FI112658B - Menetelmä uusien kardioprotektiivisten hydroksibentsopyraani-2-karboksyylihappojohdannaisten ja niiden laktonien valmistamiseksi - Google Patents

Description

112658

Menetelmä uusien kardioprotektiivisten hydroksibentsopyraa-ni-2-karboksyylihappojohdannaisten ja niiden laktonien valmistamiseksi 5 Tämä keksintö liittyy tiettyihin 3,4-dihydro- 2,5,7,8-tetra-alkyyli-2H-l-bentsopyraani-2-karboksyylihapon hydroksijohdannaisiin ja näiden laktoneihin, näiden valmistuksessa käyttökelpoisiin menetelmiin ja välituotteisiin sekä niiden käyttöön vapaan radikaalin sieppaajina 10 vapaiden happiradikaalien aiheuttaman kudostuhon hoidossa.

Erityisesti tämä keksintö koskee kaavojen (IA) ja (IB) mukaisia yhdisteitä f1 ?*5

15 I

RrL:V^^-^~(CH2)"c(0)R4 T ch3

IA

20 ; I C=o

~(CHJ

25 ch3

: IB

*.· * niiden yksittäisiä isomeerejä ja niiden seoksia ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja, joissa 30 R on H tai Ci-4-alkyyli, O"; Ri on Ci-4-alkyyli, R2 on H tai C(0)R3, ''· ’ R3 on H tai Ci-9-alkyyli, R4 on OR tai N(R)2, ’ : 35 R5 on H, -C(0)R tai Ci-4-alkyyli, ja ; n on nolla tai yksi.

112658 2 Tässä käytettynä termi alkyyli käsittää suora- ja haaraketjuiset radikaalit, joissa on edellä esitetty määrä hiiliatomeita, edullisesti metyylin ja etyylin. C(0)R3-osa käsittää formyylin ja suora- ja haaraketjuiset alkyylikar-5 bonyyliosat, edullisesti formyylin, metyylikarbonyylin tai etyylikarbonyylin. Tapauksessa, jossa R4 muodostaa amidin, on edullista, että molemmat alkyyliryhmät ovat samoja, ja että alkyyliradikaalit ovat metyyli tai etyyli sekä mono-että dialkyloidussa amidoasemassa. Kun muuttujia kuten R 10 käytetään rakenteen määrittelyssä useammin kuin kerran, se tarkoittaa, että jokaisessa tapauksessa muuttuja voi kuvata eri osaa.

Tämän keksinnön mukaiset yhdisteet käsittävät ste-reoisomeerejä; termi "stereoisomeeri" on yleinen nimitys 15 kaikille yksittäisen molekyylin isomeereille, jotka eroavat toisistaan vain niiden atomien avaruudellisen orientaation suhteen. Se käsittää peilikuvaisomeerit (enantio-isomeerit), geometriset isomeerit (cis/trans-isomeerit) ja enemmän kuin yhden kiraalisen keskuksen omaavien yhdistei-20 den isomeerit, jotka eivät ole peilikuvia toisilleen (diastereoisomeerit).

Yleisesti rakennekaavojen IA ja IB mukaisia yhdis-teitä (yhdessä nimetty rakennekaavojen 1 mukaisiksi yhdis-• | teiksi) voidaan valmistaa, eristää ja muuttaa halutuiksi ; ; ; 25 suoloiksi kemiallisilla menetelmillä, jatkokäsittely- ja ·· kiteyttämistekniikoilla analogisesti tekniikan tason mu kaisten menetelmien kanssa. Lähtöaineet ovat sopivasti joko tunnettuja tai niitä voidaan valmistaa vakiomenetel-millä.

30 Kaavan 1 mukaisten yhdisteiden valmistus voidaan kaavamaisesti esittää seuraavissa reaktiokaavioissa A ja B.

Reaktiokaavio A

3 112658 f, ft HO^_-^·—— ^ AcO'^.— 5 o —*- o

RrS^O^°«, R ’ R ’ (2) (3)

10 R OH I

. · * 0H f, 0 Acowr^

RrL>-^o-^ [ ·<OOQ*' U

1 CH, 15 J 1 T CH, (7) + (4)

fi .. · · *°\ I

20 jTi .......*'C=0 i^JV OH

c°ToTl te) Rr^r^i^°'^i''<00CH' : . 25 R CHi (5) R, + .. · ·°\ 30 \ .........C~°

Rr^r^-"1 : R CH, (6) : jossa R ja Ra ovat edellä määriteltyjä ja Ac on edullinen 35 asyyliosa.

Reaktiokaavio A (jatkuu) 5 \ 4 112658 (5)-(8)

R, OH

OH 4 isomeeriä ”1

08 enantio- I

meeriä I

10 R

R CH* (9) + 15 r- -η R -Ov 2 isomeeriä 1

I --—' \ 4 enantio- I

H°r^r^T°« \ [meeriä J

O ^—c=o 20 CH· (10) Tässä reaktiosekvenssissä hapot (2) esteröidään ja asetyloidaan peräkkäin yhdisteiden (3) muodostamiseksi, 25 jotka dehydrogenoidaan reagenssin kuten esimerkiksi DDQ:n (2,3-dikloori-5,6-disyano-l,4-bentsokinoni) avulla välituotteeksi (4). Cis-dihydroksylaatio reagenssin, kuten esimerkiksi osmiumtetroksidin, avulla tuottaa laktonit (6) ja dihydroksiesterit (5). Molemmat voidaan hydrolysoida 30 dihydroksihapoiksi (9) (joissa hydroksiryhmät ovat cis- asennossa toisiinsa nähden), mutta vain toinen voi lakto- noitua uudelleen yhdisteeksi (10). Lähtien resolvoidusta yhdisteestä (2) eli yhdisteen (2) S- ja R-enantiomeereis-tä, voidaan saada kahta yhdisteen (10) neljästä mahdolli-35 sesta enantiomeeristä, ja neljää yhdisteen (9) kahdeksasta 112658 5 mahdollisesta enantiomeeristä. Trans-dihydroksyloimalla reagenssilla, kuten esimerkiksi dimetyylidioksiraanilla, saadaan laktoneita (7) ja dihydroksiestereitä (8), joista analogisesti saadaan muita yhdisteiden (9) ja (10) enan-5 tiomeerejä.

Samalla tavalla saadaan reaktiokaavion B mukaisesti homologisista hapoista (11) lähtien edellisen reaktiokaa-vio A:n mukaista prosessitekniikkaa käyttäen 6-laktoneita (12) ja dihydroksihappoja (13). Yhdisteiden (4) hydrolyy-10 sillä ja amidoinnilla tai yhdisteiden (11) amidoinnilla saadaan amideja (14), joiden cis- ja trans-dihydroksylaa-tiolla saadaan dihydroksiamideja (15).

♦ * * 1

Reaktiokaavio B

6 112658 οϊΗ~ o HOj

5 _____— COOH

R’ \T ch> 1 T

(11) (12) +

R, OH

10 11 I

__o^-^^COOH

R

15 <13> 20 '-•Q'-^o^·--KH^CIOINR,), 1 I CH,

R J

(14) l

25 T

HO OH

3· oT T

v : (CHJ.qojNR.), 30 ' CH3 (15)

Seuraavat esimerkit valaisevat tämän keksinnön mukaisten yhdisteiden valmistuksen yksityiskohtia ja teknii-35 koita.

112658 7

Esimerkki 1

Metyyli-(2-R,S)-asetyylioksi-2,5,7,8-tetrametyyli- 2H-l-bentsopyraani-2-karboksylaatti

Liuosta, jossa on 100 g (2-R,S)-3,4-dihydro-6-hyd-5 roksi-2,5,7,8-tetrametyyli-2H-l-bentsopyraani-2-kar- boksyylihappoa ja 1 g p-tolueenisulfonihappoa liuotettuna 700 ml:aan kuivaa metanolia, sekoitetaan refluksointiläm-pötilassa 20 tunnin ajan. Noin 400 ml metanolia haihdutetaan ja jäännöksen annetaan jäähtyä kiteyttämistä varten. 10 Esteri kerätään talteen, pestään pienellä määrällä me tanolia ja kuivataan.

Esteri liuotetaan 500 ml:aan pyridiiniä, 250 ml asetaattianhydridiä lisätään ja syntyvää liuosta sekoitetaan yön yli huoneenlämpötilassa. Veden ja jään lisäämi-15 nen saostaa asetaatin, joka kerätään talteen, pestään vedellä ja kuivataan 80 °C:ssa 0,1 mm:n paineessa fosfori-pentoksidin läsnä ollessa. Tuote voidaan kiteyttää uudelleen etyyliasetaatin ja heptaanin seoksesta.

Tähän esteriin lisätään 1,1 ekvivalenttia (99,93 g) 20 2,3-dikloori-5,6-disyano-l,4-bentsokinonia (DDQ) 600 ml:ssa tolueenia ja seosta sekoitetaan refluksointilämpö-tilassa 24 - 48 h:n ajan. Seoksen annetaan jäähtyä, se suodatetaan kiinteiden aineiden poistamiseksi ja ajetaan aktivoidulla alumiinioksidilla täytetyn pylvään läpi vä-25 rillisen materiaalin poistamiseksi. Tämä prosessi voidaan joutua toistamaan kaiken värin poistamiseksi. Eluaatti , haihdutetaan ja jäännös kiteytetään uudelleen tolueenin ja heptaanin seoksesta, jolloin saadaan 57,32 otsikon yhdistettä. NMR-spektrissä CDCl3:ssa nähdään kaksi kaksoisviivaa 30 6:n (vs. TMS) arvojen 5,70 ja 6,56 ppm kohdalla kytkentä- vakiolla J = 7 Hz, mikä varmistaa rakenteen.

