FI112661B - Antiproliferatiivisina aineina ja Garft-inhibiitteinä käyttökelpoisia yhdisteitä - Google Patents

Description

112661 ANTIPROLIFERATIIVISINA AINEINA JA GARFT-INHIBIITTEINÄ KÄYTTÖKELPOISIA YHDISTEITÄ

Keksintö koskee patenttivaatimuksissa määriteltyjä yhdisteitä, jotka inhiboivat entsyymiä gly-5 sinamidiribonukleotidi formyylitransferääsi (GARFT). Yhdisteillä on kasvainten, tulehdusten, hilsettymän vastainen ja/tai immunosupressiivinen vaikutus.

Suuri joukko antiproliferatiivisia aineita sisältää antimetaboliittiyhdisteitä. Eräs erityinen 10 antifolaatteina tai antifooleina tunnettu antimetabo-liittien alaryhmä ovat vitamiinifoolihapon antagonistit. Tyypillisesti antifolaatit muistuttavat läheisesti foolihapon rakennetta ja sisältävät tunnusomaisen foolihapon p-bentsoyyliglutamaattiosan. Foolihapon 15 glutamaattiosa saa negatiivisen kaksoisvarauksen fysiologisella pH-alueella. Sen vuoksi tällä yhdisteellä ja sen analogeilla on aktiivisen energian käyttämä siirtojärjestelmä solukalvon ylittämiseksi ja metabolisen vaikutuksen kohdistamiseksi.

20 GAFRT on folaatti-riippuvainen entsyymi pu- riinin biosynteesipolun alussa. Tämä polku on kriitti- :Y: nen solun jakautumiselle ja proliferaatiolle. Tämän polun sulkemisella tiedetään olevan antiproliferatii-vinen vaikutus, erityisesti kasvaimia ehkäisevä vaiku- ,···. 25 tus. Siten lukuisia folaattianalogeja on syntetisoitu ja tutkittu niiden kyvyn vuoksi estää GARFT: ia. Proto-tyypin asteella olevan erikoisen tiukkasidoksisen ’·’ ‘ GARFT-inhibiitin, 5,10-dideatsatetrahydrofoolihapon, on ilmoitettu osoittavan kasvaimia ehkäisevää vaiku- * · · • 30 tusta. Ks. F.M. Muggia, "Folaatti tuottaa inhibiitin * » · :,γ puriinisynteesin alkamisen estämiseen", New Drugs,

Concepts and Results in Cancer Chemotherapy, Kluwer γ.’( Academic Publishers, Boston (1992), 65-87.

Äskettäin on julkistettu antiproliferatiivi- » > •. * 35 sinä aineina tai GARFT-inhibiitteinä käyttökelpoisia kondensoituneita heterosyklisiä glutamiinihappojohdan-naisia kansainvälisessä patenttihakemuksessa 2 s\ s, ·- ·" ," -Ί 1 ίζ,ϋϋ ! PCT/US94/00418, jonka tämän hakija on kirjannut 18. tammikuuta 1994. Keksintö jatkaa etenemistä tällä alueella kehittämällä edelleen käyttökelpoisia antiproli-feratiivisia aineita ja GARFT-inhibiittejä.

5 Keksintö koskee patenttivaatimuksissa määri teltyjä yhdisteitä. Nämä yhdisteet ovat tehokkaita estämään glysinamidiribonukleotidi formyylitransferaasia (GARFT) ja korkeampien eliöiden ja mikro-organismien, kuten bakteerien, hiivan ja sienten, solujen kasvua ja 10 proliferaatiota.

Kuten edellä on esitetty, keksinnön yhdisteet omaavat antiproliferatiivisen aktiivisuuden, ominai suuden, joka voi ilmetä kasvaimia ehkäisevän vaikutuksen muodossa. Keksinnön yhdiste voi olla aktiivinen 15 sellaisenaan tai esivaihe, joka muuttuu elimistössä aktiiviseksi yhdisteeksi. Keksinnön edulliset yhdisteet ovat erikoisen aktiivisia GARFT-entsyymin inhi-boinnissa. Erityisesti edulliset yhdisteet ovat aktiivisia L1210 solusukupolven, hiiren leukemia solusuku-20 polven, kasvun estämisessä, jota voidaan kasvattaa kudosviljelmässä. Keksinnön yhdisteet voivat olla ak-V. tiivisia myös inhiboitaessa bakteerien kasvua, kuten ’ gram-negatiivisten Escherichia coli-bakteerien, joita ,, , voidaan kasvattaa viljelmässä.

25 Keksinnön mukaisia yhdisteitä samoin kuin niiden farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja voidaan : ’·· yhdistää sopiviin annosmuotoihin, kuten kapselit, tab- · letit ja ruiskutettavat valmisteet. Kiinteitä tai nestemäisiä farmaseuttisesti hyväksyttäviä kantoaineita, , *‘; 3 0 laimennusaineita tai täyteaineita voidaan myös käyt- tää.

Kiinteisiin kantoaineisiin kuuluvat tärkke-’·’ lys, laktoosi, kalsiumsulf aatt idihydraatti, valkea kaoliini, ruokosokeri, talkki, gelatiini, agar-agar, 35 pektiini, akaasia, magnesiumstearaat ti ja steariini- happo. Nestemäisiin kantoaineisiin kuuluvat siirappi, maapähkinäöljy, oliiviöljy, fysiologinen suolaliuos ja Λ Λ r ' s\ 2 I I u 0 i vesi .

Kantoaine tai laimennusaine voi sisältää hitaasti vapautuvaa materiaalia, kuten glyserolimono-stearaattia tai glyseryylidistearaattia, yksin tai va-5 hän yhteydessä. Käytettäessä nestemäistä kantoainetta valmiste voi olla siirapin, eliksiirin, emulsion, pehmeän gelatiinikapselin, steriloidun ruiskutettavan nesteen (esim. liuoksen) tai vedettömän tai vesipitoisen suspension muodossa.

10 Lääkevalmisteet valmistetaan noudattaen ta vanomaisia apteekkimenetelmiä käsittäen vaiheet, kuten sekoittamisen, rakeistuksen ja kokoonpuristamisen tarvittaessa tabletin muodoiksi tai ainesosien sekoittamisen, täyttämisen ja liuottamisen sopivasti haluttu-15 jen tuotteiden saamiseksi annettavaksi suun kautta, ruoansulatuskanavan ulkopuolisesti, ulkoisesti, emättimen sisäisesti, nenän kautta, keuhkoputken sisäisesti, silmän kautta, korvan kautta tai peräsuolen kautta .

20 Keksinnön yhdisteet voivat lisäksi sisältää yhden tai useampia muita farmaseuttisesti aktiivisia ,·. yhdisteitä. Esim. joku seuraavista kasvaimia ehkäise vistä aineista voidaan sisällyttää seokseen: mitoosi-, . inhibiitit (esim. vinblastiini); alkylointiaineet; di- 25 hydrofolaattireduktaasi-inhibiitit tai TS-inhibiitit; ··’ antimetaboliitit (esim. 5-f luorourasiili, sytosiinira- : '·· binosidi) ; interkalaatioantibiootit (esim. adriamycin, .· ·’ bleomycin); entsyymit (esim. asparaginaasi) ; to- poisomeraasi-inhibiitit (esim. etoposidi); ja biologi-: 30 set reaktiomodifikaattorit (esim. interferoni). Kek- sinnön yhdisteitä voidaan käyttää myös yhdessä yhden tai useamman antiproliferatiivisen aineen tai GARFT-inhibiitin kanssa, kuten yleiseksi siirretyssä (com-.·.* monly assigned) kansainvälisessä patenttijulkaisussa ; 35 W0 94/13295, joka on julkaistu 23. kesäkuuta 1994, tai » » ... · patenttijulkaisussa WO 92/05153, joka on julkaistu 2.

huhtikuuta 1992, joiden paljastukset sisällytetään tä- 4

Λ < (' ' f A

I Uuö I

hän hakemukseen tällä viittauksella, kuvattu yhdiste. Keksinnön seokset voivat sisältää myös yhden tai useamman bakteerien, sienten, iholoisten, virusten, hil-settymän tai kokkidioosin vastaisen aineen. Esimerk-5 keinä bakteereja vastustaviin aineisiin kuuluvat: sul- fonamidit, kuten sulfametoksatsoli, sulfadiatsiini, sulfameter ja sulfadoksiini; dihydrofoolireduktaasi-inhibiitit, kuten trimethoprim, bromodiaprin ja tri-metreksaatti; penisilliinit; kefalosporiinit; ja kino-10 lonikarboksyylihapot ja niiden kondensoidut isotiatso-loanalogit.

Hoitomenetelmässä korkeampien eliöiden tai mikro-organismien solujen kasvun tai proliferaation estämiseksi voidaan antaa tehokas annos tai määrä kek-15 sinnön mukaista yhdistettä isännälle. Keksinnön yhdisteet ovat erityisen käyttökelpoisia nisäkäsisäntien, kuten ihmisisäntien ja lintuisäntien hoidossa. Hoitoprosessi voi käsittää keksinnön mukaisen yhdisteen määrän, joka on tehokas estämään GARFT:ia, antamisen 20 isännälle.

Monia hakemuksessa kuvatuista antiprolifera-tiivisista yhdisteistä ja niiden farmaseuttisesti hy-väksyttävistä suoloista voidaan käyttää hoitomenetel-. . mässä. Yhdisteet voidaan antaa farmaseuttisesti hyväk- ' ; 25 syttävän seoksen muodossa, joka sisältää edellä kuvat- ’tua laimennus- tai kantoainetta.

" Annos seosta sisältää vähintään tehokkaan ·’ määrän aktiivista yhdistettä ja koostuu edullisesti yhdestä tai useammasta farmaseuttisesta annosyksikös-3 0 tä. "Tehokas määrä" tarkoittaa riittävää määrää fo-laattimetabolisten polkujen estämiseksi ja hyötyvaiku-tusten saamiseksi siitä, esim. antamalla yksi tai use-'·’ ampia farmaseuttisia annosyksiköitä.

