ES2201079T3 - Compuestos utiles como agentes antiproliferativos e inhibidores de garft. - Google Patents
Compuestos utiles como agentes antiproliferativos e inhibidores de garft.Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A COMPUESTOS, P.EJ. EL COMPUESTO (1), EN EQUILIBRIO CON SU TAUTOMERO 4-HIDROXI, Y A SUS SALES FARMACEUTICAMENTE ACEPTABLES. DICHOS COMPUESTOS SON UTILES COMO INHIBIDORES DE LA GLICINAMIDA RIBONUCLEOTIDO FORMIL TRANSFERASA (GARFT), O COMO AGENTES ANTIPROLIFERATIVOS. LA INVENCION SE REFIERE ASIMISMO A COMPOSICIONES FARMACEUTICAS Y METODOS QUE EMPLEAN DICHOS COMPUESTOS COMO INHIBIDORES DE LA GARFT O COMO AGENTES ANTIPROLIFERATIVOS, ASI COMO A INTERMEDIARIOS PARA LA OBTENCION DE DICHOS COMPUESTOS.
Description
Compuestos útiles como agentes antiproliferativos
e inhibidores de GARFT.
La presente invención se refiere a los compuestos
que se definen a continuación que inhiben la enzima glicinamida
ribonucleótido formil transferasa (GARFT). La invención también se
refiere a los preparados farmacéuticos que contienen estos
compuestos. Los compuestos tienen una actividad antitumoral,
antiinflamatoria, antipsoriásica o inmunosupresora. La invención
también está relacionada con la preparación de los compuestos
descritos.
La gran clase de agentes antiproliferativos
incluye compuestos antimetabolitos. Una subclase particular de
antimetabolitos conocidos como antifolatos o antifoles son
antagonistas de la vitamina ácido fólico. Típicamente, los
antifolatos son muy parecidos estructuralmente al ácido fólico e
incorporan el componente característico P-benzoil
glutamato del ácido fólico. El componente glutamato del ácido fólico
adquiere una carga negativa doble en un pH fisiológico, por lo que
este compuesto y sus análogos tienen un sistema de transporte
activo guiado por energía para atravesar la membrana celular y
ejercen un efecto metabólico.
La GARFT es una enzima dependiente de folato que
actúa en la vía de biosíntesis de novo de purinas. Esta vía
es crítica para la división y proliferación celular. Se sabe que si
se anula esta vía se consigue un efecto antiproliferativo, en
particular, un efecto antitumoral. En consecuencia, se han
sintetizado varios análogos de folato y se ha estudiado su
capacidad para inhibir la GARFT. Se ha descrito que un prototipo de
inhibidor específico de la unión estricta de la GARFT, el ácido
5,10-dideazatetrahidrofólico, tiene una actividad
antitumoral. Véase F.M. Muggia, "Folate antimetabolites
inhibitor to de novo purine synthesis", New Drugs, Concepts
and Results in Cancer Chemotherapy, Kluwer Academic Publishers,
Boston (1992), 65-87.
Recientemente, se han revelado derivados
condensados del ácido glutámico heterocíclico útiles como agentes
antiproliferativos o inhibidores de la GARFT en la Solicitud
Internacional PCT/US94/00418, presentada por este solicitante el 18
de enero de 1994. La presente invención continúa avanzando en este
campo a través del desarrollo de nuevos agentes antiproliferativos
útiles e inhibidores de la GARFT.
En la patente
EP-A-0438261 se revelan derivados
bicíclicos del ácido glutámico útiles como agentes antitumorales,
inhibiendo una de las vías de biosíntesis en la que están
implicados el ácido fólico y los compuestos relacionados. La
estructura general de los compuestos reivindicados consiste en un
anillo A condensado sobre una pirimidina en la que el anillo A es
un anillo de 5 miembros. Preferiblemente el anillo A es un anillo
pirrol o pirrolina N-sustituido y el grupo divalente
de enlace B es un grupo cíclico o cadena divalente que podría ser
sustituido.
En la patente WO 86/05181 se revelan derivados
heterocíclicos
pirido[2,3-d]pirimidina que muestran
actividad antineoplásica. Los derivados bicíclicos tienen un grupo
metileno o metino en la posición 5 del anillo bicíclico. El grupo de
enlace aromático es un grupo 1,4-fenileno.
En la patente WO 94/13295 se revelan compuestos
monocíclicos 5-tia y
5-selenopirimidina que muestran inhibición de la
enzima GARFT y antiproliferación de las células de organismos
superiores y microorganismos. Los compuestos contienen un componente
de ácido glutámico y un azufre o selenio añadido en la posición 5 de
la estructura pirimidina.
En la patente
US-A-4123550 se revelan compuestos
endobicíclicos etilaminocarbonilo-tieniloxi útiles
como fármacos cardiovasculares en el tratamiento de la hipertensión
y otras alteraciones cardiacas en mamíferos.
Casarrubio y cols. (Journal of Heterocyclic
Chemistry, vol. 20, nº 6, 1983, pp. 1557-1560)
revelan análogos de tiofeno de los agentes betabloqueantes
adrenérgicos cardioselectivos practolol y "practolol
invertido".
La presente invención se refiere a los compuestos
que se definen a continuación. Estos compuestos son eficaces
inhibiendo la glicinamida ribonucleótido formil transferasa (GARFT)
y el crecimiento y proliferación de las células de organismos
superiores y microorganismos como bacterias, levaduras y hongos. La
invención también se refiere a los preparados farmacéuticos que
contienen estos compuestos o sus sales adecuadas y el uso de estos
compuestos como inhibidores de la enzima GARFT.
Como se ha indicado anteriormente, los compuestos
de la invención poseen actividad antiproliferativa, una propiedad
que se puede expresar en forma de actividad antitumoral. Un
compuesto de la invención puede ser activo per se, o como
precursor convertido in vivo a un compuesto activo. Los
compuestos preferidos de la invención son especialmente activos
inhibiendo la enzima GARFT. Particularmente preferidos son los
compuestos activos inhibiendo el crecimiento de la línea celular
L1210, una línea celular de leucemia de ratón que se puede cultivar
en un cultivo de tejidos. Los compuestos de la invención también
pueden ser activos inhibiendo el crecimiento de bacterias como las
bacterias gramnegativas Escherichia coli que pueden crecer en
cultivos.
Los compuestos de acuerdo con la invención, así
como sus sales farmacéuticamente aceptables, se pueden incorporar
en las formas posológicas adecuadas como cápsulas, comprimidos y
preparados inyectables. Asimismo, se pueden utilizar vehículos,
diluyentes o excipientes sólidos o líquidos farmacéuticamente
aceptables.
Los vehículos sólidos incluyen almidón, lactosa,
sulfato cálcico dihidrato, terra alba, sacarosa, talco, gelatina,
agar, pectina, acacia, estearato de magnesio y ácido esteárico. Los
vehículos líquidos incluyen jarabe, aceite de cacahuete, aceite de
oliva, solución salina y agua.
El vehículo o el diluyente puede incluir
cualquier material de liberación prolongada como el
glicerilmonoestearato o el glicerildiestearato, solos o con cera.
Cuando se usa un vehículo líquido, el preparado puede adoptar la
forma de un jarabe, un elixir, una emulsión, cápsulas de gelatina
blanda, líquido inyectable estéril (por ejemplo, en solución) o una
suspensión líquida acuosa o no acuosa.
Los preparados farmacéuticos se preparan
siguiendo las técnicas convencionales de la química farmacéutica
que incluyen pasos como mezclado, granulación y compresión cuando
es necesario para las formas en comprimidos, o mezclado, llenado y
disolución de los ingredientes según proceda para dar los productos
deseados para la administración oral, parenteral, tópica,
intravaginal, intranasal, intrabronquial, intraocular, intraaural o
rectal.
