DE69432801T2 - Verbindungen die als antiproliferierende mittel und garft inhibitoren verwendbar sind - Google Patents

Verbindungen die als antiproliferierende mittel und garft inhibitoren verwendbar sind

Info

Publication number
DE69432801T2
DE69432801T2 DE69432801T DE69432801T DE69432801T2 DE 69432801 T2 DE69432801 T2 DE 69432801T2 DE 69432801 T DE69432801 T DE 69432801T DE 69432801 T DE69432801 T DE 69432801T DE 69432801 T2 DE69432801 T2 DE 69432801T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
compound
compounds
formula
mmol
added
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
DE69432801T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69432801D1 (de
Inventor
L. Palmer
H. Romines
D. Varney
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Agouron Pharmaceuticals LLC
Original Assignee
Agouron Pharmaceuticals LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Agouron Pharmaceuticals LLC filed Critical Agouron Pharmaceuticals LLC
Application granted granted Critical
Publication of DE69432801D1 publication Critical patent/DE69432801D1/de
Publication of DE69432801T2 publication Critical patent/DE69432801T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D417/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00
    • C07D417/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings
    • C07D417/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D333/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom
    • C07D333/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D333/04—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings not substituted on the ring sulphur atom
    • C07D333/26—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings not substituted on the ring sulphur atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D333/38—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D513/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for in groups C07D463/00, C07D477/00 or C07D499/00 - C07D507/00
    • C07D513/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for in groups C07D463/00, C07D477/00 or C07D499/00 - C07D507/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D513/04—Ortho-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D517/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having selenium, tellurium, or halogen atoms as ring hetero atoms
    • C07D517/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having selenium, tellurium, or halogen atoms as ring hetero atoms in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D517/04—Ortho-condensed systems

