FI110870B - Kasvinsiemenanalogeja, menetelmiä niiden valmistamiseksi, menetelmiä kasvikudosyksikön ja kasvin alkion idättämiseksi sekä laitteisto siemenanalogien hapettamiseksi - Google Patents

Description

: 110870

Kasvinsiemenanalogeja, menetelmiä niiden valmistamiseksi, menetelmiä kasvikudosyksikön ja kasvin alkion idättämiseksi sekä laitteisto siemenanalogien hapettamiseksi 5 Keksinnön kenttä Tämä keksintö koskee menetelmää kasvien lisäämiseksi. Tarkemmin määriteltynä se koskee menetelmiä kasvien li-sääntymisyksiköiden tuottamiseksi, joista kukin sisältää lisätyn kasvin alkion ja joka voidaan kylvää luonnollisten 10 siementen tavoin.

Keksinnön tausta

Nykyaikainen maanviljelys, metsänhoito mukaan luettuna, vaatii usein, että istutetaan suuria määriä suurin piirtein identtisiä kasveja, joista on tehty geneettisesti 15 sellaisia, että ne kasvavat optimaalisesti jossakin määrätyssä paikassa, tai sellaisia, että niillä on määrättyjä muita toivottavia piirteitä. Uusien kasvien tuotanto suvullisen lisääntymisen kautta, joka antaa tulokseksi kasvin-siemeniä, voi olla hidasta ja on usein altista geneettisil-20 le rekombinaatiotapahtumille, jotka johtavat vaihteleviin ominaisuuksiin jälkeläisissä. Mainitunlainen risteyttäminen ·; on myös aikaavievää ja työlästä. Lisäksi sisäsiittoisilta ·· kannoilta, kuten mainitunlaisten risteytysten tekemiseen käytetyiltä, puuttuu usein elinvoimaa, mikä johtaa alhai-25 seen siementuotantoon.

Huolimatta tavanomaisen suvullisin keinoin tehdyn risteyttämisen haittapuolista on mainitunlaisilla menetel- • * · ' ’ millä tuotetuilla kasvinsiemenillä se tärkeä etu, että ku kin siemen käsittää ravintovarastoelimet ja suojarakenteet, ·. 30 jotka suojaavat siemenen sisällä olevaa kasvialkiota anka- raita maaympäristöltä ja ravitsevat alkiota ratkaisevien : kylvö- ja itämisvaiheiden aikana. Ilman tällaisia elimiä ja >>tt; rakenteita kasvialkio olisi kyvytön säilymään hengissä . luonnossa ennen kasvamistaan taimen kokoiseksi.

t * » : 35 2 110870

Niiden epäkohtien vuoksi, joita liittyy identtisten jälkeläiskasvien tuottamiseen suurina määrinä suvullisin keinoin, on tutkittu intensiivisesti kaupallisesti arvokkaiden kasvien lisäämistä viljelemällä somaattisia tai tsy-5 goottisia kasvialkioita. Tällaisen "suvuttoman" lisäämisen on osoitettu joidenkin lajien kohdalla antavan tulokseksi suuria määriä geneettisesti identtisiä alkioita, joista kullakin on kyky kehittyä normaaliksi kasviksi. Näiltä alkioilta, joita tuotetaan laboratorio-olosuhteissa, puuttu-10 vat ikävä kyllä siemenissä esiintyvät suoja- ja ravintora-kenteet. Tämän seurauksena alkioita täytyy tavallisesti kasvattaa edelleen laboratorio-olosuhteissa, kunnes ne saavuttavat autotrofisen "taimitilan", jolle on tunnusmerkillistä kyky tuottaa oma ravintonsa fotosynteesin kautta, 15 kestää kuivuutta, tuottaa juuria, joilla on kyky tunkeuta maahan, ja torjua maaperän mikro-organismeja. Mainitunlainen laajamittainen laboratorioviljely kasvin muutaman eri kehitysvaiheen ajan on aikaavievää, kallista ja ammattitaitoista työvoimaa vaativaa.

20 Jotkut tutkjat ovat kokeilleet "keinotekoisten" siementen tuottamista koteloimalla yksittäisiä somaattisia * :· tai tsygoottisia kasvialkioita hydratoituun geeliin. (Tässä -;· käytettynä "hydratoitu" tarkoittaa vapaan veden läsnäoloa jakautuneena kaikkialle geelikotelon muodostavaan geelimo-25 lekyylimatriksiin.) Tämä menetelmä sai alkunsa muista tut-kimuksista, jotka osoittivat, että siementen kotelointi hydratoituihin geeleihin voi edistää itämistä joidenkin la- ti» • jien kohdalla erityisesti siitä syystä, että mainitunlaisia geelejä voidaan täydentää kasvihormoneilla ja muilla yhdis-*: 30 teillä, jotka edistävät itämistä ja parantavat taimen pysy- mistä hengissä pellolla. Keinotekoisten siementen suhteen > : viitataan EP-hakemusjulkaisuun 0 107 141, joka on Plant Ge- netics, Inc. :n nimissä ja julkaistu 2. toukokuuta 1984 . (jolla vaaditaan prioriteettia US-patenttijulkaisun : *.· 35 4 562 663 nojalla, joka julkaistu 12. lokakuuta 1982) ja '·“* jossa esitetään, että kasvialkioiden kotelointiin käytettä- 3 110870 vien hydratoitujen geelien pitäisi mahdollistaa kaasun diffuusio ympäristöstä alkioon ja suojata alkiota hankautumiselta. Sopiva geeli voidaan valita alginaattien, guarkumi-en, agarin, agaroosin, gelatiinin, tärkkelyksen, polyakryy-5 liamidin ja muiden geelien joukosta. Geeli voi sisältää lisäaineita, kuten kasviravinteita, pestisidejä ja hormoneja. Tarvittaessa geelin pinta voidaan kovettaa hankauksen- ja tunkeutumisenkeston parantamiseksi.

Vaikka hydratoitu geelikapseli näyttää antavan 10 riittävästi kosteutta kasvialkiolle ja tyydyttävän suojan fysikaalisia vaurioita vastaan joissakin tapauksissa, sillä on heikko läpäisevyys ilmakehän kaasujen, erityisesti hapen, suhteen, jotka ovat välttämättömiä alkion hengissä pysymisen ja kasvun kannalta. Tämän seurauksena on tehty jon-15 kin verran työtä, jonka päämääränä on ollut hapen määrän lisääminen kotelon sisällä. US-patenttijulkaisussa 4 808 430, joka on Kuonon nimissä, esitetään siemenen kote-lomista hydratoituun geeliin yhdessä ilmakuplan kanssa. Ikävä kyllä tällainen kupla sisältää itse asiassa hyvin 20 pienen tilavuuden ilmaa, joka monissa tapauksissa ei tarjoa tarpeeksi happea asianmukaista itämistä varten. Asia on tä-*:· ten erityisesti varastoitaessa mainitunlaisia kuplan sisäl- ··· täviä kapseleita jonkin pituinen aika huoneenlämpötilassa.

Huoneenlämpötilassa monentyyppisten kasvien alkiot hengit-25 tävät, vaikka eivät varsinaisesti itäisi, mikä kuluttaa < · ;·ι·ι happea. Koska hydratoitu geeli on heikko ilman hapen absor- ,,! boija, joutuu siemenssä oleva alkio pian happivajaustilaan • huolimatta kuplassa olevasta aluksi otaksuttavasti riittävästä varastosta. Tämän seurauksena mainitunlaisen varas- » » * » *. 30 toinnin jälkeen ei ole jäljellä happea itämisen tukemisek- • * » •.,. · s i .

,*, : Heikkouksia, jotka liittyvät ilmakuplan sisällyttä- i>ti; miseen yhdessä koteloidun siemen kanssa, ei korjattaisi . täysin koteloimalla alkio tai siemen vaahtoutettuun gee- * » i : ’.· 35 liin, joka sisältää useita ilmakuplia. Kaasunvaihtoon käy- '**'! tettävissä oleva todellinen pinta-ala ympäröivän atmosfää- 4 110870 rin, geelikapselin, ilmakuplien ja alkion välillä on edelleen sangen pieni vaahtoutetussa geelissä. Tällainen pieni pinta-ala yhdistyneenä hapen pieneen siirtymisnopeuteen ilman ja hydratoidun geelin välillä antaisi tulokseksi liian 5 alhaisen hapenluovutusnopeuden alkioon, erityisesti itämisen aikana, jolloin happivaatimukset kasvavat nopeasti.

Toinen tähänastisiin keinotekoisiin siemeniin liittyvä ongelma on niistä tuotettavissa olevien onnistuneiden versojen, erityisesti "normaalien" versojen, alhainen luku-10 määrä. Vaikka monet tekijät voivat todennäköisesti aiheuttaa epänormaalia itämistä, nämä tulokset osoittavat yleensä, että alalla nykyisin tunnetut keinotekoiset siemenet eivät simuloi täsmällisesti luonnonsiemenissä läsnä olevia tärkeitä fysikaalisia parametreja, kuten sitä, miten ja 15 minkäasteisesti alkio pysyy keinotekoisen siemenen sisällä.

Siten on olemassa tarve saada aikaan kasvinsie-menanalogi, joka käsittää kasvialkion kosketuksessa hydratoidun geelin kanssa, jossa vallitsee korotettu happipitoisuus .

20 On myös olemassa tarve saada aikaan kasvinsie- menanalogi, joka simuloi paremmin luonnollsta tapaa, jolla ;· kasvialkio pysyy siemenen sisällä.

··· On myös olemassa tarve saada aikaan kasvinsiemen, josta saatavien onnistuneiden normaalien versojen lukumäärä 2 5 on suurempi.

» · > Yhteenveto keksinnöstä

Esillä olevan keksinnön kohteena on erityisesti se, * mitä patenttivaatimuksissa on määritelty.