Los compuestos de la invención pueden también
comprender uno o más compuestos farmacéuticamente activos. Por
ejemplo, se puede incluir en el compuesto uno de los siguientes
agentes antitumorales: inhibidores de la mitosis (como, por ejemplo,
vinblastina); un agente alquilante; inhibidores de la dihidrofolato
reductasa o inhibidores de la TS; antimetabolitos (por ejemplo,
5-fluorouracilo, arabinósido de citosina);
antibióticos intercalantes (por ejemplo, adriamicina o bleomicina);
enzimas (por ejemplo, asparaginasa); inhibidores de la
topoisomerasa (por ejemplo, etoposido); y modificadores de la
respuesta biológica (por ejemplo, interferon). Los compuestos de la
invención pueden también incluir otro inhibidor de la GARFT o agente
antiproliferativo, como un compuesto que se describe en la
publicación Internacional Nº WO 94/13295 comúnmente asignada,
publicada el 23 de junio de 1994, o en la publicación internacional
Nº WO 92/05153, publicada el 2 de abril de 1992. Los compuestos de
la invención también pueden incluir una o más sustancias
antibacterianas, antimicóticas, antiparasitarias, antivíricas,
antipsoriásicas o anticcodiales. Como ejemplo de agentes
antibacterianos se pueden mencionar sulfonamidas, como
sulfametoxazol, sulfadiazina, sulfameter y sulfadoxina; inhibidores
de la dihidrofólico reductasa, como trimetoprim, bromodiaprim y
trimetrexato; penicilinas; cefalosporinas; y los ácidos
carboxílicos quinolona y sus análogos fusionados isotiazolo.
Otro aspecto de la invención se refiere a un
método de tratamiento para inhibir el crecimiento o proliferación
de las células de organismos superiores o microorganismos, que
consiste en la administración a un huésped de una cantidad efectiva
o dosis de un compuesto de acuerdo con la presente invención. Los
compuestos de la invención son particularmente útiles en el
tratamiento de huéspedes mamíferos, como el hombre, y en el
tratamiento de los huéspedes aviares. Un proceso terapéutico
particularmente preferido consiste en la administración a un
huésped de una cantidad de un compuesto de acuerdo con la presente
invención que sea eficaz para inhibir la enzima GARFT.
Muchos de los compuestos antiproliferativos que
se describen en este documento y sus sales farmacéuticamente
aceptables se pueden emplear en el proceso terapéutico de la
invención. Los compuestos se pueden administrar en forma de un
preparado farmacéuticamente aceptable que incluya un diluyente o
vehículo según se ha descrito anteriormente.
Una dosis de un compuesto contiene al menos una
cantidad eficaz del compuesto activo y preferiblemente consiste en
una o más unidades posológicas farmacéuticas. Una "cantidad
eficaz" puede ser una cantidad suficiente para inhibir las vías
metabólicas del folato y derivar los efectos beneficiosos de las
mismas como, por ejemplo, a través de la administración de una o
más unidades posológicas farmacéuticas.
Por ejemplo, una dosis diaria para un huésped
vertebrado consiste en una cantidad de hasta un gramo del compuesto
activo por kilo de peso del huésped, preferiblemente medio gramo,
más preferiblemente 100 miligramos, y más preferiblemente aún,
aproximadamente 50 miligramos o menos por kilo de peso corporal del
huésped. La dosis seleccionada se puede administrar a un animal de
sangre caliente o mamífero, por ejemplo, un hombre que necesite
tratamiento mediado por la inhibición de las vías metabólicas del
folato, por cualquier método adecuado de administración de la dosis,
incluyendo: la vía tópica, por ejemplo, como pomada o crema; por
vía oral; por vía rectal, por ejemplo, en forma de supositorio; por
vía parenteral por inyección; o continuamente por infusión
intravaginal, intranasal, intrabronquial, intraaural o
intraocular.
Los compuestos de acuerdo con la invención
producen cualquiera o más de un efecto antiproliferativo, un efecto
antibacteriano, un efecto antiparasitario, un efecto antivírico, un
efecto antipsoriásico, un efecto antiprotozoario, un efecto
anticoccidial, un efecto antiinflamatorio, un efecto inmunosupresor
y un efecto antimicótico. Los compuestos son especialmente útiles
para producir un efecto antitumoral en un huésped vertebrado que
alberga un tumor.
\newpage
En particular, la presente invención se refiere a
compuestos antiproliferativos de la Fórmula siguiente:
en la
cual:
A es S;
X es CH_{2};
Y es S; y
R_{1} y R_{2} son independientemente
hidrógeno. La invención también se refiere a las sales
farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la presente
invención. La invención también se refiere a los productos
intermedios para la elaboración de tales compuestos.
Aunque los compuestos de la presente invención se
muestran en la forma 4-oxo y se denominan como
tales en toda esta descripción, el grupo oxo existe en equilibrio
tautomérico con el grupo correspondiente 4-hidroxi.
Por lo tanto, se entenderá que el término "los compuestos de la
presente invención" significa las formas estructuralmente
representadas como 4-oxo y sus formas tautoméricas
4-hidroxi. Por lo tanto, la invención también se
refiere a las sales farmacéuticamente aceptables de los tautómeros
4-hidroxi de los compuestos representados por la
presente invención.
Una realización de la presente invención se
refiere a un compuesto de la fórmula
En una realización preferida, la invención se
refiere a un compuesto según se ha definido anteriormente, que es
ópticamente activo. En una realización más preferida, el compuesto
según se ha definido anteriormente tiene la siguiente
estructura:
En otra realización preferida, el compuesto según
se ha definido anteriormente tiene la siguiente estructura:
Preferiblemente, X es CH_{2}, Y es
preferiblemente S. Preferiblemente, R_{1} y R_{2} se
seleccionan independientemente entre hidrógeno, más preferiblemente,
entre hidrógeno. Es particularmente preferido que A e Y sean cada
uno de ellos azufre y X sea CH_{2}.
Los compuestos de la presente invención son
útiles como inhibidores de la GARFT. Los compuestos de la presente
invención en los cuales R^{1} y R^{2} son cada uno de ellos
hidrógeno son agentes antitumorales o antiproliferativos
especialmente activos.
Las sales farmacéuticamente aceptables de la
invención incluyen, por ejemplo, sales de metales alcalinos, de
metales alcalinotérreos, otros metales no tóxicos y amoniaco o
sales sustituidas de amoniaco de los compuestos del ácido glutámico
de la invención. Como ejemplo de sales se pueden citar los
compuestos de sodio, potasio, litio, calcio, magnesio, piridinio y
sales sustituidas de piridinio del ácido libre.
Los compuestos de la invención se pueden preparar
de la forma siguiente. Un material de partida útil para preparar
los compuestos de la presente invención en los cuales X es CH_{2}
es un compuesto de la Fórmula II:
en la cual B, C e Y son los definidos
anteriormente en el compuesto de la presente invención; D es
C_{1}, Br o I; y R_{6} es un hidrógeno o un componente que
forma con el CO_{2} unido un grupo éster fácilmente hidrolizable.
Preferiblemente, D es bromo o iodo. Preferiblemente, R_{6} es
hidrógeno, C_{1}-C_{6} alquil, hidroxialquil,
alquilaril o arilalquil, más preferiblemente, hidrógeno o
C_{1}-C_{2}
alquil.
