ES2201079T3 - Compuestos utiles como agentes antiproliferativos e inhibidores de garft. - Google Patents

Compuestos utiles como agentes antiproliferativos e inhibidores de garft.

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ES2201079T3
ES2201079T3 ES94925701T ES94925701T ES2201079T3 ES 2201079 T3 ES2201079 T3 ES 2201079T3 ES 94925701 T ES94925701 T ES 94925701T ES 94925701 T ES94925701 T ES 94925701T ES 2201079 T3 ES2201079 T3 ES 2201079T3
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Michael D. Varney
William H. Romines
Cynthia L. Palmer
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Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A COMPUESTOS, P.EJ. EL COMPUESTO (1), EN EQUILIBRIO CON SU TAUTOMERO 4-HIDROXI, Y A SUS SALES FARMACEUTICAMENTE ACEPTABLES. DICHOS COMPUESTOS SON UTILES COMO INHIBIDORES DE LA GLICINAMIDA RIBONUCLEOTIDO FORMIL TRANSFERASA (GARFT), O COMO AGENTES ANTIPROLIFERATIVOS. LA INVENCION SE REFIERE ASIMISMO A COMPOSICIONES FARMACEUTICAS Y METODOS QUE EMPLEAN DICHOS COMPUESTOS COMO INHIBIDORES DE LA GARFT O COMO AGENTES ANTIPROLIFERATIVOS, ASI COMO A INTERMEDIARIOS PARA LA OBTENCION DE DICHOS COMPUESTOS.

Description

Compuestos útiles como agentes antiproliferativos e inhibidores de GARFT.
Antecedentes de la invención
La presente invención se refiere a los compuestos que se definen a continuación que inhiben la enzima glicinamida ribonucleótido formil transferasa (GARFT). La invención también se refiere a los preparados farmacéuticos que contienen estos compuestos. Los compuestos tienen una actividad antitumoral, antiinflamatoria, antipsoriásica o inmunosupresora. La invención también está relacionada con la preparación de los compuestos descritos.
La gran clase de agentes antiproliferativos incluye compuestos antimetabolitos. Una subclase particular de antimetabolitos conocidos como antifolatos o antifoles son antagonistas de la vitamina ácido fólico. Típicamente, los antifolatos son muy parecidos estructuralmente al ácido fólico e incorporan el componente característico P-benzoil glutamato del ácido fólico. El componente glutamato del ácido fólico adquiere una carga negativa doble en un pH fisiológico, por lo que este compuesto y sus análogos tienen un sistema de transporte activo guiado por energía para atravesar la membrana celular y ejercen un efecto metabólico.
La GARFT es una enzima dependiente de folato que actúa en la vía de biosíntesis de novo de purinas. Esta vía es crítica para la división y proliferación celular. Se sabe que si se anula esta vía se consigue un efecto antiproliferativo, en particular, un efecto antitumoral. En consecuencia, se han sintetizado varios análogos de folato y se ha estudiado su capacidad para inhibir la GARFT. Se ha descrito que un prototipo de inhibidor específico de la unión estricta de la GARFT, el ácido 5,10-dideazatetrahidrofólico, tiene una actividad antitumoral. Véase F.M. Muggia, "Folate antimetabolites inhibitor to de novo purine synthesis", New Drugs, Concepts and Results in Cancer Chemotherapy, Kluwer Academic Publishers, Boston (1992), 65-87.
Recientemente, se han revelado derivados condensados del ácido glutámico heterocíclico útiles como agentes antiproliferativos o inhibidores de la GARFT en la Solicitud Internacional PCT/US94/00418, presentada por este solicitante el 18 de enero de 1994. La presente invención continúa avanzando en este campo a través del desarrollo de nuevos agentes antiproliferativos útiles e inhibidores de la GARFT.
En la patente EP-A-0438261 se revelan derivados bicíclicos del ácido glutámico útiles como agentes antitumorales, inhibiendo una de las vías de biosíntesis en la que están implicados el ácido fólico y los compuestos relacionados. La estructura general de los compuestos reivindicados consiste en un anillo A condensado sobre una pirimidina en la que el anillo A es un anillo de 5 miembros. Preferiblemente el anillo A es un anillo pirrol o pirrolina N-sustituido y el grupo divalente de enlace B es un grupo cíclico o cadena divalente que podría ser sustituido.
En la patente WO 86/05181 se revelan derivados heterocíclicos pirido[2,3-d]pirimidina que muestran actividad antineoplásica. Los derivados bicíclicos tienen un grupo metileno o metino en la posición 5 del anillo bicíclico. El grupo de enlace aromático es un grupo 1,4-fenileno.
En la patente WO 94/13295 se revelan compuestos monocíclicos 5-tia y 5-selenopirimidina que muestran inhibición de la enzima GARFT y antiproliferación de las células de organismos superiores y microorganismos. Los compuestos contienen un componente de ácido glutámico y un azufre o selenio añadido en la posición 5 de la estructura pirimidina.
En la patente US-A-4123550 se revelan compuestos endobicíclicos etilaminocarbonilo-tieniloxi útiles como fármacos cardiovasculares en el tratamiento de la hipertensión y otras alteraciones cardiacas en mamíferos.
Casarrubio y cols. (Journal of Heterocyclic Chemistry, vol. 20, nº 6, 1983, pp. 1557-1560) revelan análogos de tiofeno de los agentes betabloqueantes adrenérgicos cardioselectivos practolol y "practolol invertido".
Resumen de la invención
La presente invención se refiere a los compuestos que se definen a continuación. Estos compuestos son eficaces inhibiendo la glicinamida ribonucleótido formil transferasa (GARFT) y el crecimiento y proliferación de las células de organismos superiores y microorganismos como bacterias, levaduras y hongos. La invención también se refiere a los preparados farmacéuticos que contienen estos compuestos o sus sales adecuadas y el uso de estos compuestos como inhibidores de la enzima GARFT.
Como se ha indicado anteriormente, los compuestos de la invención poseen actividad antiproliferativa, una propiedad que se puede expresar en forma de actividad antitumoral. Un compuesto de la invención puede ser activo per se, o como precursor convertido in vivo a un compuesto activo. Los compuestos preferidos de la invención son especialmente activos inhibiendo la enzima GARFT. Particularmente preferidos son los compuestos activos inhibiendo el crecimiento de la línea celular L1210, una línea celular de leucemia de ratón que se puede cultivar en un cultivo de tejidos. Los compuestos de la invención también pueden ser activos inhibiendo el crecimiento de bacterias como las bacterias gramnegativas Escherichia coli que pueden crecer en cultivos.
Los compuestos de acuerdo con la invención, así como sus sales farmacéuticamente aceptables, se pueden incorporar en las formas posológicas adecuadas como cápsulas, comprimidos y preparados inyectables. Asimismo, se pueden utilizar vehículos, diluyentes o excipientes sólidos o líquidos farmacéuticamente aceptables.
Los vehículos sólidos incluyen almidón, lactosa, sulfato cálcico dihidrato, terra alba, sacarosa, talco, gelatina, agar, pectina, acacia, estearato de magnesio y ácido esteárico. Los vehículos líquidos incluyen jarabe, aceite de cacahuete, aceite de oliva, solución salina y agua.
El vehículo o el diluyente puede incluir cualquier material de liberación prolongada como el glicerilmonoestearato o el glicerildiestearato, solos o con cera. Cuando se usa un vehículo líquido, el preparado puede adoptar la forma de un jarabe, un elixir, una emulsión, cápsulas de gelatina blanda, líquido inyectable estéril (por ejemplo, en solución) o una suspensión líquida acuosa o no acuosa.