'...· Esimerkin luonteinen päivittäinen annos sel- : 35 kärankaiselle isännälle sisältää määrältään yhteen . : grammaan asti aktiivista yhdistettä isäntä-kg kohden, edullisesti puoli grammaa, edullisemmin 100 mg ja 5 11 ο λ ,·: i

I I/.UU I

edullisimmin n. 50 mg tai vähemmän isännän kehonpaino-kiloa kohden. Valittu annos voidaan antaa lämminveriselle eläimelle tai nisäkkäälle, esim. hoidon tarpeessa olevalle ihmispotilaalle, folaattimetabolisten pol-5 kujen estämisen välittämänä kaikilla sopivilla annoksen antomenetelmillä, mukaanlukien ulkoisesti, esim. voiteena tai rasvana; suun kautta; peräsuolen kautta, esim. peräpuikkona; ruoansulatuskanavan ulkopuolisesti ruiskeena; tai jatkuvasti emättimen sisäisesti, nenän 10 kautta, keuhkoputken sisäisesti, korvan tai silmän kautta suihkeena.

Keksinnön mukaiset yhdisteet tuottavat yhden tai useampia antiproliferatiivisesta vaikutuksesta, bakteerien vastaisesta vaikutuksesta, iholoisten vas-15 täisestä vaikutuksesta, virusten vastaisesta vaikutuksesta, hilsettymän vastaisesta vaikutuksesta, al kueläinten vastaisesta vaikutuksesta, kokkodioosin vastaisesta vaikutuksesta, tulehdusten vastaisesta vaikutuksesta, immunosupressiivisesta vaikutuksesta ja 20 sienten vastaisesta vaikutuksesta. Yhdisteet ovat erityisen käyttökelpoisia tuotettaessa kasvainten kasvua estävä vaikutus selkärankaiseen isäntään, jolla on ·' kasvain.

' Seuraavassa kuvataan keksintöä yksityiskoh- : 25 taisesti.

- > Keksintö koskee erityisesti yhdisteitä: 0 COjfl,

H

; 3 5 ' I jossa A on S; 6 1 12661 X on CH2; Y on S: B on vety; C on vety; ja 5 Ri ja R2 ovat itsenäisesti vety.

Edullisesti X on CH2. Y on edullisesti S. B on edullisesti vety. C on edullisesti vety. Ri ja R2 valitaan edullisesti itsenäisesti ryhmistä vety. On erityisen edullista, että A ja Y ovat kumpikin rikki 10 ja X on CH2.

Patenttivaatimusten yhdisteet ovat käyttökelpoisia GARFT-inhibiitteinä. Yhdisteet, joissa Ri ja R2 ovat kumpikin vety, ovat erikoisen aktiivisia kasvaimia ehkäisevinä tai antiproliferatiivisina aineina. 15 Yhdisteiden farmaseuttisesti hyväksyttäviin suoloihin kuuluvat esim. keksinnön glutamiinihappoyh-disteiden alkalimetalli-, maa-alkalimetalli-, muut ei myrkylliset metalli- ja ammonium- ja substituoidut am-moniumsuolat. Esimerkkisuoloihin kuuluvat vapaiden 20 happoyhdisteiden natrium-, kalium-, litium-, kalsium-, magnesium-, pyridiini- ja substituoidut pyridiinisuo-lat.

Keksinnön yhdisteitä voidaan valmistaa seu-raavasti. Käyttökelpoinen lähtöaine yhdisteiden, jois-25 sa X on CH2, yhdisteiden valmistamiseksi on kaavan II yhdiste: b- lii-

; D Y ] (ID

O

' 35 jossa B, C ja Y ovat kuten edellä määriteltiin; D on : Cl, Br tai I; ja R6 on vety tai osa, joka muodostaa *;·; sidotun C02:n kanssa helposti hydrolysoituvan esteri- Ία r a

LuO ! 7 ryhmän. D on edullisesti bromi tai jodi. R6 on edullisesti vety, Ci-C6alkyyli, hydroksialkyyli, alkyyliaryy-li tai aryylialkyyli, edullisemmin vety tai Ci-C2alkyyli.

5 Kaavan II yhdisteen annetaan reagoida kaavan III yhdisteen kanssa: 10 (III) jossa R3 on substituoitu tai substituoimaton Ci-C6alkyyliryhmä tai trisubstituoitu silyyliryhmä. R3 on edullisesti CH2OH tai trimetyylisilyyli.

15 Kaavojen II ja III yhdisteiden reaktio toteu tetaan sopivan siirtymämetallikatalyytin, edullisesti palladiumin tai nikkelin, ei-nukleofiilisen apuemäk-sen, edullisesti substituoidun amiinin läsnäollessa liuottimessa, johon vähintään yksi reaktioon osallis-20 tuvista aineista ainakin osittain liukenee olosuhteissa, jotka riittävät kaavan IV yhdisteen saamiseksi: jossa B, C ja Y ovat kuten edellä määriteltiin; R6 on 30 kuten edellä määriteltiin kaavaa II varten; ja R3 on , kuten edellä määriteltiin kaavaa III varten.

R3:n ollessa trisubstituoitu silyyliryhmä si- » * lyyliryhmä poistetaan edullisesti nukleofiilisella emäksellä, kuten metanolia tai etanolia sisältävä ka-; 35 liumkarbonaatti, tai fluorisuolalla, kuten kaliumfluo- ; ridilla, keesiumfluoridilla tai tetrabutyyliammonium- fluoridilla, liuottimessa (esim. metanoli, dimetyyli- 8

11 r / h-1 I I «L u u I

formamidi, etanoli, dimetyyl iasetamidi, dimetyylisulf-oksidi tai iso-propanoli), johon vähintään yksi reaktioon osallistuvista aineista ainakin osittain liukenee, kaavan V yhdisteen antamiseksi: 5 B ,c 'COjflj

10 H"" Y

jossa B, C ja Y ovat kuten edellä määriteltiin kaavaa I varten; ja R6 on kuten edellä määriteltiin kaavaa II

15 varten.

Kaavan V yhdisteen annetaan reagoida elektro-fiilin, edullisesti N-suojatun glysinaalin, edullisemmin N-t-butoksikarbonyyliglysinaalin tai bis-N-t-butoksikarbonyyliglysinaalin, kanssa emäksisissä olo- 20 suhteissa käyttäen ei-nukleof iilista emästä, edullisesti litiumbis-trimetyylisilyyliamidia, kaliumbis-, trimetyylisilyyliamidia, natriumbis-trimetyyli- silyyliamidia tai litiumdi - isopropyyliamidia, alhai-* sessa lämpötilassa, edullisesti -90°C - +25°C, sopi- ,: 2 5 vassa liuottimessa, johon vähintään yksi reaktioon osallistuvista aineista ainakin osittain liukenee, : ,, edullisesti tetrahydrofuraanissa, dietyylieetterissä tai dioksaanissa, kaavan VI yhdisteen antamiseksi: 30 a.c

35 R5fVT

:· (vi> 9 Λ Λ r , - ,- ^ I Ι^ϋϋ ! jossa Β, C ja Υ ovat kuten edellä määriteltiin; R6 on kuten edellä määriteltiin kaavaa II varten; ja R4 ja R5 ovat kumpikin itsenäisesti vety tai helposti poistettava typpi-suojaryhmä. R4 ja R5 ovat edullisesti vety, 5 t-butoksikarbonyyli, bentsyylioksikarbonyyli tai bent-syyli .

Sitten kaavan VI yhdiste pelkistetään, edullisesti vetykaasulla sopivan metallikatalyytin läsnäollessa kaavan VII yhdisteen saamiseksi: 10 \ 15 (VII)

no^J

R5R4N

20 , jossa B, C ja Y ovat kuten edellä määriteltiin; R6 on ‘t kuten edellä määriteltiin kaavaa II varten; ja R4 ja R5 ovat kuten edellä määriteltiin kaavaa VI varten.

25 Sitten kaavan VII yhdisteen annetaan reagoida asylointi- tai sulfonylointiaineen, edullisesti me-taanisulfonyylikloridin tai p-tolueenisulfonyyliklo-; ridin, kanssa ei-nukleofiilisen emäksen, edullisesti trietyyliamiinin ta di-isopropyylietyyliamiinin, läs- 30 näollessa sopivassa liuottimessa, johon vähintään yksi reaktioon osallistuvista aineista ainakin osittain liukenee aktivoidun hydroksiyhdisteen saamiseksi. Ak-. * tivoitu hydroksiyhdiste korvataan sopivalla nukleofii- ' lilla, edullisesti tiohapon suolalla, edullisemmin ka- : 35 liumtioasetaatilla, kaavan VIII yhdisteen saamiseksi: ΙΑ Γ si L· C ϋ i 10 a c 5 \ C02Re

AcA^J (VIII) R5R4N— 10 jossa A, B, C ja Y ovat kuten edellä määriteltiin; Re on kuten edellä määriteltiin kaavaa II varten; ja R4 ja R5 ovat kuten edellä määriteltiin kaavaa VI varten; ja Ac on asyyliryhmä, edullisesti asetyyli.

15 Vaihtoehtoisesti kaavan VII yhdiste muunne taan kaavan VIII yhdisteeksi yhdessä kemiallisessa prosessissa käyttäen trifenyylifosfiinia, dietyyli- tai dimetyyliatsadikarboksylaattia ja happonukleof ii-lia, edullisesti tioetikkahappoa, sopivassa liuotti-20 messa.

Kaavan VIII yhdistettä käsitellään nukleofii-lisella emäksellä, edullisesti kaliumkarbonaatilla, ; natriumkarbonaatilla, natriumhydroksidilla, kaliumhyd- roksidilla, alkoholiliuottimessa, edullisesti me-25 tanolissa, etanolissa tai isopropanolissa, alkylointi- aineen, edullisesti dimetyyli- tai dietyylikloorima-lonaatin, läsnäollessa kaavan IX yhdisteen saamiseksi: r* y~\

Re02C^V

Γ ; ; 35 r5r4n— 11 Λ Λ f .·' ," I Uuu 1 jossa A, B, C ja Y ovat kuten edellä määriteltiin; R6 on kuten edellä määriteltiin kaavaa II varten; ja R4 ja R5 ovat kuten edellä määriteltiin kaavaa VI varten.

Kaavan IX yhdistettä käsitellään jomman kum-5 man tai molempien suojaryhmien R4 ja R5 poistamiseen sopivissa olosuhteissa kaavan X yhdisteen tuottamisek- | (x) 15 ____

H

jossa A, B, C ja Y ovat kuten edellä määriteltiin; ja 20 Rö on kuten edellä määriteltiin kaavaa II varten, t-Butoksikarbonyylin (t-BOC) ollessa suojaryhmä puitteet ,· ._ tämän ryhmän poistamiseksi ovat edullisesti käsittely trifluorietikkahapolla, sen jälkeen neutralointi kaa-,, van X yhdisteen tuottamiseksi.

