5 Inc.), jota annosteltiin tasolla noin 5 g tuotetta/l pesunestettä (88 ppm kokonais-proteiinia), jolloin saatiin annossuhde noin 1:1,5 kokonaisproteiinin pohjalta; 3. MULTIFECT™ P41 (sieniproteaasia, joka on peräisin Aspergillus oryzaesta ja jota on saatavissa kaupallisesti yhtiöstä Genencor International, Inc.), jota annosteltiin tasolla noin 5 g tuotetta/l pesunestettä (172 ppm kokonaisproteii- 10 nia), jolloin saatiin annossuhde noin 1:2,75 kokonaisproteiinin pohjalta; 4. Subtilisiini GC399 (saatavissa yhtiöstä Genencor International, Inc.), jota annosteltiin tasolla noin 2,5 g tuotetta/l pesunestettä (238 ppm kokonaisprote-iinia), jolloin saatiin annossuhde noin 1:4 kokonaisproteiinin pohjalta.

Kaikki lisätyn proteaasin käsittelyt antoivat tulokseksi vähemmän uu-15 delleenkerrostusta samanlaisilla hankaustasoilla verrattuna uudelleenkerrostus-sellulaasikontrollivaatteisiin. Kaikissa tapauksissa lisätyn proteaasin käsittely paransi hangatun ulkänäön yleiskontrastia. Katso kuviota 2. Tämä esimerkki osoittaa vaikutuksen eri mikrobilähteistä olevilla lisätyillä proteaaseilla, joilla on sama uudelleenkerrostumisenvastainen vaikutus kuin aikaisemmissa esimerkeissä käy-20 tetyllä lisätyllä proteaasilla.

Esimerkki 5 » * * v * Suoritettiin sarja sellulaasipesuja osoittamaan lisätyn proteaasiproteii- nin teho sinänsä uudelleenkerrostusasteen alentamisessa vastakohtana lisätyn proteaasituotteen formulaatiokomponenteille. Käytettiin GCS99- • 25 proteaasiproteiinia, joka ei sisältänyt lainkaan muita entsyymituoteformulaa- ; tiokomponentteja kuin proteaasiproteiinia. Käytettiin samaa esimerkissä 1 kuvat- ’ j * tua sellulaasipesumenettelytapaa.

* * ·

Suoritettiin seuraavat käsittelyt: 1. Puskurikontrolli (ei proteaasia tai sellulaasia).

: 30 2. Uudelleenkerrostussellulaasikontrolli = annos 0,5 ml INDIAGE® .,: 44L-tuotetta (Trichoderma-sellulaasikoostumus, saatavissa kaupallisesti yhtiöstä •, Genencor International, lnc.)/l pesunestettä (62,5 ppm kokonaisproteiinia).

.··’ 3. Uudelleenkerrostamaton sellulaasikontrolli = annos 2,5 ml DENI- ;* MAX™ (endoglukanaasi, joka on peräisin Humicolasta, ei-patogeenisestä ho- 35 meesta, ja on saatavissa kaupallisesti yhtiöstä Novo Nordisk) -tuotetta/l pesunes-: tettä (100 ppm kokonaisproteiinia). Tämä oli valmistajan suosittelema annos. 4.

115840 14

Lisätyllä proteaasilla käsittely = annos 0,5 ml INDIAGE® 44L (Trichoderma-sellulaasikoostumus, saatavissa kaupallisesti yhtiöstä Genencor International, Inc.) -tuotetta/l pesunestettä (62,5 ppm kokonaisproteiinia) plus noin 0,18 ml GCS99-proteaasiproteiinia/l pesunestettä (25 ppm kokonaisproteiinia). Tämä an-5 toi tulokseksi annossuhteen noin 1 :Q,4 kokonaisproteiinin pohjalta.