Los preparados farmacéuticos se preparan siguiendo las técnicas convencionales de la química farmacéutica que incluyen pasos como mezclado, granulación y compresión cuando es necesario para las formas en comprimidos, o mezclado, llenado y disolución de los ingredientes según proceda para dar los productos deseados para la administración oral, parenteral, tópica, intravaginal, intranasal, intrabronquial, intraocular, intraaural o rectal.
Los compuestos de la invención pueden también comprender uno o más compuestos farmacéuticamente activos. Por ejemplo, se puede incluir en el compuesto uno de los siguientes agentes antitumorales: inhibidores de la mitosis (como, por ejemplo, vinblastina); un agente alquilante; inhibidores de la dihidrofolato reductasa o inhibidores de la TS; antimetabolitos (por ejemplo, 5-fluorouracilo, arabinósido de citosina); antibióticos intercalantes (por ejemplo, adriamicina o bleomicina); enzimas (por ejemplo, asparaginasa); inhibidores de la topoisomerasa (por ejemplo, etoposido); y modificadores de la respuesta biológica (por ejemplo, interferon). Los compuestos de la invención pueden también incluir otro inhibidor de la GARFT o agente antiproliferativo, como un compuesto que se describe en la publicación Internacional Nº WO 94/13295 comúnmente asignada, publicada el 23 de junio de 1994, o en la publicación internacional Nº WO 92/05153, publicada el 2 de abril de 1992. Los compuestos de la invención también pueden incluir una o más sustancias antibacterianas, antimicóticas, antiparasitarias, antivíricas, antipsoriásicas o anticcodiales. Como ejemplo de agentes antibacterianos se pueden mencionar sulfonamidas, como sulfametoxazol, sulfadiazina, sulfameter y sulfadoxina; inhibidores de la dihidrofólico reductasa, como trimetoprim, bromodiaprim y trimetrexato; penicilinas; cefalosporinas; y los ácidos carboxílicos quinolona y sus análogos fusionados isotiazolo.
Otro aspecto de la invención se refiere a un método de tratamiento para inhibir el crecimiento o proliferación de las células de organismos superiores o microorganismos, que consiste en la administración a un huésped de una cantidad efectiva o dosis de un compuesto de acuerdo con la presente invención. Los compuestos de la invención son particularmente útiles en el tratamiento de huéspedes mamíferos, como el hombre, y en el tratamiento de los huéspedes aviares. Un proceso terapéutico particularmente preferido consiste en la administración a un huésped de una cantidad de un compuesto de acuerdo con la presente invención que sea eficaz para inhibir la enzima GARFT.
Muchos de los compuestos antiproliferativos que se describen en este documento y sus sales farmacéuticamente aceptables se pueden emplear en el proceso terapéutico de la invención. Los compuestos se pueden administrar en forma de un preparado farmacéuticamente aceptable que incluya un diluyente o vehículo según se ha descrito anteriormente.
Una dosis de un compuesto contiene al menos una cantidad eficaz del compuesto activo y preferiblemente consiste en una o más unidades posológicas farmacéuticas. Una "cantidad eficaz" puede ser una cantidad suficiente para inhibir las vías metabólicas del folato y derivar los efectos beneficiosos de las mismas como, por ejemplo, a través de la administración de una o más unidades posológicas farmacéuticas.
Por ejemplo, una dosis diaria para un huésped vertebrado consiste en una cantidad de hasta un gramo del compuesto activo por kilo de peso del huésped, preferiblemente medio gramo, más preferiblemente 100 miligramos, y más preferiblemente aún, aproximadamente 50 miligramos o menos por kilo de peso corporal del huésped. La dosis seleccionada se puede administrar a un animal de sangre caliente o mamífero, por ejemplo, un hombre que necesite tratamiento mediado por la inhibición de las vías metabólicas del folato, por cualquier método adecuado de administración de la dosis, incluyendo: la vía tópica, por ejemplo, como pomada o crema; por vía oral; por vía rectal, por ejemplo, en forma de supositorio; por vía parenteral por inyección; o continuamente por infusión intravaginal, intranasal, intrabronquial, intraaural o intraocular.
Los compuestos de acuerdo con la invención producen cualquiera o más de un efecto antiproliferativo, un efecto antibacteriano, un efecto antiparasitario, un efecto antivírico, un efecto antipsoriásico, un efecto antiprotozoario, un efecto anticoccidial, un efecto antiinflamatorio, un efecto inmunosupresor y un efecto antimicótico. Los compuestos son especialmente útiles para producir un efecto antitumoral en un huésped vertebrado que alberga un tumor.
\newpage
Descripción detallada de la invención
En particular, la presente invención se refiere a compuestos antiproliferativos de la Fórmula siguiente:
1
en la cual:
A es S;
X es CH_{2};
Y es S; y
R_{1} y R_{2} son independientemente hidrógeno. La invención también se refiere a las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la presente invención. La invención también se refiere a los productos intermedios para la elaboración de tales compuestos.
Aunque los compuestos de la presente invención se muestran en la forma 4-oxo y se denominan como tales en toda esta descripción, el grupo oxo existe en equilibrio tautomérico con el grupo correspondiente 4-hidroxi. Por lo tanto, se entenderá que el término "los compuestos de la presente invención" significa las formas estructuralmente representadas como 4-oxo y sus formas tautoméricas 4-hidroxi. Por lo tanto, la invención también se refiere a las sales farmacéuticamente aceptables de los tautómeros 4-hidroxi de los compuestos representados por la presente invención.
Una realización de la presente invención se refiere a un compuesto de la fórmula
2
En una realización preferida, la invención se refiere a un compuesto según se ha definido anteriormente, que es ópticamente activo. En una realización más preferida, el compuesto según se ha definido anteriormente tiene la siguiente estructura:
3
En otra realización preferida, el compuesto según se ha definido anteriormente tiene la siguiente estructura:
4
Preferiblemente, X es CH_{2}, Y es preferiblemente S. Preferiblemente, R_{1} y R_{2} se seleccionan independientemente entre hidrógeno, más preferiblemente, entre hidrógeno. Es particularmente preferido que A e Y sean cada uno de ellos azufre y X sea CH_{2}.
Los compuestos de la presente invención son útiles como inhibidores de la GARFT. Los compuestos de la presente invención en los cuales R^{1} y R^{2} son cada uno de ellos hidrógeno son agentes antitumorales o antiproliferativos especialmente activos.
Las sales farmacéuticamente aceptables de la invención incluyen, por ejemplo, sales de metales alcalinos, de metales alcalinotérreos, otros metales no tóxicos y amoniaco o sales sustituidas de amoniaco de los compuestos del ácido glutámico de la invención. Como ejemplo de sales se pueden citar los compuestos de sodio, potasio, litio, calcio, magnesio, piridinio y sales sustituidas de piridinio del ácido libre.
Los compuestos de la invención se pueden preparar de la forma siguiente. Un material de partida útil para preparar los compuestos de la presente invención en los cuales X es CH_{2} es un compuesto de la Fórmula II:
5
en la cual B, C e Y son los definidos anteriormente en el compuesto de la presente invención; D es C_{1}, Br o I; y R_{6} es un hidrógeno o un componente que forma con el CO_{2} unido un grupo éster fácilmente hidrolizable. Preferiblemente, D es bromo o iodo. Preferiblemente, R_{6} es hidrógeno, C_{1}-C_{6} alquil, hidroxialquil, alquilaril o arilalquil, más preferiblemente, hidrógeno o C_{1}-C_{2} alquil.
El compuesto de la Fórmula II se hace reaccionar con un compuesto de la Fórmula III:
6
en la cual R_{3} es un grupo alquilo C_{1}-C_{6} sustituido o no sustituido, o un grupo sililo trisustituido. Preferiblemente, R_{3} es CR_{2}OH o trimetilsilil.