Tämän keksinnön yhden puolen mukaisesti tarjotaan • · *. ·; 30 käyttöön kasvinsiemenanalogi, joka käsittää kasvialkion tai muun totipotentin kasvikudosyksikön koteloituna hydratoi-.·. : tuun hapetettuun geeliin tai ainakin kosketuksessa sen ’ t': kanssa. Geeli sisältää edullisesti myös liuenneita ravin- . teitä ja muita hyödyllisiä yhdisteitä, kuten vitamiineja, ; 35 hormoneja ja hiili- ja energialähteitä, joita itävä alkio M M | I · 5 110870 voi hyödyntää kasvun tai elossapysymistodennäköisyyden parantamiseksi. Soveltuvat geeliytyvät liuenneet aineet ovat kasveille suurin piirtein myrkyttömiä, ja ne voidaan valita monien eri tyyppien, kuten, mainittuihin kuitenkaan rajoit-5 tumatta, natriumalginaatin, agarin, agaroosin, amyloosin, pektiinien, dekstraanin, gelatiinin, tärkkelyksen, muunnettujen selluloosien ja polyakryyliamidin joukosta. Geeli toimii siten "keinotekoisena gametofyyttinä" alkiolle luonnollisen kasvinsiemenen gametofyyttiosan kanssa analogisel-10 la tavalla.

On ymmärrettävä, että termi "keinotekoinen gameto-fyytti" tarkoittaa, että geeli toimii keinotekoisena endo-sperminä tai siemenen muuna ravitsemuskudoksena totipoten-tin kasvikudoksen alkuperän mukaan.

15 Eri kasvilajien alkiot tarvitsevat erilaisia määriä happea itääkseen. Siten "hapetulla" geelillä on tässä käytettynä happipitoisuus, joka on korkeampi kuin happipitoisuus, joka muuten imeytyisi atmosfääristä normaalilämpöti-lassa ja -paineessa. "Happea kantava" geeli on samantyyppi-20 nen geeli, joka sisältää mitä tahansa ulkopuolelta lisättyä happea absorboivaa tai happea kantavaa ainetta. Siten hap-_G* pea kantava geeli on yksi hapetetun geelin tyyppi.

**· Yksi tapa saada aikaan tämän keksinnön mukaisen geelin hapetus on puhaltaa happikaasua geeliliuoksen läpi 25 ennen geelin kovettumista. Vaihtoehtoisesti geelikapselit voidaan hapettaa saattamalla ne kovettumisen jälkeen alt-,,! tiiksi hapen vaikutukselle, tarvittaessa paineen alaisena.

* Geelin hapettumista edistetään lisäämällä kovettu- mattomaan geeliliuokseen sopivalla tavalla stabiloitua hap-'' 30 pea kantavan tai happea absorboivan yhdisteen emulsiota, ...· joka yhdiste valitaan perfluorihiilivetyjen ja silikoniöl- .·. : jyjen joukosta. Perf luorihiilivetyj en edustajia ovat per- fluorisykloalkaanit, perfluori (alkyylisykloalkaanit) , tyydyttyneet heterosykliset perfluorialkyyliyhdisteet ja per-; .* 35 fluori(tert-amiinit). Tämän tyyppisillä yhdisteillä on kyky 6 110870 absorboida suuria määriä happea, ja ne ovat myös inerttejä ja suurin piirtein myrkyttömiä.

Emulsio stabiloidaan edullisesti lisäämällä kasveille suurin piirtein myrkytöntä pinta-aktiivisuusainetta 5 geeliliuoksen ja perfluorihiilivedyn tai silikonin seokseen. Pinta-aktiivisuusaineisiin kuuluvat metyylioksi-raanipolymeerit, muna-albumiini ja kasveille suurin piirtein myrkyttömät pinta-aktiivisuusaineet, kuten elintarvikkeissa tai nieltävissä lääkkeissä käytettäviksi tarkoitetut 10 pinta-aktiivisuusaineet.

Perfluorihiilivetypitoisuus (tai silikonipitoisuus) voi riippua geeliin koteloitavan kasvilajin happivaatimuk-sista, käytettävän perfluorihiilivedyn (tai silikoniöljyn) hapenkantokapasiteetista, geelin tyypistä tai emulsion si-15 sältämien mikropisaroiden koosta. Geelin perfluorihiilive-typitoisuus (tai silikoniöljypitoisuus) on yleensä korkeintaan noin 15 % (paino/tilavuus) ja silikoniöljypitoisuus korkeintaan noin 30 % (paino/tilavuus).

Pinta-aktiivisuusainepitoisuus riippuu käytettäväs-20 tä pinta-aktiivisuusaineesta ja emulsion sisältämien mikro-pisaroiden koosta. Kun pisaroiden läpimitta yksikkötilavuu-:· dessa perfluorihiilivetyemulsiota laskee, dispergoituneen *· faasin pinta-ala kasvaa ja siten tarvitaan enemmän pinta- aktiivisuusainetta emulsion stabiloimiseksi sopivasti.

* · 25 Yleensä pinta-aktiivisuusainepitoisuus on korkeintaan noin 10 % (paino/tilavuus) .

Tämän keksinnön mukainen siemenanalogi sisältää • 1 · * * edullisesti jonkin "sirkkalehtipidäkejärjestelyn". Tämä tarkoittaa, että alkion aikaisessa kasvaa siemenanalogissa *. *: 30 valmistautuakseen itämään siitä alkion yhtä tai useampaa ·...· sirkkalehteä estetään kasvamasta geeliin ja jäämästä louk- ,·. : kuun siihen. Edullisiin sirkkalehtipidäkevälineisiin kuulu- • t i vat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, mitkä tahan-. sa erilaiset huokoiset, putkimaiset rakenteet, jotka ympä-

• » I

i 35 5***1 7 110870 röivät alkiota, erityisesti alkion yhtä tai useampaa sirk-kalehteä, ja ovat kosketuksessa sen tai niiden kanssa. Huokoinen putki puolestaa sijaitsee geelin ontelossa. Huokoinen putki mahdollistaa veden, ravinteiden ja hapen kul-5 jetuksen geelistä alkioon. Sirkkalehdet suuntautuvat huokoisessa putkessa kohden suljettua päätä ja alkeisjuuri kohden avointa päätä, joka voi olla kevyesti peitetty kuivumisen estämiseksi. Kun yksi tai useampi sirkkalehti pidentyy itämisen aikana, ne työntyvät kohden putken suljetit) tua päätä, ja estävät sirkkalehtien jäämisen loukkuun ja pakottavat alkeisjuuren ulos huokoisen putken avoimesta päästä. Siten itävä alkio tulee ulos siemenanalogista luonnollisen kasvinsiemenen itämistä vastaavalla tavalla.

Tämän keksinnön mukainen kasvisiemenanalogi voi 15 sisältää myös jäykän ulkokuoren lisäsuojana kuivumista ja fysikaalisia vaurioita vastaan. Ulkokuorella voi olla suippeneva tai kiilan muotoinen pää alkeisjuuren ulostulon helpottamiseksi itämisen aikana. Ulkokuoressa voi myös olla aukko tai vastaava osa, tai se murtuu helposti auki 20 itämisen aikana, mikä tekee alkeisjuuren ulostyöntymisen analogista suhteellisen helpoksi itämisen aikana. Ulkokuori voidaan valmistaa erilaisista materiaaleista, mukaan • » · luettuina, mainittuhan kuitenkaan rajoittumatta, selluloo- • samateriaalit, lasi, muovi, kovetetut polymeerihartsit, .* 25 parafiini ja niiden yhdistelmät.

* Ulkokuori voi lisäksi käsittää useita kerroksia, 1 ' t jolloin sen sisempi kerros voi käsittää suhteellisen tai-: : : puisaa ja vettä läpäisemätöntä selluloosamateriaalia ja ulompi kerros polymeerimateriaalia, jolla on korkea kuiva-30 lujuus ja alhainen märkälujuus. Vaihtoehtoisesti sisempi ,·. kerros voi käsittää jäykän muotokappaleen, kuten päistään * avoimen sylinterin, jolloin ainakin osa mainituista avoi- : mistä päistä on peitettynä ulkokerrosmateriaalilla, jolla ; * on korkea kuivalujuus ja alhainen märkälujuus.

8 110870

Ulompi kuori voi lisäksi vaihtoehtoisesti käsittää suhteellisen taipuisaa selluloosa- tai vastaavaa materiaalia, joka on muotoiltu noudattamaan ainakin osittain siinä olevan hydratoidun hapetetun geelikapselin muotoa ja jossa 5 on ainakin yksi suippeneva pää. Suippeneva pää päättyy aukoon, joka on edullisesti peitetty polymeerimateriaalilla, jolla on korkea kuivalujuus ja alhainen märkälujuus.

Vaikka alkion sisältävä geeliyksikkö sisältää edullisesti ravinteita siihen liuenneina, on mahdollista liuot-10 taa ravinteet erilliseen ravinteita sisältävään yksikköön, joka on kosketuksessa alkion sisältävän geeliyksikön kanssa. Ravinteita sisältävä yksikkö voi koostua mistä tahansa kasveille suurin piirtein myrkyttömästä aineesta, joka mahdollistaa sisällään olevien ravinteiden kuljetuksen veden 15 kautta alkion sisältävään yksikköön. Tällaisten aineiden edustajia ovat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, vesi, samanlainen geeli kuin alkion sisältävässä yksikössä, vermikuliitti, perliitti tai mikä tahansa polymeerinen materiaali, joka on myrkytöntä ja vapauttaa helposti ravin-20 teet jonkin ajan kuluessa. Ravinteet voidaan esimerkiksi mikrokapseloida sinänsä tunnetulla tavalla, i* Tämän keksinnön yhtenä päämääränä on siten tarjota Ί* käyttöön kasvinsiemenanalogeja, joille on tunnusmerkillistä .V. kasvialkioiden korkea itämisprosentti.

25 Yhtenä lisäpämääränä on tarjota käyttöön mainitun- lainen analogi, joka käsittää totipotentin kasvikudosyksi-kön koteloituna hydratoituun hapetettuun geelin tai ainakin ' kosketuksessa sellaisen kanssa, niin että tarjolla on riit tävästi happea totipotentin kasvikudosyksikön menestyksel-1. 30 lisen itämisen mahdollistamiseksi.