112658 8

Esimerkki 2

Metyyli-2S- (-) -6-asetyylioksi-2,5,7,8-tetrametyyli- 2H-l-bentsopyraani-2-karboksylaatti

Kuumaan liuokseen, jossa on 78,07 g (311,9 mmol) 5 (2-R,S)-3,4-dihydro-6-hydroksi-2,5,7,8-tetrametyyli-2H-l- bentsopyraani-2-karboksyylihappoa 400 ml:ssa 2-propanolia, lisätään 37,80 g (311,9 mmol) S-(-)-a-metyylibentsyyli-amiinia, ja liuoksen annetaan jäähtyä jääkaapissa hitaasti usean päivän ajan. Syntyvät diastereomeerisen suolan ki-10 teet kerätään talteen ja kiteytetään uudelleen kolme kertaa 2-propanolista, jälleen huolehtien siitä, että kiteytyminen tapahtuu hitaasti joka kerralla. Syntyvä tuote (45,13 g, 39 %, sp. 149 - 59 °C) suspendoidaan 400 ml:aan vettä, 100 ml 2N HCl:a lisätään, ja happo uutetaan etyy-15 liasetaatilla. Uute kuivataan natriumsulfaatilla, suodatetaan, ja haihdutetaan, jolloin saadaan 30,40 g (39 %) S-(-)-enantiomeeriä, sp. 157 - 159 °C, [a]n5 = -71,26 (c = 1,03 CH30H: ssa).

Tämä tuote esteröidään, asetyloidaan ja dehydro-20 genoidaan DDQ:lla, kuten kuvattu esimerkkissä 1, jolloin saadaan otsikon yhdistettä, jonka [0]“= -246,86 (c = 1,05 CH3OH: ssa).

Esimerkki 3

Metyyli-2R- (+) -6-asetyylioksi-2,5,7,8-tetrametyyli-25 2H-l-bentsopyraani-2-karboksylaatti

Esimerkin 2 diastereomeerisen suolan kiteytyksen ja uudelleenkiteytyksen yhdistetyt suodokset haihdutetaan ja ;· konvertoidaan vapaaksi hapoksi, 46,68 g (60 %). Tähän jäännökseen lisätään 22,60 g (186,5 mmol) R-(+)-a-metyyli-30 bentsyyliamiinia 2-propanolissa, ja hitaan kitettämisen ja kahden uudelleenkiteyttämisen jälkeen saadaan 48,78 g dia-stereomeeristä suolaa, sp. 149 - 150 °C (sekoitettaessa sulamispiste alenee 112 - 124 °C:seen) ja se konvertoidaan vapaaksi hapoksi, sp. 157 - 159 °C, [a]|5= +73,75 (c = 1,04 35 CH30H:ssa).

112658 9

Esimerkki 4 10-anti- (+/-) -7-asetyylioksi-2,3-dihydro-10-hydrok-si-2,6,8,9-tetrametyyli-2,5-metano-5H-l, 4-bentso-dioksepi ini-3-oni 5 24,07 g: aan (176,8 mmol) N-metyylimorfoliini-N-ok- sidimonohydraattia 200 ml:ssa vettä ja 100 ml:ssa asetonia lisätään 5 ml 2,5-%:ista (w/v) osmiumtetroksidin liuosta t-butanolissa ja liuosta sekoitetaan 30 minuutin ajan. Tähän liuokseen lisätään tipoittain 5 - 7 h:n ajan liuos-10 ta, jossa on 51,24 g (168,4 mmol) esimerkissä 1 kuvattua metyyli-(2-R,S)-6-asetoksi-2,5,7,8-tetrametyyli-2H-l-bent-sopyraani-2-karboksylaattia 350 ml:ssa asetonia. Seosta sekoitetaan huoneenlämpötilassa yön yli ja refluksointi-lämpötilassa 6 h:n ajan. Seoksen jäähdyttyä siihen lisä-15 tään 4 g natriumbisulfiittia 50 ml:ssa vettä sisältävää liuosta, ja seosta sekoitetaan 30 min:n ajan, se suodatetaan supergeelin läpi ja haihdutetaan. Kaikkien näiden käsittelyiden aikana tulisi huolellisesti välttää kontaktia hyvin myrkyllisiin osmiumsuoloihin ja ne tulisi myös 20 asianmukaisesti hävittää. Jäännös hapotetaan laimealla rikkihapolla ja uutetaan kahdesti etyyliasetaatilla. Uute pestään laimealla rikkihapolla, vedellä ja kyllästetyllä natriumbikarbonaattiliuoksella, kuivataan natriumsulfaa-tilla, suodatetaan ja haihdutetaan, jolloin saadaan : : 25 48,57 g öljyä. Kiteyttämällä etyyliasetaatista/heptaanista • saadaan 38,81 g ainetta, joka uudelleenkiteytettiin, jol loin saatiin 17,62 g otsikon yhdistettä ja 15,71 g toisessa erässä 15,71 g ainetta, joka kuvataan seuraavassa esi-merkissä. Ensimmäisen aine-erän uudelleenkiteytyksellä 30 saadaan puhdas erä otsikon yhdistettä, sp. 210 - 211 °C, UV (CH3CN): lmax 289 (6 = 1925), 282 (sh), 224 (sh), 206 (47,266); IR (KBr) 1762 cm'1; 1H-NMR (DMSO); 6 (ppm vs TMS) 6,49 (1, s, OH), 5,54 (1, s, 5-H), 4,43 (1, s, 10-H), 2,38 (3, s, COCHj), 2,18 (3, S, Ar-CH3), 2,14 (3, s, Ar-CH3), "1 35 2,09 (3, s, Ar-CH3), 1,69 (3, s, 2-CH3).

112658 10

Esimerkki 5

Metyyli - trans, cis- (+/-) -6-asetyylioksi-3,4-dihydro- 3,4-dihydroksi-2,5,7,8-tetrametyyli-2H-l-bentsopy-raani-2-karboksylaatti 5 Jälkimmäinen aine-erä, joka saatiin edellisessä esimerkissä, koostuu kahdesta yhdisteestä, kuten ohutker-roskromatografia osoittaa, jotka voidaan erottaa piihappo-geelikromatografiällä käyttäen uuttamiseen heptaanin ja etyyliasetaatin seoksia (3:1 ja 2:1). Toinen on esimerkis-10 sä 4 kuvattu yhdiste, toinen on otsikon yhdiste.

Esimerkki 6 10-anti-(+/-)-2,3-dihydro-7,10-dihydroksi-2,6,8,9-tetrametyyli-2,5-metano-5H-l, 4-bentsodioksepiini-3-oni 15 Liuokseen, jossa on 17,62 g esimerkin 4 otsikon yhdisteen 7-asetaattia 200 ml:ssa metanolia typen läsnä ollessa, lisätään 100 ml 2N NaOH:ia. Seosta sekoitetaan refluksointilämpötilassa 2 h:n ajan, jäähdytetään, hapote-taan 2N HCl:lla ja uutetaan kolme kertaa etyyliasetaatil-20 la. Uute pestään vedellä ja kahdesti natriumbikarbonaatti-liuoksella, kuivataan natriumsulfaatilla, suodatetaan ja haihdutetaan. Bikarbonaattipesutuotteet hapotetaan ja uutetaan uudelleen etyyliasetaatilla, jolloin saadaan kuivaamisen ja haihduttamisen jälkeen hapan tuote. Tämä lie-* : 25 tetään vedettömään etyylieetteriin, johon on lisätty kaa- sumaista HCl:a. Liuotin ja kaasu haihdutetaan niiden oltua .huoneenlämpötilassa yön yli, jäännös otetaan talteen etyyliasetaattiin ja pestään bikarbonaattilioksella, kuivataan : : : ja haihdutetaan. Kaksi näin saatua ei-happaman tuotteen

30 fraktiota voivat vaatia kromatografiapuhdistusta ennen uudelleen kiteyttämistä etyyliasetaatista/heptaanista, jolloin saadaan otsikon yhdistettä, sp. 179 - 181 °C. UV

(CH3CN) lmax 298 nm (e = 3322), 229 (sh), 206 (39123); IR (KBr) 1766 ccm‘1: ^-NMR (CD30D) δ (ppm vs. TMS) 5.37 (1, s, 35 5-H), 4,23 (1, s, 10-H).

112658 11

Esimerkki 7

Trans,cis-(+/-)-3,4-dihydro-3,4,6-trihydroksi-2,5,7,8-tetrametyy 1 i - 2H-1 -bent sopyr aani - 2-karbok-syylihappo 5 Esimerkkissä 5 kuvatun otsikon yhdisteen 6-ase- taattimetyyliesteriä sekoitetaan IN 50-%risen NaOH-me-tanolin kanssa typen alla 5 h:n ajan refluksointilämpöti-lassa. Jäähtymisen jälkeen liuos hapotetaan 2N HCl:n avulla ja uutetaan etyyliasetaatilla. Uute pestään vedellä ja 10 kahdesti natriumbikarbonaattiliuoksella. Bikarbonaatti-pesutuotteet hapotetaan, kyllästetään natriumkloridilla ja uutetaan neljä kertaa etyyliasetaatilla. Liuos kuivataan natriumsulfaatilla, suodatetaan ja haihdutetaan, minkä jälkeen saadaan öljyä, joka kiteytyy etyliasetaatista/hep-15 taanista, jolloin saadaan otsikon yhdistettä. UV (CH3CN) Xaax 295 nm (e = 3802), 223 (sh), 201 (35620); IR (KBr) 1717 cm'1; 1H-NMR (D20) δ (ppm vs TMS) 4,78 (1, s, 4-H), 4,32 (1, s, 3-H), 2,19 - 2,22 (9, 3s, Ar-CH3), 1,70 (3, s, 2-CH3). Esimerkki 8 20 10-anti- (+) - (2S, 5R, 10R) -7-asetyylioksi-2,3-dihydro- 10-hydroksi-2,6,8,9-tetrametyyli-2,5-metano-5H-l, 4-bentsodioksepiini-3-oni Lähtien 12,18 g:sta esimerksissä 2 kuvattua 2S-enantiomeeriä ja käyttäen esimerkissä 4 kuvattua menetel-: 25 mää saadaan 11,98 g raakatuotetta. Kiteyttämällä 40 mlrsta etyyliasetaattia saadaan 2,49 g tuotetta. Suodoksen pii-, happogeelikromatografiällä (eluutio etyyliasetaatti/hep- taanilla: 1/2) saadaan fraktio, joka sisältää vielä 3,7 g samaa tuotetta ja uudelleenkiteyttämällä yhdistetty tuote 30 etyyliasetaatti/heptaanista saadaan 5,01 g (41 %) otsikon yhdistettä, sp. 201-5 °C, [a]25D = +58,92 (c = 1,02 CH30H:ssa). UV, IR ja 1H-NMR vastaavat esimerkissä 4 kuvattujen raseemisten yhdisteiden arvoja.