El compuesto de la Fórmula II se hace reaccionar
con un compuesto de la Fórmula III:
en la cual R_{3} es un grupo alquilo
C_{1}-C_{6} sustituido o no sustituido, o un
grupo sililo trisustituido. Preferiblemente, R_{3} es CR_{2}OH o
trimetilsilil.
La reacción de los compuestos de las Fórmulas II
y III se realiza en presencia de un catalizador metálico adecuado
de transición, preferiblemente paladio o níquel, una base auxiliar
no nucleófila, preferiblemente una amina sustituida, en un
disolvente en el que al menos uno de los reactantes es al menos
parcialmente soluble bajo las condiciones suficientes para obtener
un compuesto de la Fórmula IV:
en la cual B, C e Y son los definidos
anteriormente en el compuesto de la presente invención; R_{6} es
el definido anteriormente en la Fórmula II; y R_{3} es el
definido anteriormente en la Fórmula
III.
Cuando R_{3} es un grupo sililo trisustituido,
el grupo sililo se elimina preferiblemente con una base nucleófila,
como carbonato metanólico o etanólico potásico, o una sal fluoruro,
como fluoruro potásico, fluoruro de cesio o fluoruro de
tetrabutilamonio, en un disolvente en el que al menos uno de los
reactantes es al menos parcialmente soluble (como, por ejemplo,
metanol, dimetilformamida, etanol, dimetilacetamida,
dimetilsulfóxido o isopropanol) para dar un compuesto de la Fórmula
V:
en la cual B, C e Y son los definidos
anteriormente en el compuesto de la presente invención; y R_{6}
es el definido anteriormente en la Fórmula
II.
El compuesto de la Fórmula V se hace reaccionar
con un electrófilo, preferiblemente un glicinal
N-protegido, más preferiblemente
N-t-butoxicarbonilglicinal o
bis-N-t-butoxicarbonilglicinal,
bajo condiciones básicas usando una base no nucleófila,
preferiblemente bis-trimetilsililamida de litio,
bis-trimetilsililamida de potasio,
bis-trimetilsililamida de sodio o diisopropilamida
de litio, a una temperatura baja, preferiblemente entre -90ºC y
25ºC, en un disolvente adecuado en el que uno de los reactantes es
al menos parcialmente soluble, preferiblemente tetrahidrofurano,
dietil éter o dioxano, para dar un compuesto de la Fórmula VI:
en la cual B, C e Y son los definidos
anteriormente en el compuesto de la presente invención; R_{6} es
el definido anteriormente en la Fórmula II; y R_{4} y R_{5} son
cada uno de ellos independientemente hidrógeno o un grupo protector
de nitrógeno fácilmente extraíble. R_{4} y R_{5} son
preferiblemente hidrógeno, t-butoxicarbonil,
benciloxicarbonil o
bencil.
El compuesto de la Fórmula VI se reduce a
continuación, preferiblemente con gas hidrógeno en presencia de un
catalizador metálico adecuado, para obtener un compuesto de la
Fórmula VII:
en la cual B, C e Y son los definidos
anteriormente en el compuesto de la presente invención; R_{6} es
el definido anteriormente en la Fórmula II; y R_{4} y R_{5} son
los definidos anteriormente en la Fórmula
VI.
El compuesto de la Fórmula VII se hace reaccionar
a continuación con un agente acilante o sulfonilante,
preferiblemente cloruro metanosulfonil o cloruro
p-toluenosulfonil, en presencia de una base no
nucleófila, preferiblemente trietilamina o diisopropiletilamina, en
un disolvente adecuado en el que al menos uno de los reactantes es
al menos parcialmente soluble, para obtener un grupo hidroxi
activado. El grupo hidroxi activado se desplaza con un nucleófilo
adecuado, preferiblemente una sal tioácido, más preferiblemente
tioacetato potásico, para obtener un compuesto de la Fórmula
VIII:
en la cual A, B, C e Y son los definidos
anteriormente en el compuesto de la presente invención; R_{6} es
el definido anteriormente en la Fórmula II; R_{4} y R_{5} son
los definidos anteriormente en la Fórmula VI; y Ac es un grupo
acilo, preferiblemente
acetil.
Como alternativa, el compuesto de la Fórmula VII
se convierte en el compuesto de la Fórmula VIII en un procedimiento
químico usando trifenilfosfina, dietil o dimetil azadicarboxilato,
y un nucleófilo acídico, preferiblemente ácido tioacético, en un
disolvente adecuado.
El compuesto de la Fórmula VIII se trata con una
base nucleófila, preferiblemente carbonato potásico, carbonato
sódico, hidróxido sódico o hidróxido potásico, en un disolvente
alcohólico, preferiblemente metanol, etanol o isopropanol, en
presencia de un agente alquilante, preferiblemente dimetil o dietil
cloromalonato, para obtener un compuesto de la Fórmula IX:
en la cual A, B, C e Y son los definidos
anteriormente en el compuesto de la presente invención; R_{6} es
el definido anteriormente en la Fórmula II; y R_{4} y R_{5} son
los definidos anteriormente en la Fórmula
VI.
El compuesto de la Fórmula IX se trata bajo
condiciones adecuadas para eliminar uno o ambos grupos protectores
R_{4} y R_{5} para producir un compuesto de la Fórmula X:
en la cual A, B, C e Y son los definidos
anteriormente en el compuesto de la presente invención; y R_{6}
es el definido anteriormente en la Fórmula II. Donde
t-butoxicarbonil (t-BOC) es un grupo
protector, las condiciones de eliminación de este grupo son
preferiblemente tratamiento con ácido trifluoroacético seguido por
neutralización para producir el compuesto de la Fórmula
X.
El compuesto de la Fórmula X se hace reaccionar
con un agente alquilante, preferiblemente trimetil o trietil oxonio
tetrafluoroborato, en un disolvente adecuado, preferiblemente
diclorometano, para formar un éter lactimo intermedio. Este éter
lactimo intermedio se hace reaccionar con guanidina en un disolvente
alcohólico, preferiblemente metanol, etanol o isopropanol, para
formar un compuesto de la Fórmula XI:
en la cual A, B, C e Y son los definidos
anteriormente en el compuesto de la presente invención; y R_{6}
es el definido anteriormente en la Fórmula
II.
Como alternativa, el compuesto de la Fórmula X se
convierte en el compuesto de la Fórmula XI haciendo reaccionar el
compuesto de la Fórmula X con un agente tiolante, preferiblemente
P_{2}S_{5} o
2,4-bis(4-metoxifenil)-1,3-ditia-2,4-difosfetano-2,4-disulfuro,
para formar el intermedio tiolactam. A continuación, éste se puede
alquilar con un agente alquilante, preferiblemente yoduro de metilo
o trimetil o trietil oxonio tetrafluoroborato, y a continuación con
guanidina en un disolvente alcohólico, preferiblemente metanol,
etanol o isopropanol, para obtener el compuesto de la Fórmula
XI.
El compuesto de la Fórmula XI se hidroliza bajo
condiciones básicas para formar un compuesto de la Fórmula XII:
en la cual A, B, C e Y son los definidos
anteriormente en el compuesto de la presente invención. Donde
R_{6} es hidrógeno en el compuesto de la Fórmula XI, la reacción
de hidrolización no es necesaria, y el compuesto de la Fórmula XI se
acopla a un péptido según se describe más
adelante.
El compuesto de la Fórmula XII (o el compuesto de
la Fórmula XI donde R_{6} es hidrógeno), que se encuentra en
forma de ácido carboxílico libre, puede acoplarse al péptido, por
métodos bien conocidos por los expertos en la materia, con un ácido
glutámico diéster clorhídrico para formar un diéster de la Fórmula
XIII:
en la cual A, B, C e Y son los definidos
anteriormente en el compuesto de la presente invención; y R_{1} y
R_{2} son cada uno de ellos independientemente un componente que
forma con el CO_{2} unido un grupo éster fácilmente hidrolizable,
como un alquilo C_{1}-C_{6}, hidroxialquil,
alquilaril o
arilalquil.