La reacción de los compuestos de las Fórmulas II y III se realiza en presencia de un catalizador metálico adecuado de transición, preferiblemente paladio o níquel, una base auxiliar no nucleófila, preferiblemente una amina sustituida, en un disolvente en el que al menos uno de los reactantes es al menos parcialmente soluble bajo las condiciones suficientes para obtener un compuesto de la Fórmula IV:
7
en la cual B, C e Y son los definidos anteriormente en el compuesto de la presente invención; R_{6} es el definido anteriormente en la Fórmula II; y R_{3} es el definido anteriormente en la Fórmula III.
Cuando R_{3} es un grupo sililo trisustituido, el grupo sililo se elimina preferiblemente con una base nucleófila, como carbonato metanólico o etanólico potásico, o una sal fluoruro, como fluoruro potásico, fluoruro de cesio o fluoruro de tetrabutilamonio, en un disolvente en el que al menos uno de los reactantes es al menos parcialmente soluble (como, por ejemplo, metanol, dimetilformamida, etanol, dimetilacetamida, dimetilsulfóxido o isopropanol) para dar un compuesto de la Fórmula V:
8
en la cual B, C e Y son los definidos anteriormente en el compuesto de la presente invención; y R_{6} es el definido anteriormente en la Fórmula II.
El compuesto de la Fórmula V se hace reaccionar con un electrófilo, preferiblemente un glicinal N-protegido, más preferiblemente N-t-butoxicarbonilglicinal o bis-N-t-butoxicarbonilglicinal, bajo condiciones básicas usando una base no nucleófila, preferiblemente bis-trimetilsililamida de litio, bis-trimetilsililamida de potasio, bis-trimetilsililamida de sodio o diisopropilamida de litio, a una temperatura baja, preferiblemente entre -90ºC y 25ºC, en un disolvente adecuado en el que uno de los reactantes es al menos parcialmente soluble, preferiblemente tetrahidrofurano, dietil éter o dioxano, para dar un compuesto de la Fórmula VI:
9
en la cual B, C e Y son los definidos anteriormente en el compuesto de la presente invención; R_{6} es el definido anteriormente en la Fórmula II; y R_{4} y R_{5} son cada uno de ellos independientemente hidrógeno o un grupo protector de nitrógeno fácilmente extraíble. R_{4} y R_{5} son preferiblemente hidrógeno, t-butoxicarbonil, benciloxicarbonil o bencil.
El compuesto de la Fórmula VI se reduce a continuación, preferiblemente con gas hidrógeno en presencia de un catalizador metálico adecuado, para obtener un compuesto de la Fórmula VII:
10
en la cual B, C e Y son los definidos anteriormente en el compuesto de la presente invención; R_{6} es el definido anteriormente en la Fórmula II; y R_{4} y R_{5} son los definidos anteriormente en la Fórmula VI.
El compuesto de la Fórmula VII se hace reaccionar a continuación con un agente acilante o sulfonilante, preferiblemente cloruro metanosulfonil o cloruro p-toluenosulfonil, en presencia de una base no nucleófila, preferiblemente trietilamina o diisopropiletilamina, en un disolvente adecuado en el que al menos uno de los reactantes es al menos parcialmente soluble, para obtener un grupo hidroxi activado. El grupo hidroxi activado se desplaza con un nucleófilo adecuado, preferiblemente una sal tioácido, más preferiblemente tioacetato potásico, para obtener un compuesto de la Fórmula VIII:
11
en la cual A, B, C e Y son los definidos anteriormente en el compuesto de la presente invención; R_{6} es el definido anteriormente en la Fórmula II; R_{4} y R_{5} son los definidos anteriormente en la Fórmula VI; y Ac es un grupo acilo, preferiblemente acetil.
Como alternativa, el compuesto de la Fórmula VII se convierte en el compuesto de la Fórmula VIII en un procedimiento químico usando trifenilfosfina, dietil o dimetil azadicarboxilato, y un nucleófilo acídico, preferiblemente ácido tioacético, en un disolvente adecuado.
El compuesto de la Fórmula VIII se trata con una base nucleófila, preferiblemente carbonato potásico, carbonato sódico, hidróxido sódico o hidróxido potásico, en un disolvente alcohólico, preferiblemente metanol, etanol o isopropanol, en presencia de un agente alquilante, preferiblemente dimetil o dietil cloromalonato, para obtener un compuesto de la Fórmula IX:
12
en la cual A, B, C e Y son los definidos anteriormente en el compuesto de la presente invención; R_{6} es el definido anteriormente en la Fórmula II; y R_{4} y R_{5} son los definidos anteriormente en la Fórmula VI.
El compuesto de la Fórmula IX se trata bajo condiciones adecuadas para eliminar uno o ambos grupos protectores R_{4} y R_{5} para producir un compuesto de la Fórmula X:
13
en la cual A, B, C e Y son los definidos anteriormente en el compuesto de la presente invención; y R_{6} es el definido anteriormente en la Fórmula II. Donde t-butoxicarbonil (t-BOC) es un grupo protector, las condiciones de eliminación de este grupo son preferiblemente tratamiento con ácido trifluoroacético seguido por neutralización para producir el compuesto de la Fórmula X.
El compuesto de la Fórmula X se hace reaccionar con un agente alquilante, preferiblemente trimetil o trietil oxonio tetrafluoroborato, en un disolvente adecuado, preferiblemente diclorometano, para formar un éter lactimo intermedio. Este éter lactimo intermedio se hace reaccionar con guanidina en un disolvente alcohólico, preferiblemente metanol, etanol o isopropanol, para formar un compuesto de la Fórmula XI:
14
en la cual A, B, C e Y son los definidos anteriormente en el compuesto de la presente invención; y R_{6} es el definido anteriormente en la Fórmula II.
Como alternativa, el compuesto de la Fórmula X se convierte en el compuesto de la Fórmula XI haciendo reaccionar el compuesto de la Fórmula X con un agente tiolante, preferiblemente P_{2}S_{5} o 2,4-bis(4-metoxifenil)-1,3-ditia-2,4-difosfetano-2,4-disulfuro, para formar el intermedio tiolactam. A continuación, éste se puede alquilar con un agente alquilante, preferiblemente yoduro de metilo o trimetil o trietil oxonio tetrafluoroborato, y a continuación con guanidina en un disolvente alcohólico, preferiblemente metanol, etanol o isopropanol, para obtener el compuesto de la Fórmula XI.
El compuesto de la Fórmula XI se hidroliza bajo condiciones básicas para formar un compuesto de la Fórmula XII:
15
en la cual A, B, C e Y son los definidos anteriormente en el compuesto de la presente invención. Donde R_{6} es hidrógeno en el compuesto de la Fórmula XI, la reacción de hidrolización no es necesaria, y el compuesto de la Fórmula XI se acopla a un péptido según se describe más adelante.
El compuesto de la Fórmula XII (o el compuesto de la Fórmula XI donde R_{6} es hidrógeno), que se encuentra en forma de ácido carboxílico libre, puede acoplarse al péptido, por métodos bien conocidos por los expertos en la materia, con un ácido glutámico diéster clorhídrico para formar un diéster de la Fórmula XIII:
16
en la cual A, B, C e Y son los definidos anteriormente en el compuesto de la presente invención; y R_{1} y R_{2} son cada uno de ellos independientemente un componente que forma con el CO_{2} unido un grupo éster fácilmente hidrolizable, como un alquilo C_{1}-C_{6}, hidroxialquil, alquilaril o arilalquil.
Por último, el compuesto de la Fórmula XIII se hidroliza al ácido glutámico libre del compuesto de la presente invención (R_{1} y R_{2} son cada uno de ellos H).
Los compuestos de la invención contienen uno o más centros quirales. La invención incluye mezclas racémicas y mezclas de diastereómeros, así como compuestos ópticamente activos, como los compuestos esencialmente libres de otros isómeros ópticos, cuyos compuestos ópticamente activos pueden obtenerse por los métodos conocidos por los expertos en la materia.