• ·’ 25 Kaavan X yhdisteen annetaan reagoida alky- .* lointiaineen, edullisesti trimetyyli- tai trietyyliok- : '· sonium-tetrafluoriboraatin, kanssa sopivassa liuotti- ;,· ·' messa, edullisesti dikloorimetaanissa, laktiimieette- rivälituotteen muodostamiseksi. Laktiimieetteriväli-. 3 0 tuotteen annetaan reagoida guanidiinin kanssa alkoho- liliuottimessa, edullisesti metanolissa, etanolissa tai isopropanolissa, kaavan XI yhdisteen muodostami- • ’ seksi: 35 Λ < r s .< s, 12 I ί L. ϋ ϋ ί

5 I

HNX^Vj^'A*^--(XI) 1 ο μ2ν ν μ jossa A, Β, C ja Υ ovat kuten edellä määriteltiin; ja R6 on kuten edellä määriteltiin kaavaa II varten.

Vaihtoehtoisesti kaavan X yhdiste muunnetaan 15 kaavan XI yhdisteeksi antamalla kaavan X yhdisteen reagoida tiolointiaineen, edullisesti P2S5:n tai 2,4- bis (4 - met oksi f enyyli) - l,3-ditia-2,4 - di f osf etaani -2 -4 -disulfidin, kanssa tiolaktaamivälituotteen muodostamiseksi. Tämä voidaan sitten alkyloida alkylointiaineel-20 la, edullisesti metyylijodidilla tai trimetyyli- tai trietyylioksonium-tetraf luoriboraatilla, ja sitten guanidiinilla alkoholiliuottimessa, edullisesti me-tanolissa, etanolissa tai isopropanolissa, kaavan XI yhdisteen saamiseksi.

; ·' 25 Kaavan XI yhdiste hydrolysoidaan emäksisissä olosuhteissa kaavan XII yhdisteen muodostamiseksi: : hn^^A^J (XII) \ ; 3 5 13 112061 jossa A, B, C ja Y ovat kuten edellä määriteltiin. R6:n ollessa vety kaavan XI yhdisteessä silloin hydro-lyysireaktio ei ole tarpeellinen ja kaavan XI yhdiste on alla olevalla tavalla liitetty peptidi.

5 Kaavan XII yhdiste (eli kaavan XI yhdiste, jossa R6 on vety), joka on vapaan karboksyylihapon muodossa, voi olla alan asiantuntijoiden tuntemalla tavalla glutamiinihapon diesterihydrokloridiin liitetty peptidi kaavan XIII diesterin muodostamiseksi: 10 ° COjfl’ (χιπ) 20 jossa A, B, C ja Y ovat kuten edellä määriteltiin; ja Ri ja R2 ovat kumpikin itsenäisesti osa, joka muodostaa . sidotun C02: n kanssa helposti hydrolysoituvan esteri- \ ryhmän, kuten Ci-C6alkyyli, hydroksialkyyli, alkyy- liaryyli tai aryylialkyyli.

: .· 25 Lopuksi kaavan XIII yhdiste hydrolysoidaan .: haluttaessa kaavan I vapaan glutamiinihapon muotoon .. (Ri ja R2 ovat kumpikin H) .

Yhdisteitä, joissa X on muu kuin CH2, voidaan valmistaa käyttäen kaavan XIV olefiinia: i ” X.

(XIV)

35 J

14 11 k ύ ϋ 1 jossa Β, C ja Υ ovat kuten edellä määriteltiin; X on kuten edellä määriteltiin kaavaa I varten sillä poikkeuksella, että X on muu kuin CH2; ja R6 on kuten edellä määriteltiin kaavaa II varten.

5 X:n ollessa rikki, happi tai substituoitu tai substituoimaton amino kaavan XIV yhdiste valmistetaan alkyloimahla kaavan XV yhdiste : 10 \ / (XV)

jrV

hx"^\y/~-coir· 15 jossa B, C ja Y ovat kuten edellä määriteltiin kaavaa I varten; X on rikki, happi tai substituoitu tai substituoimaton amino; ja Re on kuten edellä määriteltiin kaavaa II varten. Alkylointi voidaan suorittaa käyttäen allyylihalidia, edullisesti allyylibromidia, ei- 20 nukleofiilisen emäksen, edullisesti trietyyliamiinin tai di-isopropyylietyyliamiinin, läsnäollessa kaavan XIV yhdisteen saamiseksi.

X:n ollessa substituoitu tai substituoimaton Ci-C2alkyyli, muu kuin CH2, substituoitu tai substitu- 25 oimaton C2-C3alkenyyli tai substituoitu tai substituoimaton C2-C3alkynyyli kaavan XIV yhdiste valmistetaan muodostamalla kaavan XVI aldehydistä olefiini:

- V

WVI)

. V

o 15 λ a r ·* r I UUO ! jossa B, C ja Y ovat kuten edellä määriteltiin kaavaa I varten; ja X on substituoitu tai substituoimaton Ci-C2alkyyli, muu kuin CH2, substituoitu tai substituoimaton C2-C3alkenyyli tai substituoitu tai substituoimaton 5 C2-C3alkynyyli. Kaavan XVI aldehydi voidaan valmistaa analogisesti Chuan Shih et al:n kuvaamalla tavalla, Journal of Medicinal Chemistry, osa 35 (1992) , 1109- 1116. Aldehydin muodostaminen olefiiniksi voidaan suorittaa käyttäen metyleenisiirtymäainetta, edullisesti 10 metyleeni-trifenyylifosforaania.

Kaavan XIV yhdisteen annetaan reagoida dihyd-roksylointiaineen, edullisesti osmiumtetroksidin, kanssa sopivan hapettavan aineen, edullisesti N-metyylimorfoliini-N-oksidin, läsnäollessa kaavan XVII 15 yhdisteen saamiseksi:

B C

JK

X--\ COjfie 20 I > ^ * (XVII)

HO^^J

< * I

' ’ 25 jossa B, C ja Y ovat kuten edellä määriteltiin kaavaa I varten; ja X on kuten edellä määriteltiin kaavaa I • '·. varten sillä poikkeuksella, että se on muu kuin CH2; : : ; ja Ri on kuten edellä määriteltiin kaavaa II varten.

Kaavan XVII yhdisteen annetaan reagoida sul-c. ·. 30 fonylointiaineen, edullisesti p-tolueenisulfonyyli- , kloridin tai metaanisulf onyylikloridin, kanssa ei- ·' nukleofiilisen emäksen, edullisesti trietyyliamiinin .* tai di-isopropyylietyyliamiini n, läsnäollessa monosul- fonyloidun välituoteyhdisteen tuottamiseksi. Tämän vä-; 35 lituotteen annetaan reagoida vahvan emäksen, edulli- sesti natriumhydridin, kanssa kaavan XVIII yhdisteen tuottamiseksi: i6 111 ϋ o 1

Β C

, Jrt- V/^COjfle (XVIII) <r 10 jossa B, C, X, Y ja R6 ovat kuten edellä määriteltiin kaavaa XVII varten.

Kaavan XVIII epoksin annetaan reagoida typpeä sisältävän nukleofiilin, edullisesti natriumatsidin, 15 kanssa laimean Lewis-happokatalyytin, edullisesti litium- tai magnesiumperkloraatin, läsnäollessa alkoho-liatsidivälituotteen saamiseksi . Tämä välituote pelkistetään edullisesti vetykaasulla metallikatalyytin läsnäollessa ja suojataan sen jälkeen sopivalla typpeä 20 sisältävällä suojaryhmällä, edullisesti t-butoksi-karbonyylillä, bentsoksikarbonyylillä tai bentsyylil-lä, kaavan VII' yhdisteen tuottamiseksi: Γ Sv c il (VII') : . . 3 0 j"

R5R4N

.· jossa B, C, X, Y ja R6 ovat kuten edellä määriteltiin : 35 kaavaa XVII varten; ja R4 ja R5 ovat kuten edellä mää- ,riteltiin kaavaa VI varten.

Kaavan VII' yhdisteen annetaan sitten reagoi- 17

1 UOD I

da asylointi- tai sulfonylointiaineen, edullisesti me-taanisulfonyylikloridin tai p-tolueenisulfonyyli-kloridin, kanssa ei-nukleofiilisen emäksen, edullisesti trietyyliamiinin tai di-isopropyylietyyliamiinin, 5 läsnäollessa sopivassa liuottimessa, johon vähintään yksi reaktiivisista aineista ainakin osittain liukenee, aktivoidun hydroksiryhmän saamiseksi. Aktivoitu hydroksiryhmä korvataan sopivalla nukleofiililla, edullisesti tiohapon suolalla, edullisemmin kaliumtio- 10 asetaatilla, kaavan VIII' yhdisteen saamiseksi:

X

-, c X ' \ / 15 I Y 2 ®

AcA — .—j (VIII·) R5R4N—1 20 jossa A on kuten edellä määriteltiin kaavaa I varten; B, C, X, Y ja R6 ovat kuten edellä määriteltiin kaavaa XVII varten; R4 ja R5 ovat kuten edellä määriteltiin kaavaa VI varten; ja Ac on asyyliryhmä, edullisesti asetyyli.

: ·* 25 Vaihtoehtoisesti kaavan VII' yhdiste muunne- taan kaavan VIII' yhdisteeksi yhdessä kemiallisessa i ’*· prosessissa käyttäen trifenyylifosfiinia, dietyyli- : tai dimetyyliatsadikarboksylaattia ja happonukleofii- lia, edullisesti tioetikkahappoa, sopivassa liuotti-;V. 3 0 messa.

, , Kaavan VIII' yhdistettä käsitellään nukleo- fiilisella emäksellä, edullisesti kaliumkarbonaatilla, natriumkarbonaatilla, natriumhydroksidilla tai kalium-hydroksidilla, alkoholiliuottimessa, edullisesti me-; 35 tanolissa, etanolissa tai isopropanolissa, alkylointi- 5 t « aineen, edullisesti dimetyyli- tai dietyylikloorima-lonaatin, läsnäollessa kaavan IX' yhdisteen saamisek- si : 18 112.0 ΰ 1 s ε°Λ /~"1 ‘CQa".

I Y (ix') r6o2c ______

10 R5R4N

jossa A on kuten edellä määriteltiin kaavaa I varten; B, C, X, Y ja Rg ovat kuten edellä määriteltiin kaavaa XVII varten; ja R4 ja R5 ovat kuten edellä määriteltiin 15 kaavaa VI varten.