Por último, el compuesto de la Fórmula XIII se
hidroliza al ácido glutámico libre del compuesto de la presente
invención (R_{1} y R_{2} son cada uno de ellos H).
Los compuestos de la invención contienen uno o
más centros quirales. La invención incluye mezclas racémicas y
mezclas de diastereómeros, así como compuestos ópticamente activos,
como los compuestos esencialmente libres de otros isómeros ópticos,
cuyos compuestos ópticamente activos pueden obtenerse por los
métodos conocidos por los expertos en la materia.
Una síntesis detallada de un compuesto preferido
de la presente invención se presenta en el siguiente ejemplo.
\newpage
El compuesto 2 (Nº de Reg. CAS
[62224-19-5]) se preparó según se
describe en S. Gronowitz, Ark. Kemi 8, 1955, 87, y S. O. Lawesson,
Ark. Kemi 11, 1957, 337.
A una solución agitada de 5 g (22,7 mmol) del
bromuro 3 se añadieron 160 mg (0,23 mmol) de cloruro de
tris-trifenilfosfina paladio (II) y 65 mg (0,34
mmol) de yoduro cuproso en 75 ml de dietilamina y 4,8 ml (34 mmol)
de trimetilsilil acetileno. La solución resultante se agitó a 25ºC.
Después de 18 horas, el disolvente se extrajo bajo presión
reducida, y el residuo crudo se disolvió en 300 ml de Et_{2}O
(dietil éter) y se extrajo con 100 ml de HCl 1 N y 100 ml de una
solución de bicarbonato saturada. La capa orgánica se secó
(Na_{2}SO_{4}) y el disolvente se extrajo bajo presión reducida.
El residuo crudo se sometió a una cromatografía rápida en silica
gel con Et_{2}O/hexanos al 5% para dar 4,4 g (con un rendimiento
del 81%) del producto protegido con silil como un sólido amarillo.
Este material se usó directamente en el paso siguiente.
A una solución de 4,4 g (18,5 mmol) del acetileno
protegido con silil anterior en 50 ml de dimetilformamida (DMF) se
añadió 3,3 g (35,2 mmol) de fluoruro potásico monohidrato. Después
de 15 minutos a 25ºC, la mezcla se vertió sobre 500 ml de Et_{2}O
y se extrajo cuatro veces con 100 ml de agua (4 x 100 ml H_{2}O).
La solución orgánica se secó (Na_{2}SO_{4}), y el disolvente se
extrajo bajo presión reducida. El residuo crudo se sometió a una
cromatografía rápida en silica gel con Et_{2}O/hexanos al 10% para
dar 2,65 g (con un rendimiento del 86%) del producto deseado 3 como
un sólido naranja. NMR (CDCl_{3}) \delta: 3,45 (s, 1H), 3,88
(s, 3H), 7,22 (d, 1H, J = 3,5 Hz), 7,65 (d, 1H, J = 3,5 Hz). Anal.
Calc. para C_{8}H_{6}SO_{2}: C, 57,81; H, 3,64; S, 19,29.
Encontrado: C, 57,91; H, 3,71; S, 19,18.
También se usó un método alternativo para la
extracción del grupo sililo de la forma siguiente. A una suspensión
agitada de 3,7 g (0,02 mol) de K_{2}CO_{3} anhidro en 700 ml de
metanol se añadió 59,7 g del silil-acetileno
preparado anteriormente como un producto sólido. La suspensión se
agitó durante 2 horas a 35 C, y a continuación el metanol se
evaporó. El residuo se añadió a 50 ml de agua y se extrajo con 3 x
150 ml de Et_{2}O, y las fracciones orgánicas combinadas se
secaron (Na_{2}SO_{4}) y se evaporaron. El residuo crudo se
cromatografió en silica gel rápido usando Et_{2}O/hexanos al 7%
para dar el producto deseado 3 con un rendimiento del 98% (38,72
g).
A una solución agitada de 2 g (12,4 mmol) de
N-(t-butoxicarbonil)-2-hidroxi-etilamina
(obtenido de Sigma Chemicals) en 80 ml de CH_{2}Cl_{2} a -78ºC
se añadió 1,3 ml (18,6 mmol) de dimetil sulfóxido (DMSO) y 1,2 ml
(13,7 mmol) de cloruro de oxalilo. Después de 5 minutos se
añadieron 5,4 ml (38,4 mmol) de trietilamina y la solución se dejó
calentar hasta 25ºC. La mezcla se vertió sobre 200 ml de Et_{2}O y
se extrajo con 100 ml de agua, 100 ml de HCl 0,5 N y 100 ml de una
solución de bicarbonato saturada. La fracción orgánica se secó
(Na_{2}SO_{4}), y el disolvente se extrajo bajo presión
reducida. El aldehído crudo se disolvió en 100 ml de benceno, y el
disolvente se extrajo de nuevo bajo presión reducida. Este material
crudo, que se encontró que era inestable, se usó inmediatamente en
el paso siguiente.
A una solución de 1,7 g (10,2 mmol) de acetileno
3 en 10 ml de tetrahidrofurano (THF) seco a -78ºC se añadió 14,3 ml
(14,0 mmol) de una solución 1 M de
bis-trimetilsilil amida de litio en THF. Después de
10 minutos, el aldehído crudo 4 obtenido anteriormente se añadió
gota a gota en 5 ml de THF seco. La solución se agitó a -78ºC
durante 10 minutos y se dejó calentar hasta 0ºC en un periodo de
veinte minutos. A la mezcla se añadió 5 ml de una solución acuosa
saturada de cloruro amónico. La mezcla se vertió sobre 200 ml de
Et_{2}O y se lavó con 100 ml de H_{2}O y a continuación 50 ml
de una solución saturada de NaCl. La capa orgánica se secó
(Na_{2}SO_{4}) y el disolvente se extrajo bajo presión
reducida. El residuo crudo se sometió a una cromatografía rápida en
silica gel con EtOAc/hexanos al 10-40% para dar 0,96
g (29%) del alcohol deseado 5 como un aceite ligeramente amarillo.
NMR (CDCl_{3}) \delta: 1,46 (s, 9H), 3,38 y 3,58 (AB, 2H, J =
3, 7 Hz), 3,88 (s, 3H), 4,71 (dt, 1H, J = 2,9, 5,2 Hz), 5,05 (brs,
1H), 7,15 (d, 1H, J = 3,9 Hz), 7,64 (d, 1H, J = 3,9 Hz). IR
(limpia): 2978,3, 1729,5, 1685, 1523, 1452, 1368, 1286, 1167, 1098,
959, 822, 750,4 cm^{-1}. Espectroscopia de masas de alta
resolución, Calc. para C_{15}H_{19}NO_{5}S: M^{+}Cs^{+},
458,0038. Encontrado: 458,0051.