Una síntesis detallada de un compuesto preferido de la presente invención se presenta en el siguiente ejemplo.
Ejemplo ácido 4-[2-(2-amino-4-oxo-4,6,7,8-tetrahidro-3H-pirimido[5,4-6][1,4]tiazin-6- il)-etil]-2,5-tienoilamino-L-glutámico (Compuesto 1)
17 
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Preparación de metil-5-bromo-2-tiofenocarboxilato 2
18
El compuesto 2 (Nº de Reg. CAS [62224-19-5]) se preparó según se describe en S. Gronowitz, Ark. Kemi 8, 1955, 87, y S. O. Lawesson, Ark. Kemi 11, 1957, 337.
Preparación de 5-etinil-2-carbometoxi-tiofeno 3
19
A una solución agitada de 5 g (22,7 mmol) del bromuro 3 se añadieron 160 mg (0,23 mmol) de cloruro de tris-trifenilfosfina paladio (II) y 65 mg (0,34 mmol) de yoduro cuproso en 75 ml de dietilamina y 4,8 ml (34 mmol) de trimetilsilil acetileno. La solución resultante se agitó a 25ºC. Después de 18 horas, el disolvente se extrajo bajo presión reducida, y el residuo crudo se disolvió en 300 ml de Et_{2}O (dietil éter) y se extrajo con 100 ml de HCl 1 N y 100 ml de una solución de bicarbonato saturada. La capa orgánica se secó (Na_{2}SO_{4}) y el disolvente se extrajo bajo presión reducida. El residuo crudo se sometió a una cromatografía rápida en silica gel con Et_{2}O/hexanos al 5% para dar 4,4 g (con un rendimiento del 81%) del producto protegido con silil como un sólido amarillo. Este material se usó directamente en el paso siguiente.
A una solución de 4,4 g (18,5 mmol) del acetileno protegido con silil anterior en 50 ml de dimetilformamida (DMF) se añadió 3,3 g (35,2 mmol) de fluoruro potásico monohidrato. Después de 15 minutos a 25ºC, la mezcla se vertió sobre 500 ml de Et_{2}O y se extrajo cuatro veces con 100 ml de agua (4 x 100 ml H_{2}O). La solución orgánica se secó (Na_{2}SO_{4}), y el disolvente se extrajo bajo presión reducida. El residuo crudo se sometió a una cromatografía rápida en silica gel con Et_{2}O/hexanos al 10% para dar 2,65 g (con un rendimiento del 86%) del producto deseado 3 como un sólido naranja. NMR (CDCl_{3}) \delta: 3,45 (s, 1H), 3,88 (s, 3H), 7,22 (d, 1H, J = 3,5 Hz), 7,65 (d, 1H, J = 3,5 Hz). Anal. Calc. para C_{8}H_{6}SO_{2}: C, 57,81; H, 3,64; S, 19,29. Encontrado: C, 57,91; H, 3,71; S, 19,18.
También se usó un método alternativo para la extracción del grupo sililo de la forma siguiente. A una suspensión agitada de 3,7 g (0,02 mol) de K_{2}CO_{3} anhidro en 700 ml de metanol se añadió 59,7 g del silil-acetileno preparado anteriormente como un producto sólido. La suspensión se agitó durante 2 horas a 35 C, y a continuación el metanol se evaporó. El residuo se añadió a 50 ml de agua y se extrajo con 3 x 150 ml de Et_{2}O, y las fracciones orgánicas combinadas se secaron (Na_{2}SO_{4}) y se evaporaron. El residuo crudo se cromatografió en silica gel rápido usando Et_{2}O/hexanos al 7% para dar el producto deseado 3 con un rendimiento del 98% (38,72 g).
Preparación de N-(t-Butoxicarbonil)-glicinal 4
20
A una solución agitada de 2 g (12,4 mmol) de N-(t-butoxicarbonil)-2-hidroxi-etilamina (obtenido de Sigma Chemicals) en 80 ml de CH_{2}Cl_{2} a -78ºC se añadió 1,3 ml (18,6 mmol) de dimetil sulfóxido (DMSO) y 1,2 ml (13,7 mmol) de cloruro de oxalilo. Después de 5 minutos se añadieron 5,4 ml (38,4 mmol) de trietilamina y la solución se dejó calentar hasta 25ºC. La mezcla se vertió sobre 200 ml de Et_{2}O y se extrajo con 100 ml de agua, 100 ml de HCl 0,5 N y 100 ml de una solución de bicarbonato saturada. La fracción orgánica se secó (Na_{2}SO_{4}), y el disolvente se extrajo bajo presión reducida. El aldehído crudo se disolvió en 100 ml de benceno, y el disolvente se extrajo de nuevo bajo presión reducida. Este material crudo, que se encontró que era inestable, se usó inmediatamente en el paso siguiente.
Preparación de 4-N-(t-butoxicarbonil)-3-hidroxi-1-(2-carbometoxi-5-tiofen)- butino 5
21
A una solución de 1,7 g (10,2 mmol) de acetileno 3 en 10 ml de tetrahidrofurano (THF) seco a -78ºC se añadió 14,3 ml (14,0 mmol) de una solución 1 M de bis-trimetilsilil amida de litio en THF. Después de 10 minutos, el aldehído crudo 4 obtenido anteriormente se añadió gota a gota en 5 ml de THF seco. La solución se agitó a -78ºC durante 10 minutos y se dejó calentar hasta 0ºC en un periodo de veinte minutos. A la mezcla se añadió 5 ml de una solución acuosa saturada de cloruro amónico. La mezcla se vertió sobre 200 ml de Et_{2}O y se lavó con 100 ml de H_{2}O y a continuación 50 ml de una solución saturada de NaCl. La capa orgánica se secó (Na_{2}SO_{4}) y el disolvente se extrajo bajo presión reducida. El residuo crudo se sometió a una cromatografía rápida en silica gel con EtOAc/hexanos al 10-40% para dar 0,96 g (29%) del alcohol deseado 5 como un aceite ligeramente amarillo. NMR (CDCl_{3}) \delta: 1,46 (s, 9H), 3,38 y 3,58 (AB, 2H, J = 3, 7 Hz), 3,88 (s, 3H), 4,71 (dt, 1H, J = 2,9, 5,2 Hz), 5,05 (brs, 1H), 7,15 (d, 1H, J = 3,9 Hz), 7,64 (d, 1H, J = 3,9 Hz). IR (limpia): 2978,3, 1729,5, 1685, 1523, 1452, 1368, 1286, 1167, 1098, 959, 822, 750,4 cm^{-1}. Espectroscopia de masas de alta resolución, Calc. para C_{15}H_{19}NO_{5}S: M^{+}Cs^{+}, 458,0038. Encontrado: 458,0051.
Preparación de metil-5-[(4-N-(t-butoxicarbonil)-amino 3-hidroxi)-butil]- tienil-2-carboxilato 6
22
A una solución agitada de 940 mg (2,89 mmol) del acetileno 5 anterior en 50 ml de acetato de etilo (EtOAc) se añadió 320 mg de Pd/C al 5%. La mezcla se colocó bajo 40 psi de H_{2} gas y se agitó a 25ºC durante 17 horas. La mezcla se filtró a través de Celite (tierra de diatomeas) y el disolvente se extrajo bajo presión reducida. El residuo crudo se sometió a una cromatografía rápida en silica gel con EtOAc/CH_{2}Cl_{2} al 20% para dar 800 mg (con un rendimiento del 84%) del alcohol deseado como un aceite amarillo. NMR (CDCl_{3}) \delta: 1,44 (s, 9H), 1,81 (m, 2H), 2,28 (brs, 1H), 2,99 (m, 2H), 3,10 y 3,29 (AB, 2H, J = 3, 6,9 Hz), 3,74 (m, 1H), 3,86 (s, 3H), 4,89 (brs, 1H), 6,82 (d, 1H, J = 3,7 Hz), 7,63 (d, 1H, J = 3,7 Hz). Anal. Calc. para C_{15}H_{23}NO_{5}S: C, 54,69; H, 7,04; N, 4,25; S, 9,73. Encontrado: C, 54,79; H, 7,02; N, 4,29; S, 9,63.