Kaavan IX1 yhdistettä käsitellään jomman kumman tai molempien suojaryhmien R4 ja R5 poistamiseen sopivissa olosuhteissa kaavan X1 yhdisteen tuottamiseksi : 20

> . JtC

ij x-^Xy/^c0!b, ix·) ; I 25 —1 o 30 jossa A on kuten edellä määriteltiin kaavaa I varten; ja B, C, X, Y ja R6 ovat kuten edellä määriteltiin kaavaa XVII varten. t-Butoksikarbonyylin ollessa suo- ' jaryhmä puitteet tämän ryhmän poistamiseksi ovat edul lisesti käsittely trifluorietikkahapolla, sen jälkeen . 35 neutralointi kaavan X' yhdisteen valmistamiseksi.

Kaavan X’ yhdisteen annetaan reagoida alky-lointiaineen, edullisesti trimetyyli- tai trietyyliok- 19 y\ A r ,;· /j

I Ιζ,ϋϋ I

soniumtetrafluoriboraatin, kanssa sopivassa liuotti-messa, edullisesti dikloorimetaanissa, laktiimieette-rivälituotteen muodostamiseksi. Laktiimieetteriväli-tuotteen annetaan reagoida guanidiinin kanssa alkoho-5 liliuottimessa, edullisesti metanolissa, etanolissa tai isopropanolissa, kaavan XI' yhdisteen muodostamiseksi : " i ,'XL· - .xxx jossa A on kuten edellä määriteltiin kaavaa I varten; 20 ja B, C, X, Y ja R6 ovat kuten edellä määriteltiin kaavaa XVII varten.

Vaihtoehtoisesti kaavan X' yhdiste muunnetaan » kaavan XI' yhdisteeksi antamalla kaavan X1 yhdisteen ; reagoida tiolointiaineen, edullisesti P2S5:n tai 2,4- 25 bis (4-metoksifenyyli)-1,3-ditia-2,4-difosfetaani-2-4-‘ disulfidin, kanssa tiolaktaamivälituotteen muodostami- • ” seksi. Tämä voidaan sitten alkyloida alkylointiaineel- ’ ' la, edullisesti metyyli j odidilla tai trimetyyli- tai trietyylioksoniumtetrafluoriboraatilla, ja sitten gua- • ' 30 nidiinilla alkoholiliuottimessa, edullisesti me- ; tanolissa, etanolissa tai isopropanolissa, kaavan XI1 yhdisteen saamiseksi.

Kaavan XI' yhdiste hydrolysoidaan emäksisissä olosuhteissa kaavan XII' yhdisteen muodostamiseksi: 35 20

Ί u. ju I

5 I λ (XII') 10 jossa A on kuten edellä määriteltiin kaavaa I varten; ja B, C, X ja Y ovat kuten edellä määriteltiin kaavaa XVII varten. R6:n ollessa vety kaavan XI1 yhdisteessä silloin hydrolysointireaktio ei ole tarpeellinen ja 15 kaavan XI 1 yhdiste on alla kuvatulla tavalla liitetty peptidi.

Kaavan XII1 yhdiste (eli kaavan XI1 yhdiste, jossa R6 on vety) , joka on vapaan karboksyylihapon muodossa, voi olla alan asiantuntijoiden tuntemalla 20 tavalla glutamiinihapon diesterihydrokloridin kanssa liitetty peptidi kaavan XIII' diesterin muodostamiseksi:

I I

HN \---AT--- ° COjR’

, „ AV

jossa A on kuten edellä määriteltiin kaavaa I varten; ja B, C, X ja Y ovat kuten edellä määriteltiin kaavaa ·. ; 35 XVII varten; ja Ri ja R2 ovat kumpikin itsenäisesti | osa, joka muodostaa sidotun C02:n kanssa helposti hyd rolysoituvan esteriryhmän, kuten Ci-C6alkyyli, hydrok- 21 I \ΔύΟ \ sialkyyli, alkyyliaryyli tai aryylialkyyli.

Lopuksi, mikäli halutaan vapaa happomuoto, kaavan XIII' yhdiste hydrolysoidaan kaavan I yhdisteiden, joissa Ri ja R2 ovat kumpikin H, tuottamiseksi.

5 Yhdisteisiin kuuluvat: (4-[2-(2-amino-4-okso-4,6,7,8-tetrahydro-3H-pyrimido-[5,4-6]-[1,4]tiatsiini-6-yyli)-etyyli]-2,5-tienoyyliamino-L-glutamiinihapon)dietyyliesteri; 4- [2- (2-amino-4-okso-4,6,7,8-tetrahydro-3H-pyrimido-[5,4-10 6]- [1,4]tiatsiini-6-yyli)-etyyli]-2,5 -tienoyyliamino- L-glutamiinihappo; 4 -[3 -(2-amino-4-okso-4,6,7,8-tetra- hydro-3H-pyrimido-[5,4-6]-[1,4]tiatsiini-6-yyli)-pro-pyyli]-2,5-tienoyyliamino-L-glutamiinihappo; 4- [2- (2-amino-4-okso-4,6,7,8-tetrahydro-3H-pyrimido-[5,4-6]-15 [1,4]tiatsiini-6-yyli)-etyyli]-3-metyyli-2,5-tieno- yyliamino-L-glutamiinihappo; ja 4-[2-(2-amino-4-okso- 4,6,7,8-tetrahydro-3H-pyrimido-[5,4-b]-[1,4]tiatsiini- 6-yyli)-etyyli]-2,5-furanoyyliamino-L-glutamiinihappo.

Keksinnön yhdisteet sisältävät yhden tai use-20 ampia päällekkäisiä keskuksia. Keksintö pitää sisällään raseemisia seoksia ja diastereomeerien seoksia , sekä optisesti aktiivisia yhdisteitä, kuten pääosin > · muista optisista isomeereistä vapaita yhdisteitä, joi- > * * * ta optisesti aktiivisia yhdisteitä voidaan saada ai- ‘ 25 kaan alan asiantuntijoiden tuntemilla tavoilla.

Edullisen yhdisteen yksityiskohtainen syntee-; si on esitetty alla olevassa esimerkissä.

Esimerkki: 4-[2-(2-amino-4-okso-4,6,7,8-tetrahydro-3H- ; 30 pyrimido-[5,4-6] - [1,4] tiatsiini-6-yyli)-etyyli]-2,5- » » tienoyyliamino-L-glutamiinihappo (Yhdiste 1) : 35 * m 22 112661

Metyyli-5-bromi-2-tiofeenikarboksylaatin 2 valmistus: rv 5 Br--^\SX^C02CH3 2

Yhdiste 2 (CAS rek.no. [62224-19-5]) valmistettiin, kuten on kuvattu artikkeleissa S. Gronowitz, 10 Ark. Kemi 8, 1955, 87 ja S.O. Lawesson, Ark. Kemi 11, 1957, 337.

5-etynyyli-2-karboksimetoksitiofeenin 3 valmistus: 15 _ ^ / - co2ch3 3 20 , Bromidin 3 5 g (22,7 mmoolia) , tris-trife- *, nyylifosfiinipalladium(II) kloridin 160 mg (0,23 mmoo lia) ja kuparijodidin 65 mg (0,34 mmoolia) sekoitet-tuun liuokseen 75 ml:ssa dietyyliamiinia lisättiin 4,8 f t , * 25 ml (34 mmoolia) trimetyylisilyyliasetyleenia. Saatua liuosta sekoitettiin 25°C:ssa. 18 tunnin kuluttua liuotin poistettiin alipaineessa ja raakajäännös liuotettiin 300 ml:aan Et20 (dietyylieetteri) ja uutettiin 100 ml :11a IN HC1 ja 100 ml :11a kyllästettyä bikarbo-30 naattiliuosta. Orgaaninen kerros kuivattiin (Na2S04) ja liuotin poistettiin alipaineessa. Raakajäännös puhdistettiin liekkikromatografisesti silikageelillä eluoi-maila 5% ET20/heksaanilla saaden 4,4 g (saanto 81 %) . . ; silyylisuojattua tuotetta keltaisena kiinteänä ainee- 35 na. Tämä aine käytettiin suoraan seuraavaan vaiheeseen .

23 112661

Edellä olevan silyylisuojatun asetyleenin 4,4 g (18,5 mmoolia) liuokseen 50 ml:ssa dimetyyliformami-dia (DMF) lisättiin 3,3 g (35,2 mmoolia) kaliumfluori-dimonohydraattia. Seos kaadettiin 15 minuutin kuluttua 5 25°C:ssa 500 ml:aan Et20 ja uutettiin neljä kertaa 100 ml :11a vettä (4x100 ml H20) . Orgaaninen liuos kuivattiin (Na2S04) ja liuotin poistettiin alipaineessa. Raa-kajäännös puhdistettiin liekkikromatografisesti sili-kageelillä eluoimalla 10% ET20/heksaanilla saaden 2,65 10 g (saanto 86 %) haluttua tuotetta 3 oranssina kiinteänä aineena.

NMR (CDC13) δ: 3,45 (s, 1H), 3,88 (s, 3H), 7,22 (d, 1H, J=3,5 Hz), 7,65 (d, 1H, J=3,5 Hz).

15 Laskettu analyysi C8H6S02:lle: C, 57,81; H 3,64; S, 19,29.

Mitattu: C, 57,91; H, 3,71; S, 19,18.

Käytettiin myös seuraavaa vaihtoehtoista menetelmää silyyliryhmän poistamiseen. Vedettömän K2C03:n 20 3,7 g (0,02 moolia) sekoitettuun suspensioon 700 ml:ssa metanolia lisättiin 59,7 g edellä olevassa kiinteänä aineena valmistettua silyyli-asetyleeniä. Suspensiota sekoitettiin 2 tuntia 35°C:ssa ja sitten ’ ' haihdutettiin metanoli. Jäännös lisättiin 50 ml:aan : ‘ 25 vettä ja tätä uutettiin 3x150 ml :11a Et20 ja yhdiste- tyt orgaaniset jakeet kuivattiin (Na2S04) ja haihdutet-> ‘ · tiin. Raakajäännös puhdistettiin liekkikromatografi- . sesti silikageelillä eluoimalla 7% ET20/heksaanilla saaden haluttua tuotetta 3 98 %:n saannolla (38,72 g).