A una solución agitada de 940 mg (2,89 mmol) del
acetileno 5 anterior en 50 ml de acetato de etilo (EtOAc) se añadió
320 mg de Pd/C al 5%. La mezcla se colocó bajo 40 psi de H_{2}
gas y se agitó a 25ºC durante 17 horas. La mezcla se filtró a través
de Celite (tierra de diatomeas) y el disolvente se extrajo bajo
presión reducida. El residuo crudo se sometió a una cromatografía
rápida en silica gel con EtOAc/CH_{2}Cl_{2} al 20% para dar 800
mg (con un rendimiento del 84%) del alcohol deseado como un aceite
amarillo. NMR (CDCl_{3}) \delta: 1,44 (s, 9H), 1,81 (m, 2H),
2,28 (brs, 1H), 2,99 (m, 2H), 3,10 y 3,29 (AB, 2H, J = 3, 6,9 Hz),
3,74 (m, 1H), 3,86 (s, 3H), 4,89 (brs, 1H), 6,82 (d, 1H, J = 3,7
Hz), 7,63 (d, 1H, J = 3,7 Hz). Anal. Calc. para
C_{15}H_{23}NO_{5}S: C, 54,69; H, 7,04; N, 4,25; S, 9,73.
Encontrado: C, 54,79; H, 7,02; N, 4,29; S, 9,63.
Un método alternativo para la preparación del
alcohol 6 usa bis-t- butoxicarbonil alilamina 14 de
la siguiente forma.
A una solución de 57,10 g (1,0 mol) de alilamina
y 1,2 g (0,01 mol) de dimetilaminopiridina (DMAP) en 500 ml de
acetonitrilo se añadió una solución de 220 g (1 mol) de
(t-BOC)_{2}O en 100 ml de acetonitrilo, y
la mezcla resultante se agitó durante 6 horas. La mezcla de
reacción se diluyó con tolueno (100 ml) y los disolventes se
evaporaron bajo presión reducida a 60ºC. El aceite resultante se
redisolvió en acetonitrilo (400 ml) y se añadió otro 1,2 g (0,01
mol) de DMAP, y a esta solución se añadieron lentamente 220 g (1
mol) de (t-BOC)_{2}O en 100 ml de
acetonitrilo. La mezcla de reacción se agitó durante 12 horas a
60ºC, el disolvente se evaporó bajo presión reducida a 60ºC, y se
añadió NaHCO_{3} diluido (100 ml). Se extrajo con 3 x 150 ml de
CH_{2}Cl_{2}, y las capas orgánicas combinadas se lavaron con
solución salina concentrada, se secaron (Na_{2}SO_{4}) y se
evaporaron. El residuo crudo se purificó mediante cromatografía en
silica gel rápido eluyendo con un gradiente de EtOAc/hexanos al
5-20% para dar 156,9 g (con un rendimiento del 63%)
del producto deseado 14 como un sólido cristalino transparente (p.f.
43-44ºC). ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta (ppm):
1,5 (s, 18H), 4,18 (dd, 2H, J = 15 Hz, J = 1 Hz), 5,14 (ddd, 2H, J
= 15 Hz, J = 10 Hz, J = 1 Hz), 5,85 (ddt, 2H, J = 10 Hz, J = 5 Hz,
J = 1 Hz). IR (KBr): 2978, 2935, 2860, 1724, 1689, 1342, 1130
cm^{-1}. Anal. Calc. para C_{13}H_{23}NO_{4}: C, 60,68; H,
9,01; N, 5,44. Encontrado: C, 60,78; H, 9,04; N, 5,50.
Una solución de 0,60 g (2,34 mmol) de
bis-t-butoxicarbonil alilamina 14 en
20 ml de CH_{2}Cl_{2} se ozonizó (40 voltios, 500 amperios, 1,0
1/min de O_{2} a 3 psi) a -78ºC hasta que persistió un color
azul, se añadieron 10 ml de dimetil sulfuro, y esta mezcla se agitó
durante 14 horas a 25ºC. La mezcla se añadió a solución salina
concentrada diluida y se extrajo con CH_{2}Cl_{2} (3 x 50 ml),
y las fracciones orgánicas se secaron (Na_{2}SO_{4}) y se
evaporaron. Se cromatografió en silica gel rápido con un rendimiento
de 603 mg (con un rendimiento del 99%) del producto deseado 15 como
un sólido cristalino transparente (p.f. 37-39ºC).
^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta (ppm) : 1,50 (s, 18H), 4,38 (s,
2H), 9,55 (s, 1H). IR (KBr): 2984, 2935, 2724, 1792, 1734, 1699,
1362, 1153 cm^{-1}. Anal. Calc. para C_{12}H_{21}NO_{5}: C,
55,58; H, 8,16; N, 5,40. Encontrado: C, 55,20; H, 8,19; N, 5,19.
A una solución de 9,64 g (59 mmol) de
5-etinil-2 carbometoxi tiofeno 3 en
THF (250 ml) a -78ºC se añadió 65,6 ml (60 mmol, 0,9 M) de hexametil
disilazida de litio (LiHMDS), y la mezcla se agitó durante 2 horas
a -78ºC. Se canuló una solución de 15,6 g (60 mmol) de
1-(bis-t-butoxixcarbonilamino)-2-etanal
15 en THF (40 ml) dentro de la mezcla de reacción, y la mezcla se
agitó durante 8 horas a -78ºC. Se añadió una solución de 3,4 ml (60
mmol) de ácido acético en metanol (10 ml) como neutralizador, la
mezcla se agitó durante 10 minutos calentando hasta 0ºC, y se añadió
agua (60 ml). Se extrajo con EtOAc (3 x 100 ml), y los extractos
orgánicos se lavaron con NaHCO_{3} diluido y se secaron
(Na_{2}SO_{4}). El disolvente se extrajo bajo presión reducida
hasta aproximadamente 50 ml. Al residuo resultante se añadió EtOAc
(125 ml), y esta solución se añadió a un frasco de Parr que
contenía 7,38 g (30% en peso de la materia prima acetileno) de Pd al
5% en carbono y se hidrogenó a 55 psi de H_{2} durante 24 horas.
El material de hidrogenación crudo se filtró a través de Celite, y
la pasta del filtro se lavó con metanol (100 ml) y EtOAc (100 ml).
El disolvente se evaporó bajo presión reducida, el residuo crudo se
filtró a través de silica eluyendo con EtOAc en hexanos al 50%, y
el disolvente se evaporó. El residuo se disolvió en 20 ml de
metanol (MeOH) azeotropado con benceno (50 ml), y redisuelto en MeOH
seco (20 ml). Esta mezcla se añadió a una solución recién preparada
de 60 ml (2 M) de metóxido sódico en metanol. La mezcla de reacción
se agitó durante 45 minutos, se añadió HCl diluido (0,1 M, 50 ml) y
esta mezcla se extrajo con EtOAc (3 x 75 ml). Las fracciones
orgánicas se combinaron y se lavaron con tampón de pH 7 (1 M), se
secaron (Na_{2}SO_{4}) y se evaporaron. El residuo crudo se
cromatografió en silica rápido eluyendo con EtOAc/hexanos al 40%
para dar 9,32 g (con un rendimiento del 48%) del producto deseado
6.
A una solución agitada de 9,26 g (28,1 mmol) del
alcohol 6 en 100 ml de THF a 0ºC se añadió 5,9 ml (42 mmol) de
trietilamina (TEA) y 2,4 ml (31 mmol) de metanosulfonil cloruro.