112658 12

Esimerkki 9 10-anti-(+)-(2S,5R,10R)-2,3-dihydro-7,10-dihydrok-si-2,6,8,9-tetrametyyli-2,5-metano-5H-l,4-bentso-dioksepiini-3-oni 5 Edellisen esimerkin otsikon yhdisteen 7-asetaatti hydrolysoidaan ja laktonisoidaan uudelleen esimerkissä 6 kuvatulla menetelmällä, jolloin saadaan otsikon yhdistettä, sp. 172 - 173 °C, [a]f = +63,24 (c = 1,05 CH30H:ssa). UV, IR ja XH-NMR vastaavat esimerkissä 6 kuvatun raseemisen 10 yhdisteen arvoja.

Esimerkki 10 10-anti- (-) - (2R, 5S, 10S) -7-asetyylioksi-2,3-dihydro-10-hydroksi-2,6,8,9-tetrametyyli-2,5-metano-5H-l,4-bentsodioksepiini-3-oni 15 Esimerkissä 8 kuvatun yhdisteen antipodia saadaan 50-%:isena saantona samalla menetelmällä mutta aloittaen esimerkissä 3 kuvatusta R-enantiomeeristä. Sp. 210 -211 °C, [a]f= -63,32 (c = 1,15 CH30H:ssa). UV-, IR- ja 1H-NMR-spektrit vastaavat esimerkissä 4 kuvattujen (+)-20 enantiomeerin ja rasemaatin spektrejä.

Esimerkki 11

Cis, cis-(+)-(2R,3S,4S)-3,4-dihydro-3,4,6-trihyd-roksi-2,5,7,8-tetrametyyli-2H-l-bentsopyraani-2-karboksyy1ihappo 25 3,06 g:aan (1 mmol) edellisessä esimerkissä kuvat- \ tua laktoniasetaattia 50 ml:ssa metanolia typen alla lisä tään 50 ml 2N natriumhydroksidia, ja seos kuumennetaan refluksointilämpötilaan 20 min:ksi. Syntyvä liuos jäähdy-i tetään, hapotetaan 60 ml:llä 2N suolahappoa ja konsentroi- 30 daan metanolin poistamiseksi. Jäljelle jäävä vesiliuos uutetaan neljä kertaa etyylieetterillä ja uute pestään natriumbikarbonaattiliuoksella. Vesifaasi yhdistetään bi-karbonaattipesutuotteisiin, hapotetaan huolellisesti pienimmällä mahdollisella määrällä 2N suolahappoa, kylläste-35 tään natriumkloridilla ja uutetaan neljä kertaa etyy- 112658 13 liasetaatilla. Uute kuivataan natriumsulfaatilla, suodatetaan ja haihdutetaan, jolloin saadaan 2,87 g otsikon yhdistettä, sp. 115 °C (dec.), [α]ρ5= +57,45 (c = 1,02 MeOH-: ssa). UV (CH3CN) lBax 295 nm (6 = 3530), 225 (sh), 204 5 (35820); IR (KBr) 1718 cm-1; Hl-NMR (DMSO) 6 (ppm vs TMS) 4,67 (1, d, J = 3,8, 4-H), 3,82 (1, d, J = 3,8, 3-H), 2,1 - 2,2 (9, 3s, Ar-CH3, 1,62 (3, s, 2-CH3); Anal.; C, H. NMR-spektri osoittaa, että yhdiste sisältää noin 10 % seu-raavassa esimerkissä kuvattua laktonia.

10 Esimerkki 12 10-anti-(-)-(2R,5S,10S)-2,3-dihydro-7,10-dihydrok-si-2,6,8,9-tetrametyyli-2,5-metano-5H-l, 4-bentso-dioksepiini-3-oni

Edellisessä esimerkissä saatu kiteyttämisen emä-15 liuos haihdutetaan, suspendoidaan vedettömään etyylieette-riin, ja kaasumaista vetykloridia annetaan kuplia siihen. Seoksen annetaan olla huoneenlämpötilassa yön yli ja sitten se haihdutetaan. Jäännös otetaan talteen etyyliasetaattiin, pestään natriumbikarbonaattiliuoksella, 20 kuivataan natriumsulfaatilla, suodatetaan ja haihdutetaan. Kiteyttämällä etyyliasetaatista/heptaanista saadaan 530 mg otsikon ainetta, sp. 171 - 172 °C, [a]„5 = -68,63 (c = 1,02 CH30H:ssa). UV-, IR- ja ^-NMR-spektrit vastaavat esimer-kissä 9 kuvattua enantiomeeria ja esimerkki 6:n raseemista i ; | 25 yhdistettä.

Esimerkki 13 10-syn-(+)-(2S,5R,10S)-7-asetyylioksi-2,3-dihydro-10-hydroksi-2,6,8,9-tetrametyyli-2,5-metano-5H-l, 4-bentsodioksepiini-3-oni 30 Noin 0,1 M dimetyylioksiraanin asetoniliuosta saa daan lisäämällä annoksittain 250 g kaliumperoksimonosul-faattia (Oxone®) sekoitettuun suspensioon, jossa on 120 g natriumbikarbonaattia 200 ml:ssa vettä ja 140 ml asetonia noin 150 mm:n osittaisessa tyhjiössä, ja keräämällä tisle 35 kuivaan jäällä ja asetonilla jäähdytettyyn erottimeen.

112658 14 Tämä liuos (100 - 120 ml) lisätään 3,04 g:aan (1 mmol) me-tyyli-2S-(-)-6-asetyylioksi-2,5,7,8-tetrametyyli-2H-l-bentsopyraani-2-karboksylaattia (kuvattu esimerkissä 2) 50 ml:ssa asetonia, ja seosta sekoitetaan huoneenlämmmössä 2 5 h:n ajan. Liuos kuivataan magnesiumsulfaatilla, suodatetaan ja haihdutetaan kuivaksi huoneenlämpötilassa alennetussa paineessa, jolloin saadaan 3,74 g raakaepoksidia, joka on melko epästabiilia, ja johon lisätään välittömästi 1,96 g vedetöntä vedetöntä kaliumasetaattia ja 20 ml etik-10 kahappoa. Seosta kuumennetaan refluksointilämpötilassa 1 h:n ajan, haihdutetaan kuivaksi ja otetaan talteen etyy-lieetteriin. Syntynyt liuos pestään vedellä, kyllästetyllä natriumbikarbonaattiliuoksella ja kyllästetyllä natrium-kloridiliuoksella, suodatetaan ja haihdutetaan, jolloin 15 saadaan 2,96 g erästä öljyä. Kromatografioinnilla piihap-pogeelillä etyyliasetaatti/heksaanissa : 1/2 saadaan useita fraktioita, joista eräs (2,36 g) kiteytetään uudelleen etyyliasetaatti/heksaanista, jolloin saadaan otsikon yhdistettä, sp. 200 - 201 °C, [a]|5= +78,04 (c = 1,02 20 CH30H: ssa). UV(CH3CN) Xmax 289 nm (6 = 2037), 283 (sh), 224 (sh), 206 (42685); IR (KBr) 1798, 1734 cm'1; 1H-NMR (DMSO), δ (ppm vs. TMS) 6,30 (1, m, OH), 5,67 (1, d, J = 6 Hz, 5-H), 4,44 (1, dd, Jj = 4, J2 = 6 Hz, 10-H), 2,43 (3, s, COCH3), 2,07 - 2,17 (9, 3s, Ar-CH3), 2,07 - 2,17 (9, 3s, : 25 Ar-CH3), 1,62 (3, s, 2-CH3).

Esimerkki 14

Trans, trans-(-)-(2S, 3R,4R)-3,4-dihydro-3,4,6-tri-hydroksi-2,5,7,8-tetrametyyli-2H-l-bentsopyraani-2-karboksyy1ihappo 30 Liuokseen, jossa on 460 mg (1,5 mmol) edellisessä esimerkissä kuvattua laktoniasetaattia 10 ml:ssa metanolia typen alla, lisätään 10 ml 2 N Na0H:a, ja seosta kuumennetaan refluksointilämpötilaan 30 min:n ajaksi. Liuos jäähdytetään, hapotetaan 15 ml:11a 2 N HCl:a ja konsentroidaan 35 metanolin poistamiseksi. Jäännös kyllästetään natriumklo- 112658 15 ridilla ja uutetaan kahdesti etyyliasetaatilla. Uute kuivataan natriumsulfaatilla, suodatetaan ja haihdutetaan. Kiteyttämällä jäännös etyyliasetaatista/heptaanista saadaan 270 mg otsikon yhdistettä, [α]^5= -41,88 (c = 1,01 5 H20: ssa, pH = 3,20). UV (H20) Xmax 292 nm (e = 3441), 221 (11197); IR (KBr) 1741 cm'1; 1H-NMR(DMSO), 6 (ppm vs. TMS) 4,48 (1, d, J = 2,5 Hz, 4-H), 4,09 (1, d, J = 2,5 Hz, 4-H), 4,09 (1, d, J = 2,5 Hz, 3-H).