:v, 30 N-(t-butoksikarbonyyli)-glysinaalin 4 valmistus:

O

NHBOC

: 35 4 N-(t-butoksikarbonyyli)-2-hydroksi-etyyli- 24 I I l ϋ ϋ ! amiinin (toimittaja Sigma Chemicals) 2 g (12,4 mmoo-lia) sekoitettuun liuokseen 80 ml:ssa CH2C12 -78°C:ssa lisättiin 1,3 ml (18,6 mmoolia) dimetyyli-sulfoksidia (DMSO) ja 1,2 ml (13,7 mmoolia) oksasyyli-5 kloridia. 5 minuutin kuluttua lisättiin trietyyliamii-nia 5,4 ml (38,4 mmoolia) ja liuoksen annettiin lämmitä 25°C:een. Seos kaadettiin 200 ml:aan ET20 ja uutettiin 100 ml :11a vettä, 100 ml :11a 0,5N HC1 ja 100 ml :11a kyllästettyä bikarbonaattiliuosta. Orgaaninen 10 jae kuivattiin (Na2S04) ja liuotin poistettiin alipaineessa. Raakajäännös liuotettiin 100 ml:aan bentseeniä ja liuotin poistettiin jälleen alipaineessa. Tämä raakajäännös, jonka havaittiin olevan pysymätön, käytettiin välittömästi seuraavaan vaiheeseen.

15 4-N-(t-butoksikarbonyyli)-3-hydroksi-l-(2-karbometok-si-5-tiofeeni)-butyynin 5 valmistus: 2 0 C02CHj s' 5

BOCHN

» 25 Asetyleenin 3 1,7 g (10,2 mmoolia) liuokseen 10 ml:ssa kuivaa tetrahydrofuraania (THF) -78°C:ssa lisättiin 14,3 ml (14,0 mmoolia) litiumbis-trimetyylisilyyliamidin IM liuosta THF:ssa. 10 minuutin kuluttua edellä olevasta peräisin oleva raaka al-: 30 dehydi 4 lisättiin pisaroittain 5 ml:aan kuivaa THF.

Liuosta sekoitettiin -78°C:ssa 10 minuuttia ja annettiin lämmetä 0°C:een 20 minuutin jakson kuluessa. Tähän lisättiin 5 ml kyllästettyä ammoniumkloridin vesi-liuosta. Seos kaadettiin 200 ml:aan Et20 ja pestiin J 35 100 ml :11a H20 ja sitten 50 ml :11a kyllästettyä NaCl- ; liuosta. Orgaaninen kerro kuivattiin (Na2S04) ja liuo tin poistettiin alipaineessa. Raakajäännös puhdistet- I i IL \J 0 I 25 tiin liekkikromatografisesti silikageelillä eluoimalla 10-40% ETOAc/heksaanilla saaden 0,96 g (29 %) haluttua alkoholia 5 hieman kellertävänä öljynä.

5 NMR (CDC13) δ: 1,46 (s, 9H), 3,38 ja 3,58 (AB, 2H, J=3, 7 Hz), 3,88 (s, 3H) , 4,71 (dt, 1H, J=2,9, 5,2 Hz), 5,05 (brs, 1H) , 7,15 (d, 1H, J=3,9 Hz), 7,64 (d, 1H, J=3,9 Hz). IR (puhdas) 2978,3, 1729,5, 1685, 1523, 1452, 1368, 1286, 1167, 1098, 959, 822, 750,4 cm'1.

10 Tarkkuusmassaspektri, laskettuna Ci5Hi9N05S : lie: M+Cs+, 458,0038, Mitattu: 458,0051.

Metyyli-5-[4-N-(t-butoksikarbonyyli)-amino-3-hydroksi) -butyyli] -tienyyli-2-karboksylaatin 6 valmistus: —\ /^**^co2ch3 s (BOC)HN 6 20

Edellä olevan asetyleenin 5 940 mg (2,89 *: mmoolia) sekoitettuun liuokseen 50 ml:ssa etyyliase- • taattia (EtOAc) lisättiin 320 mg 5% Pd/C. Seos asetet- ; ·. tiin 40 psi:n paineessa H2-kaasuun ja sekoitettiin , 't 25 25°C:ssa 17 tuntia. Seos suodatettiin seliitin läpi y (piimää) ja liuotin poistettiin alipaineessa. Raaka- * > » jäännös puhdistettiin liekkikromatograf isesti silika-’ geelillä eluoimalla 20% ETOAC/CH2CI2:11a saaden 800 mg (saanto 84 %) haluttua alkoholia 5 keltaisena öljynä.

• 30 NMR (CDCI3) δ: 1,44 (s, 9H) , 1,81 (m, 2H) , 2,28 (brs, :' 1H) , 2,99 (m, 2H) , 3,10 ja 3,29 (AB, 2H, J=3, 6,9 Hz), , ' , 3,74 (m, 1H) , 3,86 (s, 3H) , 4,89 (brs, 1H) , 6,82 (d, 1H, J=3,7 Hz), 7,63 (d, 1H, J=3,7 Hz). Laskettu ana- ; ' lyysi Ci5H23N05S: lie: C, 54,69; H, 7,04; N, 4,25; S, 35 9,73. Mitattu: C, 54,79; H, 7,02; N, 4,29; S, 9,63.

26 112601

Vaihtoehtoinen menetelmä alkoholin 6 valmistamiseksi käyttää hyväksi bis-t-butoksikarbo- nyyliallyyliamiinia 14 seuraavasti.

5 Bis-t-butoksikarbonyyliallyyliamiinin 14 valmistus: N(BOC)2 14 10

Allyyliamiinin 57,10 g (1,0 moolia) ja dime-tyyliaminopyridiinin (DMAP) 1,2 g (0,01 moolia) liuokseen 500 ml:ssa asetonitriiliä lisättiin (t-B0C)0:n 220 g (1 mooli) liuos 100 mlrssa asetonitriiliä ja 15 saatua seosta sekoitettiin 6 tuntia. Reaktioseos laimennettiin tolueenilla (100 ml) ja liuottimet haihdutettiin alipaineessa 60°C:ssa. Saatu öljy liuotettiin uudelleen asetonitriiliin (400 ml) ja toinen 1,2 g (0,01 moolia) DMAP lisättiin ja tähän liuokseen lisät-20 tiin hitaasti (t-BOC)O.-n 220 g (1 mooli) liuos 100 ml:ssa asetonitriiliä. Reaktioseosta sekoitettiin 12 : tuntia 60°C:ssa, liuotin haihdutettiin alipaineessa • 60°C:ssa ja lisättiin laimeata NaHC03 (100 ml) . Tämä . . uutettiin 3x150 ml :11a CH2C12 ja yhdistetyt orgaaniset , . 25 kerrokset pestiin suolaliuoksella, kuivattiin (Na2S04) ja haihdutettiin. Raakajäännös puhdistettiin liekki-kromatografisesti silikageelillä eluoimalla 5-20% EtO-' ’ Ac/heksaanigradientilla saaden 159,9 g (saanto 63 %) haluttua tuotetta 14 kirkkaana kiteisenä aineena (sp.

: 30 43-44°C) .

XH NMR (CDC13) δ (ppm): 1,5 (s, 18H) , 4,18 (dd, 2H, J=15 Hz, J=1 Hz), 5,14 (ddd, 2H, J=15 Hz, J=10 Hz, J=1 _ Hz), 5,85 (ddt, 2H, J=10 Hz, J=5 Hz, J=1 Hz).

.1 35 IR (KBr):2978, 2935, 2860, 1724, 1689, 1342, 1130 cm"1.

: Laskettu analyysi C13H23NO4: lie: C, 60,68; H, 9,01; N, 5,44. Mitattu: C, 60,78; H, 9,04; N, 5,50.

27 1 !-ϋ0 I

1- (bis-t-butoksikarbonyyliamino) -2-etanaalin 15 valmistus : 0 ^1^^N(80C)2

H

15 10 Bis-t-butoksikarbonyyliallyyliamiinin 14 0,60 g (2,34 mmoolia) liuosta 20 ml:ssa CH2C12 otsonoitiin (40 volttia, 500 A, 1,0 1/min 02 @ 3 psi) -78°C:ssa, kunnes sininen väri säilyi, lisättiin 10 ml dimetyyli-sulfidia ja tätä seosta sekoitettiin 14 tuntia 15 25°C:ssa. Seokseen lisättiin laimeaa suolaliuosta ja uutettiin CH2Cl2:lla (3x50 ml) ja orgaaniset jakeet kuivattiin (Na2S04) ja haihdutettiin. Liekkisilikagee-liä käyttäen kromatografia antoi 603 mg (saanto 99 %) haluttua tuotetta 15 kirkkaana kiteisenä aineena (sp. 20 37-39°C).

ΧΗ NMR (CDC13) δ (ppm): 1,50 (s, 18H) , 4,38 (s, 2H) , 9,55 (s, 1H) .

IR (KBr) : 2984, 2935, 2724, 1792, 1734, 1699, 1362, 25 1153 cm'1.

.. Laskettu analyysi Ci2H2iN05 : lie: C, 55,58; H, 8,16; N, 5,40. Mitattu: C, 55,20; H, 8,19; N, 5,19.

: ·’ 30 Metyyli-5-[(4-N-(t-butoksikarbonyyli)-amino-3-hydrok- ' si)-butyyli]-tienyyli-2-karboksylaatin 6 valmistus: : v 5-etynyyli-2-karbometoksitiofeenin 3 9,64 g : (59 mmoolia) liuokseen THF.-ssa (250 ml) lisättiin . -78°C:ssa 65,6 ml (60 mmoolia, 0,9M) litiumheksametyy- 35 lidisilaattia (LiHMDS) ja seosta sekoitettiin 2 tuntia -78°C:ssa. 1-(bis-t-butoksikarbonyyliamino)-2-etanaa- 28 112061