Kaikki käsittelyt ajettiin pH-arvossa 5 paitsi uudelleenkerrostamatto-malla sellulaasilla käsittely, joka suoritettiin pH-arvossa 7 valmistajan suositusten mukaan. Heijastuskykylukemat esitetään seuraavassa taulukossa 1:

Taulukko I

10 Käsittely__Heijastuskyky (L-arvo)_

Puskurikontrolli__43,25_

Uudelleenkerrostussellulaasikontrolli 37,92_

Uudelleenkerrostamaton sellulaasikont- 42,60 rolli__

Lisätyllä proteaasilla käsittely 43,51

Heijastuskykytulokset vastaavat näköhavaintojen kanssa, että prote-aasiproteiinin lisääminen alentaa vaatteille uudelleenkerrostumisen astetta. Proteaasilla käsitellyillä vaatteilla on samanlaiset heijastuskykylukemat kuin uudel-v : 15 leenkerrostamattomalla sellulaasilla käsittely. Samoin hangatun kontrastin laatu ί,,,ί on parantunut proteaasikäsittelyllä uudelleenkerrostumissellulaasikäsittelyyn ver- : * i'; rattuna.

I I I

; " : Esimerkki 6

* 1 I

/ Seuraavissa käsittelyissä osoitetaan lisätyn proteaasin käyttö yhdis- ' 20 telmänä surfaktantin kanssa, joko lisättynä erikseen uudelleenkerrostavan-sellu- laasin kanssa tai lisättynä uudelleenkerrostumista estävänä koostumuksena. Jäl-: leen kaikissa tapauksissa käytettiin samaa sellulaasipesuprotokollaa, joka kuvat- ; tiin esimerkissä 1.

1. Puskurikontrolli (ilman proteaasia tai sellulaasia).

* • 25 2. Uudelleenkerrostussellulaasikontrolli = annos 0,5 ml uudelleenker- rostavaa sellulaasia, CELLUSOFT™L (Trichoderma-sellulaasivalmiste, saatavis-, · l sa kaupallisesti yhtiöstä Novo Nordisk) -tuotetta/l pesunestettä (100 ppm koko- ; naisproteiinia), plus annos 0,25 ml ionitonta TRITON® X-100 -surfaktanttia (ioni- 1 1 5840 15 tonta oktyylifenoksipolyetoksietanolisurfaktanttia, saatavissa kaupallisesti yhtiöstä Union Carbide Chemicals ja Plastics Co., Inc.) tuotetta/l pesunestettä (250 ppm).

3. Lisätty proteaasi/surfaktantti-käsittely = annos 0,5 ml uudelleenker-rostavaa CELLUSOFT™L-sellulaasi (Trichoderma-sellulaasivalmistetta, saatavis- 5 sa kaupallisesti yhtiöstä Novo Nordisk) -tuotetta/l pesunestettä (100 ppm koko-naisproteiinia), plus annos 0,25 ml ionitonta TRITON® X-100- surfaktantti (ioniton oktyylifenoksipolyetoksietanolisurfaktantti, saatavissa kaupallisesti yhtiöstä Union Carbide) -tuotetta/l pesunestettä (250 ppm), plus noin 0,2 ml GCS99-proteaasiproteiinia/l pesunestettä (40 ppm kokonaisproteiinia). Tämä antoi tulok-10 seksi annossuhteen noin 1:0,4 kokonaisproteiinin pohjalta.

4. Uudelleenkerrostamaton sellulaasikontrolli = annos 2,5 ml DENI-MAX™ L -tuotetta (endoglukanaasi, joka on peräisin Humicolasta, ei-patogeenisestä homeesta ja jota on saatavissa kaupallisesti yhtiöstä Novo Nordisk)/! pesunestettä (100 ppm kokonaisproteiinia).

15 5. Takaisinvärjäyksenestokoostumusseosta = seosta, joka koostuu uudelleenkerrostavasta Trichoderma-sellulaasista (yhtiöstä Genencor International, Inc.), subtilisiiniproteaasista (GC399 yhtiöstä Genencor International, Inc.) ja ionittomasta surfaktantista (TRITON® X-120, ioniton oktyylifenoksipolyetoksi-etanolisurfaktantti, saatavissa kaupallisesti yhtiöstä Union Carbide) annosteltiin 20 tasolle 2 g seosta/l pesunestettä. Tämä merkitsee suhdetta noin 1:0,4 sellu-laasia/proteaasiproteiinia edellä määritellyllä tavalla. Tämä annos sekoitetuotetta . antoi tulokseksi annokset 60 ppm kokonaisproteiinia sellulaasituotteesta, 24 ppm kokonaisproteiinia proteaasituotteesta, ja 120 ppm surfaktanttia. Sekoitus koostui *;;; ’ 3 %:sta kokonaisproteiinia sellulaasista, 1,2 %:sta kokonaisproteiinia proteaasista » 1 · *·' 25 ja 6 %:sta surfaktanttia.