Yhtenä lisäpäämääränä on tarjota käyttöön mainitun- ·. : lainen analogi, joka sisältää happea suurempana pitoisuute- > » > i(ii| na, kuin mitä hydratoiduissa geeleissä olisi normaalisti . läsnä ilmakehästä tapahtuvan hapen absorption seurauksena.

Ί i t ; 35 MH» * » 9 110870

Yhtenä lisäpäämääränä on tarjota käyttöön mainitunlainen analogi, jossa on ulkokuori geelin ja alkion suojaamiseksi paremmin kuivumiselta ja fysikaalisilta vaurioilta, joka kuitenkin helpottaa korotettujen happipitoi-5 suuksien ylläpitämistä siemenanalogin sisällä ja sallii verson puhkeamisen ulos siemenanalogista itämisen aikana.

Yhtenä lisäpäämääränä on tarjota käyttöön mainitunlainen analogi, jossa on sopiva sirkkalehtipidäke, jonka tarkoituksena on mahdollistaa alkion itäminen analogista 10 tavalla, joka muistuttaa normaalia itämistä siemenestä.

Tämän keksinnön edellä esitetyt päämäärät ja muut piirteet ja edut ymmärrettäneen täydellisemmin keksinnön yksityiskohtaisen kuvauksen edetessä, erityisesti tarkasteltaessa sitä yhdessä liitteenä olevien piirustusten 15 kanssa.

Piirustusten lyhyt kuvaus

Kuvio IA on poikkileikkauskuva yhdestä keksinnön mukaisen kasvinsiemenanalogin suoritusmuodosta, joka käsittää alkion koteloituna hydratoituun hapetettuun gee-20 liin.

Kuvio IB on poikkileikkauskuva yhdestä kuvion IA , esittämän kasvinsiemenanalogin vaihtoehtoisesta suoritus- » i · ‘" t* muodosta.

·’· Kuvio 1C on poikkileikkauskuva yhdestä toisesta * · » 25 kuvion IA esittämän kasvinsiemenanalogin vaihtoehtoisesta ’ ·” · suoritusmuodosta.

il · • ’,·* Kuvio 2A on poikkileikkauskuva kasvinsiemenanalo- : gista, joka on samankaltainen kuin kuvion IA esittämä, mutta sisältää myös ulkokuoren.

| 30 Kuvio 2B on poikkileikkauskuva yhdestä kuvion 2A

,··. esittämän kasvinsiemenanalogin vaihtoehtoisesta suoritus- • · ] · muodosta.

• · i : Kuvio 2C on poikkileikkauskuva yhdestä toisesta kuvion 2A esittämän kasvinsiemenanalogin vaihtoehtoisesta 35 suoritusmuodosta.

» t t * · I t » » 10 110870

Kuvio 3A on poikkileikkauskuva koneellisessa kylvö-menetelmässä käyttökelpoisesta kasvinsiemenanalogista.

Kuvio 3B on poikkileikkauskuva yhdestä kuvion 3A esittämän kasvinsiemenanalogin vaihtoehtoisesta suoritus-5 muodosta.

Kuvio 3C on poikkileikkauskuva yhdestä toisesta kuvion 3A esittämän kasvinsiemenanalogin vaihtoehtoisesta suoritusmuodosta.

Kuvio 3D perspektiivikuva kuvion 3C esittämälle 10 analogille vaihtoehtoisen suoritusmuodon ulkopuolesta.

Kuvio 4 on peräkkäisiä vaiheita esittävä kaaviokuva, joka valaisee yhtä itämistapaa, joka usein havaitaan tämän keksinnön mukaisen kasvinsiemenanalogin yhteydessä ja jossa geelikapseli pysyy jonkin aikaa kiinnittyneenä 15 itävän alkion alkeisvarteen.

Kuvio 5 on kuvion 4 kaltainen peräkkäisiä vaiheita esittävä kaaviokuva, jossa geelikapseli kuitenkin pysyy jonkin aikaa kiinnittyneenä itävään alkioon.

Kuvio 6 on poikkileikkauskaaviokuva kasvinsiemen-20 analogista, jota arvioidaan kuten esimerkin 4 käsittelyssä (2).

Kuvio 7 on poikkileikkauskaaviokuva kasvinsiemenan- I t ' ; alogista, jota arvioidaan kuten esimerkin 4 käsittelyssä :(4).

.25 Kuvio 7 on poikkileikkauskaaviokuva kasvinsiemen- • '· analogista, jota arvioidaan kuten esimerkin 4 käsittelyssä TV (6).

: : : Kuvio 9A on pylväsdiagrammi, joka esittää alkeis- juurten ja alkeisvarsien prosentuaalista itämistä kasvin-30 siemenanalogeista, joka on määritetty kahden viikon inku-.··*. boinnin jälkeen esimerkissä 6.

Kuvio 9B on pylväsdiagrammi, joka esittää esimer-*· '.* kissä 6 kahden viikon inkuboinnin jälkeen havaittujen itä- ·"* neiden alkioiden epämuodostumien prosentuaalista osuutta.

I t a 1 » u 110870

Kuvio 9C on kahden viikon inkuboinnin jälkeen saatu pylväsdiagrammi, joka esittää esimerkissä 6 määritettyjä itäneiden alkioiden alkeisjuurien ja alkeisvarsien pituuksia.

5 Kuvio 9D on muuten samanlainen pylväsdiagrammi kuin kuviossa 9A, mutta tulokset on saatu esimerkissä 6 viiden viikon inkuboinnin jälkeen.

Kuvio 9E on muuten samanlainen pylväsdiagrammi kuin kuviossa 9B, mutta tulokset on saatu esimerkissä 6 viiden 10 viikon inkuboinnin jälkeen.

Kuvio 9F on muuten samanlainen pylväsdiagrammi kuin kuviossa 9C, mutta tulokset on saatu esimerkissä 6 viiden viikon inkuboinnin jälkeen.

Kuvio 10A on pylväsdiagrammi, joka esittää esimer-15 kissä 7 määritettyjä muutamien paljassiemenisten lajien eri alkiorakenteiden epämuodostumien prosentuaalisia osuuksia kapseleista itämisen jälkeen.

Kuvio 10B on pylväsdiagrammi, joka esittää esimerkissä 7 määritettyjä itäneiden alkioiden alkeisjuurien ja 20 alkeisvarsien pituuksia.

Kuvio 11A on pylväsdiagrammi, joka esittää esimerkissä 8 havaittujen alkioiden epämuodostumien prosentuaa- ·· : lista osuutta.

- * * .. ·' Kuvio 11B on pylväsdiagrammi, joka esittää esimer- 25 kissä 8 määritettyjä itäneiden alkioiden alkeis juurien ja alkeisvarsien pituuksia.

| Kuvio 12A on pylväsdiagrammi, joka esittää esimer- kissä 9 havaittujen alkioiden epämuodostumien prosentuaalista osuutta.

: 30 Kuvio 12B on pylväsdiagrammi, joka esittää esimer- kissä 9 määritettyjä itäneiden alkioiden alkeisjuurien ja » · T alkeisvarsien pituuksia.

♦ ·

Kuvio 13A on pylväsdiagrammi, joka esittää esimer- ’·” kissä 10 havaittujen alkioiden epämuodostumien prosentuaa- :v, 35 lista osuutta.

I i · > » 12 110870

Kuvio 13B on pylväsdiagrammi, joka esittää esimerkissä 10 määritettyjä itäneiden alkioiden alkeisjuurien ja alkeisvarsien pituuksia.

Kuvio 14 on putkistokaavio, joka kuvaa edullista 5 laitteistosuoritusmuotoa siemenanalogien hapettamiseksi käyttämällä happikaasua.

Kuvio 15 on leikkauskuva kuviossa 14 yleisesti esitetyn hapetustornin sisäpuolesta.

Kuvio 16 on leikkauskuva edullisesta siemenanalogi-10 suoritusmuodosta, joka on varustettu sirkkalehtipidäkejärjestelyllä.

Kuvio 17 peräkkäisiä vaiheita esittävä kaaviokuva, joka valaisee kuvion 16 mukaisen siemenanalogisuoritusmuo-don itämistä.

15 Yksityiskohtainen kuvaus

Totipotentti kasvikudos Tämän keksinnön yhden puolen mukainen kasvinsiemen-analogi käsittää totipotentin kasvikudosyksikön, jonka ainakin yksi pinta on kosketuksessa kovetetun, hydratoi-20 dun, hapetetun geelin kanssa.

Tässä käytettynä "totipotentti" tarkoittaa kykyä , kasvaa ja kehittyä normaaliksi kasviksi. Totipotentti kas vikudos omaa sekä kasvin täydellisen geneettisen informaa- • tion että valmiin kyvyn kehittyä kokonaiseksi kasviksi ·’ 25 suotuisissa olosuhteissa kasvatettuna. Totipotenttia kas- * vikudosta on saatavissa muutamilta kasvin alueilta, kuten ; .· kasvusolukkokudoksesta ja kasvin alkiokudoksesta.

: : Kasvusolukko- eli meristeemikudos koostuu erilais- tumattomista kasvisoluista, jotka jakautuvat toisiksi me-;*· ; 30 risteemisoluiksi samoin kuin erilaistuneiksi soluiksi, .···, jotka pidentyvät ja erikoistuvat edelleen kasvin rakenne- kudoksiksi ja elimiksi. Meristeemikudosta on esimerkiksi ’· '·’ kasvavien versojen tai juurien äärimmäisissä kärjissä, • · nupuissa ja puumaisten kasvien jälsikerroksessa.

tl f » » * ; ( 13 110870

Kasvin alkiokudosta voidaan löytää ("tsygoottisen" alkion muodossa) suvullisen lisääntymisen kautta syntyneen kasvinsiemenen sisältä. Kasvin "somaattisia" alkioita voidaan myös tuottaa kasvattamalla totipotentteja kasvisolu-5 ja, kuten meristeemikudosta, laboratorio-olosuhteissa, jolloin kudoksen muodostavat solut erotetaan toisistaan ja pakotetaan kehittymään hyvin pieniksi täydellisiksi alkioiksi.