Esimerkki 15 10 10-syn- ( + ) - (2S, 5R, 10S) -2,3-dihydro-7,10-dihydroksi- 2,6,8,9-tetrametyyli-2,5-metano-5H-l,4-bentsodiok-sepiini-3-oni Käsittelemällä 1,18 g edellisessä esimerkissä kuvattua happoa haihtuvalla vetykloridilla esimerkissä 12 15 kuvatulla tavalla, saadaan otsikon yhdistettä, sp. 185 °C, [a]f = +93,55 (c = 1,07 CH30H:ssa). UV (CH3CN) Xnax 298 nm (e = 3567), 224 (sh), 206 (39200); IR(KBr) 1763 cm*1; ^-NMR(CD30D), δ (ppm vs. TMS) 5,49 (1, d, J = 4,5, 5-H), 4,21 (1, d, J = 4,5, 10-H); MS: MH+ = 265.

20 Esimerkki 16 10-syn-(-)-(2R,5S,10R)-7-asetyylioksi-2,3-dihydro-10-hydroksi-2,6,8,9-tetrametyyli-2,5-metano-5H-l, 4-bentsodioksepiini-3-oni Käyttämällä esimerkissä 13 kuvattua menetelmää, • 25 mutta lähtien esimerkissä 3 kuvatusta 2R-(+)-enantiomee- 2; * ristä, saadaan otsikon yhdistettä, sp. 203-4 °C, [α]β5 = -81,27 (c = 0,95 CH30H:ssa). UV-, IR- ja Hl-NMR-spektrit vastaavat esimerkissä 13 kuvatun enantiomeerin spektrejä. Esimerkki 17 30 Metyyli-cis,trans-(2R,3R,4R)-4,6-diasetyylioksi- 3,4-dihydro-3-hydroksi-2,5,7,8-tetrametyyli-2H-l-bentsopyraani-2-karboksylaatti ; Edellisessä esimerkissä kuvatussa reaktiossa saa- : daan toista tuotetta, joka todetaan otsikon yhdisteeksi : 35 NMR-spektrin perusteella. 1H-NMR (CDC13) 6 (ppm vs TMS) 112658 16 5,83 (1, d, J = 2,9 Hz, 4-H), 2,22 (3, s, COCH3) 1,92-2,08 (9, 3s, ArCH3), 1,70 (3, s, 2-CH3); sp. 180 °C.

Esimerkki 18

Metyyli-cis,trans-(2R,3R,4R)-6-asetyylioksi-3,4-5 dihydro-3,4-dihydroksi-2,5,7,8-tetrametyyli-2H-l- bentsopyraani-2-karboksylaatti

Esimerkkissä 13 kuvatulla tavalla valmistettuun 0,1 M dimetyylioksiraanin asetoniliuokseen (60 ml) lisätään 1,37 g (4,5 mmol) 2R-(+)-olefiiniä (esimerkki 3) ase-10 tonissa. Seosta sekoitetaan huoneenlämpötilassa 1,5 h:n ajan epoksidin muodostamiseksi. Viisi tippaa vettä ja noin 0,2 g piihappogeeliä lisätään liuokseen ja sekoittamista jatketaan yön yli. Ohutkerroskromatografiällä todettu päätuote eristetään kromatografilalla, 0,83 g, ja kiteytetään 15 etyyliasetaatista/heptaanista. MS: MNH4+ = 356; 1H-NMR

(CDC13) δ (ppm vs TMS) 4,70 (1, d, J = 2,9, 4-H), 4,18 (1, m, 3-H), 3,67 (3, s, 0CH3), 2,33 (3, s, C0CH3), 2,05 - 2,13 (9, 3s, Ar-CH3), 1,70 (3, s, 2-CH3).

Esimerkki 19 20 Trans, trans- (+) - (2R, 3S, 4S) -3,4-dihydro-3,4,6-tri- hydroksi-2,5,7,8 -1 e trame tyy 1 i - 2H-1 -bent sopyraani - 2 -karboksyy1ihappo

Esimerkissä 16 kuvattu laktoni hydrolysoidaan IN 50-%:isella esimerkissä 14 kuvatulla metanolisella • 25 NaOH:lla, jolloin saadaan otsikon yhdistettä, [α]ρ5= +34,6 ; : (c = 0,77 CC13/CH30H:ssa 2/1). UV, IR ja "H-NMR-spektrit vastaavat esimerkissä 14 kuvatun enantiomeerin spektrejä. Esimerkki 20 10-syn- (-) - (2R, 5S, 10R) -2,3-dihydro-7,10-dihydroksi-30 2,6,8,9-tetrametyyli-2,5-metano-5H-l,4-bentsodiok- sepiini-3-oni

Liuosta, jossa on 1,22 g edellisessä esimerkissä kuvattua happoa 70 ml:ssa tolueenia, jossa on 0,1 g p-to-lueenisulfonihappoa, refluksoidaan 1 h:n ajan. Jäähtymisen 35 ja etyyliasetaatin lisäämisen jälkeen liuos pestään nat- 112658 17 riumbikarbonaattiliuoksella, kuivataan natriumsulfaatilla, suodatetaan ja haihdutetaan, jolloin saadaan 0,77 g öljyä. Kiteyttämällä se etyyliasetaatista/heksaanista saadaan otsikon yhdistettä, sp. 178 °C, [α]ρ5 = -83,8 (c = 0,933 5 CH30H:ssa). UV-, IR- ja 1H-NMR-spektrit vastaavat esimerkissä 15 kuvatun enantiomeerin spektrejä.

Esimerkki 21 11-syn-(+/-)-8-asetyylioksi-2,3,4,6-tetrahydro-ll-hydroksi-2,7,9,10-tetrametyyli-2,6-metano-l,5-bent-10 sodioksosiini-4-oni Käyttäen esimerkissä 1 kuvattua menetelmää esteröi-dään, asetyloidaan ja dehydrogenoidaan DDQilla (2R,S )-3,4-dihydro-6-hydroksi-2,5,7,8-tetrametyyli-2H-l-bentsopyraa-ni-2-etikkahappoa, jolloin saadaan metyyli-(2r,S)-6-ase-15 tyylioksi-2, 5,7,8-tetrametyyli-2H-l-bentsopyraani-2-ase-taattia, 1H-NMR (CDC13) δ (ppm vs TMS) 6,52 (1, d, J = 10, 4-H), 5,72 (1, d, J = 10, 3-H), 3,61 (3, s, 0CH3), 2,68 (2, s, C0CH2), 2,31 (3, s, COCHj), 2,02-2,10 (9, 3s, ArCH3), 1,56 (3, s, 2-CH3).

20 Cis-hydrolysoimalla osmiumtetroksidin kanssa esi merkissä 4 kuvatulla tavalla saadaan kahta tuotetta, jotka erotetaan pylväskromatografiällä piihappogeelissä. Toinen niistä on otsikon yhdiste, sp. 179 - 181 °C. MS: MNH4+ = 338; IR (KBr) 1762, 1714 cm-1; XH-NMR (CDC13) δ (ppm vs TMS) 25 5,38 (1, d, J = 3, 6-H), 4,07 (1, d, J = 3, 11-H), 2,88 : (1, d, J = 20, C0CH2), 2,31 (3, s, C0CH3), 2,02 - 2,12 (9, 3s, Ar-CH3), 1,61 (3, s, 2-CH3).

Esimerkki 22 , Trans,cis-(+/-)-6-asetyylioksi-3,4-dihydro-3,4-di- 30 hydroksi-2,5,7,8-tetrametyyli-2H-l-benzopyraani-2- etikkahapon metyyliesteri

Edellisessä esimerkissä kuvatussa reaktiossa saatu toinen tuote on otsikon yhdiste, sp. 135 - 145 °C, joka identifioidaan MS:nsä perusteella (MNH/ = 370), ja jonka 35 hydrolyysituote kuvataan seuraavassa esimerkissä.