• · » > · ; > 1 1

» I

1 # 115840 16

Taulukko II

Käsittely__Heijastuskyky (L-arvo)_

Puskurikontrolli__43,25_

Uudelleenkerrostussellulaasikontrolli__35,65_

Proteaasi/surfaktantti-käsittely__42,48_

Uudelleenkerrostamattoman sellulaasin 42,60 kontrolli__

Takaisinvärjäyksen estävä koostumusse- 42,33 koitus_____ 5 Kuten voidaan nähdä, proteaasin lisääminen uudelleenkerrostavaan sellulaasiin surfaktantin läsnä ollessa, joko erillisinä komponentteina lisättynä kaikki yhdessä (proteaasi/surfaktantti-käsittely) tai yhtenä ainoana takaisinvärjäys-tä estävänä koostumuksena (takaisinvärjäyksen estävä koostumussekoitus), vähentää uudelleenkerrostuksen astetta merkittävästi. Proteaasikäsittelyjen heijas-10 tuskykyarvot ovat samanlaiset kuin uudelleenkerrostamattomalla sellulaasilla tai puskurilla käsittelyn heijastuskykyarvot. Näköhavainnot varmistavat tämän. Myös hangatun ulkonäön kontrasti on parantunut proteaasikäsittelyllä, joka on parempi ’; ‘ ’ kuin käsittely uudelleenkerrostussellulaasikontrollilla.

Esimerkki 7 15 Testi suoritettiin oleellisesti samalla tavalla kuin esimerkki 1, paitsi että proteaasi ja uudelleenkerrostava sellulaasi sekoitetaan yhteen ennen pesusykliin lisäämistä. Seos, INDIAGE 44L:ää ja Protease GCS99:ää, valmistetaan suhteessa noin 10:1 kokonaisproteiinin pohjalta. Tässä esimerkissä määrä on noin 111 ppm kokonaisproteiinia. Kun pesunesteen pH-arvo oli vakioitunut, lisättiin : i 20 uudelleenkerrostavan sellulaasin ja proteaasin seosta konsentraatiossa noin ,.,: 1,0 ml seos/l pesunestettä. Kaikki muut käsittelyparametrit olivat samat kuin esi- : ’ , merkissä 1, paitsi että tässä esimerkissä ja esimerkissä 8 alla käytettiin eri denim- ’ I;.' kangaserää.

’; · ‘ Uudelleenkerrostussellulaasikontrolliin verrattuna heijastuskykyluke- *: · ’: 25 mat näytteellä, joka oli käsitelty uudelleenkerrostavalla sellulaasilla/proteaasilla, ·;··· olivat merkittävästi erilaiset. Heijastuskykytulokset vastaavat näköhavaintoa, että 115840 17 proteaasiproteiinin lisääminen seokseen alentaa denimvaatteille uudelleenkerros-tumisen astetta uudelleenkerrostussellulaasikontrolliin verrattuna. Proteaasikäsi-tellyillä vaatteilla nähdään samanlaiset heijastuskykylukemat kuin kerrostamatto-malla sellulaasilla käsittelyllä. Hangatun kontrastin laatu kankaassa oli myös pa-5 rantunut uudelleenkerrostavan sellulaasin/proteaasin seoksen avulla verrattuna uudelleenkerrostavaan sellulaasiin yksinään. Katso taulukkoa III alla.

Esimerkki 8

Testi suoritettiin samalla tavalla kuin esimerkki 7 käyttäen samaa uudelleenkerrostavan sellulaasin ja proteaasin seosta, sellulaasi/proteaasisuhdetta 10 muutettiin kuitenkin ja liitettiin mukaan lisäkuumennusprosessi.