Vaihtoehtoisesti voidaan indusoida alalla tunnettu 10 prosessi, josta käytetään termiä "jakautumismonialkioi-suus", normaalin alkionkehityksen aikana siemenessä. Yksinkertaisuuden vuoksi totipotenttia kasvikudosta kutsutaan tässä yksinkertaisesti "alkioksi", ellei toisin mainita.

15 Tässä käytettynä "yksikkö" kasvin meristeemikudosta tai kasvin alkiokudosta on pala mainitunlaista kudosta, jota voidaan käsitellä yksitellen, joka voidaan sijoittaa tai koteloida geeliin tämän keksinnön mukaisesti ja joka kehittyy versoksi ja lopulta kasviksi suotuisissa olosuh-20 teissä.

Geelit . Totipotentin kasvukudoksen kotelointiin käytettävä materiaali on hydratoitu geeli. "Geeli" on aine, joka val- ; misetaan kolloidisena liuoksena ja joka muodostaa puoli- » 25 kiinteän materiaalin tai voidaan saattaa muodostamaan sellainen. Tällaista nestemäisen geeliliuoksen muuttumista ' * . .·’ puolikiinteäksi materiaaliksi kutsutaan tässä geelin "ko- • ( ' i vettumiseksi" . Tämän keksinnön mukaisesti hydratoitu geeli toimii yhdessä siihen mahdollisesti sisällytettyjen muiden 30 aineiden kanssa "keinotekoisena gametofyyttinä" totipoten-tille kasvikudokselle.

.* . Tässä käytettynä "hydratoitu" tarkoittaa vettä si- *· : sältävää. Mainitunlaisia geelejä valmistetaan liuottamalla ' ’ ensin veteen (jolloin vesi toimii liuotteena eli "jatkuva- i 35 na faasina") hydrofiilinen polymeerinen aine (joka toimii » » I ! | i4 110870 liuenneena aineena eli "dispergoituneena faasina"), joka kovettumisen aikana yhtyy jatkuvaan faasiin, jolloin muodostuu puolikiinteä materiaali. Vesi tulee toisin sanoen homogeenisesti liitetyksi liuenneen aineen molekyyleihin, 5 ilman että tapahtuu jatkuvan faasin olennaista erottumista dispergoituneesta faasista. Vesimolekyylit ovat kuitenkin vapaasti poistettavissa kovettuneesta hydratoidusta geelistä, esimerkiksi haihtumisen tai itävän alkion imemis-toiminnan kautta. Kovettuneina näillä geeleillä on se 10 joustavien kiinteiden aineiden, kuten gelatiinimassan, tuttu tunnusmerkillinen ominaisuus, että joustavuus vähenee ja geeli muuttuu "kiinteämmän" tuntuiseksi geelin sisältämän vesimäärän laskiessa.

Sen lisäksi että soveltuvat liuotettavat geelinmuo-15 dostusaineet ovat vesiliukoisia, ne eivät ole solumyrkkyjä eivätkä olennaisesti fytotoksisia. Tässä käytettynä "kasveille suurin piirtein myrkytön" aine on aine, joka ei olennaisesti häiritse kasvin normaalia kehittymistä, esimerkiksi tappamalla olennaisia määriä kasvisoluja, muutta-20 maila olennaisesti solujen erilaistumista tai kypsymistä, aiheuttamalla mutaatioita, rikkomalla olennaisia määriä solukalvoja tai häiritsemällä olennaisesti solumetaboliaa tai muita prosesseja.

( · ' ; Liuotettaviin geelinmuodostusaine-ehdokkaisiiin * · ’ ·’ 25 kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, natrium- alginaatti, agar, agaroosi, amyloosi, pektiini, dekstraa- * ‘ % ; ni, gelatiini, tärkkelys, amylopektiini, muunnetut sellu- loosat, kuten metyyli selluloosa ja hydroksietyyliselluloo-sa, ja polyakryyliamidi. Muitakin hydrofiilisiä liukenevia 30 geelinmuodostusaineita voidaan käyttää, kunhan niillä on samanlaiset hydratoitumis- ja geelinmuodostusominaisuudet ja ne ovat myrkyttömiä. On myös tärkeää pystyä lisäämään • * « *· *·’ muita aineita, kuten kasviravinteita tai emulgoituja mate- » *'· riaaleja, geeliin häiritsemättä olennaisesti geelinmuodos- 35 tuskykyä. Kovettuneen geelin täytyy lisäksi olla riittävän

* I J f I

is 110870 lujaa kapselin yhtenäisyyden ylläpitämiseksi, ilman että kapseli olisi niin kestävä, ettei itävä alkio pysty tunkeutumaan sen läpi.

Geelejä valmistetaan tyypillisesti liuottamalla 5 liuotettava geelinmuodostusaine, tavallisesti hienojakois ten hiukkasten muodossa, veteen, jolloin muodostuu geeli-liuos. Kyseessä oleva liuotettavan geelinmuodostusaineen mukaan tarvitaan tavallisesti kuumennusta, joskus kiehuvaksi, ennen kuin liuotettava geelinmuodostusaine liuke-10 nee. Sitä seuraava jäähdytys aiheuttaa monien geeliliuos-ten reversiibelin "kovettumisen" (geeliytyrnisen). Esimerkkejä ovat gelatiini, agar ja agaroosi. Tällaisia liuotettavia geelinmuodostusaineita kutsutaan "reversiibeleiksi", koska kovettuneen geelin kuumentaminen uudelleen johtaa 15 takaisin geeliliuokseen. Joidenkin liuotettavien geelin- muodostusaineiden liuokset vaativat "kompleksointiainet-ta", jonka tehtävänä on kovettaa geeli kemiallisesti silloittamalla liuotettuja geelinmuodostusainemolekyylejä. Esimerkiksi natriumalginaatti kovetetaan lisäämällä kal-20 siumnitraattia [Ca(N03)2] tai muiden divalenttisten ionien, kuten, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, kalsiumin, bariumin, lyijyn, kuparin, strontiumin, kadmiumin, sinkin, nikkelin, koboltin, magnesiumin ja raudan, suoloja geeli- ; · liuokseen. Monet kompleksointiaineita vaativat liuotetut * * ’·'·* 25 geelinmuodostusaineet kovettuvat irreversiibelisti, jol- ' ' loin uudelleenkuumennus ei johda takaisin geeliliuokseen.

< ! » i ',· Liuotetun geelinmuodostusaineen pitoisuus, joka v : tarvitaan tyydyttävän geelin valmistamiseksi kotelointi- tarkoituksiin tämän keksinnön mukaisesti vaihtelee kysees-30 sä olevan liuotettavan geelinmuodostusaineen mukaan. Käyt-tökelpoineen natriumalginaattipitoisuus on esimerkiksi * · · ,· f suunnilleen alueella 0,5 - 2,5, edullisesti noin 0,9 - t | | '· : 1,5 % (paino/tilavuus). Käyttökelpoinen agarpitoisuus on ‘ suunnilleen alueella 0,5 - 2,5, edullisesti noin 1,8 % ; 35 (paino/tilavuus). [Tässä käytettynä pitoisuusyksikkö "% » « * * » I » 16 110870 (paino/tilavuus)" on sama kuin grammaa liuotettua ainetta 100 cm3:ä kohden liuotetta]. Geelipitoisuuksia, jotka ovat korkeintaan noin 24 % (paino/tilavuus) on käytetty menestyksellisesti toisten geelien kohdalla. Yleensä komplek-5 soimalla kovetettavat geelit vaativat tyydyttävän geelin muodostamiseksi vähemmän liuotettua geelinmuodostusainetta kuin "reversiibelit" geelit.

On edullista varustaa alkio tavanomaisella valikoimalla kasviravinteita ja muita hyödyllisiä aineita, kuten 10 vitamiineja, ja hiili- je energialähteellä (tässä käytetään yhteisnimitystä "ravinteet") alkion ollessa koteloituna geeliin. Tyypillisiä tapoja ravinteiden tarjoamiseksi ovat liuottaa liuotettava geelinmuodostusaine ravinneliu-okseen tai lisätä jokin tilavuus konsentroitua ravinneliu-15 osta geeliliuokseen ennen geelin kovettamista. Geelin kovettuessa kaikki alkion alueet, jotka ovat kosketuksessa geelin kanssa, ovat täten toimittaessa suorassa kosketuksessa myös liuotettujen ravinteiden kanssa, kun liuotettuja ravinteita on läsnä suurin piirtein yhtenäisenä pitoi-20 suutena kaikkialla geelissä. Yksi toinen tapa tarjota ravinteita on saattaa geelikapseli, joka sisältää alkion mutta ei ravinteita, suoraan kosketukseen toisen massan kanssa saman- tai erityyppistä hydratoitua geeliä, joka sisältää ravinteita. Kahden hydratoidun geelimassan väli- • · '·’ 25 sen ravinnepitoisuusgradientin seurauksena ravinteita va- im eltaa ravinteita sisältävästä geelimassasta alkion sisäl-: V tävään geelimassaan.

V · Yksi mahdollinen tapa tarjota ravinteita on saattaa geelikapseli, joka sisältää alkion mutta ei ravinteita, 30 kosketukseen toisen yksikön kanssa, joka käsittää mikro- • » kapseloituja ravinteita tai ravinteita liitettyinä mihin , tahansa kasveille suurin piirtein myrkyttömään aineeseen, '· j joka mahdollistaa itseensä liuenneiden ravinteiden siirty misen veden kautta alkion sisältävään geeliyksiköön. Täl-35 laisia materiaaleja edustavat, mainittuihin kuitenkaan 17 110870 rajoittumatta, vesi, samanlainen geeli kuin alkion sisältävässä yksikössä, vermikuliitti, perliitti tai mikä tahansa polymeerinen materiaali, joka on myrkytöntä ja vapauttaa ravinteet helposti jonkin ajan kuluessa.