1β 112658

Esimerkki 23

Trans,cis-(+/-)-3,4-dihydro-3,4,6-trihydroksi-2,5,7,8-tetrametyyli-2H-l-bentsopyraani-2-etikkaha-pon metyyliesteri 5 Liuokseen, jossa on 930 mg edellisessä esimerkissä

kuvattua asetaattia 30 ml:ssa metanolia typen alla, lisätään liuos, jossa on 4,0 g kaliumkarbonaattia 20 ml:ssa vettä, ja seosta sekoitetaan huoneenlämpötilassa yön yli. 2N HCl:llä hapottamisen ja metanolin haihduttamisen jäl-10 keen tuote uutetaan etyyliasetaattiin ja uute pestään nat-riumbikarbonaattiliuoksella ja kuivataan natriumsulfaatil-la, suodatetaan ja haihdutetaan. Uudelleenkiteyttämällä se etyyliasetaatista/heptaanista saadaan 440 mg otsikon yhdistettä, sp. 162 - 163 °C. IR (KBr) 1716 cm'1; 1H-NMR

15 (CDC13) 6 (ppm vs TMS) 7,26 (1, s, ArOH), 4,87 (1, d, J = 5, 4-H), 4,08 (1, d, J = 5, 3-H), 2,82 (2, s, CH2C0), 2,31 (3, s, COCH3), 2,10-2,31 (p, 3s, ArCH3), 1,45 (3, s, 2-CH3). Esimerkki 24

Cis, cis-(+/-)-6-asetyylioksi-3,4-dihydro-3,4-di-20 hydroksi-2,5,7,8-tetrametyyli-2H-l-bentsopyraani-2- karboksamidi

Liuokseen, jossa on 18,62 g esimerkissä 1 kuvattua olefiiniä 200 ml:ssa metanolia typen alla, lisätään 200 ml 2N NaOHra, ja seosta refluksoidaan 5 tunnin ajan. Jäähdyt-25 tämisen jälkeen seosta hapotetaan 220 ml:11a 2 HCl:a ja metanoli poistetaan haihduttamalla. Tuote uutetaan etyyliasetaattiin, ja uute pestään natriumbikarbonaattiliuok-sella. Hapottamalla ja uuttamalla uudelleen etyyliasetaatilla saadaan (2R,S)-6-hydroksi-2,5,7,8-tetrametyyli-2H-l-30 bentsopyraani-2-karboksyylihappoa. Happo liuotetaan 100 ml:aan etikkahappoanhydridiä ja kuumennetaan kiehuvaksi, jolloin muodostuvan etikkahapon annetaan haihtua. Ylimääräinen etikkahappoanhydridi poistetaan haihduttamalla alennetussa paineessa. Jäännös liuotetaan 300 ml:aan kui-35 vaa tetrahydrofuraania, ja liuos kyllästetään kaasumaisel- 112658 19 la ammoniumilla sen jäähdyttyä. Liuosta sekoitetaan 2 tuntia huoneenlämmössä, minkä jälkeen seos haihdutetaan kuivaksi, jäännös otetaan talteen etyyliasetaattiin, pestään 2N HClillä, vedellä ja NaHC03-liuoksella, kuivataan 5 Na2S04:lla, suodatetaan ja haihdutetaan. Jäännös kiteytetään uudelleen etyyliasetaatista/heptaanista, jolloin saadaan 8,15 g (2R,S)-6-asetoksi-2,5,7,8-tetrametyyli-2H-l-bentsopyraani-2-karboksamidia.

Cis-hydroksyloimalla osmiumtetroksidilla esimerkis-10 sä 4 kuvattua menetelmää käyttäen saadaan raakatuotetta, joka käsitellään piihappogeelipylväskromatografiällä. Yksi fraktioista kiteytetään uudelleen etyyliasetaatista/heptaanista, jolloin saadaan 1,1 g otsikon yhdistettä. IR (KBr) 1758, 1702 cm'1; ^-NMR (DMSO) δ (ppm vs TMS) 4,68 (1, 15 d, J = 4, 4-H), 3,82 (1, d, J = 4, 3-H), mikä viittaa pikemminkin cis,cis- kuin trans,cis-konfiguraatioon; MS: MNH4+ = 341.

Tämän keksinnön mukaiset yhdisteet ovat vapaan radikaalin sieppaajia. Vapaiden radikaalien reaktioita on 20 osoitettu useamman kuin 50: n ihmisten sairauden patologiassa. Radikaaleja ja muita reaktiivisia happiyhdisteitä muodostuu jatkuvasti ihmiselimistössä sekä tarkoituksellisissa synteeseissä (esim. aktivoidussa fagosynteesissä) että kemiallisissa sivureaktioissa. Ne poistuvat elimis-_j ; 25 töstä entsymaattisilla ja ei-entsymaattisilla antioksida- : ; : tiivisilla puolustusjärjestelmillä. Oksidatiivinen stressi, joka ilmenee antioksidatiivisten puolustusjärjestelmien ollessa riittämättömiä, voi vahingoittaa lipidejä, , proteiineja, hiilihydraatteja ja DNA:ta. Jotkut sairausti- 30 lat johtuvat oksidatiivisesta stressistä, mutta useammin stressi on seurausta taudista ja voi olla tärkeä osatekijä taudin patologiassa. Tarkemmin kts. B.Halliwellin katsaus julkaisussa Drugs, 1991, 42 569 - 605.

: On olemassa lisääntyvää tietoa, joka viittaa vapaan | 35 happiradikaalin välittämän lipidiperoksidaation pato- 112658 20 fysiologiseen rooliin keskushermoston traumassa tai iskee-misessä (verettömässä) tai hemorraagisessa (verenvuoto-) halvauksessa. Endogeenisten antioksidanttien pitoisuuden on todettu alentuneen aivokudoksessa, kuten myös lipidipe-5 roksidaatiotuotteiden lisääntyneen. Aivojen lipidien pe-roksidaation inhibiittorit vastustavat ja vähentävät aivo-kudoksen vauriota, kuten myös pidentävät traumatisottujen eläinten ikää. Nämä löydökset on julkaistu E. D. Hallin ja J. M. Braughlerin toimesta julkaisussa Free Radical 10 Biology and Medicine, 1989, 6, 303 - 313 ja toisaalla. M. Miyamoto ym. (J.Pharmacol.Exp.Ther., 1989, 250, 1132) raportoivat ylenmääräisen glutamiinin vapautumisesta johtuvan neurotoksisuuden samoin vähentyvän antioksidanteilla. He ehdottavat aivojen lipidien peroksidaatiota vähentävien 15 aineiden käyttöä neurodegeneratiivisten sairauksien kuten Huntingtonin ja Alzheimerin tautien hoidossa, joissa taudeissa on todettu ylenmääräistä glutamiinin vapautumista. M. R. Hori ym. (Chem.Pharm.Bull. 1991, 39, 367) raportoivat aivojen lipidien peroksidaation inhibiittoreilla ole-20 van anti-amnestisen (muistinmenetystä estävän) vaikutuksen rotilla. Vapaiden happiradikaalien roolia Parkinsonin taudissa on selostettu äskettäin (Free Radical Biol. Med., 1991, 10, 161 - 169) ja vapaiden radikaalien siep- , paajia on testattu kliinisesti jonkinlaisella menestyksel- : : 25 lä (Fundam. Clin. Pharmacol., 1988, 2, 1 - 12).

: Reperfuusiota edeltävä iskemia aiheuttaa happipe- räisten vapaiden radikaalien muodostumista ja lisääntynyttä lipidiperoksidaatiota ja johtaa kudosvaurioon. Vapaiden : , radikaalien sieppaajien anto iskemialle/reperfuusiolle 30 altistetuille eläimille vähentää näitä vaikutuksia sydämessä, keuhkoissa, munuaisissa, haimassa, aivoissa ja muissa kudoksissa.

Vitamiini E eli α-tokoferoli, hyvin tunnettu seu-: raavan rakennekaavan mukainen yhdiste I 35 21 1 12658 CH, H0\/X «3

I I

Π ^(CH2CH2CH2CH)3CH3 h3c1T^ 0 3 ch3 ch3 5 on luonnollinen antioksidantti, joka reagoi sekä happipe-räisten vapaiden radikaalien että vetyperoksidin kanssa. Sen on todettu olevan interkaloituneena lipidimembraaneis-sa (rasvakalvoissa) ja sen biologisen funktion on todettu olevan biomembraanien suojelu oksidatiiviiselta hyökkäyk-10 seltä. Kaikkialla läsnäolevat hapetus-pelkistys-systeemit regeneroivat jatkuvasti α-tokoferolin antioksidanttiosaa 3,4-dihydro-2,5,7,8-tetrametyyli-2H-2-bentsopyraani-6-olia.

Tämän keksinnön mukaiset yhdisteet ovat myös hyö-15 dyllisiä tulehdusprosessin hoidossa, jonka tiedetään koskevan superoksidien vapautumista fagosytoivista soluista, jotka aiheuttavat osan oireista nivelreumassa ja muissa tulehduksellisissa taudeissa, kuten haavaisessa paksussa suolessa (ulseratiivisessa koliitissa) ja tulehdukselli-20 sissa ihotaudeissa kuten psoriasiksessa. Erityisen käyttökelpoinen on tämän keksinnön yhdisteiden anti-inflammatorinen (tulehdusta estävä) vaikutus tulehduksellisissa suolen loppupään sairauksissa.

; Keuhkojen inhalaatiovaurio (sisäänhengitysvaurio) : : ; 25 aiheutuu tyypillisesti kuumasta ja kemiallisesta ärsytyk- sestä, ja savuinhalaatiovaurion tärkein kuoleman aiheutta-va syy on kemiallinen vaurio. Savuinhalaatio (savun si-säänhengitys) johtaa keuhkojen mikroverenkierron lisäänty- ; misestä ja keuhkoödeemasta (keuhkopöhöstä) aiheutuvaan 30 keuhkovaurioon. Tätä prosessia seuraa lisääntynyt lipidi-peroksidaatio keuhkokudoksessa. Z. Min ym. totesivat lipi-diperoksidaation inhibiittorin vähentävän näitä oireita kuumalle sahanpurusavulle altistetuilla eläimillä (J. Med. Cell. PLA, 1990, 5, 176 - 180). He esittävät antioksidant-35 tien käyttöä keuhkojen savuinhalaatiovaurion, ARDS:n 112658 22 (= adult respiratory distress syndrome, aikuisten hendi-tysvaikeusoireyhtymän) ja emfyseeman (keuhkolaajentuman) hoidossa.

Reaktiiviisilla happiyhdisteillä on merkitystä myös 5 vaahtosolujen muodostumisessa ateroskleroottisissa pla-keissa (D.Steinberg ym., New Engl. J. Med., 1989, 320, 915 - 924), ja vapaan radikaalin sieppajalla probukolilla on merkittävä antiateroskleroottinen vaikutus hyperlipi-deemisillä rotilla (Carew ym., Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 10 1987, 84, 7725 - 7729). Degeneratiivinen verkkokalvon vau rio ja diabeteksen aiheuttama retinopatia (verkkokalvon sairaus) on myös listattu vapaiden radikaalien sieppaaja-hoidon kohteina (vrt. J.W. Baynes, Diabetes, 1991, 40, 405 - 412; S. P. Wolff ym., Free Rad. Biol. Med., 1991, 15 10, 339 - 352).