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Description

    Hintergrund der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verbindungen, wie sie unten definiert sind, und die das Enzym Glycinamidribonucleotidformyltransferase (GARFT) inhibieren. Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf pharmazeutische Zusammensetzungen enthaltend diese Verbindungen. Die Verbindungen besitzen Antitumor-, entzündungshemmende, antipsoriatische und/oder immunsuppressive Aktivität. Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf die Herstellung dieser beschriebenen Verbindungen.
  • Die große Klasse der antiproliferativen Agenzien schließt Antimetabolitverbindungen mit ein. Eine besondere Unterklasse der Antimetabolite, die als Anitfolate oder Antifole bekannt sind, sind Antagonisten des Vitamins Folsäure. Typischerweise bilden Antifolate die Struktur von Folsäure sehr gut nach und bauen den charakteristischen p-Benzoylglutamatrest der Folsäure mit ein. Der Glutamatrest der Folsäure besitzt bei einem physiologischen pH eine zweifach negative Ladung. Diese Verbindung und seine Analoga besitzen daher ein aktives energiegesteuertes Transportsystem, um die Zellmembran zu durchqueren und einen metabolischen Effekt auszuüben.
  • GARFT ist ein Folat-abhängiges Enzym im de novo Purinbiosynthesepfad. Dieser Pfad ist für die Zellteilung und Proliferation kritisch. Diesen Pfad zu unterbinden, führt bekannterweise zu einem antiproliferativen Effekt, insbesondere zu einem Antitumoreffekt. Daher wurden eine Reihe von Folatanaloga synthetisiert und auf ihre Fähigkeit analysiert, die GARFT zu inhibieren. Von einem prototypischen, spezifischen, stark bindenden Inhibitor von GARFT, 5,10-Dideazatetrahydrofolsäure, wurde berichtet, dass er Antitumoraktivität aufweist. Siehe F. M. Muggia, "Folate antimetabolites inhibitor to de novo purine synthesis", New Drugs, Concepts and Results in Cancer Chemotherapy, Kluwer Academic Publishers, Boston (1992), 65-87.
  • Kürzlich wurden kondensierte heterocyclische Glutaminsäurederivative in der internationalen Anmeldung PCT/US94/00418 beschrieben, und die als antiproliferative Agenzien oder GARFT-Inhibitoren nützlich sind, wobei die Anmeldung durch diesen Anmelder am 18. Januar 1994 eingereicht wurde. Die vorliegende Erfindung bringt den Fortschritt in dieser Richtung durch die Entwicklung von weiteren nützlichen antiproliferativen Agenzien und GARFT-Inhibitoren voran.
  • EP-A-0438261 beschreibt bicyclische Glutaminsäurederivate, die als Antitumoragenzien nützlich sind und einen der Biosynthesepfade inhibieren, an dem Folsäure und verwandte Verbindungen beteiligt sind. Die allgemeine Struktur der beanspruchten Verbindungen umfassen einen A-Ring, der an ein Pyrimidin kondensiert ist, wobei der A- Ring ein 5-Ring ist. Vorzugsweise ist der A-Ring ein N-substituierter Pyrrol- oder Pyrrolinring und die divalente Verbindungsgruppe B ist eine divalente cyclische oder kettenförmige Gruppe, die substituiert werden kann.
  • WO 86/05181 beschreibt heterocyclische Pyrido[2,3-d]pyrimidin-Derivate, die eine antineoplastische Aktivität zeigen. Die bicyclischen Derivate besitzen eine Methylen- oder eine Methingruppe in der 5-Position des cyclischen Rings. Die aromatische Verbindungsgruppe ist eine 1,4-Phenylen-Gruppe.
  • WO 94/13295 beschreibt monocyclische 5-Thia- und 5-Selenopyrimidinverbindungen, die eine Inhibition der GARFT-Enzyme und Antiproliferation von Zellen höherer Organismen und Mikroorganismen zeigen. Die Verbindungen enthalten einen Glutaminsäurerest und ein Schwefel oder Selen, das an die 5-Position der Pyrimidinstruktur addiert wurde.
  • US-A-4123550 beschreibt endobicyclische Ethylaminocarbonylthienyloxyverbindungen, die als cardiovaskuläre Agenzien in der Behandlung von Bluthochdruck und abnormalen Herzzuständen in Säugetieren nützlich sind.
  • Casarrubio et al. (Journal of Heterocyclic Chemistry, Bd. 20, Nr. 6, 1983, S. 1557-1560) beschreiben Thiophenanaloga der cardio-selektiven β-adrenergische Blockingagenzien Practolol und "reverses Practolol".
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verbindungen, wie sie unten definiert sind. Diese Verbindungen sind bei der Inhibierung von Glutinamidribonucleotidformyltransferase (GRAFT) effektiv sowie der Inhibierung von Wachstum und Proliferation von Zellen höherer Organismen und von Mikroorganismen, wie beispielsweise Bakterien, Hefe und Pilzen. Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf pharmazeutische Zusammensetzungen enthaltend diese Verbindungen oder geeignete Salze davon sowie auf die Verwendung dieser Verbindungen als Inhibitoren des Enzyms GARFT.
  • Wie oben angedeutet, besitzen die Verbindungen gemäß der Erfindung antiproliferative Aktivität, eine Eigenschaft, welche sich in der Form von Antitumoraktivität zeigen kann. Eine Verbindung der Erfindung kann per se aktiv sein oder als ein Precursor, der in vivo in eine aktive Verbindung konvertiert wird. Bevorzugte Verbindungen der Erfindung sind insbesondere bei der Inhibierung des Enzyms GARFT aktiv. Insbesondere bevorzugte Verbindungen sind in der Inhibierung des Wachstums der L1210-Zelllinie aktiv, einer Mausleukämiezelllinie, die in Gewebekultur gezüchtet werden kann. Verbindungen der Erfindung können ebenfalls bei der Inhibierung des Wachstums von Bakterien aktiv sein, wie beispielsweise gram-negativen Bakterien aus Escherichia coli, die in Kulturen gezüchtet werden.
  • Die Verbindungen gemäß der Erfindung wie auch die pharmazeutisch geeigneten Salze davon können in bequeme Dosierungsformen gebracht werden, wie beispielsweise Kapseln, Tabletten und injizierbare Präparationen. Fest oder flüssige pharmazeutisch geeignete Träger, Verdünnungsmittel oder Arzneimittelhilfsträger können ebenfalls verwendet werden.
  • Feste Träger schließen Stärke, Lactose, Kalziumsulfatdihydrat, Terra alba, Saccharose, Talg, Gelatine, Agar, Pektin, Acacia, Magnesiumstearat und Stearinsäure ein. Flüssige Träger schließen Sirup, Erdnussöl, Olivenöl, Salzlösung und Wasser mit ein.
  • Die Träger oder Verdünnungsmitte(können jedes Material zur verzögerten Freigabe mit einschließen, wie beispielsweise Glycerinmonostearat oder Glycerindistearat, allein oder mit Wachs. Wird ein flüssiger Träger verwendet, kann die Präparation in Form eines Sirups, eines Elexiers, einer Emulsion, einer Softgelatinkapsel, einer sterilen injizierbaren Flüssigkeit (z. B. Lösung) oder einer nicht wässrigen oder wässrigen Suspension vorliegen.
  • Die pharmazeutischen Präparationen werden durch Befolgung konventioneller Techniken des pharmazeutischen Chemikers hergestellt, einschließlich Schritten, wie beispielsweise Mischen, Granulierung und Pressen, wenn nötig für Tablettenform oder Mischen, Füllen und Lösen der Inhaltsstoffe in geeigneterweise, um die gewünschten Produkte für orale, parenterale, topische, intravaginale, intranasale, intrabronchiale, intraokulare, intraaurale oder rektale Verabreichung bereitzustellen.
  • Die Zusammensetzungen der Erfindung können weiterhin eine oder mehrere andere pharmazeutisch aktive Verbindungen umfassen. Beispielsweise kann eine der folgenden Antitumoragenzien in der Zusammensetzung enthalten sein: mitotische Inhibitoren (z. B. Vinblastin); alkylierende Agenzien; Dihydrofolatreduktaseinhibitoren oder TS-Inhibitoren; Antimetaboliten (beispielsweise 5-Fluorouracil, Cytosinrabinosid); interkalierende Antibiotika (beispielsweise Adriamycin, Bleomycin); Enzyme (beispielsweise Asparaginase); Topoisomeraseinhibitoren (beispielsweise Etoposid); und biologische Mittel zur Modifizierung der Antwort (beispielsweise Interferon). Die Zusammensetzungen der Erfindung können ebenfalls andere GARFT-Inhibitoren oder antiproliferative Agenzien umfassen, wie beispielsweise eine Verbindung, die in der wie üblich übertragenen internationalen Veröffentlichung Nr. WO 94/13295, veröffentlicht am 23. Juni 1994, oder in der internationalen Veröffentlichung Nr. WO 92/05153, veröffentlicht am 2. April 1992, beschrieben wurde. Die Zusammensetzungen der Erfindung können ebenfalls eine oder mehrere antibakterielle, antifungale, antiparasitäre, antivirale, antipsoriatische oder antikokkidiale Agenzien umfassen. Beispielhafte antibakterielle Agenzien schließen mit ein: Sulfonamide, wie beispielsweise Sulfamethoxazol, Sulfadiazin, Sulfameter und Sulfadoxin; Dihydrofolreduktaseinhibitoren, wie beispielsweise Trimethoprim, Bromodiaprim und Trimetrexat; Penicilline; Cephalosporine; und die Chinoloncarboxylsäuren und ihre fusionierten Isothiazolanaloga.
  • Ein anderer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf ein therapeutisches Verfahren zur Inhibierung des Wachstums oder der Proliferation von Zellen von höheren Organismen oder Mikroorganismen, welches die Verabreichung einer effektiven Menge oder Quantität einer Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung an einen Wirt umfasst. Die Verbindungen der Erfindung sind insbesondere bei der Behandlung von Säugetierwirten nützlich, wie beispielsweise humanen Wirten, sowie bei der Behandlung von avianen Wirten. Ein insbesonders bevorzugtes therapeutisches Verfahren umfasst die Verabreichung einer Menge einer Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung an einen Wirt, die effektiv ist, GARFT zu inhibieren.