Valmistettiin seos, joka sisälsi INDIAGE 44L:ää ja Protease GCS99:ää suhteessa noin 60:1 kokonaisproteiinin pohjalta. Seosta kuumennettiin edelleen lämpötilaan 37 °C 120 tunnin ajan ennen pesusykliin lisäämistä. Tässä esimerkissä määrä on noin 122 ppm kokonaisproteiinia. Kaikki muut käsittelyparametrit oli-15 vat samat kuin esimerkeissä 1 ja 7 kuvatut.

Taulukko lii Käsittely__Heijastuskyky (L-arvo)_

Uudelleenkerrostussellulaasikontrolli__45,08_ :J. Uudelleenkerrostussellulaa- 52,58 si/proteaasiseos (esimerkki 7)__ '.· · Uudelleenkerrostussellulaa- 52,53 * si/proteaasiseos ‘.'V Lämpökäsittely (esimerkki 8)__ * » » , > - · ’ Uudelleenkerrostamaton sellulaasikontrolli 51,86_ : ... Samalla tavalla kuin tuloksissa esimerkistä 7, jossa vaatteet käsitel- 20 lään uudelleenkerrostavan sellulaasi/proteaasin seoksella, johtaa vaatteiden kä-;·' sittely aikaisemmin lämmitetyllä uudelleenkerrostavan sellulaasin/proteaasin : : seoksella parantuneeseen takaisinvärjäyksen vähenemiseen verrattuna vaattei- siin, jotka on käsitelty pelkästään uudelleenkerrostavalla sellulaasilla. Lisäksi • , hangatun ulkonäön kontrasti on selvästi parantunut käytettäessä etukäteen inku- 11 E 8 40 18 boitua sellulaasi/proteaasiseosta verrattuna uudelleenkerrostussellulaasikontrol-liin ja esimerkin 7 uudelleenkerrostavan sellulaasin/proteaasin seokseen. 1

Claims (22)

1. Menetelmä paikallisesti rajoittuvien alueiden lisäämiseksi indigovär-jätyn denimkankaan pinnalle, joilla paikallisesti rajoittuvilla alueilla on väritiheyden vaihtelua ja suuri kontrasti denimkankaan sinisten ja valkoisten kuitujen välillä, 5 tunnettu siitä, että denimkangas saatetaan kontaktiin: a. tehokkaan määrän kanssa uudelleenkerrostavaa sellulaasia, joka on riittävä väritiheyden vaihteluiden tuottamiseen; ja b. tehokkaan määrän kanssa lisättyä proteaasia, joka on riittävä ta-kaisinvärjäyksen vähentämiseen ja sinisten ja valkoisten kuitujen välisen kontras- 10 tin lisäämiseen missä hyvänsä järjestyksessä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sellulaasin ja proteaasin tehokas määrä on suhde noin 5 ppm kokonaisproteii-nia uudelleenkerrostavassa sellulaasissa : 1 000 ppm kokonaisproteiinia lisätyssä 15 proteaasissa -1 000 ppm kokonaisproteiinia uudelleenkerrostavassa sellulaasissa : 1 ppm kokonaisproteiinia lisätyssä proteaasissa.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lisätty proteaasi on seriini- tai metalloproteaasia.

4. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1 - 3 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että proteaasi on Bacilluksesta tai Aspergilluksesta.

... 5. Minkä tahansa edeltävän patenttivaatimuksen mukainen menetellä ‘ mä, t u n n e 11 u siitä, että edelleen lisätään riittävä määrä surfaktanttia uudel- * · ·. leenkerrostuneen indigovärin poiston edelleen lisäämiseksi.

·.·’ : 6. Minkä tahansa edeltävän patenttivaatimuksen mukainen menetel- : :': 25 mä, tunnettu siitä, että uudelleenkerrostava sellulaasi on Trichodermasta.