Yhdisteet voivat olla hyödyllisiä myös syöpien ja vanhenemiseen liittyvien degeneratiivisten (rappeuttavien) sairauksien, halvauksen ja pään vammojen hoidossa, koska happiperäisten vapaiden radikaalien on todettu olevan ai-20 heuttavien tekijöiden joukossa. Katsauksia varten kts. B. Halliwell ja C. Gutteridge, Biochem. J. , 1984, 219, 1 - 14; TINS 1985, 22 - 26. Antioksidantit on todettu hyödyllisiksi myös harmaakaihen hoidossa, Free Rad. Biol. Med., 12:251 - 261 (1992).

j · 25 Tämän keksinnön mukaisten yhdisteiden aktiivisuus : : in vitro ja in vivo voidaan määrittää standardianalyyseil- lä, jotka osoittavat vapaan radikaalin sieppausominaisuut-ta, affiniteettia sydänkudokseen ja kardioprotektiivisia , , (sydäntä suojaavia) ominaisuuksia, kuten myös vertailemal- 30 la aineita, joiden tiedetään vaikuttavan näihin tarkoituksiin.

Kuvaava tämän keksinnön yhdisteiden vapaan radii-kaalin sieppausominaisuuden määrittämisessä käyttökelpoinen analyysi on lipidiperoksidaation in vitro inhibitio 35 rotan aivohomogenaateissa.

112658 23

Yhdisteiden vapaan radikaalin sieppausominaisuuksia voidaan helposti arvioida siten että tuotetaan superoksi-diradikaaleja 4 mU ksantiinioksidaasilla 0,1 mM ksantii-nin läsnä ollessa, ja ne osoitetaan 40 μΜ nitrosinitetrat-5 solin (NBT) reduktiolla diformatsaaniväriaineeksi spektrofotometrisessä analyysissä C. Beauchampin ja I. Fridovickin kuvaamalla tavalla (Analyt. Biochem., 1971, 44, 276 - 287). 30 U superoksididismutaasia inhiboi tätä reaktiota 90-%:isesti, mikä johtuu superoksidiradikaaleis-10 ta. Superoksidisieppaajan (testiyhdiste) läsnä ollessa syntyy kilpailua superoksidiradikaalista ja niinpä NBT:n värinmuodostuksen vähentyminen osoittaa testiyhdisteen superoksidiradikaalin sipeppausominaisuutta.

Lipidiperoksidaatioprosessin inhibitio voidaan mää-15 rittää käyttämällä kudoshomogenaatteja biologisten nesteiden antioksidanttiaktiivisuuden mittaamista varten J. Stocksin ym. (Clin.Sci. Mol. Med., 1974, 47, 215 - 222) metodologiaa käyttäen, jossa käytetään hoidettujen täysi-ikäisten Spraque Dawley-rottien aivokudoshomogenaatteja. 20 Inkuboidaan näytteitä, joissa on laimennettua aivo- homogenaattia ja sieppaajaa tarkoituksenmukaisena laimennoksena yhteensä 1 ml:n totaalivolyymin verran. Ei-inku-boituja näytteitä otetaan taustaksi. Kontrollit ajetaan ilman sieppajaa ja vain puskuria sisältävä näyte otetaan < 25 sokeaksi kokeeksi. Inkuboidaan 37 °C:ssa 30 min ajan, li- : sätään 200 μΐ 35-%:ista perkloorihappoa, näytteet sentrifugoidaan ja 800 μΐ supernatanttia sekoitetaan 200 pl:aan l-%:ista tiobarbituurihappoa. Vaaleanpunainen tiobarbituurihapon reaktiivisen materiaalin kondensaatio-30 tuote muodostuu 100 °C:ssa kiehuvassa vesihauteessa 15 min aikana, ja absorbanssi luetaan 532 nm:n kohdalla.

Kudoksen ex vivo -inhibitiota varten, mukaan lukien sydän- ja aivokudoksen, voidaan käyttää lipidiperoksidaa-tiota hiirissä demonstroimaan yhdisteiden penetraatiokykyä 35 ja kykyä toimia vapaan radikaalin sieppaajina näissä ku- 112658 24 doksissa. Tämä analyysi käsittää miespuolisten CDl-hiirten esihoidon testiyhdisteellä ihonalaisesti annettuna. Tunnin kuluttua kudokset leikataan, homogenisoidaan 1+9 (w/v) 20 nM kaliumfosfaattipuskurissa pH:ssa 7,3 (0,14 M KC1) ja 5 inkuboidaan 1/100 konsentraatiossa 1 mlrssa puskuria 37 °C:ssa 30 - 120 min:n ajan. Inkuboinnin lopussa lisätään 200 μΐ 35-%:ista perkloorihappoa ja proteiinin poistetaan sentrifugoinnilla. 800 ml:aan supernatanttia lisätään 200 μΐ l-%:ista TBArta ja näytteet kuumennetaan 10 100 °C:seen 15 min ajaksi. TBA-additiotuote uutetaan kah teen kertaan 1 ml:aan n-butanolia. Fluoresenssi mitataan 515 nm:n viritysaallonpituudella ja 553 nm:n emissioaal-lonpituudella malonidialdehydidimetyyliasetaalista valmistettua standardia vasten.

15 Stimuloidut ihmisen valkosolut vapauttavat radikaa leja ja muita happiaineenvaihdunnan tuotteita, jotka tulehduksen aikana toimivat mikrobeille myrkyllisinä aineina. Samalla ne vapauttavat proteolyyttisiä entsyymeitä, kuten elastaasia, jotka ovat myös mikrobeja tappavia mutta 20 potentiaalisesti uhkaavat isännän sidekudosta. Endogeeni-nen c^-proteiinaasin inhibiittori suojaa tavallisesti isän-täkudosta proteolyyttiseltä hajotukselta. Valkosoluperäi-set oksidantit inaktivoivat kuitenkin a]Pi:n. c^P^n inak-tivaation antagonismi osoittaa esitetyt radikaalisieppaa-25 jät. cijPl:n inhibitiokapasiteetin 50-%: iseen säilyttämiseen tarvittava konsentraatio (PC 50) riippuu läsnäolevien stimuloitujen valkosolujen määrästä.

: : Metodi: Käytettiin Skoseyn ja Chowin kuvaamaa mene telmää (kts. J. L. Skosey ja D. C. Chow julkaisussa Hand-\ 30 book of Methods for Oxygen Radical Research (Greenwald, R.

A., ed.), 1985, s. 413 - 416, CRC Press, Boca Raton). Lyhyesti sanottuna ihmisen c^P^ta inkuboitiin tsymosaanilla ' stimuloitujen ihmisen perifeerisen veren valkosolujen kanssa sieppaajien läsnä ollessa ja ilman niitä. Oksida-; 35 tiiviselta inaktivaatiolta suojatun axPi:n määrä määritet- 112658 25 tiin sen jäljelle jääneen elastaasin inhibitorisen kapasiteetin avulla.

5-lipoksigenaasin inhibitio voidaan määrittää rotan basofiilisista (emäshakuisista) leukemiasoluista (RBL-1) 5 saadun puhdistetun entsyymin avulla. J.-F. Nave ym. ovat kuvanneet määritysmenetelmän julkaisuissa Prostaglandins, 1988, 36, 385 - 398 ja Biochem. J., 1991, 278, 549 - 555. Eikosa-5(Z),8(Z)-dieenihappoja käytetään substraattina ja hapettuneet tuotteet (5-hydroperoksi- ja 5-hydroksieikosa-10 6,8-dienohapot) uutetaan ja analysoidaan HPLC:n avulla.

Weiss on julkaissut katsauksen tulehdusasian merkityksestä (kts. Weiss, N. England J. Med., 1989, 320, 365 -376). Keuhkolaajentuma assosioituu geneettiseen defektiin c^Piissä; tupakanpolton aikana sisäänhengitetyt hapetti-15 met, jotka johtavat alPi:n oksidatiiviseen inaktivaatioon keuhkokudoksessa, edistävät tautia edelleen (kts. J. Travis ja G.S. Salvesen, Annu.Rev.Biochem., 1983, 52, 655 -709). Hapetettu c^Pi on myös eristetty reumaattisesta nivelnesteestä (kts. P. S. Wong ja J. Travis, Biochem. 20 Biophys. Roc. Commun., 1980, 06, 1440 - 1454). Ihmisen valkosolujen in vitro vapauttamat superoksyyliradikaalit laukaisevat nivelnesteen viskositeettiin osallisen hyalu-ronihapon hajoaminen (kts. R. A. Greenwald ja S. A. Moak, : Inflammation, 1986, 10, 15 - 30). Lisäksi nonsteroidaalis- 25 ten anti-inflammatoristen (tulehdusta estävien) lääkkeiden ,, todettiin inhiboivan superoksyyliradikaalien vapautumista valkosoluista (kts. H. Strom ja I. Ahnfelt-Ronne, Agents : and Actions, 1989, 26, 235 - 237 ja M. Roche-Arveiller, V.

Revelant, D. Pharm Huy, L. Maman, J. Fontagne, J. R. J. 30 Sorenson ja J.P. Giroud, Agents and Actions, 1990, 31, 65 - 71) ja 5-aminosalisyylihapon terapeuttinen vaikutus tulehduksellisessa suolisairaudessa voi perustua radikaalin sieppausmekanismiin (kts. I. Ahnfelt-Ronne, 0. H. Nielsen, A. Christensen, E. Langholz, V. Biinder ja P. 35 Riis, Gastroenterology, 1990, 98, 1162 - 1169). Siksi tä- 112658 26 män keksinnön mukaisten yhdisteiden uskotaan olevan hyödyllisiä edellä mainituissa patologisissa tiloissa ja tulehduksellisten suolistosairauksien uskotaan olevan erityinen kohde. Antioksidanttien immuunijärjestelmää stimu-5 loiva vaikutus on myös raportoitu, koska ne lisäävät lymfosyyttien (imusolujen) aktiivisuutta (R. Anderson ja P.