Iin 15 15,6 g (69 mmoolia) liuos THF:ssa (40 ml) kany-loitiin reaktioseokseen ja seosta sekoitettiin 8 tuntia -78°C:ssa. Etikkahapon 3,4 ml (60 mmoolia) liuos metanolissa (10 ml) lisättiin nopeasti jäähdytettynä, 5 seosta sekoitettiin 10 minuutin ajan lämmittäen 0°C:een ja lisättiin vesi (60 ml). Tätä uutettiin EtO-Ac:lla (3x100 ml) ja orgaaniset uutteet pestiin laimealla NaHC03:11a ja kuivattiin (Na2C04) . Liuotinta poistettiin alipaineessa n. 50 mliksi. Saatuun jäännökseen 10 lisättiin EtOAc (125 ml) ja tämä liuos lisättiin Parr-kolviin, joka sisälsi 7,38 g (30 p% asetyleenilähtöai-neesta) 5% Pd:ia hiilellä ja hydrattiin 55 psi:n läpänneessä 24 tuntia. Raaka hydrattu aine suodatettiin seliitin läpi ja suodatettu kakku pestiin metanolilla 15 (100 ml) ja EtOAc :11a (100 ml) . Liuotin haihdutettiin alipaineessa, raakajäännös suodatettiin silikan läpi eluoimalla 50 % EtOAc:11a heksaanissa ja liuotin haihdutettiin. Jäännös solvatoitiin 20 ml:aan bentseenin (50 ml) atseotrooppista metanoliseosta (MeOH) ja liuo-20 tettiin uudelleen kuivaan MeOH:iin (20 ml). Tämä seos lisättiin vasta valmistettuun 60 ml:aan (2M) natrium-metoksidin liuosta metanolissa. Reaktioseosta sekoitettiin 45 minuuttia, lisättiin laimeaa HCl (0,1M, 50 » > » ml) ja tämä seos uutettiin EtOAc:lla (3x75 ml). Or-25 gaaniset jakeet yhdistettiin ja pestiin pH 7 (IM) puskurilla, kuivattiin (Na2S04) ja haihdutettiin. Raaka-i jäännös puhdistettiin liekkikromatografisesti silikal- :; la eluoimalla 40% EtOAc/heksaanilla saaden 9,32 g (saanto 48 %) haluttua tuotetta 6.

jV. 30 ,···, Metyyli-5 - [ (4-N- (t-butoksikarbonyyli) -amino-3- asetyylitio)-butyyli]-2-tiofeenikarboksylaatin 7 val-mi s tus: : 35 1 1 r ' ί i I L· U U 1 29

AcS\ J V

-----\s/^ COjCHj (BOC)HN^ 7

Alkoholin 6 9,26 g (28,1 mmoolia) sekoitet tuun liuokseen 100 ml:ssa THF lisättiin 0°C:ssa 5,9 ml 10 (42 mmoolia) trietyyliamiinia (TEA) ja 2,4 ml (31 mmoolia) metaanisulfonyylikloridia. 20 minuutin kuluttua lisättiin 100 ml DMF ja 12,8 g (110 mmoolia) ka-liumtioasetaattia ja saadun liuoksen annettiin lämmitä 25°C:een. Kolmen päivän kuluttua seos kaadettiin 500 15 ml:aan vettä ja uutettiin 800 ml :11a Et20. Orgaaninen kerros pestiin 200 ml :11a vettä, 200 ml :11a IN HC1, 200 ml :11a kyllästettyä bikarbonaattiliuosta ja 100 ml :11a kyllästettyä NaCl-liuosta. Orgaaninen kerros kuivattiin (MgS04) ja liuotin poistettiin alipainees-20 sa. Raakajäännös puhdistettiin liekkikromatografisesti silikageelillä eluoimalla 25% ETOAc/heksaanilla saaden : 10,3 g (saanto 95 %) haluttua tioasetaattia 7 keltai- • sena öljynä.

25 NMR (CDC13) δ: 1,44 (s, 9H) , 1,91 ja 2,04 (ABm, 2H) , 2,37 (s, 3H) , 2,96 (m, 2H) , 3,36 (m, 2H) , 3,61 (m, 1H) , 3,86 (s, 3H) , 4,74 (brs, 1H) , 6,79 (d, 1H, J=3,6

Hz), 7,62 (d, 1H, J=3,6 Hz).

: 30 IR (puhdas): 3366, 2976,4, 1713, 1520, 1462,1, 1366, > 1290,5, 1267,3, 1169, 1098, 752, 631 cm'1.

Tarkka massaspektri, laskettuna C17H25NO5S2: lie: M+Cs+, : 520,0229. Mitattu: 520,0240.

’ i 35 Metyyli-5-[(4-N-(t-butoksikarbonyyli)-amino-3-(dime- • tyylimalonyyli)tio)-butyyli]-2-tiofeenikarboksylaatin 8 valmistus: 112661 30 O _ ---Xj^-COjCH, '^^BOCHN — H3CO 8

Edellä olevan tioasetaatin 7 10,2 g (26 mmoo-lia) sekoitettuun liuokseen 200 ml:ssa kuivaa me-10 tanolia lisättiin 0°C:ssa 7,2 g (52 mmoolia) K2C03 ja 3,7 ml (29 mmoolia) dimetyylikloorimalonaattia. Kolmen tunnin kuluttua seos kaadettiin 500 ml:aan vettä ja uutettiin Et20:lla (3x500 ml). Yhdistetyt orgaaniset kerrokset pestiin 500 ml :11a vettä ja sitten 200 15 ml :11a kyllästettyä bikarbonaattiliuosta ja 100 ml :11a kyllästettyä NaCl-liuosta ja kuivattiin (MgS04) . Liuotin poistettiin alipaineessa ja raakajäännös puhdistettiin liekkikromatografisesti silikageelillä eluoi-malla 30% ETOAc/heksaanilla saaden 11,46 g (saanto 93 20 %) haluttua tioeetteriä 8 hieman kellertävänä öljynä.

·. NMR (CDCI3) δ: 1,44 (s, 9H) , 1,85 ja 2,00 (ABm, 2H) , ; 3,03 (m, 3H) , 3,30 (m, 2H) , 3,80 (s, 6H) , 3,86 (s, ’ 3H) , 5,10 (brs, 1H) , 6,82 (d, 1H, J=3,8 Hz), 7,63 (d, 25 1H, J=3,8 Hz).

IR (puhdas): 3442, 2974, 2955, 1734, 1713, 1512, 1460, : 1435, 1366, 1291, 1267, 1167, 1098, 1022, 752 cm"1.

; ; 30 Tarkka massaspektri, laskettuna C2oH29N08S2: lie: M+Cs+, : . 608,0389. Mitattu: 608,0370.

6- [ (5-karbometoksitieeni-2-yyli)-etyyli]-2-karbometok-si-3-okso-3,4,5,6-tetrahydro- [1,4]-tiatsiinin 9 val-; 35 mistus: 112661 31

O

CO2CH3 5 9

H

Edellä olevan tioeetterin 8 470 mg (0,99 mmoolia) sekoitettuun liuokseen 12 ml:ssa CH2C12 lisättiin 0°C:ssa 4 ml trifluorietikkahappoa (TFA). 1,5 10 tunnin kuluttua seos kaadettiin 50 ml:aan kyllästettyä bikarbonaattiliuosta ja uutettiin CH2Cl2:lla (4x100 ml) . Liuotin poistettiin alipaineessa ja raakajäännös liuotettiin 10 ml:aan metanolia. 1,5 tunnin sekoituksen jälkeen liuotin poistettiin alipaineessa ja raaka-15 jäännös puhdistettiin liekkikromatografisesti silika-geelillä eluoimalla 40% ETOAc/CH2Cl2:11a saaden 298 mg (saanto 88 %) haluttua laktaamia 9 hieman värittömänä öljynä.

NMR (CDCI3) δ: 1,94 (m, 2H) , 3,01 (m, 2H) , 3,4-3,7 (m, 20 4H) , 3,80 ja 3,82 (s, 3H) , 3,87 (s, 3H) , 6,25 (brs, 1H) , 6,83 (d, 1H, J=3,7 Hz), 7,64 (d, 1H, J=3,7 Hz).

IR (KBr): 2951, 1732, 1669, 1462, 1294, 1267, 1194, * 1157, 1098, 1005, 752 cm'1.

» * 25 Analyysi laskettuna Ci4H17N05S2: lie: C, 48.96; H 4,99; N, 4,08; S, 18,67. Mitattu: C, 49.06; H 4,93; N, 4,09; : .. S, 18,60.

Metyyli- [2- (2-amino-4-okso-4,6,7,8-tetrahydro-3H-pyr-; , 30 imido[5,4-6][1,4]tiatsiini-6-yyli)-etyyli]-2,5- tienoaatin 10 valmistus: HN CO2CH3 35 L JL .

ί K o 112661 32

Edellä olevan laktaamin 9 1,9 g (5,5 mmoolia) sekoitettuun liuokseen 150 ml:ssa CH2C12 lisättiin yhdellä kertaa 1,06 g (7,2 mmoolia) trimetyylioksonium-5 tetrafluoriboraattia. Liuosta sekoitettiin 6 tuntia 25°C:ssa. Saatu seos kaadettiin 50 ml:aan 10 % K2C03 ja uutettiin CH2Cl2:lla (3x200 ml). Yhdistetyt orgaaniset kerrokset kuivattiin (MgS04) ja liuotin poistettiin alipaineessa. Saatu aine käytettiin suoraan seuraavaan 10 vaiheeseen.

Erilliseen kolviin asetettiin 1,58 g (16,6 mmoolia) kuivaa guanidiinihydrokloridia. Tähän lisättiin 600 ml kuivaa metanolia. Kuivaa argon-kaasua puhallettiin liuoksen läpi 10 minuutin ajan, jonka jäl-15 keen lisättiin 926 mg (17,1 mmoolia) kuivaa natriumme-toksidia. Saatuun seokseen lisättiin kanyylin avulla raaka edellä valmistettu laktiimieetteri 20 mlrssa MeOH. Liuosta refluksoitiin argon-kaasussa 20 tuntia. pH säädettiin arvoon 4 IN HClrlla ja liuotin poistet-20 tiin alipaineessa. Raakajäännös liuotettiin 500 ml:aan CHC13 ja pestiin 2x100 ml :11a vettä. Orgaaninen kerros kuivattiin (MgS04) ja liuotin poistettiin alipaineessa. Raakajäännös puhdistettiin liekkikromatografisesti silikageelillä eluoimalla 5-10% MeOH/CH2Cl2:11a saaden 25 413 mg harmahtavaa kiinteää ainetta. Tämä aine liuo tettiin sitten 25 ml:aan kuumaa MeOH ja jäähdytettiin j · hitaasti 4°C.-een 18 tunnin jakson kuluessa. Kiinteä aine otettiin talteen suodattamalla saaden 180 mg (saanto 9 %) haluttua pyrimidinonia 10 hieman keller-; 30 tävänä kiinteänä aineena.

NMR (d6-DMSO) δ: 1,72 (m, 1H) , 1,88 (m, 1H) , 2,8-3,22 : (m, 4H) , 3,50 (dt, 1H, J=2, 8 Hz)), 5,99 (brs, 2H) , : 6,64 (brs, 1H) , 6,98 (d, 1H, J=3,8 Hz), 7,62 (d, 1H, : 35 J=3,8 Hz), 10,02 (brs, 1H).