Después de 20 minutos, se añadieron 100 ml de DMF y 12,8 g (110
mmol) de tioacetato potásico, y la solución resultante se dejó
calentar hasta 25ºC. Después de tres días, la mezcla se vertió
sobre 500 ml de agua y se extrajo con 800 ml de Et_{2}O. La capa
orgánica se lavó con 200 ml de agua, 200 ml de HCl 1 N, 200 ml de
una solución de bicarbonato saturada, y 100 ml de una solución
saturada de NaCl. La capa orgánica se secó (MgSO_{4}) y el
disolvente se extrajo bajo presión reducida. El residuo crudo se
sometió a una cromatografía rápida en silica gel con EtOAc/hexanos
al 25% para dar 10,3 g (con un rendimiento del 95%) del tioacetato
deseado 7 como un aceite amarillo. NMR (CDCl_{3}) \delta: 1,44
(s, 9H), 1,91 y 2,04 (ABm, 2H), 2,37 (s, 3H), 2,96 (m, 2H), 3,36
(m, 2H), 3,61 (m, 1H), 3,86 (s, 3H), 4,74 (brs, 1H), 6,79 (d, 1H, J
= 3,6 Hz), 7,62 (d, 1H, J = 3,6 Hz). IR (limpia): 3366, 2976,4,
1713, 1520, 1462,1, 1366, 1290,5, 1267,3, 1169, 1098, 752, 631
cm^{-1}. Espectroscopia de masas de alta resolución, Calc. para
C_{17}H_{25}NO_{5}S_{2}: M^{+}Cs^{+}, 520,0229.
Encontrado: 520,0240.
A una solución agitada de 10,2 g (26 mmol) del
tioacetato 7 anterior en 200 ml de metanol seco a 0ºC se añadió 7,2
g (52 mmol) de K_{2}CO_{3} y 3,7 ml (29 mmol) de dimetil
cloromalonato. Después de tres horas, la mezcla se vertió sobre 500
ml de agua y se extrajo con Et_{2}O (3 x 500 ml). Las capas
orgánicas combinadas se lavaron con 500 ml de agua y a continuación
con 200 ml de solución saturada de NaCl, y se secaron (MgSO_{4}).
El disolvente se extrajo bajo presión reducida y el residuo crudo se
sometió a una cromatografía rápida en silica gel con EtOAc/hexanos
al 30% para dar 11,46 g (con un rendimiento del 93%) del tioéter 8
deseado como un aceite ligeramente amarillo. NMR (CDCl_{3})
\delta: 1,44 (s, 9H), 1,85 y 2,00 (ABm, 2H), 3,03 (m, 3H), 3,30
(m, 2H), 3,80 (s, 6H), 3,86 (s, 3H), 5,10 (brs, 1H), 6,82 (d, 1H, J
= 3,8 Hz), 7,63 (d, 1H, J = 3,8 Hz). IR (limpia): 3442, 2974,
2955, 1734, 1713, 1512, 1460, 1435, 1366, 1291, 1267, 1167, 1098,
1022, 752 cm^{-1}. Espectroscopia de masas de alta resolución,
Calc. para C_{20}H_{29}NO_{8}S_{2}: M^{+}Cs^{+},
608,0389. Encontrado: 608,0370.
A una solución agitada de 470 mg (0,99 mmol) del
tioéter 8 anterior en 12 ml de CH_{2}Cl_{2} a 0ºC se añadió 4
ml de ácido trifluoroacético (TFA). Después de 1,5 horas, la mezcla
se vertió sobre 50 ml de una solución de bicarbonato saturada y se
extrajo con CH_{2}Cl_{2} (4 x 100 ml). El disolvente se extrajo
bajo presión reducida y el residuo crudo se disolvió en 10 ml de
metanol. Después de agitar a 25ºC durante 1,5 horas, el disolvente
se extrajo bajo presión reducida y el residuo crudo se sometió a una
cromatografía rápida en silica gel con EtOAc/CH_{2}Cl_{2} al
40% para dar 298 mg (con un rendimiento del 88%) del lactam
deseado 9 como un aceite incoloro. NMR (CDCl_{3}) \delta: 1,94
(m, 2H), 3,01 (m, 2H), 3,4-3,7 (m, 4H), 3,80 y 3,82
(s, 3H), 3,87 (s, 3H), 6,25 (brs, 1H), 6,83 (d, 1H, J = 3,7 Hz),
7,64 (d, 1H, J = 3,7 Hz). IR (KBr): 2951, 1732, 1669, 1462, 1294,
1267, 1194, 1157, 1098, 1005, 752 cm^{-1}. Anal. Calc. para
C_{14}H_{17}NO_{5}S_{2}: C, 48,96; H, 4,99; N, 4,08; S,
18,67. Encontrado: C, 49,06; H, 4,93; N, 4,09; S, 18,60.
A una solución agitada de 1,9 g (5,5 mmol) del
lactam 9 anterior en 150 ml de CH_{2}Cl_{2} seco se añadió, de
una vez, 1,06 g (7,2 mmol) de trimetiloxonio tetrafluoroborato. La
solución se agitó durante 6 horas a 25ºC. La mezcla resultante se
vertió sobre 50 ml de K_{2}CO_{3} acuoso al 10% y se extrajo
con CH_{2}Cl_{2} (3 x 200 ml). Las capas orgánicas combinadas
se secaron (MgSO4) y el disolvente se extrajo bajo presión reducida.
El material resultante se usó directamente en el paso
siguiente.
En un matraz diferente se colocó 1,58 g (16,6
mmol) de clorhidrato de guanidina seco. A ello se añadió 600 ml de
metanol seco. Se hicieron pasar burbujas de argón seco a través de
la solución durante 10 minutos, después de lo cual se añadió 926 mg
(17,1 mmol) de metóxido sódico seco. A la mezcla resultante se
añadió mediante una cánula el éter lactim crudo preparado
anteriormente en 20 ml de MeOH. La solución se sometió a reflujo
bajo una atmósfera de argón durante 20 horas. El pH se ajustó a 4
con HCl 1 N, y el disolvente se extrajo bajo presión reducida. El
residuo crudo se disolvió en 500 ml de CHCl_{3} y se lavó con 2 x
100 ml de agua. La capa orgánica se secó (MgSO_{4}), y el
disolvente se extrajo bajo presión reducida. El residuo crudo se
sometió a una cromatografía rápida en silica gel con
MeOH/CH_{2}Cl_{2} al 5-10% para dar 413 mg de un
sólido casi blanco. Este material se disolvió a continuación en 25
ml de MeOH caliente y se enfrió lentamente a 4ºC en un periodo de
18 horas. El sólido se recogió por filtración para dar 180 mg (con
un rendimiento del 9%) de la pirimidinona 10 deseada como un sólido
ligeramente amarillo. NMR (d_{6}-DMSO) \delta:
1,72 (m, 1H), 1,88 (m, 1H), 2,8-3,22 (m, 4H), 3,50
(dt, 1H, J = 2, 8 Hz), 5,99 (brs, 2H), 6,64 (brs, 1H), 6,98 (d, 1H,
J = 3,8 Hz), 7,62 (d, 1H, J = 3,8 Hz), 10,02 (brs, 1H).
Espectroscopia de masas de alta resolución, Calc. para
C_{14}H_{16}N_{4}O_{3}S_{2}: M^{+}Na^{+}, 375,0562.
Encontrado: 375,0550.
También se usó un procedimiento alternativo para
la preparación de pirimidinona 10 de la siguiente forma. A una
solución agitada de 500 mg (1,46 mmol) del lactam 9 en 20 ml de THF
seco se añadió 648 mg (1,60 mmol) de reactivo de Lawesson
(2,4-bis(4-metoxifenil)
-1,3-ditia-2,4-difosfetano-
2,4-disulfuro). Después la mezcla se agitó a 25ºC
durante 20 horas, se vertió sobre 50 ml de una solución de
bicarbonato saturada y se extrajo con 2 x 200 ml de EtOAc. Las
capas orgánicas combinadas se lavaron con 50 ml de solución
saturada de NaCl y se secaron (MgSO_{4}), y el disolvente se
extrajo bajo presión reducida. El tiolactam crudo se sometió a una
cromatografía rápida en silica gel con EtOAc/CH_{2}Cl_{2} al 8%
para dar 525 mg del correspondiente tiolactam 11:
Este material se usó inmediatamente en el paso
siguiente.