T. Lukey, Ann. N. Y. Acad. Sei., 1987, 498, 229 - 247) in vitro triggeroitujen valkosolujen läsnä ollessa, ja ex vivo vapaaehtoisilla ihmisillä esihoidon jälkeen.

10 Niinpä hyvin tunnettua vakiometodologiaa käyttäen, kuten myös vertaamalla tunnettuihin käyttökelpoisiksi todettuihin yhdisteisiin, on todettavissa, että yhdisteet ovat vapaan radikaalin sieppaajia, jotka ovat hyödyllisiä liiallisesta glutamiinihapon vapautumisesta johtuvaan neu-15 rotoksisuuteen liittyvien tautitilojen, Huntingtonin taudin, Alzheimerin taudin ja muiden kognitiivisisten toimintahäiriöiden (esim. muistihäiriöt, oppimisvaikeudet ja keskittymisvaikeudet), amnesian (muistinmenetyksen), ja Parkinsonin taudin ennaltaehkäisyssä ja hoidossa, kuten 20 myös iskemian/reperfuusion aiheuttamien sydän-, keuhko-, munuais-, haima- ja aivokudosvaurioiden hoidossa ja ennaltaehkäisyssä, ja hemorraagisesta shokista johtuvan akuutin verenhukan hillitsemisessä.

: Tämän keksinnön mukaisia yhdisteitä voidaan käyttää 25 sekä ennaltaehkäisevästi että terapeuttisesti. Aktiivisen ainesosan määrä terapeuttisessa annossa voi vaihdella laa-joissa rajoissa ja riippuu sellaisista tekijöistä kuin : hoidettava potilaslaji, ikä, terveydentila, sukupuoli, paino, hoidettavan tilan luonne ja vakavuus. Termi "poti-. 30 las” viittaa lämminveriseen eläimeen, kuten esimerkiksi rottaan, hiireen, koiraan, kissaan, marsuun, kädellisiin ja ihmiseen. Yleensä terapeuttisesti (hoidollisesti) tehokas annettava aktiivisen ainesosan annos vaihtelee noin välillä 0,1 mg/kg ja 30 mg/kg painokiloa kohden päivässä. 35 Ennaltaehkäisevään annosteluun voidaan käyttää vastaavia 112658 27 alempia annoksia. Tämän keksinnön mukaisia yhdisteitä annetaan potilaalle edullisesti yhdistettynä farmaseuttisesti hyväksyttävään kantoaineeseen, joka on mikä tahansa aine, joka edesauttaa sen antamista vaikuttamatta olennai-5 sesti sen terapeuttisiin ominaisuuksiin.

Edullisimmin yhdisteitä annetaan suonensisäisesti etenkin kriisitilanteissa, joissa on olennaista, että terapeuttinen (hoitava) ainesosa saadaan sen vaikutuskohtaan niin nopeasti kuin mahdollista, kuten sydäninfarktin, hal-10 vauksen ja kirurgisten interventioiden aiheuttamissa hätätilanteissa, tilanteissa, jotka voivat aiheuttaa vakavaa reperfuusiovauriota.

Tämän keksinnön mukaisia yhdisteitä voidaan käyttää myös suun kautta annettuina, edullisesti käyttäen suurem-15 paa määrää aktiivista ainesosaa päivää kohden kuin paren-teraalisesti (ruuansulatuskanavan ulkopuolisesta) annettuna, edullisesti jakaen määrän 3-4 annokseen päivässä. Enteraalinen (ruuansulatuskanavan sisäinen) annostelu on suositeltavampi "kriisinjälkeisissä" tilanteissa, etenkin 20 sairaalasta pääsyn jälkeen. Yhdisteitä voidaan käyttää vakioannoksisina yksikkömuotoina kuten tabletteina, kapseleina, rakeina, lääketabletteina, eliksiireinä, emulsioi-,'na, suspensioina, ja milloin paikallinen anto on suositel-' ' tua, suppositorioina (peräpuikkoina) tai kielenalaisesti.

* ·' 25 100 - 400 mg aktiivista ainesosaa sisältävät tabletit tai kapselit ovat edullisia enteraalisia antotapoja. Tietenkin , tulehduksen hoidossa edullinen antotapa on depot-injektio : suoraan tulehdusalueelle, jatkossa enteraalinen antotapa.

Kiinteitä annosmuotoja kuten tabletteja valmistet-30 taessa aktiivinen ainesosa yleensä yhdistetään konventionaalisiin farmaseuttisiin kantoaineisiin tai täyteaineisiin, kuten gelatiiniin, eri tärkkelyksiin, laktoosiin, kalsiumfosfaattiin tai pölysokeriin. Termi farmaseuttinen kantoaine käsittää tässä myös voiteluaineet, joita käyte-35 tään parantamaan tabletin granulaatioiden juoksevuutta ja 112658 28 jotka ehkäisevät tablettimateriaalin adheesiota tabletti-muotteihin ja -lävistimiin. Sopivia voiteluaineita ovat esimerkiksi talkkisteariinihappo, kalsiumstearaatti, mag-nesiumstearaatti ja sinkkistearaatti. Tässä käytettynä 5 farmaseuttisen kantoaineen määritelmä käsittää myös disin-tegroivat aineet, joita lisätään edistämään nautittujen tablettien hajoamista ja liukenemista, kuten myös väri-ja/tai makuaineet, jotka lisäävät tablettien esteettisiä ominaisuuksia ja tekevät ne potilaalle mieluisammiksi.

10 Sopivia nestemäisiä täyteaineita nestemäisten an- nosmuotojen valmistusta varten ovat vesi ja alkoholit, kuten etanoli, bentsyylialkoholi ja polyetyleeniglykolit, joko pinta-aktiivisen aineen lisällä tai ilman. Yleensä edullisia nestemäisiä täyteaineita erityisesti injisoita-15 via valmisteita varten ovat vesi, fysiologiset ja suolaliuokset, dekstroosi ja glykoliliuokset kuten propyleeniglykolin tai polyetyleeniglykolin vesiliuokset. Injektio-kohdan ärsytyksen minimoimiseksi tai poistamiseksi, sellaiset koostumukset voivat sisältää ei-ionimuotoista pin-20 ta-aktiivista ainetta, jonka hydrofiili-lipofiilitasapaino (HLB) on noin 12 - 17. Pinta-aktiivisen aineen määrä sellaisissa formulaatioissa on noin 5-15 paino-%. Pinta-·;' aktiivinen aine voi olla yksittäinen ainesosa, jolla on : edellä identifioitu HLB, tai kahden tai useamman halutun 25 HLB:n omaavan ainesosan muodostama seos. Parenteraalisissa formulaatioissa hyödyllisistä pinta-aktiivisista aineista ’ kuvaavia ovat polyoksietyleenisorbitaanirasvahappoesterei- : den luokka, kuten esimerkiksi sorbitaanimono-oleaatti, ja etyleenioksidin hydrofobisen emäksen omaavat korkeamole-:\30 kyylipainoiset adduktit, joita muodostetaan kondensoimalla , propyleenioksidia propyleeniglykolilla. Tietyissä paikal lisissa ja parenteraalisissa valmisteissa voidaan käyttää eri öljyjä kantoaineina tai täyteaineina. Esimerkkeinä sellaisista öljyistä ovat mineraaliöljyt, glyseridiöljyt 35 kuten oleomargariini, turskanmaksaöljy, maapähkinäöljy, 112658 29 seesamiöljy, maissiöljy ja soijaöljy. Liukenemattomia yhdisteitä varten voidaan lisätä suspendoivia aineita kuten myös viskositeettiä kontrolloivia aineita, kuten esimerkiksi magnesiumalumiinisilikaattia tai karboksimetyy-5 liselluloosaa. Näiden täyteaineiden lisäksi voidaan lisätä myös puskureita, säilöntäaineita ja emulgointiaineita. Tyypillinen retentiotyyppinen peräruiskevalmiste edellyttää pienen tilavuuden, yleensä paljon vähemmän kuin noin 150 ml aikuisille, tyypillisesti edullisia ovat vain alle 10 muutaman millilitran tilavuudet. Retentioperäruiskeita varten käytettävät täyteaineet ja liuottimet tulisi luonnollisesti valita siten, että vältetään paksunsuolen ärsytystä ja minimoidaan eri ainesosien imeytyminen.

Tämän keksinnön mukaisia yhdisteitä voidaan antaa 15 myös ulkoisesti. Tämä voidaan saada aikaan yksinkertaisesti valmistamalla annettavasta yhdisteestä liuos, edullisesti käyttäen liuotinta, jonka tiedetään edistävän trans-dermaalista (= ihon läpäisevää) imeytymistä, kuten etanolia tai dimetyylisulfoksidia (DMSO) muiden täyteaineiden 20 kanssa tai ilman niitä. Edullisesti ulkoinen anto voidaan toteuttaa käyttämällä joko huokoista membraanityyppistä tai reservimembraanityyppistä tai kiinteiden sideaineiden lajitelmasta tehtyä laastaria.