  • Viele der hier beschriebenen antiproliferativen Verbindungen und ihre pharmazeutisch geeigneten Salze können in den therapeutischen Verfahren der Erfindung verwendet werden. Die Verbindungen können in der Form einer pharmazeutisch geeigneten Zusammensetzung verabreicht werden, die ein Verdünnungsmittel oder einen Träger umfassen, wie oben beschrieben.
  • Eine Dosis einer Zusammensetzung enthält mindestens eine effektive Menge der aktiven Verbindung und wird vorzugsweise aus einer oder mehreren pharmazeutischen Dosiseinheiten aufgebaut. Eine "effektive Menge" kann eine Menge sein, die ausreichend ist, die metabolischen Pfade von Folat zu inhibieren und die vorteilhaften Effekte daraus abzuleiten, z. B. durch die Verabreichung von einer oder mehreren der pharmazeutischen Dosiseinheiten.
  • Eine beispielhafte tägliche Dosis für ein vertebraten Wirt umfasst eine Menge von bis zu einem Gramm aktiver Verbindung pro Kilogramm des Wirtes, bevorzugt eine Hälfte eines Gramms, noch bevorzugter 100 Milligramm und am meisten bevorzugt etwa 50 Milligramm oder weniger pro Kilogramm des Körpergewichts des Wirtes. Die ausgewählte Dosis kann einem warmblütigen Tier oder Säugetier verabreicht werden, beispielsweise einem humanen. Patienten, der eine Behandlung benötigt, die durch die Inhibierung des folatmetabolischen Pfads vermittelt wird, mit Hilfe jedes geeigneten Verfahrens zur Verabreichung der Dosis einschließlich: topikal, beispielsweise als Salbe oder Creme; oral; rektal, beispielsweise als Suppositorium; parenteral durch Injektion; oder kontinuierlich durch intravaginale, intranasale, intrabronchiale, intraaureale oder intraokulare Infusion.
  • Die Verbindungen gemäß der Erfindung erzeugen etwas oder mehr eines antiproliferativen Effektes, eines antibakteriellen Effektes, eines antiparasitären Effektes, eines antiviralen Effektes, eines antipsoriatischen Effektes, eines antiprotazolen Effektes, eines antikokkidialen Effektes, eines antiinflammatorischen Effektes, eines immunsupressiven Effektes und eines antifungalen Effektes. Die Verbindungen sind insbesondere in der Erzeugung eines Antitumoreffektes in einem Vertebratenwirt nützlich, der einen Tumor trägt.
    • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich insbesondere auf antiproliferative Verbindungen der unten gezeigten Formel:
  • wobei:
  • A gleich S ist;
  • X gleich CH&sub2; ist;
  • Y gleich S ist; und
  • R&sub1; und R&sub2; unabhängig voneinander Wasserstoff sind.
  • Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf pharmazeutisch geeignete Salze der Verbindungen der vorliegenden Erfindung. Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf Intermediate zur Herstellung solcher Verbindungen.
  • Obwohl die Verbindungen der vorliegenden Erfindung in der 4-Oxo-Form gezeigt werden und während dieser Beschreibung Bezug darauf genommen wird, liegt die Oxogruppe in einem tautomeren Gleichgewicht mit der korrespondierenden 4- Hydroxygruppe vor. Es soll daher verstanden werden, dass der Begriff "Verbindungen der vorliegenden Erfindung" die strukturell dargestellten 4-Oxo- und die tautomeren 4- Hydroxyformen bedeuten. Die Erfindung bezieht sich daher ebenfalls auf pharmazeutisch geeignete Salze der 4-Hydroxytautomere der in der vorliegenden Erfindung dargestellten Verbindung.
  • Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf eine Verbindung der Formel
  • In einer bevorzugten Ausführungsform bezieht sich die Erfindung auf eine wie oben definierte Verbindung, die optisch aktiv ist. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform besitzt die oben definierte Verbindung die folgende Struktur:
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform besitzt die oben definierte Verbindung die folgende Struktur:
  • Vorzugsweise ist X gleich CH&sub2;, Y ist vorzugsweise S. Vorzugsweise werden R&sub1; und R&sub2; unabhängig voneinander aus Wasserstoff ausgewählt, und am stärksten bevorzugt aus Wasserstoff. Es ist insbesondere bevorzugt, dass A und Y jeweils Schwefel sind und X CH&sub2; ist.
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind als GARFT-Inhibitoren verwendbar. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung, in welcher R&sub1; und R&sub2; jeweils Wasserstoff sind, sind insbesondere aktive Antitumor- oder antiproliferative Agenzien.
  • Die pharmazeutisch geeigneten Salze der Erfindung schließen beispielsweise Alkalimetalle, Erdalkalimetalle, andere nichttoxische Metalle, und Ammonium und substituierte Ammoniumsalze der Glutaminsäureverbindungen der Erfindung mit ein. Beispielhafte Salze schließen Natrium, Kalium, Lithium, Kalzium, Magnesium, Pyridin und substituierte Pyridinsalze der freien Säureverbindungen mit ein.
  • Die Verbindungen der Erfindung können wie folgt hergestellt werden. Ein nützliches Ausgangsmaterial zur Herstellung von Verbindungen der vorliegenden Erfindung ist eine Verbindung der Formel II, wobei X gleich CH&sub2; ist:
  • wobei B, C und Y wie oben für die Verbindung der vorliegenden Erfindung definiert sind. D ist Cl, Br oder I; und R&sub6; ist ein Wasserstoff oder ein Rest, der mit dem gebundenen CO&sub2; eine leicht hydrolysierbare Estergruppe bildet. Vorzugsweise ist D Brom oder Iod. Vorzugsweise ist R&sub6; Wasserstoff, C&sub1;-C&sub6; Alkyl, Hydroxyalkyl, Alkylaryl oder Arylalkyl, stärker bevorzugt Wasserstoff oder C&sub1;-C&sub2; Alkyl.
  • Die Verbindung der Formel II wird mit einer Verbindung der Formel III umgesetzt:
  • wobei R&sub3; eine substituierte oder nicht-substituierte C&sub1;-C&sub6;-Alkylgruppe, oder eine trisubstituierte Silylgruppe ist. Vorzugsweise ist R&sub3; gleich CH&sub2;OH oder Trimethylsilyl.
  • Die Reaktion der Verbindungen der Formeln II und III wird in der Gegenwart eines geeigneten Übergangmetallkatalysators durchgeführt, vorzugsweise Palladium oder Nickel, einer nicht-nukleophilen Hilfsbase, vorzugsweise einem substituierten Amin, in einem Lösungsmittel, in welchem mindestens einer der Reaktanten mindestens teilweise unter Bedingungen löslich ist, die ausreichend sind, um eine Verbindung der Formel IV zu erhalten:
  • wobei B, C und Y wie oben für die Erfindung der vorliegenden Erfindung definiert sind. R&sub6; ist wie oben für Formel II definiert; und R&sub3; ist wie oben für Formel III definiert.
  • Wenn R&sub3; eine trisubstituierte Silylgruppe ist, wird die Silylgruppe bevorzugt mit einer nukleophilen Base entfernt, wie beispielsweise methanolisches oder ethanolisches Kaliumcarbonat, oder einem Fluoridsalz, beispielsweise Kaliumfluorid, Cäsiumfluorid oder Tetrabutylammoniumfluorid, in einem Lösungsmittel, in welchem mindestens einer der Reaktanten zumindestens teilweise löslich ist (z. B. Methanol, Dimethylformamid, Ethanol, Dimethylacetamid, Dimethylsulfoxid oder Isopropanol), um eine Verbindung der Formel V zu ergeben:
  • wobei B, C und Y wie oben für die Verbindung der vorliegenden Erfindung definiert sind und R&sub6; wie oben für die Formel II definiert ist.
  • Die Verbindung der Formel V wird mit einem Elektrophil umgesetzt, vorzugsweise einem N-geschützten Glycinal, noch bevorzugter N-t-Butoxycarbonylglycinal oder bis-N-t- Butoxycarbonylclycinal, unter basischen Bedingungen, unter Verwendung einer nicht- nukleophilen Base, vorzugsweise Lithiumbis-trimethylsilylamid, Kalium-bis-trimethylsilylamid, Natrium-bis-trimethylsilylamid oder Lithiumdiisopropylamid, bei einer niedrigen Temperatur, vorzugsweise -90ºC bis 25ºC, in einem geeigneten Lösungsmittel, in welchem eines der Reaktanten mindestens teilweise löslich ist, vorzugsweise Tetrahydrofuran, Diethylether oder Dioxan, um eine Verbindung der Formel VI zu ergeben:
  • wobei B, C und Y wie oben für die Verbindung der vorliegenden Erfindung definiert sind. R&sub6; ist wie oben für Formel II definiert; und R&sub4; und R&sub5; sind jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff oder eine leicht zu entfernende Stickstoff-Schutzgruppe. R&sub4; und R&sub5; sind bevorzugt Wasserstoff, t-Butoxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl oder Benzyl.
  • Die Verbindung der Formel VI wird anschließend reduziert, vorzugsweise mit Wasserstoffgas in der Anwesenheit eines geeigneten Metallkatalysators, um eine Verbindung der Formel VII zu erhalten:
  • wobei B, C und Y wie oben für die Verbindung der vorliegenden Erfindung definiert sind. R&sub6; ist wie oben für Formel II definiert; und R&sub4; und R&sub5; sind wie oben für Formel VI definiert.