5 Alalla on olemassa joukko mahdollisia ravinneformu- loita, mukaan luettuna joukko patentoituja formuloita. Yksi suosittu alusta on esimerkiksi "MS-neste" [Murashine ja Skoog, Physiologia Plantarum 15 (1962) 473 - 497], joka sisältää seuraavat aineosat veteen liuotettuina: 10 NH4N03 1650 mg/dm3 KN03 1900 mg/dm3

CaCl2*2H20 440 mg/dm3

MgS04 · 7H20 370 mg/dm3 15 KH2P04 1 70 mg/dm3

Na2EDTA 37,25 mg/dm3

FeS04 · 7H20 27,85 mg/dm3

MnS04*4H20 22,3 mg/dm3

ZnS0*4H20 8, 6 mg/dm3 20 H3BO3 6,2 mg/dm3 KI 0,83 mg/dm3

Na2Mo04 · 2H20 0,25 mg/dm3 » '"l" CuS04*5H20 0,025 mg/dm3 ; CoCl2 · 6H20 0,025 mg/dm3 ' · ' ·’ 25 Glysiini 0,2 mg/100 cm3 » * t *

Nikotiinihapo 0,05 mg/100 cm3 * * » : .* Pyridoksiinihydrokloridi 0,05 mg/100 cm3 V : Tiamiinihydrokloridi 0,01 mg/100 cm3

Kinetiini 0,1 mg/dm3 : * *. · 30 Myoinositoli 100 mg/dm3 :"‘j IAA 10 mg/dm3 • · » .* , Sakkaroosi 30 000 mg/dm3 '·ph 5,7 - 5,8 [Huomaa: MS-alusta sisältää myös 1,0 % (paino/tilavuus) Γ·': 35 agaria, Murashiga ja Skoog, ibid.} Lisättäessä ravinneliu- 18 110870 osta geeliliuokseen tulisi kummassakin liuoksessa vallitsevien pitoisuuksien tietenkin olla niin korkeita, että tuloksena olevassa kahden liuoksen seoksessa vallitsee asianmukaiset geeli- ja ravinnepitoisuudet.

5 Ravinneliuos voi sisältää myös kasvien kasvuhormo neja ja muita yhdisteitä, joiden tehtävänä on parantaa edelleen verson elossapysymistodennäköisyyttä.

Tässä käytettynä "ravinneneste" on samanlainen ravinteiden vesiliuos kuin "MS-neste"-formula. "Ravinneagar" 10 on samanlainen kuin "MS-alusta". Määrättyjen aineosien tyyppejä ja määriä voidaan muuttaa määrättyä tyyppiä olevien kasvien tarpeiden täyttämiseksi poikkeamatta olennaisesti ravinnenesteen tai ravinnealustan tarkoituksesta ja käyttökelpoisuudesta.

15 Koska ravinnealustat, ravinneliuokset ja mitkä ta hansa ravinteita sisältävät geelit ovat hyviä kasvualustoja mikro-organismeille ja sienille, on tärkeää, että kaikki tällaiset liuokset, samoin kuin itse alkiot, ovat steriilejä ennen käyttöä. Alkiot pidetään steriileinä kasvat-20 tantalla steriileissä olosuhteissa. Nesteet voidan autokla-voida tai mikrosuodattaa.

,:t Hapetetut geelit Tässä käytettynä "hapetettu" geeli sisältää happea suurempana pitoisuutena kuin happipitoisuus, joka vallit-25 sisi geelissä normaalilämpötilassa ja -paineessa pelkän ilmakehästä tapahtuvan absorption seurauksena. "Happea : .* kantava" geeli on tässä käytettynä geeli, jossa on mitä v ·’ tahansa ulkopuolelta lisättyjä happea absorboivia tai hap pea kantavia aineita. Niinpä happea kantava geeli on yksi 30 hapetetun geelin tyyppi.

• · ,*; Geelin hapetus voidaan saada aikaan muutamin mene- ,* , telmin. Geeliliuos voidaan ensinnäkin hapettaa ennen kove- * tusta johtamalla happikaasua liuoksen läpi. Laboratoriossa tämä voidaan tehdä sijoittamalla liuos alalla tunnettuun i ·’: 35 "kaasunpesupulloon" ja puhaltamalla happikaasua liuoksen 19 110870 läpi sen ollessa pullossa. Vastaavia menetelmiä voidaan käyttää suurten tilavuuksien hapettamiseen ja jatkuvan ko-vettumattoman geelivirran hapettamiseen. Hapetettaessa geeliliuos tällä tavalla tulisi pitää mielessä, että kuu-5 mat liuokset absorboivat yleensä vähemmän happea kuin kylmät liuokset. Kuten jäljempänä kuvataan yksityiskohtaisemmin, geeliliuos voidaan toisaalta hapettaa kovetuksen jälkeen esimerkiksi sijoittamalla geeli paineistettua happea sisältävään, hapen suhteen rikastettuun tai pelkästä ha-10 pestä koostuvaan ympäristöön. Nämä menetelmät ovat tehokkaita myös geelin sisältäessä hapenkantaja- tai happea absorboivia yhdisteitä.

Hapetetun geelin happipitoisuus riippuu joukosta tekijöitä. Minimihappipitoisuus alkiota ympäröivässä gee-15 likapselissa on vähintään riittävä tukemaan riittävästi alkeisjuuren (alkion rakenteen, josta lopulta tulee kasvin juuri) kasvua, jotta se pystyy rikkomaan kapselin ja pääsee ilmakehän hapen vaikutuksen alaiseksi. Alkeisjuuri on hyvin herkkä happipitoisuuden suhteen. Jos happipitoisuus 20 on esimerkiksi liian alhainen, alkeisjuuri kuolee, ennen kuin pääsee kasvamaan ulos kapselista (katso esimerkki 2). Jos happipitoisuus on kyllin korkea alkeisjuuren kasvulle, se on yleensä myös kyllin korkea tukeakseen kasvialkion *;; muiden osien, kuten verson kasvua ulos kapselista. Minimi- ’·'·* 25 happipitoisuus näyttää riippuvan osittain alkion edusta- ' * masta kasvilajista. Muita geelin happipitoisuutta määrää- I » · : ’.· viä tekijöitä voivat olla geelin paksuus, se, että eri- v · tyyppiset liuotetut geelinmuodostajat absorboivat eri mää riä happea, geelin hydratoitumisaste, liuotetun geelinmuo-:*·,· 30 dostajan pitoisuus, muiden geeliin liuotettujen aineiden, .·*, kuten ravinteiden läsnä- tai poissaolo ja niiden pitoisuu- ,* _ det, geelin lämpötila ja ulkokuoren läsnä- tai poissaolo.

*· Siksi useimmissa tapauksissa minimihappipitoisuus määrite- » * * tään tietyn kasvialkio-kapselirakenteen kohdalla tekemällä 35 yksinkertainen idätyskoe, jossa käytetään sarjaa samalla 110870 20 tavalla koteloituja alkioita, jolloin sarjan kussakin gee-likapselissa vallitsee asteittain erilainen happitoisuus kuin kaikissa muissa sarjan kapseleissa.

Keksinnön mukaisesti hapen pitoisuutta ja saata-5 vuutta geelissä suurennetaan sisällyttämällä geeliin happea absorboivaa tai kantavaa yhdistettä. Tietyt mainitunlaisista yhdisteistä absorboivat niin tehokkaasti happea ilmakehästä, ettei geelin hapetus käyttämällä happikaasua ole joissakin tapauksissa välttämätöntä.

10 Yksi edullinen yhdisteryhmä käytettäväksi geelin happipitoisuuden suurentamisessa ovat perfluorihiilivedyt (PFC:t). Nämä yhdisteet ovat orgaanisia yhdisteitä, joissa kaikki vetyatomit ovat korvautuneet fluoriatomeilla. Ne ovat polaarittomia, värittömiä, hajuttomia, myrkyttömiä, 15 lämmönkestäviä ja kemiallisesti äärimmäisen inerttejä. Koska kaasuilla, kuten hiilidioksidilla ja hapella, on suuri liukoisuus PFC:ihin, on PFC-yhdisteitä tutkittu veren-korvikkeina. Ensimmäinen sopivia PFC:itä edustava ryhmä käsittää perfluorisykloalkaanit ja perfluori(alkyyli-20 sykloalkaanit), kuten perfluoridekaliinin. Toinen näitä yhdisteitä edustava ryhmä käsittää tyydyttyneet heterosykli-set perfluorialkyyliyhdisteet, kuten perfluoributyylitetra-'i1 hydrof uraanin. Kolmas näitä yhdisteitä edustava ryhmä kä- sittää perfluori (tert-amiini) yhdisteet, kuten perfluoritri- » > 25 butyyliamiinin.

Koska PFC:t ovat polaarittomia, ne eivät ole vesi- • · pitoisten nesteiden, kuten geeliliuosten, kanssa sekoittu- * · * via. Jotta vesipohjaiseen geeliliuokseen saataisiin yhdistetyksi sellainen määrä PFC:tä, että se on käyttökelpoinen • · 1 ’· N 30 hapen absorboijana tai kantajana, on välttämätöntä muodos-taa sopivan stabiili PFC-emulsio. Mainitunlaisessa emulsi-ossa PFC-mikropisarat, jotka muodostavat dispergoituneen faasin, ovat yhtenäisesti suspendoituina geeliliuokseen • (jatkuvaan faasiin). Tässä käytettynä "sopivan stabii- 1 1 t 35 li" emulsio on sellainen, jossa dispergoitunut faasi pysyy 21 110870 jatkuvaan faasiin suspendoituneena ainakin siihen asti, kunnes alkio on itänyt kapselista. Emulsion stabilointiin sopivalla tavalla voidaan käyttää pinta-aktiivisuusainet-ta. Emulsio voidaan joissakin tapauksissa stabiloida sopi-5 vasti myös vain kovettamalla geeli.