’ Joitakin sopivia transdermaalisia valmisteita on 25 kuvattu US-patenttijulkaisuissa nro 3 742 951, 3 797 494, 3 996 934 ja 4 031 894. Nämä valmisteet sisältävät yleensä , '/ kantajaosan, joka rajaa sen toista päällyspintaa, toista : päällyspintaa rajaavan aktiivista ainesosaa läpäisevän tarttuvan kerroksen, ja vähintään yhden aktiivia ainesosaa 30 sisältävän varaston kahden päällyspinnan välissä. Vaihtoehtoisesti aktiivinen ainesosa voi olla sisällytetty suureen määrään mikrokapseleita, jotka on kauttaaltaan levitetty läpäisevälle tarttuvalle kerrokselle. Kummassakin tapauksessa aktiivista ainesosaa vapautuu jatkuvasti : 35 varastosta tai mikrokapseleista kalvon läpi aktiivista 112658 30 ainesosaa läpäisevään kiinnepintaan, joka on kontaktissa saajan ihoon tai limakalvoon. Jos aktiivinen ainesosa imeytyy ihon läpi, saaja saa kontrolloidun ja ennalta määrätyn virran aktiivista ainesosaa. Mikrokapseleiden ta-5 pauksessa kapseloiva aineosa voi toimia myös membraanina.

Toisessa valmisteessa tämän keksinnön mukaisten yhdisteiden transdermaalista antoa varten farmaseuttisesti aktiivinen yhdiste on sisällytetty matriisiin, josta se vapautuu halutulla asteittaisella, kontrolloidulla va-10 kionopeudella. Matriisi läpäisee yhdisteen vapautumisen diffuusiolla tai mikrohuokoisella virtauksella. Vapautuminen säätelee nopeutta. Sellainen systeemi, joka ei vaadi membraania, on kuvattu US-patenttijulkaisussa nro 3 921 636. Näissä systeemeissä on ainakin kaksi mahdollis-15 ta vapautumistapaa. Vapautumista diffuusiolla tapahtuu, kun sideaine ei ole huokoista. Farmaseuttisesti vaikuttava yhdiste liukenee ja hajaantuu itse sideaineeseen. Vapautumista mikrohuokoisella virtauksella tapahtuu, kun farmaseuttisesti vaikuttava yhdiste kulkeutuu nestemäisen 20 faasin läpi sideaineen huokosissa.

Tämän keksinnön mukaiset yhdisteet voidaan yhdistää aerosolivalmisteeseen alan ammattilaisten yleisesti tuntemia teknisiä menetelmiä käyttäen. Aerosolivalmisteita voi- • daan valmistaa käytettäviksi ulkoisina aerosoleina tai 25 inhalaatioina. Aerosolivalmisteet voivat olla liuoksen tai ., / suspension muodossa ja voivat sisältää muita ainesosia, kuten liuottimia, ponneaineita ja/tai dispergointiaineita.

; Tyypillisiä esimerkkejä aerosolivalmisteista on esitetty julkaisussa Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., , 30 Mack Publishing Company, Easton Pennsylvamia, s. 1694 - 1712 (1990).

Kuten useimmissa tapauksissa, joissa tietyillä ke- • miallisten yhdisteiden luokilla on todettu olevan suotui- : siä terapeuttisia käyttösovelluksia, tietyt subgeneeriset 35 ryhmät ja eräät tietyt yhdisteet ovat luonnollisesti edul- 112658 31 lisiä. Tässä yhteydessä edullisia ovat rakennekaavan IB mukaiset yhdisteet ja edullisesti siten että R on metyyli, Ri on metyyli ja/tai n on nolla. Kun R2 on C(0)R3, Rx on edullisesti C^-alkyyli, edullisemmin C^-alkyyli ja 5 edullisimmin metyyli.

Claims (10)

32 1 12 6 5 8

1. Menetelmä kaavan (IA) tai (IB) mukaisen kardio-protektiivisen yhdisteen, niiden yksittäisten stereoiso-5 meerien ja näiden seosten, ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi, Ri ?Rs oh R 3 IA tai

15 Ri oh \ I c=0

20 R IB >’ ·’, joissa kaavoissa * « · » I » · . .·, R on H tai Ci-4-alkyyli Ri on Ci-4-alkyyli,

25 R2 on H tai C(0)R3, « < > *;;; R3 on H tai Ci-9-alkyyli, » * » *·’ ’ R4 on OR tai N(R)2, Rs on H, -C(0)R tai Ci-4-alkyyli, ja ’.· n on nolla tai yksi; 30 tunnettu siitä, että dihydroksyloidaan seuraava yhdiste ; k

35 Ri^U^0^f(CH2)nC(0)R4 Ri u CH, R 3 112658 33 sopivalla hydroksyloivalla aineella, jolloin saadaan seu-raavan rakennekaavan mukaisia joko cis- tai trans-muotoi-sia yhdisteitä R OH c ~ JO JL /-OH . -«CHa>.«0>R. R1 I ^ CH. R 3 10 tai milloin 4-hydroksiryhmä on cis-asemassa happofunktioon nähden, eli kun R4 edustaa OH-ryhmää, saadaan seuraavan rakennekaavan mukainen laktoni R, 0H R,0-v/--'1---\ 15 oi >o . Rrr^°

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n- 20. e t t u siitä, että yhdisteellä on kaava IB.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yhdisteellä on kaava IA.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n- » * n e t t u siitä, että R on metyyli. ‘25 5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että R3 on metyyli.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että n on nolla.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 30 tunnettu siitä, että R2 on H.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että R2 on C(0)R3 ja R3 on metyyli.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yhdiste on rakennekaavan IB 35 mukainen, R on metyyli, R3 on metyyli ja n on nolla. 112658 34

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan anti-f +/-)-7-asetyylioksi-2,3-dihydro-10-hydroksi- 2,6,8,9-tetrametyyli-2,5-metano-5H-l,4-bentsodioksepiini-5 3-oni; metvvli-trans. cis-(+/-)-6-asetyylioksi-3,4-dihyd-ro-3,4-dihydroksi-2, 5,7,8-tetrametyyli-2|i-l-bentsopyraani-2-karboksylaatti; 10-anti-(+ /-)-2,3-dihydro-7,10-dihydroksi-2,6,8,9-10 tetrametyyli-2,5-metano-5H-l,4-bentsodioksepiini-3-oni; trans. cis-(+/-)-3,4-dihydro-3,4,6-trihydroksi-2,5,7,8-tetrametyyli-2H-l-bentsopyraani-2-karboksyylihap-po; 10-anti-( +)-(2£, 5R, 10R)-7-asetyylioksi-2,3-dihydro-15 10-hydroksi-2,6,8,9-tetrametyyli-2,5-metano-5H-l, 4-bentso- dioksepiini-3-oni; 10-anti-(+1-(2Sr5R,10R)-2,3-dihydro-7,10-dihydrok-si-2,6,8,9-tetrametyyli-2, 5-metano-5H-l, 4-bentsodioksepii-ni-3-oni; 20 10-anti-( - )-(2R, 5S, 10£)-7-asetyylioksi-2,3-dihydro- 10-hydroksi-2,6,8,9-tetrametyyli-2, 5-metano-5H-l, 4-bentso-dioksepiini-3-oni; cis,cis-(+ )-(2R, 3£, 4£)- 3,4-dihydro-3,4, 6-trihydrok-si-2,5,7,8-tetrametyyli-2H-l-bentsopyraani-2-karboksyyli-: 25 happo; : : 10-anti-(-)-(2R,5£,10S)-2,3-dihydro-7,10-dihydrok- si-2,6,8,9-tetrametyyli-2,5-metano-5H-l, 4-bentsodioksepii-ni-3-oni; : 10-sya^(+)-(2£,5R,10S)-7-asetyylioksi-2,3-dihydro- 30 10-hydroksi-2,6,8,9-tetrametyyli-2,5-metano-5H-l, 4-bentso-, dioksepiini-3-oni; , trans.trans-(-)-(2S.3R,4R)-3,4-dihydroo-3,4,6-tri- hydroksi-2, 5,7,8-tetrametyyli-2H-l-bentsopyraani-2-karbok-syylihappo; 112658 35 10-sya-( + )-(22., 5R, 10£)-2,3-dihydro-7,10-dihydroksi- 2.6.8.9- tetrametyyli-2,5-metano-5H-l,4-bentsodioksepiini- 3-oni; 10-syn-( -)-(2 )-(2R, 5S, 10R)-7-asetyylioksi-2,3-di-5 hydro-10-hydroksi-2,6,8,9-tetrametyyli-2,5-metano-5H-l,4-bentsodioksepiini-3-oni; raetyyli-cis, trans-(2R,3R,4R)-4,6-diasetyylioksi- 3,4-dihydro-3-hydroksi-2,5,7,8-tetrametyyli-2H-l-bentsopy-raani-2-karboksylaatti; 10 metyyli-cisf trans-(2Rr 3Rf 4R)-6-asetyylioksi-3f 4- dihydro-3,4-dihydroksi-2,5,7,8-tetrametyyli-2H-l-bentsopy-raani-2-karboksylaatti; trans. trans-(+)-(2R,3£,4S)-3,4-dihydro-3,4,6-tri-hydroksi-2,5,7,8-tetrametyyli-2H-l-bentsopyraani-2-karbok-15 syylihappo; 10- syn- ( - )-( 2R, 5£, 10R)-2,3-dihydro-7,10-dihydroksi- 2.6.8.9- tetrametyyli-2,5-metano-5H-l,4-bentsodioksepiini- 3-oni; 11- syn-(+/-)-8-asetyylioksi-2,3,4,6-tetrahydro-ll- 20 hydroksi-2,7,9,10-tetrametyyli-2,6-metano-l,5-bentsodiok- sosiini-4-oni; tai trans,cis-(+/-)-6-asetyylioksi-3,4-dihydro-3,4-di-hydroksi-2,5,7,8-tetrametyyli-2H-l-bentsopyraani-2-etikka-hapon metyyliesteri.

4. I 36 112658