  • Die Verbindung der Formel VII wird anschließend mit einem acylierenden oder sulfonylierenden Agens umgesetzt, vorzugsweise Methansulfonylchlorid oder p- Toluolsulfonylchlorid, in der Anwesenheit einer nicht-nukleophilen Base, vorzugsweise Triethylamin oder Diisopropylethylamin, in einem geeigneten Lösungsmittel, in welchem mindestens einer der Reaktanten mindestens teilweise löslich ist, um eine aktivierte Hydroxygruppe zu erhalten. Die aktivierte Hydroxygruppe wird gegen ein geeignetes Nukleophil ausgetauscht, vorzugsweise ein Thioacidsalz, noch bevorzugter Kaliumthioacetat, um eine Verbindung der Formel VIII zu erhalten:
  • wobei A, B, C und Y wie oben für die Verbindung der vorliegenden Erfindung definiert sind. R&sub6; ist wie oben für Formel II definiert; R&sub4; und R&sub5; sind wie oben für Formel VI definiert; und Ac ist eine Acylgruppe, vorzugsweise Acetyl.
  • Alternativ wird die Verbindung von Formel VII in die Verbindung der Formel VIII in einer chemischen Operation unter Verwendung von Triphenylphosphin, Diethyl oder Dimethylaza-dicarboxylat, und einem sauren Nukleophil, vorzugsweise Thioessigsäure, in einem geeigneten Lösungsmittel konvertiert.
  • Die Verbindung der Formel VIII wird mit einer nukleophilen Base behandelt, vorzugsweise Kaliumcarbonat, Natriumcarbonat, Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid, in einem alkoholischen Lösungsmittel, vorzugsweise Methanol, Ethanol oder Isopropanol, in der Anwesenheit eines alkylierenden Agens, vorzugsweise Dimethyl oder Diethylchloromalonat, um eine Verbindung der Formel IX zu erhalten:
  • wobei A, B, C und Y wie oben für die Verbindung der vorliegenden Erfindung definiert sind. R&sub6; ist wie oben für Formel II definiert; und R&sub4; und R&sub5; sind wie oben für die Formel VI definiert.
  • Die Verbindung der Formel IX wird unter Bedingungen behandelt, die geeignet sind, um eine oder beide der schützenden Gruppen von R&sub4; und R&sub5; zu entfernen, um eine Verbindung der Formel X zu erzeugen:
  • wobei A, B, C und Y wie oben für die Verbindung der vorliegenden Erfindung definiert sind und R&sub6; wie oben für die Formel II definiert ist. Falls t-Butoxy-carbonyl (t-BOC) eine Schutzgruppe ist, sind die Bedingungen für die Entfernung dieser Gruppe vorzugsweise eine Behandlung mit Trifluoroessigsäure, gefolgt von einer Neutralisierung, um eine Verbindung der Formel X zu erzeugen.
  • Die Verbindung der Formel X wird mit einem alkylierenden Agens umgesetzt, vorzugsweise Trimethyl- oder Triethyloxoniumtetrafluoroborat, in einem geeigneten Lösungsmittel, vorzugsweise Dichlormethan, um einen intermediären Lactimether zu erzeugen. Der intermediäre Lactimether wird mit Guanidin in einem alkoholischen Lösungsmittel umgesetzt, vorzugsweise Methanol, Ethanol oder Isopropanol, um eine Verbindung der Formel XI zu erzeugen:
  • wobei A, B, C und Y wie oben für die Verbindung der vorliegenden Erfindung definiert sind und R&sub6; wie oben für Formel II definiert ist.
  • Alternativ wird die Verbindung der Formel X in eine Verbindung der Formel XI durch Umsetzung der Verbindung der Formel X mit einem thiolierenden Agens konvertiert, vorzugsweise P&sub2;S&sub5; oder 2,4-bis(4-Methoxyphenyl)-1,3-dithia-2,4-diphosphetan-2,4- disulfid, um das Thiolactamintermediat zu bilden. Dies kann anschließend mit einem alkylierenden Agens alkyliert werden, vorzugsweise Methyliodid oder Trimethyl- oder Triethyloxoniumtetrafluoroborat, und anschließend mit Guanidin in einem alkoholischen Lösungsmittel, vorzugsweise Methanol, Ethanol oder Isopropanol, um die Verbindung der Formel XI zu erhalten.
  • Die Verbindung der Formel XI wird unter basischen Bedingungen hydrolysiert, um eine Verbindung der Formel XII zu erhalten:
  • wobei A, B, C und Y wie oben für die Verbindung der vorliegenden Erfindung definiert sind. Falls R&sub6; ein Wasserstoff in der Verbindung der Formel XI ist, ist die Hydrolysierungsreaktion nicht notwendig, und die Verbindung der Formel XI ist Peptidgekoppelt, wie unten beschrieben.
  • Die Verbindung der Formel XII (oder die Verbindung der Formel XI, wobei R&sub6; Wasserstoff ist), welche in der freien Carboxylsäureform vorliegt, kann durch einem Fachmann gut bekannte Mittei, mit einem Glutaminsäurediesterhydrochlorid-Peptid gekoppelt werden, um einen Diester der Formel XIII zu bilden:
  • wobei A, B, C und Y wie oben für die Verbindung der vorliegenden Erfindung definiert sind und R&sub1; und R&sub2; jeweils unabhängig voneinander ein Rest ist, der mit dem gebundenen CO&sub2; eine leicht hydrolysierbare Estergruppe bildet, wie beispielsweise C&sub1;-C&sub6; Alkyl, Hydroxyalkyl, Alkylaryl oder Arylalkyl.
  • Letztlich wird die Verbindung der Formel XIII zur freien Glutaminsäureform der Verbindung der vorliegenden Erfindung hydrolysiert (R&sub1; und R&sub2; sind jeweils H).
  • Verbindungen der Erfindung enthalten eine oder mehrere chirale Zentren. Die Erfindung umfasst racemische Mischungen und Mischungen von Diastereomeren, wie auch optisch aktive Verbindungen, wie beispielsweise Verbindungen, die im Wesentlichen frei von anderen optischen Isomeren sind, wobei optisch aktive Verbindungen durch Verfahren erhalten werden können, die Fachleuten bekannt sind.
  • Eine detaillierte Synthese einer bevorzugten Verbindung der vorliegenden Erfindung wird im nachfolgenden Beispiel dargestellt. Beispiel: 4-[2-(2-Amino-4-oxo-4,6,7,8-tetrahydro-3H-pyrimido[5,4-6][1,4]thiazin- 6-yl)-ethyl]-2,5-thienoylamino-L-glutaminsäure (Verbindung 1) Herstellung von Methyl-5-brom-2-thiophencarboxylat 2:
  • Verbindung 2 (CAS Reg. Nr. [62224-19-5]) wurde wie bei S. Gronowitz, Ark. Kemi 8, 1955, 87 und S. O. Lawesson, Ark. Kemi 11, 1957, 337 beschrieben, hergestellt. Herstellung von 5-Ethynyl-2-carbomethoxythiophene 3:
  • Zu einer gerührten Lösung von 5 g (22,7 mmol) des Bromids 3, 160 mg (0,23 mmol) an Tris-Triphenylphosphinpalladium(II)chlorid und 65 mg (0,34 mmol) an Kupferoxid in 75 ml an Diethylamin wurden 4,8 ml (34 mmol) an Trimethylsilylacetylen zugegeben. Die erhaltene Lösung wurde bei 25ºC gerührt. Nach 18 Stunden wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt und der rohe Rest wurde in 300 ml Et&sub2;O (Diethylether) gelöst und mit 100 ml 1 N HCl und 100 ml gesättigter Bicarbonatlösung extrahiert. Die organische Phase wurde getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der rohe Rest wurde auf Silicagel mittels Flash- Chromatografie mit 5% Et&sub2;O/Hexan chromatografiert, um 4,4 g (81% Ausbeute) an Silyl-geschütztem Produkt als gelben Feststoff zu ergeben. Dieses Material wurde direkt im nächsten Schritt verwendet.
  • Zu einer Lösung von 4,4 g (18,5 mmol) des obengenannten Silyl-geschützten Acetylens in 50 ml an Dimethylformamid (DMF) wurden 3,3 g (35,2 mmol) an Kaliumfluoridmonohydrat zugegeben. Nach 15 Minuten bei 25ºC wurde die Mischung in 500 ml Et&sub2;O gegossen und viermal mit 100 ml Wasser (4 · 100 ml H&sub2;O) extrahiert. Die organische Lösung wurde getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;), und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der rohe Rest wurde mittels Flash-Chromatografie auf Silicagel mit 10% Et&sub2;O/Hexanen chromatografiert, um 2,65 g (86% Ausbeute) des gewünschten Produkts 3 als einen orangenen Feststoff zu ergeben. NMR (CDCl&sub3;) δ: 3,45 (s, 1H), 3,88 (s, 3H), 7,22 (d, 1H, J = 3,5 Hz), 7,65 (d, 1H, J = 3,5 Hz). Anal. berechnet für C&sub8;H&sub6;SO&sub2;: C, 57,81; H, 3,64; S, 19,29. Erhalten: C, 57,91; H, 3,71; S, 19,18.
  • Ein alternatives Verfahren zur Entfernung der Silylgruppe wurde ebenfalls wie folgt verwendet. Zu einer gerührten Suspension von 3,7 g (0,02 mol) wasserfreier K&sub2;CO&sub3; in 700 ml Methanol wurden 59,7 g des oben hergestellten Silyl-acetylens als Feststoff zugegeben. Die Suspension wurde für 2 Stunden bei 35ºC gerührt und das Methanol wurde anschließend eingedampft. Der Rest wurde zu 50 ml Wasser zugegeben und dieser wurde mit 3 · 150 ml Et&sub2;O extrahiert und die vereinigten organischen Fraktionen wurden getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und eingedampft. Der rohe Rest wurde mittels Flash- Chromatografie auf Silicagel unter Verwendung von 7% Et&sub2;O/Hexanen chromatografiert, um das gewünschte Produkt mit 98% Ausbeute (38,72 g) zu erhalten. Herstellung von N-(t-Butoxycarbonyl)-glycinal 4:
  • Zu einer gerührten Lösung von 2 g (12,4 mmol) N-(t-Butoxy-carbonyl)-2-hydroxy-ethylamin (bezogen von Sigma Chemicals) in 80 ml CH&sub2;Cl&sub2; bei -78ºC wurden 1,3 ml (18,6 mmol) Dimethylsulfoxid (DMSO) und 1,2 ml (13,7 mmol) Oxalylchlorid zugegeben. Nach 5 Minuten wurden 5,4 ml (38,4 mmol) Triethylamin zugegeben und man ließ die Lösung auf 25ºC erwärmen. Die Mischung wurde in 200 ml Et&sub2;O gegossen und mit 100 ml Wasser, 100 ml 0,5 N HCl, und 100 ml gesättigter Bicarbonatlösung extrahiert. Die organische Fraktion wurde getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;), und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Das rohe Aldehyd wurde in 100 ml Benzol gelöst und das Lösungsmittel wurde erneut unter vermindertem Druck entfernt. Dieses Rohmaterial, von dem festgestellt wurde, dass es instabil ist, wurde sofort im nächsten Schritt verwendet. Herstellung von 4-N-(t-Butoxycarbonyl)-3-hydroxy-1-(2-carbomethoxy-5-thiophen)butyn 5:
  • Zu einer Lösung von 1,7 g (10,2 mmol) Acetylen 3 in 10 ml trockenem Tetrahydrofuran (THF) bei -78ºC wurden 14,3 ml (14,0 mmol) einer 1 M Lösung Lithiumbis-trimethylsilylamid in THF zugegeben. Nach 10 Minuten wurde das oben genannte rohe Aldehyd 4 tropfenweise in 5 ml trockenes THF zugegeben. Die Lösung wurde bei -78ºC für 10 Minuten gerührt und man ließ sie auf 0ºC über einen Zeitraum von 20 Minuten erwärmen. Dazu wurden 5 ml einer gesättigten wässrigen Lösung von Ammoniumchlorid zugegeben. Die Mischung wurde in 200 ml Et&sub2;O gegossen und mit 100 ml H&sub2;O gewaschen, und anschließend mit 50 ml gesättigter NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Schicht wurde getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der rohe Rest wurde auf Silicagel mittels Flash-Chromatografie mit 10-40% EtOAc/Hexanen chromatografiert, um 0,96 g (29%) des gewünschten Alkohols 5 als ein schwach gelbes Öl zu erhalten. NMR (CDCl&sub3;) δ: 1,46 (s, 9H), 3,38 und 3,58 (AB, 2H, J = 3,7 Hz), 3,88 (s, 3H), 4,71 (dt, 1H, J = 2,9, 5,2 Hz), 5,05 (brs, 1H), 7,15 (d, 1H, J = 3,9 Hz), 7,64 (d, 1H, J = 3,9 Hz). IR (sauber): 2978,3, 1729,5, 1685, 1523, 1452,1368, 1286, 1167, 1098, 959, 822, 750,4 cm&supmin;¹. Hoch auflösende Massenspektroskopie, berechnet für C&sub1;&sub5;H&sub1;&sub9;NO&sub5;S: M&spplus;Cs&spplus;, 458,0038. Gefunden: 458,0051. Herstellung von Methyl-5-[(4-N-(t-butoxycarbonyl)-amino-3-hydroxy)-butyl]thienyl-2-carboxylat 6:
  • Zu einer gerührten Lösung von 940 mg (2,89 mmol) des obengenannten Acetylens 5 in 50 ml Ethylacetat (EtOAc) wurden 320 mg an 5% Pd/C zugegeben. Die Mischung wurde unter 40 psi H&sub2;-Gas gesetzt und bei 25ºC für 17 Stunden gerührt. Die Mischung wurde durch Celit (Kieselgur) filtriert und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der rohe Rest wurde mittels Flash-Chromatografie auf Silicagel mit 20% EtOAc/CH&sub2;Cl&sub2; chromatografiert, um 800 mg (84% Ausbeute) des gewünschten Alkohols als ein gelbes Öl zu ergeben. NMR (CDCl&sub3;) δ: 1,44 (s, 9H), 1,81 (m, 2H), 2,28 (brs, 1H), 2,99 (m, 2H), 3,10 und 3,29 (AB, 2H, J = 3, 6,9 Hz), 3,74 (m, 1H), 3,86 (s, 3H), 4,89 (brs, 1H), 6,82 (d, 1H, J = 3,7 Hz), 7,63 (d, 1H, J = 3,7 Hz). Anal. berechnet für C&sub1;&sub5;H&sub2;&sub3;NO&sub5;S: C, 54,69; H, 7,04; N, 4,25; S, 9,73. Bestimmt: C, 54,79; H, 7,02; N, 4,29; S, 9,63.
  • Ein alternatives Verfahren zur Herstellung von Alkohol 6 verwendet bis-t-Butoxycarbonylallylamin 14 wie folgt. Herstellung von Bis-t-butoxycarbonylallylamin 14:
  • Zu einer Lösung von 57,10 g (1,0 mol) Allylamin und 1,2 g (0,01 mol) Dimethylaminopyridin (DMAP) in 500 ml Acetonitril wurde eine Lösung von 220 g (1 mol) (t-BOC)&sub2;O in 100 ml Acetonitril zugegeben und die erhaltene Mischung wurde für 6 Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Toluol (100 ml) verdünnt und die Lösungsmittel wurden unter vermindertem Druck bei 60ºC verdampft. Das erhaltene Öl wurde in Acetonitril (400 ml) wieder aufgelöst und weitere 1,2 g (0,01 mol) DMAP wurden zugegeben, und dazu wurde eine Lösung von 220 g (1 mol) an (t-BOC)&sub2;O in 100 ml Acetonitril langsam zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 12 Stunden bei 60ºC gerührt, das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck bei 60ºC verdampft und Verdünnungsmittel NaHCO&sub3; (100 ml) wurde zugegeben. Dieses wurde mit 3 · 150 ml CH&sub2;Cl&sub2; extrahiert und die vereinigten organischen Phasen wurden mit Salzlösung gewaschen, getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und eingedampft. Der rohe Rest wurde mittels Flash- Chromatografie auf einem Silicagel unter Elution mit einem Gradienten von 5-20% EtOAc/Hexanen aufgereinigt, um 156,9 g (63% Ausbeute) des gewünschten Produkts 14 als einen klaren kristallinen Feststoff (Schmp. 43-44ºC) zu ergeben. ¹H NMR (CDCl&sub3;) δ (ppm): 1,5 (s, 18H), 4,18 (dd, 2H, J = 15 Hz, J = 1 Hz), 5,14 (ddd, 2H, J = 15 Hz, J = 10 Hz, J = 1 Hz), 5,85 (ddt, 2H, J = 10 Hz, J = 5 Hz, J = 1 Hz). IR (KBr): 2978, 2935, 2860, 1724, 1689, 1342, 1130 cm&supmin;¹. Anal. berechnet für C&sub1;&sub3;H&sub2;&sub3;NO&sub4;: C, 60,68; H, 901; N, 5,44. Bestimmt: C, 60,78; H, 9,04; N, 5,50. Herstellung von 1-(Bis-t-butoxycarbonylamino)-2-ethanal 15:
  • Eine Lösung von 0,60 g (2,34 mmol) von Bis-t-butoxycarbonylallylamin 14 in 20 ml CH&sub2;Cl&sub2; wurde bei -78ºC ozonisiert (40 Volt, 500 Ampere, 1,0 l/min O&sub2; @ 3psi), bis eine blaue Farbe vorlag, 10 ml Dimethylsulfid wurde zugegeben, und diese Mischung wurde für 14 Stunden bei 25ºC gerührt. Die Mischung wurde zu verdünnter Salzlösung zugegeben und mit CH&sub2;Cl&sub2; extrahiert (3 · 50 ml), und die organischen Fraktionen wurden getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und eingedampft. Chromatografie unter Verwendung von Flash-Silicagel ergab eine Ausbeute von 603 mg (99% Ausbeute) des gewünschten Produkts 15 als einen klaren kristallinen Feststoff (Schmp. 37-39ºC). ¹H NMR (CDCl&sub3;) δ (ppm): 1,50 (s, 18H), 4,38 (s, 2H), 9,55 (s, 1H). IR (KBr): 2984, 2935, 2724,1792, 1734, 1699, 1362, 1153 cm&supmin;¹. Anal. berechnet für C&sub1;&sub2;H&sub2;&sub1;NO&sub5;: C, 55,58; H, 8,16; N, 5,40. Bestimmt: C, 55,20; H, 8,19; N, 5,19.
    • Herstellung von Methyl-5-[(4-N-(t-butoxycarbonyl)-amino-3-hydroxy)-butyl]- thienyl-2-carboxylat 6:
  • Zu einer Lösung von 9,64 g (59 mmol) 5-Ethynyl-2-carbomethoxythiophene 3 in THF (250 ml) bei -78ºC wurden 65,6 ml (60 mmol, 0,9M) Lithiumhexamethyldisilazid (LiHMDS) zugegeben und die Mischung wurde für 2 Stunden bei -78ºC gerührt. Eine Lösung von 15,6 g (60 mmol) von 1-(Bis-t-butoxycarbonylamino)-2-ethanal 15 in THF (40 ml) wurden über eine Kanüle in die Reaktionsmischung zugegeben und die Mischung wurde für 8 Stunden bei -78ºC gerührt. Eine Lösung von 3,4 ml (60 mmol) Essigsäure in Methanol (10 ml) wurde als Stoppmittel zugegeben, die Mischung wurde für 10 Minuten unter Erwärmung auf 0ºC gerührt, und Wasser (60 ml) wurden zugegeben. Dies wurde mit EtOAc (3 · 100 ml) extrahiert und die organischen Extrakte wurden mit verdünntem NaHCO&sub3; gewaschen und getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;). Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck bis auf etwa 50 ml entfernt. Zum erhaltenen Rest wurde EtOAc (125 ml) zugegeben und diese Lösung wurde zu einer Pan-Flasche zugegeben, die 7,38 g (30 Gew.-% Acetylenausgangsmaterial) an 5% Pd auf Kohlenstoff und bei 55 psi an H&sub2; für 24 Stunden hydriert. Das rohe Hydrierungsmaterial wurde durch Celit filtriert und der Filterkuchen wurde mit Methanol (100 ml) und EtOAc (100 ml) gewaschen. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck eingedampft und der rohe Rest wurde durch Silica filtriert und mit 50% EtOAc in Hexanen eluiert, und das Lösungsmittel wurde eingedampft. Der Rest wurde in 20 ml an Methanol (MeOH) mit Benzol (50 ml) azeotropiert und in trockenem MeOH (20 ml) erneut gelöst. Diese Mischung wurde zu einer frisch hergestellten Lösung von 60 ml (2M) Natriummethoxid in Methanol zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde für 45 Minuten gerührt, verdünntes HCl (0,1 M, 50 ml) wurden zugegeben und diese Mischung wurde mit EtOAc (3 · 75 ml) extrahiert. Die organischen Fraktionen wurden vereinigt und mit pH 7-Puffer (1 M) gewaschen, getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und eingedampft. Der rohe Rest wurde auf Flash-Silica unter Elution mit 40% EtOAc/Hexanen chromatografiert, um 9,32 g (48% Ausbeute) des gewünschten Produkts 6 zu erhalten. Herstellung von Methyl-5-[(4-N-(t-butoxycarbonyl)-amino-3-acetylthio)-butyl]-2- thiophencarboxytat 7:
  • Zu einer gerührten Lösung von 9,26 g (28,1 mmol) des Alkohols 6 in 100 ml THF bei 0ºC wurden 5,9 ml (42 mmol) Triethylamin (TEA) und 2,4 ml (31 mmol) Methansulfonylchlorid zugegeben. Nach 20 Minuten wurden 100 ml DMF und 12,8 g (110 mmol) Kaliumthioacetat zugegeben und man ließ die erhaltene Lösung auf 25ºC erwärmen. Nach drei Tagen wurde die Mischung in 500 ml Wasser gegossen und mit 800 ml Et&sub2;O extrahiert. Die organische Phase wurde mit 200 ml Wasser, 200 ml 1 N HCl, 200 ml gesättigter Bicarbonatlösung, und 100 ml an gesättigter NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Schicht wurde getrocknet (MgSO&sub4;) und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der rohe Rest wurde auf Silicagel mittels Flash-Chromatografie mit 25% EtOAc/Hexanen chromatografiert, um 10,3 g (95% Ausbeute) des gewünschten Thioacetats 7 als ein gelbes Öl zu ergeben. NMR (CDCl&sub3;) δ: 1,44 (s, 9H), 1,91 und 2,04 (ABm, 2H), 2,37 (s, 3H), 2,96 (m, 2H), 3,36 (m, 2H), 3,61 (m, 1H), 3,86 (s, 3H), 4,74 (brs, 1H), 6,79 (d, 1H, J = 3,6 Hz), 7,62 (d, 1H, J = 3,6 Hz). IR (sauber): 3366, 2976,4, 1713, 1520, 1462,1, 1366, 1290,5, 1267,3, 1169, 1098, 752, 631 cm&supmin;¹. Hoch auflösende Massenspektroskopie, berechnet für C&sub1;&sub7;H&sub2;&sub5;NO&sub5;S&sub2;: M&spplus;Cs&spplus;, 520,0229. Bestimmt: 520,0240. Herstellung von Methyl-5-[(4-N-(t-butoxycarbonyt)-amino-3-(dimethylmalonyl)thio)- butyl]-2-thiophencarboxylat 8:
  • Zu einer gerührten Lösung von 10,2 g (26 mmol) des obengenannten Thioacetats 7 in 200 ml trockenem Methanol bei 0ºC wurden 7,2 g (52 mmol) an K&sub2;CO&sub3; und 3,7 ml (29 mmol) an Dimethylchloromalonat zugegeben. Nach drei Stunden wurde die Mischung in 500 ml Wasser gegossen und mit Et&sub2;O (3 · 500 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit 500 ml Wasser gewaschen und anschließend mit 200 ml gesättigter NaCl-Lösung gewaschen und getrocknet (MgSO&sub4;). Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und der rohe Rest wurde mittels Flash- Chromatografie auf Silicagel mit 30% EtOAc/Hexanen chromatografiert, um 11,46 g (93 % Ausbeute) des gewünschten Thioethers 8 als ein schwach gelbes Öl zu erhalten. NMR (CDCl&sub3;) δ: 1,44 (s, 9H), 1,85 und 2,00 (ABm, 2H), 3,03 (m, 3H), 3,30 (m, 2H), 3,80 (s, 6H), 3,86 (s, 3H), 5,10 (brs, 1H), 6,82 (d, 1H, J = 3,8 Hz), 7,63 (d, 1H, J = 3,8 Hz). IR (sauber): 3442, 2974, 2955, 1734, 1713, 1512, 1460,1435, 1366, 1291, 1267, 1167, 1098, 1022, 752 cm&supmin;¹. Hoch auflösende Massenspektroskopie, berechnet für C&sub2;&sub0;H&sub2;&sub9;NO&sub8;S&sub2;: M&spplus;Cs&spplus; 608,0389. Bestimmt: 608,0370. Herstellung von 6-[(5-Carbomethoxythien-2-yl)-ethyl]-2-carbomethoxy-3-oxo- 3,4,5,6-tetrahydro-[1,4]-thiazin 9:
  • Zu einer gerührten Lösung von 470 mg (0,99 mmol) des obengenannten Thioethers 8 in 12 ml an CH&sub2;Cl&sub2; bei 0ºC wurden 4 ml Trifluoressigsäure (TFA) zugegeben. Nach 1,5 Stunden wurde die Mischung in 50 ml gesättigter Bicarbonatlösung gegossen und mit CH&sub2;Cl&sub2; (4 · 100 ml) extrahiert. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und der rohe Rest wurde in 10 ml Methanol gelöst. Nach Rühren für 1,5 Stunden bei 25ºC wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt und der rohe Rest wurde auf Silicagel mit 40% EtOAc/CH&sub2;Cl&sub2; mittels Flash-Chromatografie chromatografiert, um 298 mg (88% Ausbeute) des gewünschten Lactams 9 als ein farbloses Öl zu ergeben. NMR (CDCl&sub3;) δ: 1,94 (m, 2H), 3,01 (m, 2H), 3,4-3,7 (m, 4H), 3,80 und 3,82 (s, 3H), 3,87 (s, 3H), 6,25 (brs, 1H), 6,83 (d, 1H, J = 3,7 Hz), 7,64 (d, 1H, J = 3,7 Hz). IR (KBr): 2951, 1732, 1669,1462, 1294, 1267, 1194, 1157, 1098, 1005, 752 cm&supmin;¹. Anal. berechnet für C&sub1;&sub4;H&sub1;&sub7;NO&sub5;S&sub2;: C, 48,96; H, 4,99; N, 4,08; S, 18,67. Bestimmt: C, 49,06; H, 4,93; N, 4,09; S, 18,60. Herstellung von Methyl-[2-(2-amino-4-oxo-4,6,7,8-tetrahydro-3H-pyrimido[5,4-6]- [1,4]thiazin-6-yl)-ethyl]-2,5-thienoat 10:
  • Zu einer gerührten Lösung von 1,9 g (5,5 mmol) des obengenannten Lactams 9 in 150 ml trockenem CH&sub2;Cl&sub2; wurde auf ein Mal 1,06 g (7,2 mmol) Trimethyloxoniumtetrafluoroborat zugegeben. Die Lösung wurde für 6 Stunden bei 25ºC gerührt. Die erhaltene Mischung wurde in 50 ml 10% wässriger K&sub2;CO&sub3; gegossen und mit CH&sub2;Cl&sub2; (3 · 200 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden getrocknet (MgSO&sub4;) und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Das erhaltene Material wurde direkt im nächsten Schritt verwendet.
  • In einem getrennten Kolben wurden 1,58 g (16,6 mmol) an trockenem Guanidinhydrochlorid eingebracht. Dazu wurden 600 ml an trockenem Methanol zugegeben. Trockenes Argon wurde bläschenweise für 10 Minuten durch die Lösung geleitet, wonach 926 mg (17,1 mmol) an trockenem Natriummethoxid zugegeben wurden. Zu der erhaltenen Mischung wurden über eine Kanüle der oben hergestellte rohe Lactimether in 20 ml MeOH zugegeben. Die Lösung wurde unter einer Argonatmosphäre für 20 Stunden unter Rückfluss gehalten. Der pH wurde mit 1 N HCl auf 4 eingestellt, und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der rohe Rest wurde in 500 ml CHCl&sub3; gelöst und mit 2 · 100 ml Wasser gewaschen. Die organische Schicht wurde getrocknet (MgSO&sub4;), und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der rohe Rest wurde mittels Flash-Chromatografie auf Silicagel mit 5-10% MeOH/CHCl&sub2; chromatografiert, um 413 mg eines gebrochen weißen Feststoffes zu ergeben. Dieses Material wurde anschließend in 25 ml heißem MeOH gelöst und langsam auf 4ºC über einen Zeitraum von 18 Stunden abgekühlt. Der Feststoff wurde durch Filtration gesammelt, um 180 mg (9% Ausbeute) des gewünschten Pyrimidons 10 als einen schwach gelben Feststoff zu ergeben. NMR (d&sub6;- DMSO) δ: 1,72 (m, 1H), 1,88 (m, 1H), 2,8-3,22 (m, 4H), 3,50 (dt, 1H, J = 2,8 Hz), 5,99 (brs, 2H), 6,64 (brs, 1H), 6,98 (d, 1H, J = 3,8 Hz), 7,62 (d, 1H, J = 3,8 Hz), 10,02 (brs, 1H). Hoch auflösende Massenspektroskopie, berechnet für C&sub1;&sub4;H&sub1;&sub6;N&sub4;O&sub3;S&sub2;: M&spplus;Na&spplus;, 375,0562. Bestimmt: 375,0550.
  • Ein alternatives Verfahren zur Herstellung von Pyrimidon 10 wurde ebenfalls wie folgt verwendet. Zu einer gerührten Lösung von 500 mg (1,46 mmol) des Lactams 9 in 20 ml trockenem THF wurden 648 mg (1,60 mmol) an Lawesson-Reagenz (2,4-Bis(4-methoxyphenyl)-1,3-dithia-2,4-diphosphetan-2,4-disulfid) zugegeben. Nachdem die Mischung bei 25ºC für 20 Stunden gerührt wurde, wurde diese in 50 ml gesättigter Bicarbonatlösung gegossen und mit 2 · 200 ml EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit 50 ml gesättigter NaCl-Lösung gewaschen und getrocknet (MgSO&sub4;), und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Das rohe Thiolactam wurde mittels Flash-Chromatografie auf Silicagel mit 8% EtOAc/CH&sub2;Cl&sub2; chromatografiert, um 525 mg des korrespondierenden Thiolactams 11 zu ergeben:
  • Dieses Material wurde sofort im nächsten Schritt eingesetzt.
  • Zu den 525 mg des Thiolactams 11 in einer Mischung von 10 ml an trockenem THF und 10 ml an trockenem Methanol wurden 1,6 ml an 1 N NaOH zugegeben. Dazu wurden 0,1 ml (1,6 mmol) an Methyliodid zugegeben, um ein methyliertes Thiolactam zu erzeugen, welches wie unten beschrieben ohne Aufreinigung verwendet wurde. In einem getrennten Kolben wurden 1,39 g (14,6 mmol) an trockenem Guanidinhydrochlorid eingebracht. Dazu wurden 300 ml an trockenem Methanol zugegeben. Trockenes Argon wurde für 10 Minuten bläschenweise durch die Lösung durchgeleitet, wonach 796 mg (14,7 mmol) an trockenem Natriummethoxid zugegeben wurden. Zu der erhaltenen Mischung wurde über eine Kanüle das rohe oben hergestellte methylierte Thiolactam zugegeben. Die Lösung wurde unter einer Argonatmosphäre für 48 Stunden unter Rückfluss gehalten. Der pH wurde auf 4 mit 1 N HCl eingestellt und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der rohe Rest wurde in 500 ml CHCl&sub3; gelöst und mit 2 · 100 ml Wasser gewaschen. Die organische Schicht wurde getrocknet (MgSO&sub4;) und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der rohe Rest wurde mittels Flash-Chromatografie auf Silicagel mit 5-10% MeOH/CH&sub2;Cl&sub2; chromatografiert. Das Material wurde anschließend in 20 ml heißem MeOH aufgelöst und langsam auf 4ºC über einen Zeitraum von 18 Stunden abgekühlt. Der Feststoff wurde durch Filtration gesammelt, um 131 mg (9% Ausbeute) des gewünschten Pyrimidons 10 zu ergeben. Herstellung von [2-(2-Amino-4-oxo-4,6,7,8-tetrahydro-3H-pyrimido[5,4- 6][1,4]thiazin-6-yl)-ethyl]-2,5-thienonsäure 12:
  • Zu 180 mg (0,51 mmol) des Pyrimidons 10 wurden 5 ml 1 N NaOH in Wasser zugegeben. Die erhaltene Lösung wurde bei 25ºC für 20 Stunden gerührt. Nach Abkühlen auf 0ºC wurde der pH auf 2 mit 1 N HCl eingestellt. Der braune Feststoff wurde abfiltriert und mit Wasser gewaschen und unter Vakuum getrocknet, um 111 mg (64% Ausbeute) der gewünschten Säure 12 als einen schwach braunen Feststoff zu ergeben. NMR (d&sub6;-DMSO) δ: 1,72 (m, 1H), 1,92 (m, 1H), 2,78-3,68 (m), 6,07 (brs, 2H), 6,68 (brs, 1H), 6,92 (d, 1H, J = 3,7 Hz), 7,52 (d, 1H, J = 3,7 Hz), 10,12 (brs, 1H), 12,89 (brs, 1H). Hoch auflösende Massenspektroskopie, berechnet für C&sub1;&sub3;H&sub1;&sub4;N&sub4;O&sub3;S&sub2;: M&spplus;, 338,0507. Bestimmt: 338,0517. Herstellung von 4-[2-(2-Amino-4-oxo-4,6,7,8-tetrahydro-3H-pyrimido[5,4-6][1,4]- thiazin-6-yl)-ethyl]-2,5-thienoylamino-L-glutaminsäurediethylester 13:
  • Zu einer gerührten Lösung von 110 mg (0,33 mmol) der obengenannten Säure 12 in 5 ml trockenem DMF wurden 48 mg (0,36 mmol) an 1-Hydroxy-benzotriazolhydrat, 62 ul (0,36 ml) an Diisopropylethylamin, 86 mg (0,36 mmol) an Glutaminsäurediethylesterhydrochlorid, und 106 mg (0,36 mmol) an 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidmethiodiod zugegeben. Die erhaltene Lösung wurde unter einer Argonatmosphäre bei 25ºC für 20 Stunden gerührt und anschließend in 50 ml Wasser gegossen. Das Wasser wurde mit 2 · 150 ml EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit 3 · 50 ml an Wasser und anschließend 10 ml an gesättigter NaCl-Lösung rückextrahiert, und getrocknet (MgSO&sub4;). Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt, und der rohe Rest wurde mittels Flash-Chromatografie auf Silicagel mit 0-10% MeOH/CH&sub2;Cl&sub2; chromatografiert, um 120 mg (71% Ausbeute) des gewünschten Amids 13 als einen schwach gelben amorphen Feststoff zu ergeben. NMR (d&sub6;-Aceton) δ: 1,20 (m, 6H), 2,2 (m, 1H), 2,46 (t, 1H, J = 7,6 Hz), 2,78 (s, 1H), 2,82 (s, 1H), 2,92-3,1 (m, 2H), 3,41 (m, 1H), 3,72 (dt, 1H, J = 3,0, 12,7 Hz), 4,02-4,2 (m, 4H), 4,58 (m, 1H), 5,90 (brs, 1H), 6,05 (brs, 1H), 6,90 (d, 1H, J = 3,8 Hz), 7,58 (d, 1H, J = 3,8 Hz), 7,78 (d, 1H, J = 8 Hz). Hoch auflösende Massenspektroskopie, berechnet für C&sub2;&sub2;H&sub2;&sub9;N&sub5;O&sub6;S&sub2;: M&spplus;H&spplus;, 524,1638. Bestimmt: 524,1650.