A 525 mg del tiolactam 11 en una mezcla de 10 ml
de THF seco y 10 ml de metanol seco se añadió 1,6 ml de NaOH 1 N. A
esta mezcla se añadió 0,1 ml (1,6 mmol) de yoduro de metilo para
producir un tiolactam metilado que se usó según se describe más
adelante sin purificación. En un matraz diferente se colocó 1,39 g
(14,6 mmol) de clorhidrato de guanidina seco. A esta mezcla se
añadió 300 ml de metanol seco. Se hicieron pasar burbujas de argón
seco a través de la solución durante 10 minutos, después de lo cual
se añadió 796 mg (14,7 mmol) de metóxido sódico seco. A la mezcla
resultante se añadió mediante una cánula el tiolactam metilado
crudo preparado anteriormente. La solución se sometió a reflujo
bajo atmósfera de argón durante 48 horas. El pH se ajustó a 4 con
HCl 1 N y el disolvente se extrajo bajo presión reducida. El residuo
crudo se disolvió en 500 ml de CHCl_{3} y se lavó con 2 x 100 ml
de agua. La capa orgánica se secó (MgSO_{4}) y el disolvente se
extrajo bajo presión reducida. El residuo crudo se sometió a una
cromatografía rápida en silica gel con MeOH/CH_{2}Cl_{2} al
5-10%. El material se disolvió a continuación en 20
ml de MeOH caliente y se enfrió lentamente a 4ºC en un periodo de
18 horas. El producto sólido se recogió por filtración para dar 131
mg (con un rendimiento del 9%) de la pirimidinona deseada 10.
\newpage
A 180 mg (0,51 mmol) de la pirimidinona 10 se
añadió 5 ml de NaOH 1 N en agua. La solución resultante se agitó a
25ºC durante 20 horas. Después de enfriar a 0ºC, el pH se ajustó
hasta 2 con HCl 1 N. El sólido marrón se filtró y se lavó con agua
y se secó bajo vacío para dar 111 mg (con un rendimiento del 64%)
del ácido deseado 12 como un sólido ligeramente marrón. NMR
(d_{6}-DMSO) \delta: 1,72 (m, 1H), 1,92 (m,
1H), 2,78-3,68 (m), 6,07 (brs, 2H), 6,68 (brs, 1H),
6,92 (d, 1H, J = 3,7 Hz), 7,52 (d, 1H, J = 3,7 Hz), 10,12 (brs,
1H), 12,89 (brs, 1H). Espectrometría de masas de alta resolución,
Calc. para C_{13}H_{l4}N_{4}O_{3}S_{2}: M^{+},
338,0507. Encontrado: 338,0517.
A una solución agitada de 110 mg (0,33 mmol) del
ácido 12 anterior en 5 ml de DMF seco se añadió 48 mg (0,36 mmol)
de 1-hidroxi-benzotriazol hidrato,
62 \mul (0,36 mmol) de diisopropiletilamina, 86 mg (0,36 mmol) de
clorhidrato del dietiléster del ácido glutámico y 106 mg (0,36
mmol) de metioduro de
1-(3-dimetilaminopropil)-3-
etilcarbodiimida. La solución resultante se agitó bajo una
atmósfera de argón a 25ºC durante 20 horas y a continuación se
vertió en 50 ml de agua. El agua se extrajo con 2 x 150 ml de
EtOAC. Las capas orgánicas combinadas se volvieron a extraer con 3 x
50 ml de agua y a continuación se añadió 10 ml de una solución
saturada de NaCl y se secaron (MgSO_{4}). El disolvente se
extrajo bajo presión reducida, y el residuo crudo se sometió a una
cromatografía rápida en silica gel con MeOH/CH_{2}Cl_{2} al
0-10% para dar 120 mg (con un rendimiento del 71%)
de la amida deseada 13 como un sólido amorfo ligeramente amarillo.
NMR (d_{6}-acetona) \delta: 1,20 (m, 6H), 2,2
(m, 1H), 2,46 (t, 1H, J = 7,6 Hz), 2,78 (s, 1H), 2,82 (s, 1H),
2,92-3,1 (m, 2H), 3,41 (m, 1H), 3,72 (dt, 1H, J =
3,0, 12,7 Hz), 4,02-4,2 (m, 4H), 4,58 (m, 1H), 5,90
(brs, 1H), 6,05 (brs, 1H), 6,90 (d, 1H, J = 3,8 Hz), 7,58 (d, 1H, J
= 3,8 Hz), 7,78 (d, 1H, J = 8 Hz). Espectroscopia de masas de alta
resolución, Calc. para C_{22}H_{29}N_{5}O_{6}S_{2}:
M^{+}H^{+}, 524,1638. Encontrado: 524,1650.
A 115 mg (0,22 mmol) del dietiléster 13 anterior
se añadió 3 ml de una solución de NaOH 1 N en agua. La mezcla
resultante se agitó a 25ºC durante 14 horas. Después de enfriar a
0ºC se ajustó el pH a 3,5 con HCl acuoso. El sólido se filtró, se
lavó con agua y se secó bajo vacío para dar 82 mg (con un
rendimiento del 80%) del ácido deseado como un sólido casi blanco.
NMR (d_{6}-DMSO) \delta :
1,62-2,02 (m, 4H), 2,27 (m, 2H),
2,78-3,00 (m, 3H), 4,27 (dd, 1H, J = 6, 6,8 Hz),
6,00 (brs, 2H), 6,63 (brs, 1H), 6,88 (d, 1H, J = 3,7 Hz), 7,63 (d,
1H, J = 3,7 Hz), 8,37 (d, 1H, J = 7,4 Hz), 10,05 (brs, 1H), 12,85
(brs, 2H). IR (KBr): 3371, 1700, 1643, 1543, 1345 cm^{-1}.
Espectroscopia de masas de alta resolución, Calc. para
C_{18}H_{21}N_{5}O_{6}S_{2}: M^{+}H^{+}, 468,1012.
Encontrado: 468,1025. Anal. Calc. para
C_{18}H_{21}N_{5}O_{6}S_{2}. 1,5 H_{2}O: C, 43,71; H,
4,89; N, 14,16; S, 12,97. Encontrado: C, 43,50; H, 4,67; N, 14,07;
S, 12,72.
El método de valoración de la transformilasa GAR
(GARFT) de Young y cols., Biochemistry 23 (1984),
3979-3986, se modificó y usó según se describe más
adelante. Las mezclas de reacción contenían el dominio catalítico de
la GARFT humana, 0-250 nM del compuesto 1, 20
\muM de glicinamida ribonucleótido (GAR), 10 ó 20 \muM de
N^{10} -formil-5,8-dideazafolato
(FDDF), 50 mM de HEPES-KOH, pH 7,5, y 50 mM de
KCl. La reacción se inició añadiendo la enzima a una concentración
final de 11 nM, seguida por la monitorización del incremento de la
absorbancia a 294 nm a 20ºC (e_{294} = 18,9 mM^{-1}
cm^{-1}).
La constante de inhibición (Ki) de la GARFT se
determinó a partir de la dependencia de la cinética catalítica de
equilibrio sobre la concentración del inhibidor y del sustrato. Se
determinó que el tipo de inhibición observado era competitivo con
respecto al FDDF por la dependencia de la Ki aparente (Ki,app) sobre
la concentración de FDDF y se demostró que se describe por una
Ki,app = Ki + (Ki/Km)[FDDF]. La constante de Michaelis para FDDF,
Km, se determinó independientemente según la dependencia de la
cinética catalítica sobre la concentración de FDDF. Los datos de las
determinaciones de Km y Ki se ajustaron con métodos no lineales a
la ecuación de Michaelis, o a la ecuación de Michaelis para
inhibición competitiva, según proceda. Se analizaron los datos
resultantes de la inhibición de la unión estricta y se determinó su
Ki ajustando los datos a la ecuación de unión estricta de
Morrison, Biochem Biophis Acta 185 (1969), 269-286,
por métodos no lineales.