Emulsiomikropisaroita muodostetaan erilaisin alalla tunnetuin menetelmin, mukaan luettuna voimakkaasti leik-kaavan sekoituslaitteen tai ultraäänivälineiden käyttö. Voimakkaasti leikkaavien sekoittimien ollessa kyseessä 10 mitä suurempi nesteseokseen suunnattu leikkausvoima on, sitä pienempi on yleensä mikropisaroiden koko. Ultraääni-laitteiden ollessa kyseessä nesteseokseen täytyy johtaa enemmän ultraäänienergiaa mikropisaroiden pienempien kokojen saavutamiseksi. Tyypilliset mikropisaroiden läpimitta-15 alueet ulottuvat noin 100 pmrstä alle 1 pm:iin. Mitä pienempi mikropisaroiden koko on, sitä tehokkaampaa on yleensä hapen absorptio ja kuljetus geelin läpi, sillä pienempien mikropisaroiden suspensioissa mikropisaroiden kokonaispinta-ala on suurempi kuin suurempien mikropisaroiden 20 suspensioissa. Suuremman pinta-alansa seurauksena pienempien mikropisaroiden suspensiot vaativat kuitenkin enemmän pinta-aktiivisuusainetta kuin suurempien mikropisaroiden ”'j emulsiot emulsioiden tekemiseksi sopivan stabiileiksi.

4

Geelin PFC-pitoisuus on yleensä korkeintaan noin » * · •·’ 25 25 % (paino/tilavuus). Geelin edullinen PFC-pitoisuusalue •iff· * ’ on korkeintaan noin 15 % (paino/tilavuus). Optimaalinen * t · alue riippuu osittain liuotetun geelinmuodostajan tyypis- V · tä, kyseisen PFC:n hapenkantokapasiteetista, emulsion mik ropisaroiden koosta ja geelin toivotusta happipitoisuudes-30 ta. Natriumalginaattia sisältävän emulsion optimaalinen » * .**·. PFC-pitoisuusalue on esimerkiksi suunnilleen 7,5 - 12 % / ( (paino/tilavuus). Tuloksia, joita on saatu kokeissa, jois-

» I

* ” sa on tutkittu erilaisia PFC- ja geelinmuodostajapitoi- • suuksia, esitetään esimerkeissä.

* » » 22 1 10 8 7 0

Vaikka joukko erityyppisiä pinta-aktiivisuusaineita olisi tehokkaita PFC-emulsion stabiloinnissa, pinta-aktii-visuusaineen tulee olla myrkytöntä alkiolle. Tämän seurauksena tietyt ioniset pinta-aktiivisuusaineet, kuten 5 natriumdodekyylisulfaatti, jotka helposti rikkovat solu kalvoja, ovat soveltumattomia (katso esimerkki 8). Muut pinta-aktiivisuusaineet, kuten muna-albumiini ja ionitto-mat pinta-aktiivisuusaineet, kuten metyylioksiraanipoly-meerit (oksieteeni-oksipropeenilohkopolymeerit) toimivat 10 hyvin. Yksi esimerkki on Pluronic F-68, jota myy BASF Corp., Parsippany, N.J. Yleisesti esitettynä mikä tahansa kasveille suurin piirtein myrkytön pinta-aktiivisuusaine tai emulgaattori, joka on käyttökelpoinen elintarvikkeissa tai nieltävissä lääkkeissä, olisi tyydyttävä.

15 Maksimimäärä pinta-aktiivisuusainetta, joka tarvi taan sopivasti stabiloidun emulsion saavuttamiseksi, on yleensä noin 10 % (paino/tilavuus), mutta se voi olla suurempikin, jos emulgoinnin aikana muodostetaan äärimäisen pieniä PFC-mikropisaroita. Toisin sanoen kun mikropisaroi-20 den läpimitta yksikkötilavuudessa PFC-emulsiota laskee, dispergoituneen PFC-faasin pinta-ala kasvaa ja tarvitaan vastaavasti suurempi määrä pinta-aktiivisuusainetta emul-, sion stabiloimiseksi sopivalla tavalla. Edullinen pinta- , ·* aktiivisuusainepitoisuusalue on noin 0,4 - 6 % (paino/til- • 25 avuus). Pinta-aktiivisuusaine liuotetaan tyypillisesti "·* veteen ja PFC lisätään pinta-aktiivuusaineen liuokseen • V. juuri ennen emulsion muodostamista. Emulsio yhdistetään , sitten kovettamattomaan geeli-ravinnelluokseen. Tuloksena olevaa seosta käytetään "keinotekoisen gametofyytin" muo-30 dostamiseen.

i l » • * »

Yksi vaihtoehtoinen happea absorboiva yhdiste, jota voidaan sisällyttää emulsiona hydratoituun geeliin, on si-likoniöljy. Silikoniöljyjä on saatavana viskositeettiar-voiltaan monenlaisina, joista öljyt, joiden viskositeetti 35 on suunnilleen alueella 0,65 - 15 cP, ovat edullisia. Nämä

» I I * I

23 110870 öljyt ovat, samoin kuin PFC:t, polaarittomia, värittömiä, hajuttomia, myrkyttömiä, lämmönkestäviä ja kemiallisesti inerttejä, ja niillä on korkea hapenliuotusarvot. Itse asiassa hapen liukoisuus joihinkin silikoniöljyhin on suu-5 rempi kuin moniin PFCiihin. Silikoniöljyä sisältävä keinotekoinen gametofyytti valmistetaan samalla tavalla kuin PFC:tä sisältävä keinotekoinen gametofyytti. Samoin kuin PFC:iden yhteydessä tarvitaan yleensä pinta-aktiivisuusai-netta sopivalla tavalla stabiilin silikoniöljyemulsion 10 aikaansaamiseksi. Silikoniöljypitoisuus geelissä on myös yleensä korkeintaan noin 25 % (paino/tilavuus).

Kuvioiden 1-3 mukaiset suoritusmuodot Kun on valmistettu geelineste, kovetettujen geeli-yksiköiden valmistus käytettäväksi kasvialkioiden idätyk-15 sessä voidaan toteuttaa monin tavoin, sisälsipä neste emulgoitua PFCrtä tai silikoniöljyä tai ei. Valittava menetelmä riippuu osittain siitä, miten alkio on kosketuksessa geelin kanssa. On tärkeää, että alkio on kosketuksessa geelin kanssa, joko suoraan tai välissä olevan vettä 20 läpäisevän "sillan", kuten suodatinpaperin, kautta. Yleensä alkio voi levätä hapetetun geelin pinnalla tai geeli-kappaleeseen ennalta muodostetussa aukossa tai ontelossa · ' ; tai olla kokonaan koteloituna geeliin. Kahdessa ensin mai- • ; nitussa menetelmässä geeli yleensä kovetetaan muotoiltuna ' ·' 25 ennalta edulliseen muotoon tai voidaan muodostaa suurempa- • na kovetettuna massana ja leikata sopivaan kokoon ennen i i » • ’,· alkion sijoittamista siihen. Kun alkio koteloidaan kokoni : naan geeliin, on edullista sijoittaa alkio geeliyksikköön, jolla on haluttu tilavuus, ennen geelin kovettamista täy-: 30 dellisesti.

• | f • ·

Kuvio IA on poikkileikkauskuva yhdestä siemenanalo- • · gisuoritusmuodosta 10, joka on valmistettu koteloimalla *· ” alkio 12 kokonaan hydratoituun hapetettuun geelikapseliin ‘ · 14. Yksi tapa valmistaa tällainen kapseli on sijoittaa jV, 35 kovettumaton geeliseos erotussuppiloon. Suppilon hana sää- 24 110 8 7 0 detään siten, että geeliliuospisaroita muodostuu hitaasti ja vaiheittain. Aina kun erotussuppilon kärkeen muodostuu pisara, sidotetaan alkio kokonaan pisaran sisään käyttämällä steriilejä pinsettejä. Sitten alkion sisältävä pisa-5 ra joko siepataan kovettamista varten tilaan, joka noudattaa kapselin haluttua muotoa, tai sellaisten geelien ollessa kyseessä, jotka täytyy kompleksoida kovettumisen aikaansaamiseksi, pudotetaan kompleksointiliuokseen siksi aikaa, että kovettuminen on mennyt lopuun.

10 Kuvio IB on poikkileikkauskuva yhdestä toisesta siemenanalogisuoritusmuodosta 20, jossa geelikapselin suuri osa 22 on muodostetu ennalta. Kuviossa IB suuri osa 22 esitetään kuution muotoisena, vaikka muutkin muodot, kuten pallomaiset tai ovoidimuodot, kelpaavat. Suuressa osassa 15 22 on kanava 24, joka voi myös olla ennalta muodostettu tai muodostuksen jälkeen leikattu ja johon alkio 12 sijoitetaan. Kanava 24 voidaan haluttaessa sulkea tulpalla 26 alkion 12 sijoittamisen jIkeen. Tulppa 26 voidaan valmistaa lisäpalasta kovetetua geeliä tai muusta sopivasta ma-20 teriaalista, kuten parafiinista tms.

Kuten on nähtävissä kuviosta 1C, voidaan valmistaa vielä yksi muu tämän keksinnön mukainen siemenanalogisuo- » · ·· ; ritusmuoto 30 muodostamalla ennalta kaksi vastakkaista ·: kapselin puoliskoa 32a ja 32b, jotka painettuina yhteen ' 25 kokonaisen kapselin 34 muodostamiseksi rajaavat ontelon 36

’·"· alkion 12 vastaanottamista varten. Vaikka myös kuviossa 1C

• : esitetään kuutiomainen rakenne, siinä esitetty yleinen : ; : ajatus on sovellettavissa erilaisiin muotoihin.

Ymmärrettäneen, että voidaan valmistaa kaikkien ku-: 30 vioissa IA, IB ja 1C esitettyjen kolmen suoritusmuodon variaatioita, jotka ovat tämän keksinnön mukaisen koteloi-1 dun alkion suoja-alan piirissä.