Un método alternativo para la preparación del alcohol 6 usa bis-t- butoxicarbonil alilamina 14 de la siguiente forma.
Preparación de Bis-t-butoxicarbonil alilamina 14
23
A una solución de 57,10 g (1,0 mol) de alilamina y 1,2 g (0,01 mol) de dimetilaminopiridina (DMAP) en 500 ml de acetonitrilo se añadió una solución de 220 g (1 mol) de (t-BOC)_{2}O en 100 ml de acetonitrilo, y la mezcla resultante se agitó durante 6 horas. La mezcla de reacción se diluyó con tolueno (100 ml) y los disolventes se evaporaron bajo presión reducida a 60ºC. El aceite resultante se redisolvió en acetonitrilo (400 ml) y se añadió otro 1,2 g (0,01 mol) de DMAP, y a esta solución se añadieron lentamente 220 g (1 mol) de (t-BOC)_{2}O en 100 ml de acetonitrilo. La mezcla de reacción se agitó durante 12 horas a 60ºC, el disolvente se evaporó bajo presión reducida a 60ºC, y se añadió NaHCO_{3} diluido (100 ml). Se extrajo con 3 x 150 ml de CH_{2}Cl_{2}, y las capas orgánicas combinadas se lavaron con solución salina concentrada, se secaron (Na_{2}SO_{4}) y se evaporaron. El residuo crudo se purificó mediante cromatografía en silica gel rápido eluyendo con un gradiente de EtOAc/hexanos al 5-20% para dar 156,9 g (con un rendimiento del 63%) del producto deseado 14 como un sólido cristalino transparente (p.f. 43-44ºC). ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta (ppm): 1,5 (s, 18H), 4,18 (dd, 2H, J = 15 Hz, J = 1 Hz), 5,14 (ddd, 2H, J = 15 Hz, J = 10 Hz, J = 1 Hz), 5,85 (ddt, 2H, J = 10 Hz, J = 5 Hz, J = 1 Hz). IR (KBr): 2978, 2935, 2860, 1724, 1689, 1342, 1130 cm^{-1}. Anal. Calc. para C_{13}H_{23}NO_{4}: C, 60,68; H, 9,01; N, 5,44. Encontrado: C, 60,78; H, 9,04; N, 5,50.
Preparación de 1-(bis-t-butoxicarbonil amino)-2-etanal 15
24
Una solución de 0,60 g (2,34 mmol) de bis-t-butoxicarbonil alilamina 14 en 20 ml de CH_{2}Cl_{2} se ozonizó (40 voltios, 500 amperios, 1,0 1/min de O_{2} a 3 psi) a -78ºC hasta que persistió un color azul, se añadieron 10 ml de dimetil sulfuro, y esta mezcla se agitó durante 14 horas a 25ºC. La mezcla se añadió a solución salina concentrada diluida y se extrajo con CH_{2}Cl_{2} (3 x 50 ml), y las fracciones orgánicas se secaron (Na_{2}SO_{4}) y se evaporaron. Se cromatografió en silica gel rápido con un rendimiento de 603 mg (con un rendimiento del 99%) del producto deseado 15 como un sólido cristalino transparente (p.f. 37-39ºC). ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta (ppm) : 1,50 (s, 18H), 4,38 (s, 2H), 9,55 (s, 1H). IR (KBr): 2984, 2935, 2724, 1792, 1734, 1699, 1362, 1153 cm^{-1}. Anal. Calc. para C_{12}H_{21}NO_{5}: C, 55,58; H, 8,16; N, 5,40. Encontrado: C, 55,20; H, 8,19; N, 5,19.
Preparación de metil-5-[(4-N-(t-butoxicarbonil)-amino 3-hidroxi)-butil]- tienil-2-carboxilato 6
A una solución de 9,64 g (59 mmol) de 5-etinil-2 carbometoxi tiofeno 3 en THF (250 ml) a -78ºC se añadió 65,6 ml (60 mmol, 0,9 M) de hexametil disilazida de litio (LiHMDS), y la mezcla se agitó durante 2 horas a -78ºC. Se canuló una solución de 15,6 g (60 mmol) de 1-(bis-t-butoxixcarbonilamino)-2-etanal 15 en THF (40 ml) dentro de la mezcla de reacción, y la mezcla se agitó durante 8 horas a -78ºC. Se añadió una solución de 3,4 ml (60 mmol) de ácido acético en metanol (10 ml) como neutralizador, la mezcla se agitó durante 10 minutos calentando hasta 0ºC, y se añadió agua (60 ml). Se extrajo con EtOAc (3 x 100 ml), y los extractos orgánicos se lavaron con NaHCO_{3} diluido y se secaron (Na_{2}SO_{4}). El disolvente se extrajo bajo presión reducida hasta aproximadamente 50 ml. Al residuo resultante se añadió EtOAc (125 ml), y esta solución se añadió a un frasco de Parr que contenía 7,38 g (30% en peso de la materia prima acetileno) de Pd al 5% en carbono y se hidrogenó a 55 psi de H_{2} durante 24 horas. El material de hidrogenación crudo se filtró a través de Celite, y la pasta del filtro se lavó con metanol (100 ml) y EtOAc (100 ml). El disolvente se evaporó bajo presión reducida, el residuo crudo se filtró a través de silica eluyendo con EtOAc en hexanos al 50%, y el disolvente se evaporó. El residuo se disolvió en 20 ml de metanol (MeOH) azeotropado con benceno (50 ml), y redisuelto en MeOH seco (20 ml). Esta mezcla se añadió a una solución recién preparada de 60 ml (2 M) de metóxido sódico en metanol. La mezcla de reacción se agitó durante 45 minutos, se añadió HCl diluido (0,1 M, 50 ml) y esta mezcla se extrajo con EtOAc (3 x 75 ml). Las fracciones orgánicas se combinaron y se lavaron con tampón de pH 7 (1 M), se secaron (Na_{2}SO_{4}) y se evaporaron. El residuo crudo se cromatografió en silica rápido eluyendo con EtOAc/hexanos al 40% para dar 9,32 g (con un rendimiento del 48%) del producto deseado 6.
Preparación de metil-5-[(4-N-(t-butoxicarbonil) amino-3-acetiltio)-butil]-2- tiofenocarboxilato 7
25
A una solución agitada de 9,26 g (28,1 mmol) del alcohol 6 en 100 ml de THF a 0ºC se añadió 5,9 ml (42 mmol) de trietilamina (TEA) y 2,4 ml (31 mmol) de metanosulfonil cloruro. Después de 20 minutos, se añadieron 100 ml de DMF y 12,8 g (110 mmol) de tioacetato potásico, y la solución resultante se dejó calentar hasta 25ºC. Después de tres días, la mezcla se vertió sobre 500 ml de agua y se extrajo con 800 ml de Et_{2}O. La capa orgánica se lavó con 200 ml de agua, 200 ml de HCl 1 N, 200 ml de una solución de bicarbonato saturada, y 100 ml de una solución saturada de NaCl. La capa orgánica se secó (MgSO_{4}) y el disolvente se extrajo bajo presión reducida. El residuo crudo se sometió a una cromatografía rápida en silica gel con EtOAc/hexanos al 25% para dar 10,3 g (con un rendimiento del 95%) del tioacetato deseado 7 como un aceite amarillo. NMR (CDCl_{3}) \delta: 1,44 (s, 9H), 1,91 y 2,04 (ABm, 2H), 2,37 (s, 3H), 2,96 (m, 2H), 3,36 (m, 2H), 3,61 (m, 1H), 3,86 (s, 3H), 4,74 (brs, 1H), 6,79 (d, 1H, J = 3,6 Hz), 7,62 (d, 1H, J = 3,6 Hz). IR (limpia): 3366, 2976,4, 1713, 1520, 1462,1, 1366, 1290,5, 1267,3, 1169, 1098, 752, 631 cm^{-1}. Espectroscopia de masas de alta resolución, Calc. para C_{17}H_{25}NO_{5}S_{2}: M^{+}Cs^{+}, 520,0229. Encontrado: 520,0240.