    • Herstellung von 4-[2-(2-Amino-4-oxo-4,6,7,8-tetrahydro-3H-pyrimido[5,4-6][1,4]- thiazin-6-yl)-ethyl]-2,5-thienoylamino-L-glutaminsäure 1:
  • Zu 115 mg (0,22 mmol) des obengenannten Diethylesters 13 wurden 3 ml 1 N NaOH- Lösung in Wasser zugegeben. Die erhaltene Mischung wurde bei 25ºC für 14 Stunden gerührt. Nach Abkühlung auf 0ºC wurde der pH mit wässriger HCl auf 3,5 eingestellt. Der Feststoff wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen und unter Vakuum getrocknet, um 82 mg (80% Ausbeute) der gewünschten Säure als einen gebrochen weißen Feststoff zu ergeben. NMR (d&sub6;-DMSO) δ: 9,62-2,02 (m, 4H), 2,27 (m, 2H), 2,78-3,00 (m, 3H), 4,27 (dd, 1H, J = 6, 6,8 Hz)), 6,00 (brs, 2H), 6,63 (brs, 1H), 6,88 (d, 1H, J = 3,7 Hz), 7,63 (d, 1H, J = 3,7 Hz), 8,37 (d, 1H, J = 7,4 Hz)), 10,05 (brs, 1H), 12,85 (brs, 2H). IR (KBr): 3371,1700, 1643, 1543, 1345 cm&supmin;¹. Hoch auflösende Massenspektroskopie, berechnet für C&sub1;&sub8;H&sub2;&sub1;N&sub5;O&sub6;S&sub2;: M&spplus;H&spplus;, 468,1012. Bestimmt: 468,1025.. Anal. berechnet für C&sub1;&sub8;H&sub2;&sub1;N&sub5;O&sub6;S&sub2;·1,5 H&sub2;O: C, 43,71; H, 4,89; N, 14,16; S, 12,97. Bestimmt: C, 43,50; H, 4,67; N, 14,07; S, 12,72.
    • Biologische und biochemische Bewertung Bestimmung von Inhibitionskonstanten für GAR-Transformylase:
  • Das GAR-Transformylase-(GARFT)-Assayverfahren von Young et al., Biochemistry 23 (1984), 3979-3986, wurde modifiziert und wie unten beschrieben verwendet. Die Reaktionsmischungen enthielten die katalytische Domäne des humanen GARFT, 0-250 nM von Verbindung 1,20 uM Glycinamidribonucleotid (GAR), 10 oder 20 uM N¹&sup0;- Formyl-5,8-dideazafolat (FDDF), 50 mM HEPES-KOH, pH 7,5 und 50 mM KCl. Die Reaktion wurde mit der Zugabe von Enzym zu einer finalen Konzentration von 11 nM initiiert, gefolgt von einer Beobachtung des Anstiegs in der Absorption bei 294 nm bei 20 ºC (e&sub2;&sub9;&sub4; = 18,9 mM&supmin;¹cm&supmin;¹).
  • Die GARFT-Inhibitionskonstante (Ki) wurde aus der Abhängigkeit des katalytischen Steady-State-Verhältnisses von Inhibitor und Substratkonzentration bestimmt. Der Typ der Inhibition wurde in Bezug auf FDDF als kompetitiv bestimmt durch die Abhängigkeit des apparenten Ki(Ki,app) von der Konzentration an FDDF und es wurde gezeigt, dass es durch Ki,app = Ki + (Ki/Km)[FDDF] beschrieben wird. Die Michaeliskonstante für FDDF, Km wurde unabhängigerweise durch die Abhängigkeit des katalytischen Verhältnisses von der FDDF-Konzentration bestimmt. Daten für beiderseits die Km- und Ki-Bestimmungen wurden durch nichtlineare Verfahren auf die Michaelisgleichung angepasst oder auf die Michaelisgleichung für die kompetitive Inhibition, so wie es geeignet erschien. Die Daten, die aus der stark bindenden Inhibition erhalten wurden, wurden analysiert, und Ki, wurde durch das Anpassen der Daten an die stark-bindende Gleichung von Morrison, Biochem Biophys Acta 185 (1969), 269-286, mittels nichtlinearen Verfahren bestimmt.
    • Zellinien:
  • Die verwendeten Zellinien und ihre Ursprünge sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die Wachstumsbedingungen und die Erfordernisse der Medien jeder Zelllinie werden in Tabelle 2 zusammengefasst. Alle Kulturen wurden bei 37ºC, 5% Luft-CO&sub2; in einem befeuchteten Inkubator aufbewahrt.
    • In vitro-Wachstumsinhibierung:
  • Stammlösungen des Inhibitors wurden in 10 mM Natriumbicarbonat in Wasser hergestellt und in 1 ml Aliquots bei -20 C für Zellkulturexperimente aufbewahrt. Die Inhibition des Zellwachstums wurde durch eine Modifikation des Verfahrens von Mosmann, J. Immunol. Methods 65 (1983), 55-63, gemessen.
  • Die Mid-log-Phasenzellen jeder Zelllinie wurden auf 18.500 Zellen/ml in frischen RPMI- Wachstumsmedium (Mediatech, Washington, DC) verdünnt, das mit dialysiertem fötalen Kälberserum (Hyclone Laboratories Inc., Logan, UT) versetzt wurde und anschließend in die Säulen 2 bis 12 von Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen aliquotiert. Die Säule 1 wurde mit dem gleichen Volumen (135 ml) an frischem Medium, ohne Zellen, zur Verwendung als Leerprobe aufgefüllt. Die Platten wurden anschließend in einem Inkubator bei 37ºC, 5% Luft-CO&sub2; gegeben. Nach 1 bis 4 Stunden wurden die Platten aus dem Inkubator entfernt, gefolgt von einer Zugabe von Verbindung 1 bei einer 10x finalen Konzentration, 15 ml/Vertiefung in binären Verdünnungen zu den Säulen 12 bis 4. Für Umkehrexperimente wurden Hypoxanthin (1,75 mM) oder AICA (1,75 mM) in alle Medikamentenlösungen (finale Konzentration 175 mM) mit aufgenommen. Vertiefungen, die jede Konzentration von Verbindung 1 enthielten, wurden auf jeder Platte vierfacher Anzahl hergestellt. Fünfzehn Milliliter an Medium ohne Verbindung 1 wurden zu den Vertiefungen in Spalte 1 der Platten zugegeben. Die Zellen wurden anschließend in den Inkubator zurückgebracht und verblieben über die volle Inkubationszeit ungestört. An Tag 3 wurde zu L1210- und L1210/CI1920-Zellen, oder am Tag 5 zu CCRF-CEM-Zellen, 50 ml an 0,8 mg/ml MMT ((4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid; Sigma-Katalog Nr. M2128) aufgelöst in Gewebekulturmedium zu jeder Vertiefung aller Platten zugegeben, wonach die Zellen in den Inkubator zurückgebracht wurden. Nach 4 Stunden wurden alle Platten aus dem Inkubator entfernt und bei 1200 rpm für 7 Minuten zentrifugiert. Die Medien wurden abgesaugt und 150 ml DMSO wurden zu jeder Vertiefung in allen Platten zugegeben. Die Platten wurden anschließend bei niedriger Geschwindigkeit auf einem Vortex-Mischer für eine Stunde im Dunklen bei Raumtemperatur gemischt. Der Grad an metabolisiertem MTT wurde spektrofotometrisch bei 540 nm auf einem kinetischen Mikroplattenlesegerät von Molecular Devices VmaxTM ausgelesen. Die Konzentration des Wirkstoffs, der erforderlich ist, um das Wachstum der Zellen um 50% zu reduzieren, wie dies durch MTT-Metabolismus gemessen wurde, wurde durch Interpolation zwischen dem O. D. (minus leer) sofort über und unter 50% der Kontrolle O. D. (minus leer) gemessen. Tabelle 1 Gewebe vom Ursprung und der Quelle von Zellinien, die in-vitro-Untersuchungen eingesetzt wurden
  • #ATCC = American Typ Culture Collection Tabelle 2 Kulturbedingungen, Plattierungsdichten und Inkubationszeiten, die in Mikrotiterassays verwendet wurden
  • * DFCS-Konzentr. = Konzentration des dialysierten fötalen Kälberserums. TABELLE 3 Daten für Verbindung 1 Wachstumsinhibierung unter Verwendung kontinuierlicher (72-Stunden) Exponierung
  • a. Mittelwert IC&sub5;&sub0; ± Standardabweichung
    • In-vivo-Antitumoraktivität:
  • Am Tag Null wurden 2 mm² Trokar-Fragmente von 6C3HED-Lymphosarkomen subkutan in die axilläre Region in Gruppen von sechs C3H/He-weiblichen Mäusen implantiert. Beginnend mit 1 wurde die Testverbindung intraperitoneal in 40% Encapsin verabreicht, wobei es einmal täglich für neun Tage gegeben wurde. Die Kontrolltiere erhielten eine identische Behandlung ohne Testverbindung. Die Prozentangaben der Inhibition, die unten in Tabelle 4 angegeben werden, wurden durch Vergleich der Masse der Kontrolltumore (die nur Verdünnungsmittel erhielten) am Tag 11 mit solchen der Tiere berechnet, die die Testverbindung erhielten. Tabelle 4
  • Am Tag Null wurden 2 mm² Trokar-Fragmente von C3H/BA-Mammaradenokarzinomen subkutan in die axilläre Region in Gruppen von sechs C3H/He-weiblichen Mäusen implantiert. Beginn mit Tag 1 wurde die Testverbindung intraperitoneal in 40% Encapsin verabreicht, wobei es einmal täglich für neun Tage gegeben wurde. Die Kontrolltiere erhielten eine identische Behandlung ohne Testverbindung. Der Prozentsatz der Inhibition wurde durch Vergleich der Masse der Kontrolltumore (erhielten nur Verdünnungsmittel) am Tag 14 mit solchen von Tieren berechnet, die die Testverbindung erhielten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengefasst. Tabelle 5
  • Es wird Fachleuten offensichtlich sein, dass verschiedene Modifikationen und Variationen in den Verfahren und Produkten der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden können.
  • Wo es möglich ist können bei chemischen Fragestellungen chemische Gruppen substituiert Werden, die hier beschrieben wurden. In einigen Fällen wurde diese Möglichkeit explizit durch die Angabe, z. B. substituierte oder unsubstituierte C&sub1;-C&sub3;- Alkylgruppe ausgedrückt.
  • In Fällen, in denen hier mehr als eine R&sub6;-Gruppe in irgendeiner Formel angegeben ist, kann jedes R&sub6; unabhängig voneinander aus den gegebenen Möglichkeiten ausgewählt werden.