Ymmärrettäneen myös, että kuvoiden IA, IB ja 1C mukaiset suoritusmuodot voidaan valmistaa automaatistetul-35 la menetelmällä.

tl**· 25 110870

On myös mahdollista sulkea geeliin koteloitu alkio jäykkään kuoreen geelikapselin ja alkion suojaamiseksi fysikaaliselta vaurioitumiselta, kuivumiselta ja muilta haitallisilta ympäristövoimilta. Kuvio 2A on esimerkiksi 5 poikkileikkauskuva yhdestä mahdollisesta mainitunlaisesta siemenanalogisuoritusmuodosta 40, joka käsittää alkion 12, kapselin 42, joka koostuu alkiota 12 ympäröivästä hydra-toidusta hapetetusta geelistä, ja geelikapselia 42 ympäröivän ulkokuoren 44. Ulkokuori 44 voidaan valmistaa mo-10 nista erilaisista materiaaleista, mukaan luettuina, mai-nittuhin kuitenkaan rajoittumatta, selluloosamateriaali, parafiini, muovattavaissa oleva muovi tai kovetettu poly-meerihartsi tai näiden ja/tai muiden materiaalien yhdistelmä, jolle on tunnusmerkillistä myrkyttömyys ja sopiva 15 jäykkyys. Jäykkyys ei kuitenkaan saa olla sellainen, että sisältä itävä alkio ei pystyisi kasvamaan ulos siemenana-logista 40 ilman tappavia tai heikentäviä vaurioita. Siten polymeerimateriaalit, joilla on korkea kuivalujuus ja alhainen märkälujuus, ovat erityisen toivottavia. Toivotta-20 via ovat myös kuorimateriaalit, jotka murtuvat helposti ulospäin työntävän voiman suuntautuessa niihin kapselin sisältä, mutta kestävät suhteellisen hyvin kapselin uiko-! puolelta päin vaikuttavia puristusvoimia. Ulkokuoressa 44 ' on edullisesti myös aukko 46, jota kohden alkion 12 al- ’ 25 keisjuuri 48 suuntautuu, jota helpotetaan alkeisjuuren 48 kasvua ulos analogista 40 itämisen aikana. Alkeisjuuri I * % : ,* saattaisi muuten jäädä loukkuun analogin 40 sisään ja es- V ’· tyä itämästä menestyksellisesti.

Yhtä mahdollista suoritusmuotoa valaistaan kuviossa : 30 2B, joka on poikkileikkauskuva siemenanalogista 50. Tämä : analogi 50 käsittää alkion 12 ja kapselin 52, joka koostuu , alkiota 12 ympäröivästä hydratoidusta hapetetusta geelis- ' ; tä, ja kapseli 52 on valettu sisempään kuoreen 54 jonkin määrätyn muodon, kuten sylinterin, muodostamiseksi. Sisem-j ' : 35 pi kuori 54 voidaan leikata esimerkiksi muovisesta tai » I 5 . 1 110870 26 selluloosaisesta juomapillistä tai vastaavasta materiaalista, kuten lasiputkesta. Kapselin sisältävä sisempi kuori 54 päällystetään tai peitetään muulla tavalla ulommalla kuorella 56, joka on samankaltainen kuin kuvion 2A ulko-5 kuori 44. Tässäkin tapauksessa on edullista, että ulompi kuori 56 sisältää aukon 58 itävän alkeisjuuren ulostyönty-misen helpottamiseksi. On myös edullista, että ulommalla kuorella 56 on alhainen märkälujuus ja korkea kuivalujuus.

Vielä yhtä mahdollista kuoreen suljetun, alkion si-10 sältävän geelikapselin suoritusmuotoa valaistaan kuviossa 2C, joka on poikkileikkauskuva siemenanalogista 60. Samoin kuin kuviossa 2B kuvion 2C mukainen suoritusmuoto käsittää alkion 12, kapselin 52, joka koostuu alkiota 12 ympäröivästä hydratoidusta hapetetusta geelistä, ja jäykän sylin-15 terimäisen kuoren 62, joka on samanlainen kuin kuvion 2B mukainen sisempi kuori. Lisäksi asetetaan parafiinista tai muusta polymeerimateriaalista koostuva kansi 64 ainakin ensimmäiseen päähän 66 antamaan suojaa kuivumista ja fysikaalisia vaurioita vastaan samoin kuin pidättämään sirkka-20 lehtiä asianmukaisesti normaalin itämisen helpottamiseksi. Toinen kansi (ei kuvassa), joka on samanlainen kuin ensim-;t mäinen kansi 64, voidaan myös laittaa toiseen päähän 68 ! lisäsuojaksi. Jos kuori 62 valmistetaan vettä läpäisemät- r · t ; tömästä aineesta, on edullista, että kansi 64 valmistetaan « 25 vettä läpäisevästä materiaalista, varsinkin jos sellainen * laitetaan molempiin päihin 66 ja 68, jotta taataan riittä- ,· vä veden tunkeutuminen alkioon 12 itämisen edistämiseksi, v ' Kaikissa kuvioiden IA - 1C ja 2A - 2C esittämissä suoritusmuodoissa hydratoitu geeli sisältää edullisesti 30 liuenneita ravinteita. Hapetuksen vuoksi geeli sisältää * · ;edullisesti lisäksi happea absorboivan tai kantavan yhdis-,· teen, kuten PFC-yhdisteen tai silikoniöljyn, sopivasti '· · stabiloitua emulsiota siihen suspendoituna. Useimissa ta- ' 1 pauksissa mainitunlaista emulsiota sisältävä geeli tulisi 35 hapettaa ennen kovetusta johtamalla happikaasua geelin * » » · » 27 1 10870 läpi tai jälkeenpäin saattamalla se happikaasun vaikutuksen alaiseksi kovetuksen jälkeen. Vaihtoehtoisesti, ainakin sellaisten kasvilajien alkioiden kohdalla, jotka vaativat suhteellisen pieniä happipitoisuuksia itääksen, mai-5 nitunlaista emulsiota sisältävä geeli pystyisi absorboimaan riittävästi happea ilmakehästä alkioiden suuren itä-misasteen takaamiseksi ilman happilatausvaiheen tarvetta.

Aina kun alkion sisältävä geelikapseli on suurin piirtein kokonaan ulkokuoren ympäröimä, se on lisäksi ai-10 nakin osittain eristetty ilmakehästä. Seurauksena on, että geelin tulisi sisältää edellä kuvatun kaltaista emulsiota ja se tulisi ladata hapella sen takaamiseksi, että geelissä on läsnä riittävä happivarasto alkion tarpeiden täyttämiseksi itämisen aikana. Tässä tapauksessa jäykkä happea 15 läpäisemätön kuori hidastaa geelissä olevan hapen karkaamista ulos.

Kuvioiden IA - 1C ja 2A - 2C esittämät suoritusmuodot ovat vain edustavia esimerkkejä kapselin mahdollisista muodoista. Muut muodt ja kapselirakenteet ovat mahdolli-20 siä. Kuviot 3A - 3C ovat esimerkiksi poikkileikkauskuvia kolmesta lisäsuoritusmuodosta, joissa kapselit ovat luodin •t muotoisia. Vaikka muodoltaan tällaiset kapselit voivat olla hyödyllisiä koneellisessa kylvössä, se ei ole luoti-; maisen muodon päätarkoitus. Kapselin suppeneva "luotimai- 25 nen" pää ennemminkin auttaa ohjaamaan kapselista itävää I 1 alkion alkeisjuurta kasvamaan kohden "luodin" kärkeä, jot- » ta se pääsee helpommin ulos kapselista. Samoin kuin luon-nonsiementen yhteydessä kapselit voidaan kylvää mihin tahansa asentoon maahan tai vastaavaan alustaan häiritsemät- ' ·,; 30 tä alkeis juurten normaalia geotropismia.

* ·

Kuvio 3A esittää kaaviomaisesti "hyllykapselia" 70, .· f joka käsittää kappaleen 71 hydratoitua hapetettua geeliä, • : joka sisältää edullisesti stabiilia PFC- tai silikoniöljy- ’ ' emulsiota. Geelikappale 71 muodostaa hyllyn 72, jolle si- -; 35 joitetaan alkio 12, jonka alkeisjuuri 48 suuntautuu kohden 28 110870 kapselin 70 suippenevaa ensimmäistä päätä 73. Lisäksi kapselissa 70 on mahdollisesti erillinen kasviravinteita sisältävä ravinneyksikkö 74 kosketuksessa geelikappaleen 71 kanssa. Ravinneyksikkö 74 voi olla missä tahansa monista 5 mahdollisista muodoista, mukaan luettuina liuenneita ravinteita sisältävä hydratoitu geeli, mikrokapseloiduista ravinteista koostuva massa, hitaasti liukenevista ravinne-yhdisteistä koostuva massa ja muut mahdolliset suoritusmuodot. Geelikappale 71 voisi vaihtoehtoisesti (ei kuvas-10 sa) täyttää suuremman osan kapselin 70 tilasta ja sisältää myös ravinteita kaikkialle geelikappaleeseen 71 dispergoi-tuina, jolloin vältetään erillisen ravinneyksikön 74 tarve.