1 12661 33

Tarkka massaspektri, laskettuna Ci4H16N403S2 : lie: M+Na+, 375,0562. Mitattu: 375,0550.

Käytettiin myös vaihtoehtoista menetelmää py-rimidinonin 10 valmistamiseen seuraavasti. Laktaamin 9 5 500 mg (1,46 mmoolia) sekoitettuun liuokseen 20 mlrssa kuivaa THF lisättiin 648 mg (1,60 mmoolia) Lawessonin reagenssia (2,4-bis(4-metoksifenyyli)-1,3-ditia-2,4-difosfetaani-2,4-disulfidia). Sen jälkeen, kun seosta oli sekoitettu 25°C.-ssa 20 tuntia, se kaadettiin 50 10 ml:aan kyllästettyä bikarbonaattiliuosta ja uutettiin 2x200 ml :11a EtOAc. Yhdistetyt orgaaniset kerrokset pestiin 50 ml :11a kyllästettyä NaCl-liuosta ja kuivattiin (MgS04) ja liuotin poistettiin alipaineessa. Raaka tiolaktaami puhdistettiin liekkikromatografisesti 15 silikageelillä eluoimalla 8% EtOAc/CH2Cl2:11a saaden 525 mg vastaavaa tiolaktaamia 11:

O

20 --kg/'-COjCH, » 25 Tämä aine käytettiin heti seuraavaan vaiheeseen.

‘ 525 mg.*aan tiolaktaamia 11 kuivan THF:n 10 ml : , ja kuivan metanolin 10 ml seoksessa lisättiin 1,6 ml IN NaOH. Tähän lisättiin 0,1 ml (1,6 mmoolia) metyyli-jodidia metyloidun tiolaaktaamin valmistamiseksi, joka 30 käytettiin puhdistamatta alla kuvatulla tavalla. Erilliseen kolviin asetettiin 1,39 g (14,6 mmoolia) kuivaa guanidiinihydrokloridia. Tähän lisättiin 300 ml kuivaa metanolia. Kuivaa argon-kaasua puhallettiin liuoksen läpi 10 minuutin ajan, jonka jälkeen lisättiin 796 mg 35 (14,7 mmoolia) kuivaa natriummetoksidia. Saatuun seok seen lisättiin kanyylin avulla raaka edellä valmistettu metyloitu tiolaktaami. Liuosta refluksoitiin argon- 34 Λ < f -/ / Λ I I ä~ o O i kaasussa 48 tuntia. pH säädettiin arvoon 4 IN HClrlla ja liuotin poistettiin alipaineessa. Raakajäännös liuotettiin 500 ml:aan CHC13 ja pestiin 2x100 ml :11a vettä. Orgaaninen kerros kuivattiin (MgS04) ja liuotin 5 poistettiin alipaineessa. Raakajäännös puhdistettiin liekkikromatografisesti silikageelillä eluoimalla 5-10% MeOH/CH2Cl2:lla. Aine liuotettiin sitten 2 0 ml:aan kuumaa MeOH ja jäähdytettiin hitaasti 4°C.-een 18 tunnin jakson kuluessa. Kiinteä aine otettiin talteen 10 suodattamalla saaden 131 mg (saanto 9 %) haluttua py-rimidinonia 10.

(2-(2-amino-4-okso-4,6,7,8-tetrahydro-3H-pyrimido[5,4- 6][1,4]tiatsiini-6-yyli)-etyyli]-2,5-tienohapon 12 15 valmistus:

HjN^ " 12 - Pyrimidinoniin 10 180 mg (0,51 mmoolia) li sättiin 5 ml IN NaOH vedessä. Saatua liuosta sekoitet-25 tiin 25°C:ssa 20 tuntia. Jäähdytyksen jälkeen 0°C:een pH säädettiin arvoon 2 IN HCl:lla. Ruskea kiinteä aine erotettiin suodattamalla ja pestiin vedellä ja kuivattiin vakuumissa saaden 111 mg (saanto 64 %) haluttua happoa 12 hieman ruskehtavana kiinteänä aineena. 30 NMR (d6-DMSO) δ: 1,72 (m, 1H), 1,92 (m, 1H), 2,78-3,68 (m), 6,07 (brs, 2H) , 6,68 (brs, 1H) , 6,92 (d, 1H, J=3,7 Hz), 7,52 (d, 1H, J=3,7 Hz), 10,12 (brs, 1H) , 12,89 (brs, 1H).

35 Tarkka massaspektri, laskettu Ci3Hi4N403S2: lie: M+, 338,0507. Mitattu: 338,0517.

« 35 a a r ' / a 1 L· ϋ 0 i 4- [2-(2-amino-4-okso-4,6,7,8-tetrahydro-3H-pyrimi-do [5,4-6] [1,4]tiatsiini-6-yyli)-etyyli]-2,5-tienoyyli-amino-L-glutamiinihapon dietyyliesterin 13 valmistus: 5 0 _ Λ /* It 0 C0’Et u /u/ N N 13

H2N H

10

Edellä olevan hapon 12 110 mg (0,33 mmoolia) sekoitettuun liuokseen 5 ml.-ssa kuivaa DMF lisättiin 48 mg (0,36 mmoolia) 1-hydroksi-bentsotriatsoli-hydraattia, 62 μΐ (0,36 mmoolia) di- 15 isopropyylietyyliamiinia, 86 mg (0,36 mmoolia) gluta-miinihapon dietyyliesterihydrokloridia ja 106 mg (0,36 mmoolia) 1-(3-dimetyyliaminopropyyli)-3-etyylikarbodi-imidimetyylijodidia. Saatua liuosta sekoitettiin argon-kaasussa 25°C:ssa 20 tuntia ja kaadettiin sitten 20 50 ml:aan vettä. Vettä uutettiin 2x150 ml :11a EtOAc.

Yhdistetyt orgaaniset kerrokset uutettiin takaisin 3x50 ml :11a vettä ja sitten 10 ml :11a kyllästettyä NaCl-liuosta ja kuivattiin (MgS04) . Liuotin poistet-: tiin alipaineessa ja raakajäännös puhdistettiin liek- 25 kikromatografisesti silikageelillä eluoimalla 0-10% MeOH/CH2Cl2:11a saaden 120 mg (saanto 71 %) haluttua ;·, amidia 13 hieman kellertävänä amorfisena aineena.

NMR (d6-asetoni) 6: 1,20 (m, 6H) , 2,2 (m, 1H) , 2,46 (t, 30 1H, J=7,6 Hz), 2,78 (s, 1H) , 2,82 (s, 1H) , 2,92-3,1 ’·; (m, 2H) , 3,41 (m, 1H) , 3,72 (dt, 1H, J=3,0, 12,7 Hz), ; 4,02-4,2 (m, 4H) , 4,58 (m, 1H) , 5,90 (brs, 1H) , 6,05 (brs, 1H) , 6,90 (d, 1H, J=3,8 Hz), 7,58 (d, 1H, J=3,8 ,· , Hz), 7,78 (d, 1H, J=8 Hz).

'* ; 35

Tarkka massaspektri, laskettuna C22H29N506S2: lie: M+H+, 524,1638. Mitattu: 524,1650.

36 112 o ö 1 4-[2-(2-amino-4-okso-4,6,7,8-tetrahydro-3H-pyrimi-do[5,4-6] [1,4]tiatsiini-6-yyli)-etyyli]-2,5-tienoyyli-amino-L-glutamiinihapon 1 valmistus: 5 Edellä olevaan dietyyliesteriin 13 115 mg (0,22 mmoolia) lisättiin 3 ml IN NaOH-liuosta vedessä. Saatua seosta sekoitettiin 25°C:ssa 14 tuntia. Jäähdytyksen jälkeen 0°C:een pH säädettiin arvoon 3,5 HCl-vesiliuoksella. Kiinteä aine erotettiin suodattamalla, 10 pestiin vedellä ja kuivattiin vakuumissa saaden 82 mg (saanto 80 %) haluttua happoa harmahtavana kiinteänä aineena.

NMR (d6-DMS0) δ: 1,62-2,02 (m, 4H), 2,27 (m, 2H), 2,78-15 3,00 (m, 3H) , 4,27 (dd, 1H, J=6, 6,8 Hz), 6,00 (brs, 2H) , 6,63 (brs, 1H) , 6,88 (d, 1H, J=3,7 Hz)), 7,63 (d, 1H, J=3,7 Hz), 8,37 (d, 1H, J=7,4 Hz), 10.05 (brs, 1H), 12,85 (brs, 1H).

20 IR (KBr) : 3371, 1700, 1643, 1543, 1345 cm'1.

Tarkka massaspektri, laskettuna Ci8H2iN506S2: lie: M+H+, 468,1012. Mitattu: 468,1025.

Analyysi laskettuna C18H21.N5O6S2.1.5 H20:lle: C, 43,71; 25 H, 4,89; N, 14,16; S, 12,97. Mitattu: C, 43,50; H, » 4,67; N, 14,07; S, 12,72.

Biologinen ja biokemiallinen arviointi

Inhibointivakioiden määrittäminen GAR- 30 transformylaasia varten:

Young et al:n GAR-transformylaasin (GARFT) analyysimenetelmää, Biochemistry 23 (1984), 3979-3986, modifioitiin ja käytettiin alla kuvatulla tavalla. Re-, aktioseokset sisälsivät ihmisen katalyyttisen GARFT- ’· ; 35 domeenin, 0-250 nM yhdistettä 1, 20 μΜ glysinamidiri- bonukleotidia (GAR) , 10 tai 20 μΜ N10-formyyli-5,8- 37 Γ ' Λ

1^.00 I

dideatsafolaattia (FDDF), 50 mM HEPES-KOH (pH 7,5) ja 50 mM KCl. Reaktio käynnistettiin lisäämällä entsyymiä lopulliseen konsentraatioon llnM, sen jälkeen tarkkailtiin absorbanssin kasvua 294 nm:ssa 20°C:ssa (e294 5 =18,9 nM^crrf1) .