Las líneas celulares usadas y su origen se
presentan tabuladas en la Tabla 1. Las condiciones de crecimiento y
los requerimientos del medio de cada línea celular se resumen en la
Tabla 2. Todos los cultivos se mantuvieron a 37ºC, con
aire-CO_{2} al 5% en una incubadora con
humidificador.
Las soluciones madre de los inhibidores se
prepararon en bicarbonato sódico 10 mM en agua y se almacenaron en
alícuotas de 1 ml a -20ºC para los experimentos de cultivo celular.
La inhibición del crecimiento celular se midió con una modificación
del método de Mosmann, J. Immunol. Methods 65 (1983),
55-63.
Las células en la fase de crecimiento medio de
cada línea celular se diluyeron hasta 18.500 células/ml en medio de
crecimiento RPMI fresco (Mediatech, Washington, DC) suplementado
con suero fetal bovino dializado (Hyclone Laboratories Inc., Logan,
UT) y a continuación se distribuyeron por alícuotas en las columnas
2 a 12 de placas de microvaloración de 96 pocillos. La columna 1 se
llenó con el mismo volumen (135 ml) de medio fresco sin células
para usarlo como blanco. Las placas se colocaron a continuación en
una incubadora a 37ºC, aire-CO_{2} al 5%. Después
de 1 a 4 horas se extrajeron las placas de la incubadora y a
continuación se añadió el compuesto 1 a 10 x la concentración
final, 15 ml/pocillo en diluciones binarias en las columnas 12 a 4.
Para los experimentos de reversión se incluyó hipoxantina (1,75 mM)
o AICA (1,75 mM) en todas las soluciones de fármacos (concentración
final de 175 mM). Los pocillos que contenían cada concentración del
compuesto 1 se prepararon por cuadruplicado en cada placa. Se
añadieron 15 ml de medio sin el compuesto 1 a los pocillos de la
columna 1 de las placas. Las células se devolvieron a continuación
a la incubadora y se mantuvieron sin molestarlas durante el periodo
completo de incubación. En el día 3 para las células L1210 y
L1210/CI920, o en el día 5 para las células
CCRF-CEM, se añadió a cada pocillo de todas las
placas 50 ml de MTT (bromuro de (4,5
dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil
tetrazolio; Nº de catálogo Sigma M2128) 0,8 mg/ml disuelto en medio
de cultivo de tejido, después de lo que las células se devolvieron
a la incubadora. Después de 4 horas se extrajeron todas las placas
de la incubadora y se centrifugaron a 1200 rpm durante 7 minutos. El
medio se extrajo por sifón y se añadió 150 ml de DMSO a cada
pocillo de todas las placas. A continuación se mezclaron las placas
a velocidad lenta en un agitador de tipo vortex durante una hora
en la oscuridad a temperatura ambiente. El grado de metabolización
del MTT se midió espectrofotométricamente a 540 nm en un lector
cinético de microplacas Molecular Devices V_{max}™. La
concentración de fármaco requerida para reducir el crecimiento
celular en un 50% medido por el metabolismo del MTT se determinó por
interpolación de la D.O. (menos el blanco) inmediatamente superior
e inferior al 50% de la D.O. del control (menos el blanco).
| Tejido de origen y fuente de las líneas celulares | ||
| utilizadas en los estudios in vitro | ||
| Línea celular | Fuente | Origen |
| L1210 | ATCC* | Ratón, leucemia linfocítica |
| CCRF-CEM | ATCC* | Humano, leucemia linfoblástica |
| aguda | ||
| * ATCC = American Type Culture collection |
| Condiciones de cultivo, densidades en la placa | ||||
| y tiempos de incubación usados en las microvaloraciones | ||||
| Densidad en la | ||||
| DFCS | placa | Tiempo de | ||
| Línea celular | Medio | Conc.* (%) | (células/ pocillo) | incubación (días) |
| L1210 | RPMI-1640 | 5 | 2500 | 3 |
| CCRF-CEM | RPMI-1640 | 10 | 2500 | 5 |
| * DFCS Conc. = concentración de suero fetal bovino dializado. |
| Datos para el compuesto 1 | |||
| Inhibición del crecimiento usando la exposición continua (72 horas) | |||
| CI_{50} del cultivo | CI_{50} del cultivo celular | ||
| Compuesto | Ki de GARFT (nM) | celular L1210 (nM)ª | CCRF-CEM (nM)ª |
| 1 | 4,5 | 16 | 4,3 |
| ª: CI_{50} media \pm desviación estándar. |
En el día cero se implantaron por vía subcutánea
fragmentos con trocar de 2 mm^{2} de linfosarcoma 6C3HED en la
región axilar en grupos de seis ratones hembra C3H/He. Comenzando
en el día 1, el compuesto en estudio se administró por vía
intraperitoneal en encapsina al 40% una vez al día durante nueve
días. Los animales control recibieron idéntico tratamiento sin el
compuesto en estudio. La inhibición porcentual dada en la Tabla 4
siguiente se calculó comparando la masa de los tumores de los
controles (que recibieron sólo el diluyente) en el día 11 con la de
los animales que recibieron el compuesto en estudio.
| Compuesto | Dosis (mg/kg) | % inhibición | Supervivientes |
| 1 | 12,5 | 100 | 6/6 |
| 1 | 25 | 100 | 3/6 |
| 1 | 50 | Tóxico | 0/6 |
En el día cero se implantaron por vía subcutánea
fragmentos con trocar de 2 mm^{2} de adenocarcinoma de mama
C3H/BA en la región axilar en grupos de seis ratones hembra C3H/He.
Comenzando en el día 1, el compuesto en estudio se administró por
vía intraperitoneal en encapsina al 40% una vez al día durante nueve
días. Los animales control recibieron idéntico tratamiento sin el
compuesto en estudio. La inhibición porcentual se calculó
comparando la masa de los tumores de los controles (que recibieron
sólo el diluyente) en el día 14 con la de los animales que
recibieron el compuesto en estudio. Los resultados se resumen en la
Tabla 5.
| Compuesto | Dosis (mg/kg) | % inhibición | Supervivientes |
| 1 | 5 | 16 | 5/6 |
| 1 | 10 | 84 | 6/6 |
| 1 | 20 | 100 | 3/6 |
Será evidente para los expertos en la materia que
se pueden hacer varias modificaciones y variaciones en los procesos
y productos de la presente invención.
Cuando sea posible, por cuestiones meramente
químicas, los grupos químicos citados en el presente documento se
pueden sustituir. En algunos casos, esta posibilidad es explícita
cuando se habla, como, por ejemplo, de un grupo alquilo
C_{1}-C_{3} sustituido o no sustituido.
Cuando se mencionen más de un grupo R_{6} en
cualquier Fórmula del presente documento, cada R_{6} se puede
seleccionar independientemente entre las posibilidades que se
indican.
Claims (5)
1. Un compuesto de la fórmula:
2. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación
1 que es ópticamente activo.
3. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación
2 que tiene la siguiente estructura:
4. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación
2 que tiene la siguiente estructura:
5.Una composición farmacéuticamente que
comprende:
- (I)
- Un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;
- (II)
- Un portador, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.
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