7. Minkä tahansa edeltävän patenttivaatimuksen mukainen menetel- mä, tunnettu siitä, että lisättyä proteaasia tai uudelleenkerrostavaa sellulaasia on modifioitu yhdistelmä-DNA-tekniikalla sellaisen kanna tuottamiseksi, jo-. . ka yliekspressoi proteaasin tai sellulaasin erityisiä komponentteja tai jossa on de- :: 30 leetio erityisten komponenttien suhteen.

8. Minkä tahansa edeltävän patenttivaatimuksen mukainen menetel-: mä, tunnettu siitä, että lisättyä proteaasia tai uudelleenkerrostavaa sellu- , ·. laasia on modifioitu proteiininmuokkauksella sellaisten proteaasi- tai sellu- '·’ laasientsyymien tuottamiseksi, joilla on muuttuneet ominaisuudet, kuten entsyy- ' 1 ” ’ 35 miaktiivisuus tai -spesifisyys. 115840

9. Minkä tahansa edeltävän patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että denimkangas saatetaan edelleen kontaktiin hohkaki-vien kanssa.

10. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, 5 että seriiniproteaasi on subtilisiinia.

11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että uudelleenkerrostava sellulaasi ja proteaasi sekoitetaan yhteen ennen kosketusta denimin kanssa ja seosta pidetään lämpötila-alueella noin 30 - 60 °C noin 1 tunnin - noin 14 päivän ajan.

12. Proteaasin ja uudelleenkerrostavan sellulaasin käyttö takaisinvär- jäyksen estämiseen käytettäessä sellulaasia paikallisesti rajoittuvien väritiheydel-tään vaihtelevien alueiden lisäämiseksi indigovärjätyn denimkankaan pinnalle, jolloin denimkankaan sinisten ja valkoisten kuitujen välille syntyy suuri kontrasti.

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että 15 uudelleenkerrostavaa sellulaasia ja lisättyä proteaasia käytetään suhteessa noin 5 ppm kokonaisproteiinia uudelleenkerrostavassa sellulaasissa : 1 000 ppm ko-konaisproteiinia lisätyssä proteaasissa -1 000 ppm kokonaisproteiinia uudelleenkerrostavassa sellulaasissa : 1 ppm kokonaisproteiinia lisätyssä proteaasissa.

14. Patenttivaatimuksen 12 tai 13 mukainen käyttö, tunnettu siitä, 20 että proteaasi on seriini- tai metalloproteaasia.

15. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 12-14 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että proteaasi on Bacilluksesta tai Aspergilluksesta.

16. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 12-15 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että denimkangas saatetaan lisäksi kosketuksiin riittävän ‘ * 25 määrän kanssa surfaktanttia uudelleenkerrostuneen indigovärin poiston edelleen : i lisäämiseksi. • f

17. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 12-16 mukainen käyttö, ; tunnettu siitä, että uudelleenkerrostava sellulaasi on Trichodermasta.

18. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 12-17 mukainen käyttö, ,·, 30 tunnettu siitä, että proteaasia tai uudelleenkerrostavaa sellulaasia on modi- fioitu yhdistelmä-DNA-tekniikalla sellaisen kannan tuottamiseksi, joka yliekspres-;* soi proteaasin tai sellulaasin erityisiä komponentteja tai jossa on deleetio erityis- ten komponenttien suhteen.

19. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 12-18 mukainen käyttö, ‘ , 35 tunnettu siitä, että proteaasia tai uudelleenkerrostavaa sellulaasia on modi- ’ fioitu proteiininmuokkauksella sellaisten proteaasi- tai sellulaasientsyymien tuot- 11ι: 40 tamiseksi, joilla on muuttuneet ominaisuudet, kuten entsyymiaktiivisuus tai -spesifisyys.

19 1UC40 Pate ntti vaatim u kset

20. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 12-19 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että denimkangas saatetaan edelleen kontaktiin hohkakivien 5 kanssa.

21. Patenttivaatimuksen 14 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että seriiniproteaasi on subtilisiiniä.

22. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 12-21 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että uudelleenkerrostava sellulaasi ja proteaasi sekoitetaan 10 yhteen ennen kosketusta denimin kanssa ja seosta pidetään lämpötila-alueella noin 30 - 60 °C noin 1 tunnin - noin 14 päivän ajan. < · i *