GARFT-inhibointivakio (Ki) määritettiin va-kiotilan katalyyttisen nopeuden riippuvuudesta inhi-biitin ja perusaineen konsentraatiosta. Havaitun inhi-boinnin lajin määritettiin olevan kilpaileva FDDF.-n 10 suhteen näennäisen Ki:n (Ki<app) riippuessa FDDF:n konsentraatiosta ja sitä esitettiin kuvattavan yhtälöllä Ki,app = Ki + (Ki/Km) [FDDF] . Michaelis-vakio FDDF: lie, Km, määritettiin itsenäisesti katalyyttisen nopeuden riippuvuudesta FDDF-konsentraatiosta. Sekä Km- että Kj.-15 määritysten tulokset sijoitettiin epälineaarisilla menetelmillä Michaelis-yhtälöön tai tarkoituksenmukaisesti Michaelis-yhtälöön kilpailevaa inhibointia ajatellen. Lujasidoksisesta inhiboinnista saadut tulokset analysoitiin ja Ki määritettiin sijoittamalla tiedot 20 Morrisonin lujan sidoksen yhtälöön, Biochem Biophys Acta 185 (1969), 269-286, epälineaarisilla menetelmil lä.

Solusukupolvet: . Käytetyt solusukupolvet ja niiden alkuperä on 25 esitetty taulukossa 1. Kunkin solusukupolven kasvuolosuhteet ja kasvuväliainevaatimukset on esitetty yhteenvetona taulukossa 2. Kaikkia viljelmiä säilytettiin 37°C:ssa, 5 % ilma-C02-seoksessa kostutetussa kasvatuskaapissa.

. 30 : In vitro-kasvun inhibointi: : : : Inhibiittien varastoliuokset valmistettiin 10 ; ; mM natriumbikarbonaatin vesiliuoksessa ja varastoitiin ,· , 1 ml:n osina -20°C:ssa soluviljelmäkokeita varten. So- ‘ ; 35 lujen kasvun estäminen määritettiin Mosmannin menetel män modifikaation avulla, J. Immunol. Methods 65 38 Λ < ' ,< Ί I I '\J CJ ί (1983), 55-63.

Kunkin solusukupolven keskiosan faasin soluja laimennettiin 18,500 soluun/ml tuoreessa RPMI-kasvuväliaineessa (Mediatech, Washington, DC) , johon 5 lisättiin dialysoitua sikiövasikan seerumia (Hyclone Laboratories Inc., Logan, UT), ja jaettiin sitten osina 96-paikkaisten mikrotiitterilevyjen riveille 2-12. Riville 1 täytettiin samaan tilavuuteen 135 ml tuoretta väliainetta ilman soluja käytettäväksi vertailuko-10 keena. Tämän jälkeen levyt asetettiin 37 °C lämpötilaan, 5 % ilma-C02-kasvatuskaappiin. 1-4 tunnin kulut tua levyt poistettiin kasvatuskaapista, sen jälkeen lisättiin yhdistettä 1 10 kertaa lopullisessa konsent-raatiossa 15 ml/paikka kaksoislaimennuksina riveille 15 12-4. Palautumiskokeita varten kaikkiin lääkeliuoksiin (lopullinen konsentraatio 175 mM) sisällytettiin hy-poksantiinia (1,75 mM) tai AICA:a (1,75 mM) . Kyvetit, jotka sisälsivät yhdistettä 1 kutakin pitoisuutta, valmistettiin nelinkertaisina kullekin levylle. 15 ml 20 väliainetta ilman yhdistettä 1 lisättiin kyvetteihin levyjen rivillä 1. Solut palautettiin sitten kasvatus-kaappiin ja säilytettiin häiritsemättä koko inkuboin-tijakson ajan. Kolmantena päivänä L1210 ja L1210/CI920 soluihin tai viidentenä päivänä CCRF-CEM soluihin li-25 sättiin 50 ml kudosviljelmän väliaineeseen 0,8 mg/ml liuotettua MTT:ia ((4,5-dimetyylitiatsoli-2-yyli)-2,5-difenyylitetratsolium-bromidia; Sigma luettelo no.

; M2128) kaikkien levyjen kuhunkin kyvettiin, jonka jäl keen solut palautettiin kasvatuskaappiin. 4 tunnin ku-30 luttua kaikki levyt poistettiin kaapista ja sentrifu-goitiin nopeudella 1200 rpm 7 minuutin ajan. Väliaine imettiin pois ja 150 ml DMSO lisättiin kaikkien levyjen kuhunkin kyvettiin. Sitten levyjä sekoitettiin hi-, taalla nopeudella pyörresekoittimessa 1 tunnin ajan , \ : 3 5 pimeässä ja huoneen lämpötilassa. Muuttuneen MTT:n , : määrä mitattiin spektrofotometrisesti aallonpituudella 540 nm kineettisellä mikrolevyn Molecular Devices r ' ^ I L· U 0 ! 39

Vmax™-lukijalla. Solujen kasvua 50 %:lla alentamaan tarvittavan lääkeaineen konsentraatio mitattuna MTT-muutoksen avulla määritettiin interpoloimalla yliannostus (miinus vertailuarvo) heti 50 % vertailuylian-5 nostuksen (miinus vertailuarvo) yllä ja alla olevassa välissä.

« - · * ’ » A A r / ' /' A 40 I I Z.CÖ ! TAULUKKO 1

In vitro-tutkimuksissa käytettyjen solusukupolvien al-kuperäiskudos ja lähde

Solusukupolvi Alkulähde Alkuperä_ L1210 ÄTCC1 Hiiri, imusolusyöpä CCRF-CEM ATCC# Ihminen, akuutti _varhaisimusolusyöpä_ #ATCC = American Type Culture Collection 5 TAULUKKO 2

Mikrotiitterianalyyseissä käytetyt viljelyolosuhteet, sijoitustiheydet ja inkubointiajat

Solusuku- Väliaine DFCS- Sijoitus- Inkubointi- polvi pit.* tiheys aika(päiviä) (%) (solua/ _kyvetti)_ L1210 RPMI-1640 5 2500 3 CCRF-CEM RPMI-1640 10_2500_5_ * DFCS-pit.= dialysoitu sikiövasikan seerumipitoisuus.

10 TAULUKKO 3

Tulokset yhdisteen 1 kasvun estämiselle käyttäen jat-; kuvaa (72 tunnin) altistusta

Yhdiste GARFT Ki IC50, Soluviljelmä ICS0 Soluviljelmä _(nM)_L1210 (nM) a_CCRF-CEM (nM)a _1_4^_5_16_4^3_ . a: Keskimääräinen IC50 + keskihajonta; ; ; 15

Kasvaimia estävä vaikutus in vivo:

Nollapäivänä 2 mm2 6C3HED imukudossyövän ; troakaarijakeita siirrettiin ihonalaisesti kainalon alueelle kuuden C3H/He naarashiiren ryhmään. Ensimmäi-' ' 20 sestä päivästä alkaen testattavaa yhdistettä annettiin vatsaontelon sisäisesti 40 %:n Encapsinissa annostel-Λ ; tuna kerran päivässä yhdeksän päivän ajan. Vertai- : lueläimet saivat samanlaisen hoidon ilman testattavaa yhdistettä. Taulukossa 4 ilmoitettu estämisprosentti Ίλ r ' s si i iiuu ! 41 laskettiin vertaamalla (ainoastaan laimennusainetta saaneiden) vertailukasvainten massaa yhdentenätoista päivänä testattavaa yhdistettä saaneiden eläinten vastaavaan.

5

Taulukko 4

Yhdiste_Annos (mg/kg) Inhibointi-% Eloonjääneet 1 12,5 100 6/6 1 25 100 3/6 _1_50_myrkyllinen_0/6_

Nollapäivänä 2 mm2 C3H/BA rintarauhassyövän troakaarijakeita siirrettiin ihonalaisesti kainalon 10 alueelle kuuden C3H/He naarashiiren ryhmään. Ensimmäi sestä päivästä alkaen testattavaa yhdistettä annettiin vatsaontelon sisäisesti 40 %:n Encapsinissa annosteltuna kerran päivässä yhdeksän päivän ajan. Vertai-lueläimet saivat samanlaisen hoidon ilman testattavaa 15 yhdistettä. Estämisprosentti laskettiin vertaamalla (ainoastaan laimennusainetta saaneiden) vertailukasvainten massaa neljäntenätoista päivänä testattavaa yhdistettä saaneiden eläinten vastaavaan. Koetulokset on esitetty yhteenvetona taulukossa 5.

20 : Taulukko 5 ,··. Yhdiste_Annos (mg/kg) Inhibointi-% Eloonjääneet 15 16 5/6 1 10 84 6/6 \_20_100_3/6_

Alan asiantuntijoille on selvää, että erilai-siä modifikaatioita ja muutoksia voidaan tehdä keksin-25 non menetelmiin ja tuotteisiin.

; Mikäli kemian kannalta on mahdollista, hake- \ muksessa esitetyt ryhmät voivat olla substituoituja.

,· , Joissakin tapauksissa tämä mahdollisuus on tehty yksi- selitteiseksi ilmaisemalla esim. substituoitu tai sub- 3 0 stituoimaton Ci-C3alkyyliryhmä.

42 a < r * /1 1 ίζΐϋϋ !

Jos esitetään useampia kuin yksi R6-ryhmä missään hakemuksen kaavassa, kukin R6 voidaan valita itsenäisesti annetuista mahdollisuuksista.

f

Claims (4)

1Λ s\ I L. 'j (j ! 1. 4- [2-(2-amino-4-okso-4,6,7,8-tetrahydro- 3H-pyrimido-[5,4-6] [1,4] tiatsin-6-yyli)-2,5-tienoyyliamino-L-glutamiinihappo, jolla on kaava: 5 0 __ 1 .S. 1 V N XOOH hn ||^ ]] ^] Jk J O COOH , n h2n n

10 H

2. Förening enligt patentkrav 1, känne- t e c k n a d därav, att den är optiskt aktiv.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdiste, tunnettu siitä, että se on optisesti aktiivinen.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen yhdiste, tunnettu siitä, että sillä on seuraava rakenne : .o CO2H j , rvc"-^ JL ς JL / coaH ; H 25

4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen yhdiste, tunnettu siitä, että sillä on seuraava rakenne : 30 ___^CO2H CO3H

35 H yj si r . ' si 44. i L· wj ϋ t 1. 4- [2-(2-Amino-4-oxo-4,6,1,8-tetrahydro-3H-pyrimido-[5,4-6] [1,4] tiazin-6-yl)-2,5-tienoylamino-L-glutaminsyra med formel: 5 0 _ 1 .S. -COOH HN /k J O COOH h2n n n

10 H

3. Förening enligt patentkrav 2, kanne- 15 tecknad därav, att dess struktur är följande: CO2H on I qk 1 / ^ COzH HN ^ 3 V: η,ν^ν^ν H ? t 25

4. Förening enligt patentkrav 2, kanne - tecknad därav, att dess struktur är följande: COsM H