Preparación de metil-5-[(4-N-(t-butoxicarbonil)-amino 3-(dimetilmalonil)tio)- butil]-2-tiofenocarboxilato 8
26
A una solución agitada de 10,2 g (26 mmol) del tioacetato 7 anterior en 200 ml de metanol seco a 0ºC se añadió 7,2 g (52 mmol) de K_{2}CO_{3} y 3,7 ml (29 mmol) de dimetil cloromalonato. Después de tres horas, la mezcla se vertió sobre 500 ml de agua y se extrajo con Et_{2}O (3 x 500 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con 500 ml de agua y a continuación con 200 ml de solución saturada de NaCl, y se secaron (MgSO_{4}). El disolvente se extrajo bajo presión reducida y el residuo crudo se sometió a una cromatografía rápida en silica gel con EtOAc/hexanos al 30% para dar 11,46 g (con un rendimiento del 93%) del tioéter 8 deseado como un aceite ligeramente amarillo. NMR (CDCl_{3}) \delta: 1,44 (s, 9H), 1,85 y 2,00 (ABm, 2H), 3,03 (m, 3H), 3,30 (m, 2H), 3,80 (s, 6H), 3,86 (s, 3H), 5,10 (brs, 1H), 6,82 (d, 1H, J = 3,8 Hz), 7,63 (d, 1H, J = 3,8 Hz). IR (limpia): 3442, 2974, 2955, 1734, 1713, 1512, 1460, 1435, 1366, 1291, 1267, 1167, 1098, 1022, 752 cm^{-1}. Espectroscopia de masas de alta resolución, Calc. para C_{20}H_{29}NO_{8}S_{2}: M^{+}Cs^{+}, 608,0389. Encontrado: 608,0370.
Preparación de 6-[(5-carbometoxitien-2-il)-etil] 2-carbometoxi-3-oxo-3,4,5,6- tetrahidro-[1,4]-tiazina 9
27
A una solución agitada de 470 mg (0,99 mmol) del tioéter 8 anterior en 12 ml de CH_{2}Cl_{2} a 0ºC se añadió 4 ml de ácido trifluoroacético (TFA). Después de 1,5 horas, la mezcla se vertió sobre 50 ml de una solución de bicarbonato saturada y se extrajo con CH_{2}Cl_{2} (4 x 100 ml). El disolvente se extrajo bajo presión reducida y el residuo crudo se disolvió en 10 ml de metanol. Después de agitar a 25ºC durante 1,5 horas, el disolvente se extrajo bajo presión reducida y el residuo crudo se sometió a una cromatografía rápida en silica gel con EtOAc/CH_{2}Cl_{2} al 40% para dar 298 mg (con un rendimiento del 88%) del lactam deseado 9 como un aceite incoloro. NMR (CDCl_{3}) \delta: 1,94 (m, 2H), 3,01 (m, 2H), 3,4-3,7 (m, 4H), 3,80 y 3,82 (s, 3H), 3,87 (s, 3H), 6,25 (brs, 1H), 6,83 (d, 1H, J = 3,7 Hz), 7,64 (d, 1H, J = 3,7 Hz). IR (KBr): 2951, 1732, 1669, 1462, 1294, 1267, 1194, 1157, 1098, 1005, 752 cm^{-1}. Anal. Calc. para C_{14}H_{17}NO_{5}S_{2}: C, 48,96; H, 4,99; N, 4,08; S, 18,67. Encontrado: C, 49,06; H, 4,93; N, 4,09; S, 18,60.
Preparación de metil-[2-(2-amino-4-oxo-4,6,7,8-tetrahidro-3H-pirimido[5,4-6] [1,4]tiazin-6-il)-etil]-2,5-tienoato 10
28
A una solución agitada de 1,9 g (5,5 mmol) del lactam 9 anterior en 150 ml de CH_{2}Cl_{2} seco se añadió, de una vez, 1,06 g (7,2 mmol) de trimetiloxonio tetrafluoroborato. La solución se agitó durante 6 horas a 25ºC. La mezcla resultante se vertió sobre 50 ml de K_{2}CO_{3} acuoso al 10% y se extrajo con CH_{2}Cl_{2} (3 x 200 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron (MgSO4) y el disolvente se extrajo bajo presión reducida. El material resultante se usó directamente en el paso siguiente.
En un matraz diferente se colocó 1,58 g (16,6 mmol) de clorhidrato de guanidina seco. A ello se añadió 600 ml de metanol seco. Se hicieron pasar burbujas de argón seco a través de la solución durante 10 minutos, después de lo cual se añadió 926 mg (17,1 mmol) de metóxido sódico seco. A la mezcla resultante se añadió mediante una cánula el éter lactim crudo preparado anteriormente en 20 ml de MeOH. La solución se sometió a reflujo bajo una atmósfera de argón durante 20 horas. El pH se ajustó a 4 con HCl 1 N, y el disolvente se extrajo bajo presión reducida. El residuo crudo se disolvió en 500 ml de CHCl_{3} y se lavó con 2 x 100 ml de agua. La capa orgánica se secó (MgSO_{4}), y el disolvente se extrajo bajo presión reducida. El residuo crudo se sometió a una cromatografía rápida en silica gel con MeOH/CH_{2}Cl_{2} al 5-10% para dar 413 mg de un sólido casi blanco. Este material se disolvió a continuación en 25 ml de MeOH caliente y se enfrió lentamente a 4ºC en un periodo de 18 horas. El sólido se recogió por filtración para dar 180 mg (con un rendimiento del 9%) de la pirimidinona 10 deseada como un sólido ligeramente amarillo. NMR (d_{6}-DMSO) \delta: 1,72 (m, 1H), 1,88 (m, 1H), 2,8-3,22 (m, 4H), 3,50 (dt, 1H, J = 2, 8 Hz), 5,99 (brs, 2H), 6,64 (brs, 1H), 6,98 (d, 1H, J = 3,8 Hz), 7,62 (d, 1H, J = 3,8 Hz), 10,02 (brs, 1H). Espectroscopia de masas de alta resolución, Calc. para C_{14}H_{16}N_{4}O_{3}S_{2}: M^{+}Na^{+}, 375,0562. Encontrado: 375,0550.
También se usó un procedimiento alternativo para la preparación de pirimidinona 10 de la siguiente forma. A una solución agitada de 500 mg (1,46 mmol) del lactam 9 en 20 ml de THF seco se añadió 648 mg (1,60 mmol) de reactivo de Lawesson (2,4-bis(4-metoxifenil) -1,3-ditia-2,4-difosfetano- 2,4-disulfuro). Después la mezcla se agitó a 25ºC durante 20 horas, se vertió sobre 50 ml de una solución de bicarbonato saturada y se extrajo con 2 x 200 ml de EtOAc. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con 50 ml de solución saturada de NaCl y se secaron (MgSO_{4}), y el disolvente se extrajo bajo presión reducida. El tiolactam crudo se sometió a una cromatografía rápida en silica gel con EtOAc/CH_{2}Cl_{2} al 8% para dar 525 mg del correspondiente tiolactam 11:
29
Este material se usó inmediatamente en el paso siguiente.