Claims (5)

1. Eine Verbindung der Formel
oder ein pharmazeutisch geeignetes Salz dieser Verbindung.
2. Eine Verbindung gemäß Anspruch 1, die optisch aktiv ist.
3. Eine Verbindung gemäß Anspruch 2, die die folgende Struktur besitzt.
4. Eine Verbindung gemäß Anspruch 2, die die folgende Struktur besitzt.
5. Eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend:
(I) eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder ein pharmazeutisch geeignetes Salz davon;
(II) ein pharmazeutisch geeigneter Träger, Arzneihilfsträger oder Verdünnungsmittel.
DE69432801T 1994-07-28 1994-07-28 Verbindungen die als antiproliferierende mittel und garft inhibitoren verwendbar sind Expired - Fee Related DE69432801T2 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/US1994/008522 WO1996003407A1 (en) 1994-07-28 1994-07-28 Compounds useful as antiproliferative agents and garft inhibitors
SG1996008313A SG44827A1 (en) 1994-07-28 1994-07-28 Compounds useful as antiproliferative agents and garft inhibitors

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE69432801D1 DE69432801D1 (de) 2003-07-10
DE69432801T2 true DE69432801T2 (de) 2003-12-04

Family

ID=26665124

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69432801T Expired - Fee Related DE69432801T2 (de) 1994-07-28 1994-07-28 Verbindungen die als antiproliferierende mittel und garft inhibitoren verwendbar sind

Country Status (13)

Country Link
EP (1) EP0783507B1 (de)
JP (1) JP3473956B2 (de)
AT (1) ATE242253T1 (de)
AU (1) AU698868B2 (de)
DE (1) DE69432801T2 (de)
DK (1) DK0783507T3 (de)
ES (1) ES2201079T3 (de)
FI (1) FI112661B (de)
NO (1) NO308997B1 (de)
NZ (1) NZ271766A (de)
RU (1) RU2136686C1 (de)
SG (1) SG44827A1 (de)
WO (1) WO1996003407A1 (de)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5831100A (en) * 1995-06-07 1998-11-03 Agouron Pharmaceuticals, Inc. Syntheses of optically pure compounds useful as GARFT inhibitors and their intermediates
US20040043959A1 (en) * 2002-03-04 2004-03-04 Bloom Laura A. Combination therapies for treating methylthioadenosine phosphorylase deficient cells
WO2004113328A1 (en) * 2003-06-25 2004-12-29 Pfizer Inc. Convergent asymmetric synthesis route to produce a key intermediate towards the synthesis of a garft inhibitor

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4123550A (en) * 1977-10-31 1978-10-31 Syntex (U.S.A.) Inc. Bicyclo[3.1.0]hexylethylaminocarbonyl-substituted heteroaryl cardiovascular agents
ZA861235B (en) * 1985-03-08 1986-10-29 Univ Princeton Pyrido(2,3-d)pyrimidine derivatives
EP0438261A3 (en) * 1990-01-16 1992-02-26 Takeda Chemical Industries, Ltd. Condensed heterocyclic glutamic acid derivatives, their production and use
JPH08504765A (ja) * 1992-12-16 1996-05-21 アグロン・ファーマシュウティカルズ・インコーポレーテッド 抗増殖性の置換５−チアピリミジノンおよび５−セレノピリミジノン化合物

Also Published As

Publication number Publication date
NO970350L (no) 1997-03-12
AU7552094A (en) 1996-02-22
RU2136686C1 (ru) 1999-09-10
DE69432801D1 (de) 2003-07-10
EP0783507A1 (de) 1997-07-16
NO308997B1 (no) 2000-11-27
FI970318A0 (fi) 1997-01-24
EP0783507B1 (de) 2003-06-04
ATE242253T1 (de) 2003-06-15
JPH10504541A (ja) 1998-05-06
FI970318A (fi) 1997-03-05
FI112661B (fi) 2003-12-31
WO1996003407A1 (en) 1996-02-08
NO970350D0 (no) 1997-01-27
AU698868B2 (en) 1998-11-12
ES2201079T3 (es) 2004-03-16
SG44827A1 (en) 1997-12-19
DK0783507T3 (da) 2003-09-15
JP3473956B2 (ja) 2003-12-08
NZ271766A (en) 1999-01-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5646141A (en) Compounds useful as antiproliferative agents and GARFT inhibitors
DE69327796T2 (de) Antiproliferative substituierte 5-thiapyrimidinon- und 5-selenopyrimidinonverbindungen
US5641771A (en) Compounds useful as antiproliferative agents and garft inhibitors
DE69432801T2 (de) Verbindungen die als antiproliferierende mittel und garft inhibitoren verwendbar sind
DE69427394T2 (de) Kondensierte heterocyclische glutaminsäurederivate als antiproliferative mittel
JPS6383082A (ja) テトラヒドロフランカルボン酸誘導体の製造法
DD232045A5 (de) Verfahren zur herstellung von vorwirkstoffen entzuendungshemmender oxicame
DE60013607T2 (de) Bemzimidazolverbindungen und medikamente die diese enthalten
EP0156091B1 (de) Beta-Oxo-alpha-carbamoyl-pyrrolpropionitrile, Verfahren zu ihrer Herstellung, pharmazeutische Präparate enthaltend diese Verbindungen, sowie ihre therapeutische Verwendung
DE69629703T2 (de) Synthese von optisch reinen verbindungen als garft-inhibitoren und deren zwischenprodukte
CA2195417A1 (en) Compounds useful as antiproliferative agents and garft inhibitors
KR100382778B1 (ko) 항증식제및garft억제제로유용한화합물

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition
8339 Ceased/non-payment of the annual fee