A 525 mg del tiolactam 11 en una mezcla de 10 ml de THF seco y 10 ml de metanol seco se añadió 1,6 ml de NaOH 1 N. A esta mezcla se añadió 0,1 ml (1,6 mmol) de yoduro de metilo para producir un tiolactam metilado que se usó según se describe más adelante sin purificación. En un matraz diferente se colocó 1,39 g (14,6 mmol) de clorhidrato de guanidina seco. A esta mezcla se añadió 300 ml de metanol seco. Se hicieron pasar burbujas de argón seco a través de la solución durante 10 minutos, después de lo cual se añadió 796 mg (14,7 mmol) de metóxido sódico seco. A la mezcla resultante se añadió mediante una cánula el tiolactam metilado crudo preparado anteriormente. La solución se sometió a reflujo bajo atmósfera de argón durante 48 horas. El pH se ajustó a 4 con HCl 1 N y el disolvente se extrajo bajo presión reducida. El residuo crudo se disolvió en 500 ml de CHCl_{3} y se lavó con 2 x 100 ml de agua. La capa orgánica se secó (MgSO_{4}) y el disolvente se extrajo bajo presión reducida. El residuo crudo se sometió a una cromatografía rápida en silica gel con MeOH/CH_{2}Cl_{2} al 5-10%. El material se disolvió a continuación en 20 ml de MeOH caliente y se enfrió lentamente a 4ºC en un periodo de 18 horas. El producto sólido se recogió por filtración para dar 131 mg (con un rendimiento del 9%) de la pirimidinona deseada 10.
Preparación de ácido [2-(2-amino-4-oxo-4,6,7,8-tetrahidro-3H-pirimido[5,4- 6)[1,4]tiazin-6-il)-etil]-2,5-tienoico 12
30 
\newpage
A 180 mg (0,51 mmol) de la pirimidinona 10 se añadió 5 ml de NaOH 1 N en agua. La solución resultante se agitó a 25ºC durante 20 horas. Después de enfriar a 0ºC, el pH se ajustó hasta 2 con HCl 1 N. El sólido marrón se filtró y se lavó con agua y se secó bajo vacío para dar 111 mg (con un rendimiento del 64%) del ácido deseado 12 como un sólido ligeramente marrón. NMR (d_{6}-DMSO) \delta: 1,72 (m, 1H), 1,92 (m, 1H), 2,78-3,68 (m), 6,07 (brs, 2H), 6,68 (brs, 1H), 6,92 (d, 1H, J = 3,7 Hz), 7,52 (d, 1H, J = 3,7 Hz), 10,12 (brs, 1H), 12,89 (brs, 1H). Espectrometría de masas de alta resolución, Calc. para C_{13}H_{l4}N_{4}O_{3}S_{2}: M^{+}, 338,0507. Encontrado: 338,0517.
Preparación del dietiléster del ácido 4-[2-(2-amino-4-oxo-4,6,7,8-tetrahidro-3H-pirimido[5,4-6] [1,4]tiazin-6-il)-etil]-2,5-tienoilamino-L-glutámico 13
31
A una solución agitada de 110 mg (0,33 mmol) del ácido 12 anterior en 5 ml de DMF seco se añadió 48 mg (0,36 mmol) de 1-hidroxi-benzotriazol hidrato, 62 \mul (0,36 mmol) de diisopropiletilamina, 86 mg (0,36 mmol) de clorhidrato del dietiléster del ácido glutámico y 106 mg (0,36 mmol) de metioduro de 1-(3-dimetilaminopropil)-3- etilcarbodiimida. La solución resultante se agitó bajo una atmósfera de argón a 25ºC durante 20 horas y a continuación se vertió en 50 ml de agua. El agua se extrajo con 2 x 150 ml de EtOAC. Las capas orgánicas combinadas se volvieron a extraer con 3 x 50 ml de agua y a continuación se añadió 10 ml de una solución saturada de NaCl y se secaron (MgSO_{4}). El disolvente se extrajo bajo presión reducida, y el residuo crudo se sometió a una cromatografía rápida en silica gel con MeOH/CH_{2}Cl_{2} al 0-10% para dar 120 mg (con un rendimiento del 71%) de la amida deseada 13 como un sólido amorfo ligeramente amarillo. NMR (d_{6}-acetona) \delta: 1,20 (m, 6H), 2,2 (m, 1H), 2,46 (t, 1H, J = 7,6 Hz), 2,78 (s, 1H), 2,82 (s, 1H), 2,92-3,1 (m, 2H), 3,41 (m, 1H), 3,72 (dt, 1H, J = 3,0, 12,7 Hz), 4,02-4,2 (m, 4H), 4,58 (m, 1H), 5,90 (brs, 1H), 6,05 (brs, 1H), 6,90 (d, 1H, J = 3,8 Hz), 7,58 (d, 1H, J = 3,8 Hz), 7,78 (d, 1H, J = 8 Hz). Espectroscopia de masas de alta resolución, Calc. para C_{22}H_{29}N_{5}O_{6}S_{2}: M^{+}H^{+}, 524,1638. Encontrado: 524,1650.
Preparación de ácido 4-[2-(2-amino-4-oxo-4,6,7,8-tetrahidro- 3H-pirimido[5,4-6] [1,4)tiazin-6-il)-etil]-2,5-tienoilamino-L-glutámico 1
A 115 mg (0,22 mmol) del dietiléster 13 anterior se añadió 3 ml de una solución de NaOH 1 N en agua. La mezcla resultante se agitó a 25ºC durante 14 horas. Después de enfriar a 0ºC se ajustó el pH a 3,5 con HCl acuoso. El sólido se filtró, se lavó con agua y se secó bajo vacío para dar 82 mg (con un rendimiento del 80%) del ácido deseado como un sólido casi blanco. NMR (d_{6}-DMSO) \delta : 1,62-2,02 (m, 4H), 2,27 (m, 2H), 2,78-3,00 (m, 3H), 4,27 (dd, 1H, J = 6, 6,8 Hz), 6,00 (brs, 2H), 6,63 (brs, 1H), 6,88 (d, 1H, J = 3,7 Hz), 7,63 (d, 1H, J = 3,7 Hz), 8,37 (d, 1H, J = 7,4 Hz), 10,05 (brs, 1H), 12,85 (brs, 2H). IR (KBr): 3371, 1700, 1643, 1543, 1345 cm^{-1}. Espectroscopia de masas de alta resolución, Calc. para C_{18}H_{21}N_{5}O_{6}S_{2}: M^{+}H^{+}, 468,1012. Encontrado: 468,1025. Anal. Calc. para C_{18}H_{21}N_{5}O_{6}S_{2}. 1,5 H_{2}O: C, 43,71; H, 4,89; N, 14,16; S, 12,97. Encontrado: C, 43,50; H, 4,67; N, 14,07; S, 12,72.
Evaluación biológica y bioquímica Determinación de las constantes de inhibición de la transformilasa GAR
El método de valoración de la transformilasa GAR (GARFT) de Young y cols., Biochemistry 23 (1984), 3979-3986, se modificó y usó según se describe más adelante. Las mezclas de reacción contenían el dominio catalítico de la GARFT humana, 0-250 nM del compuesto 1, 20 \muM de glicinamida ribonucleótido (GAR), 10 ó 20 \muM de N^{10} -formil-5,8-dideazafolato (FDDF), 50 mM de HEPES-KOH, pH 7,5, y 50 mM de KCl. La reacción se inició añadiendo la enzima a una concentración final de 11 nM, seguida por la monitorización del incremento de la absorbancia a 294 nm a 20ºC (e_{294} = 18,9 mM^{-1} cm^{-1}).
La constante de inhibición (Ki) de la GARFT se determinó a partir de la dependencia de la cinética catalítica de equilibrio sobre la concentración del inhibidor y del sustrato. Se determinó que el tipo de inhibición observado era competitivo con respecto al FDDF por la dependencia de la Ki aparente (Ki,app) sobre la concentración de FDDF y se demostró que se describe por una Ki,app = Ki + (Ki/Km)[FDDF]. La constante de Michaelis para FDDF, Km, se determinó independientemente según la dependencia de la cinética catalítica sobre la concentración de FDDF. Los datos de las determinaciones de Km y Ki se ajustaron con métodos no lineales a la ecuación de Michaelis, o a la ecuación de Michaelis para inhibición competitiva, según proceda. Se analizaron los datos resultantes de la inhibición de la unión estricta y se determinó su Ki ajustando los datos a la ecuación de unión estricta de Morrison, Biochem Biophis Acta 185 (1969), 269-286, por métodos no lineales.
Líneas celulares
Las líneas celulares usadas y su origen se presentan tabuladas en la Tabla 1. Las condiciones de crecimiento y los requerimientos del medio de cada línea celular se resumen en la Tabla 2. Todos los cultivos se mantuvieron a 37ºC, con aire-CO_{2} al 5% en una incubadora con humidificador.
Inhibición del crecimiento in vitro
Las soluciones madre de los inhibidores se prepararon en bicarbonato sódico 10 mM en agua y se almacenaron en alícuotas de 1 ml a -20ºC para los experimentos de cultivo celular. La inhibición del crecimiento celular se midió con una modificación del método de Mosmann, J. Immunol. Methods 65 (1983), 55-63.
Las células en la fase de crecimiento medio de cada línea celular se diluyeron hasta 18.500 células/ml en medio de crecimiento RPMI fresco (Mediatech, Washington, DC) suplementado con suero fetal bovino dializado (Hyclone Laboratories Inc., Logan, UT) y a continuación se distribuyeron por alícuotas en las columnas 2 a 12 de placas de microvaloración de 96 pocillos. La columna 1 se llenó con el mismo volumen (135 ml) de medio fresco sin células para usarlo como blanco. Las placas se colocaron a continuación en una incubadora a 37ºC, aire-CO_{2} al 5%. Después de 1 a 4 horas se extrajeron las placas de la incubadora y a continuación se añadió el compuesto 1 a 10 x la concentración final, 15 ml/pocillo en diluciones binarias en las columnas 12 a 4. Para los experimentos de reversión se incluyó hipoxantina (1,75 mM) o AICA (1,75 mM) en todas las soluciones de fármacos (concentración final de 175 mM). Los pocillos que contenían cada concentración del compuesto 1 se prepararon por cuadruplicado en cada placa. Se añadieron 15 ml de medio sin el compuesto 1 a los pocillos de la columna 1 de las placas. Las células se devolvieron a continuación a la incubadora y se mantuvieron sin molestarlas durante el periodo completo de incubación. En el día 3 para las células L1210 y L1210/CI920, o en el día 5 para las células CCRF-CEM, se añadió a cada pocillo de todas las placas 50 ml de MTT (bromuro de (4,5 dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolio; Nº de catálogo Sigma M2128) 0,8 mg/ml disuelto en medio de cultivo de tejido, después de lo que las células se devolvieron a la incubadora. Después de 4 horas se extrajeron todas las placas de la incubadora y se centrifugaron a 1200 rpm durante 7 minutos. El medio se extrajo por sifón y se añadió 150 ml de DMSO a cada pocillo de todas las placas. A continuación se mezclaron las placas a velocidad lenta en un agitador de tipo vortex durante una hora en la oscuridad a temperatura ambiente. El grado de metabolización del MTT se midió espectrofotométricamente a 540 nm en un lector cinético de microplacas Molecular Devices V_{max}™. La concentración de fármaco requerida para reducir el crecimiento celular en un 50% medido por el metabolismo del MTT se determinó por interpolación de la D.O. (menos el blanco) inmediatamente superior e inferior al 50% de la D.O. del control (menos el blanco).
TABLA 1
Tejido de origen y fuente de las líneas celulares
utilizadas en los estudios in vitro
Línea celular Fuente Origen
L1210 ATCC* Ratón, leucemia linfocítica
CCRF-CEM ATCC* Humano, leucemia linfoblástica
aguda
* ATCC = American Type Culture collection
TABLA 2
Condiciones de cultivo, densidades en la placa
y tiempos de incubación usados en las microvaloraciones
Densidad en la
DFCS placa Tiempo de
Línea celular Medio Conc.* (%) (células/ pocillo) incubación (días)
L1210 RPMI-1640 5 2500 3
CCRF-CEM RPMI-1640 10 2500 5
* DFCS Conc. = concentración de suero fetal bovino dializado.
TABLA 3
Datos para el compuesto 1
Inhibición del crecimiento usando la exposición continua (72 horas)
CI_{50} del cultivo CI_{50} del cultivo celular
Compuesto Ki de GARFT (nM) celular L1210 (nM)ª CCRF-CEM (nM)ª
1 4,5 16 4,3
ª: CI_{50} media \pm desviación estándar.
Actividad antitumoral in vivo
En el día cero se implantaron por vía subcutánea fragmentos con trocar de 2 mm^{2} de linfosarcoma 6C3HED en la región axilar en grupos de seis ratones hembra C3H/He. Comenzando en el día 1, el compuesto en estudio se administró por vía intraperitoneal en encapsina al 40% una vez al día durante nueve días. Los animales control recibieron idéntico tratamiento sin el compuesto en estudio. La inhibición porcentual dada en la Tabla 4 siguiente se calculó comparando la masa de los tumores de los controles (que recibieron sólo el diluyente) en el día 11 con la de los animales que recibieron el compuesto en estudio.
TABLA 4
Compuesto Dosis (mg/kg) % inhibición Supervivientes
1 12,5 100 6/6
1 25 100 3/6
1 50 Tóxico 0/6
En el día cero se implantaron por vía subcutánea fragmentos con trocar de 2 mm^{2} de adenocarcinoma de mama C3H/BA en la región axilar en grupos de seis ratones hembra C3H/He. Comenzando en el día 1, el compuesto en estudio se administró por vía intraperitoneal en encapsina al 40% una vez al día durante nueve días. Los animales control recibieron idéntico tratamiento sin el compuesto en estudio. La inhibición porcentual se calculó comparando la masa de los tumores de los controles (que recibieron sólo el diluyente) en el día 14 con la de los animales que recibieron el compuesto en estudio. Los resultados se resumen en la Tabla 5.
TABLA 5
Compuesto Dosis (mg/kg) % inhibición Supervivientes
1 5 16 5/6
1 10 84 6/6
1 20 100 3/6
Será evidente para los expertos en la materia que se pueden hacer varias modificaciones y variaciones en los procesos y productos de la presente invención.
Cuando sea posible, por cuestiones meramente químicas, los grupos químicos citados en el presente documento se pueden sustituir. En algunos casos, esta posibilidad es explícita cuando se habla, como, por ejemplo, de un grupo alquilo C_{1}-C_{3} sustituido o no sustituido.
Cuando se mencionen más de un grupo R_{6} en cualquier Fórmula del presente documento, cada R_{6} se puede seleccionar independientemente entre las posibilidades que se indican.

Claims (5)

1. Un compuesto de la fórmula:
32
2. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 que es ópticamente activo.
3. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 2 que tiene la siguiente estructura:
33
4. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 2 que tiene la siguiente estructura:
34
5.Una composición farmacéuticamente que comprende:
(I)
Un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;
(II)
Un portador, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.
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