Kuviossa 3A näkyy myös kappaletta 71 ja ravinneyk-15 sikköä 74 samoin kuin alkiota 12 ympäröivä ulkokuori 75. Jotta mahdollistetaan yleisesti saatavissa olevien materiaalien, kuten putkimaisten materiaalien, käyttö ulkokuorena 75, on ulkokuorella 75 edullisesti pyöreä poikkileikkaus, jolloin ulkokuorella 75 on sylinterimäinen muoto ja 20 suippeneva ensimmäinen pää 73 ja toinen pää 76. Ulkokuori 75 voidaan muodostaa esimerkiksi putkimaisesta selluloo-samateriaalista, joka on samanlaista kuin paperisissa juo-

: I I

mapilleissä käytettävä. Muutkin materiaalit, kuten muovi, ovat soveltuvia. Suippeneva ensimmäinen pää 73 voidaan 25 muodostaa säteittäisten poimujen 77 avulla tai muilla ka-’*' · vennusmenetelmillä ulkokuoren 75 läpimitan pienentämiseksi * » r | \: suippenevassa ensimmäisessä päässä 73. Toinen pää 76 voi : i : olla samalla tavalla suippeneva (ei kuvassa) tai se voi olla kuvassa esitetyllä tavalla ulkokuoren 75 kanssa samaa : 30 kappaletta oleva pyöreä poikittainen taso. Suippeneva en- ,·· , simmäinen pää 73 päättyy edullisesti aukkoon 78, jota koh- ['>' den suippeneva ensimmäinen pää 73 pakottaa alkeisjuuren 48 : kasvamaan itämisen aikana. Aukko 78 voidaan tarvittaessa t · peittää kannella 79, joka koostuu pehmeästä materiaalista, 35 kuten parafiinista, tai materiaalista, jolla on korkea lii t 29 110870 kuivalujuus ja alhainen märkälujuus. Kansi 79 voi vaihtoehtoisesti koostua materiaalista, joka irtoaa helposti työntövoiman kohdistuessa siihen kapselin sisältä.

Kylvämisen aikana (ei kuvassa) kapseli 70 voidaan 5 sijoittaa maahan tai vastaavaan kasvien kasvatusalustaan mihin tahansa asentoon. Kun kannella 79 on heikko märkälujuus, seuraava kastelu kostuttaa ja pehmentää kannen 79 ja mahdollistaa itävän alkion 12 alkeisjuuren 49 pääsyn ulos kapselista 70 maahan.

10 Kuviot 3B ja 3C esittävät kaaviomaisesti kuvion 3A

esittämän kapselimallin vaihtoehtoisisa suoritusmuotoja. Kuviossa 3B alkio 12 on kokonaan upotettu kappaleeseen 81, joka käsittää hydratoitua hapetettua geeliä. Geelikappale 81 käsittää mahdollisesti myös sopivasti stabiloitua PFC-15 tai silikoniöljysuspensiota. Kuvassa näkyy erillinen ravinteita sisältävä yksikkö 84 kosketuksessa geelikappaleen 81 kanssa. Samoin kuin kuvion 3A mukaisessa suoritusmuodossa ravinteet voidaan kuitenkin sisällyttää myös geeli-r kappaleeseen 81, jolloin vältetään erillisen ravinneyksi-20 kön 84 tarve. Geelikappaletta 81 ja ravinneyksikköä 84 ympäröi ulkokuori 85, joka on samanmuotoinen kuin ulkokuo-, ri 75 kuviossa 3A. Alkion 12 alkeisjuuri 48 suuntautuu < i · I kohden ulkokuoren 85 suippenevaa ensimmistä päätä 83.

· · * *‘ Suippeneva ensimmäinen pää 83 päättyy aukkoon 88, joka V.' 25 näkyy kuvassa ilman kuvion 3A mukaista kantta mahdollisten '·"* suoritusmuotovariaatioiden valaisemiseksi. Kuvion 3B mu- » * » • ‘ ’ kainen suoritusmuoto on edullisempi kuin kuvion 3A mukaili: nen, koska alkiota estetään menettämästä kosketus geeli- kappaleen 81 kanssa koteloimalla sen täysin kappaleen si- I 30 sään.

• ( » • »

Kuvion 3C mukainen suoritusmuoto on samankaltainen • « ” kuin kuvion 3B mukainen siinä suhteessa, että kapseli 90 on luodin muotoinen, siinä on ravinneyksikkö 94 ja uiko- kuorella 95 on suippeneva ensimmäinen pää 93, joka päättyy 35 aukkoon 98. Hydratoitu hapetettu geelikappale 91, johon ft i l * t 110870 30 alkio 12 on upotettuna, esitetään kuitenkin ovoidin muotoisena kuvion 3B mukaisen sylinterimäisen geelikappaleen 81 sijasta. Kuvion 3C mukainen suoritusmuoto valaisee sitä, että alkion sisältävä geelikappale 91 voidaan muodos-5 taa erikseen sen sijasta, että se valettaisiin ulkokuoreen kuviossa 3B ehdotetulla tavalla. Paremman hapetuksen saavuttamiseksi geelikappale 91 sisältää tässäkin tapauksessa edullisesti sopivasti stabiloitua PFC- tai silikoniöljy-suspensiota. Erillinen ravinneyksikkö 94 voidaan myös eli-10 minoida sisällyttämällä ravinteet geelikappaleen 91 muodostavaan geeliin.

Selkeyden vuoksi kuvioissa 3A ja 3B suippenevat päät 73 ja vastaavasti 83 ovat jonkin matkan päässä al-keisjuuresta 48. On kuitenkin edullista, että suippeneva 15 ensimmäinen pää 93 sijaitsee kuvion 3C esittämällä tavalla mahdollisimman lähellä alkeisjuurta 48. Tämä takaa, että alkeisjuuri 48 joutuu pitenemään itämisen aikana vain hyvin vähän kapselin 90 sisällä, ennen kuin suippeneva ensimmäinen pää 93 pakottaa sen kohden aukkoa 98. Muussa 20 tapauksessa pitenevän alkeisjuuren geotropismi saattaa aiheuttaa, että alkeisjuuri 48 kasvaa poispäin suippenevasta ensimmäisestä päästä 93 ja suippenevalle päälle 93 käy vaikeaksi pakottaa alkeisjuuri kasvamaan kohden aukkoa ; 98.

·’ 25 Kuvio 3D esittää ulkopuolelta kuvion 3C mukaisen * kapselin 90 yhtä vaihtoehtoista suoritusmuotoa 90a, jossa ; .· on ulkokuori 95a, suippeneva ensimmäinen pää 93a ja toinen v · pää 96a, jotka vastaavat kuvion 3C esittämiä samanlaisia osia. Kuviossa 3D suippenevassa päässä 93a on litteä pu-30 ristusliitos 39 kuvion 3C esittämän luodin muotoisen ra-: *. kenteen sijasta. Samoin kuin kuviossa 3C alkion alkeis- f juuri (ei kuvassa) on kuvion 3D mukaisen kapselin 90a si- : säilä orientoituneena suippenevaa ensimmäistä päätä 93a kohden, erityisesti puristusliitokseen 99 jätettyä aukkoa 35 98a kohden.

110870 31

Siemenanalogien hapetus käyttämällä happikaasua

Yksi edullinen laitteistosuoritusmuoto siemenanalogien hapettamiseksi happikaasun avulla esitetään kaavio-maisesti kuviossa 14 ja yksityiskohtaisena poikkileikkauk-5 sena kuviossa 15.

Kuvion 14 mukaisesti lähteestä 200 tuleva paineistettu happi johdetaan säätimen 202 kautta suunnilleen normaalipaineeseen. Happea puhalletaan veden läpi kostuskam-miossa 204, niin että se tulee suunnilleen kyllästetyksi 10 vesihöyryllä. Vedellä kyllästetty happi johdetaan ensimmäisen biologisen suodattimen 206 (jonka huokosläpimitta on 0,2 mm) läpi mukana kulkeutuneiden mikro-organismien poistamiseksi. Sitten happi tulee hapetustornin 208 pohjalle syöttöputken 207 kautta. Tämän keksinnön mukaiset 15 siemenanalogit sijoitetaan tornin sisälle jäljempänä ku vattavalla tavalla hapetusta vastren. Happi virtaa ylöspäin tornin 208 läpi ja poistetaan yhdysputken 209 ja toisen biologisen suodattimen 210 kautta. Toinen biologinen suodatin 210 takaa, ettei torniin 208 tule ympäristöstä 20 mikro-organismeja yhdysputkea 209 pitkin. Tornin 208 läpi johdetaan koko ajan pumpun 212 avulla suljetussa kierrossa virtaavaa steriiliä vettä. Vesi tulee tornin 208 huipulle yhdysputken 211 kautta ja poistetaan pohjalta yhdysputken ; 213 kautta. Hapen kyllästäminen vesihöyryllä ja tornin 208 25 läpi kulkevan vesivirtauksen ylläpitäminen muodostaa tornin 208 sisään vedellä lähes kyllästyneen atmosfäärin, ' ’ * ; .· joka estää geelimateriaalin ja siemenanalogeissa olevien : alkioiden kuivumisen tornissa.

Kuten kuviossa 15 esitetään, yksi edullinen tornin ,· 30 208 suoritusmuoto käsittää pyöreän pohjaosan 214, pysty-

* I

suoran sylinterimäisen osan 215 ja ympyrän muotoisen ylä-laipan 216. Torni 208 suljetaan pyöreällä kannella 218, • ·’ joka voidaan tiivistää asianmukaisesti ja pitää paikallaan pulteilla tai muilla välineillä, jotka eivät näy kuvassa.

110870 32

Yhdysputki 209 hapen poistamiseksi tornista sijaitsee kannessa 218.

Tornin sisällä on pohjalla hapen tuloa varten ko-koomatila 220, johon johtaa yhdysputki 207. Kokoomatilaa 5 220 peittää huokoinen metallinen tai lasinen diffuusiolevy 222. Vesiallas 224 on diffuusiolevyn 222 päällä ja siitä johdetaan pois vettä yhdysputken 213 kautta. Sylinterimäi-nen huokoinen verho 228 lähtee alaspäin rengasmaisesta reunakourusta 226 ja ulottuu altaaseen 224. Poistettavissa 10 oleva teline 231, joka käsittää pystyosia 232 ja vaakasuoria hyllyjä 234 siemenanalogeja 238 verten, on tehty sopivaksi tornin 208 sisään ja lepää pystyasennossa diffuusio-levyllä 222. Kudotusta metalliverkosta tai rei'itetystä metallilevystä valmistettu sylinterimäinen osa 230, joka 15 sijoitetaan verhon 228 ja telineen 231 väliin, lepää myös diffuusiolevyllä 222.

Happi tulee kokoomatilaan 220 yhdysputken 207 kautta. Happi kulkee diffuusiolevyn 222 läpi ja kuplina vesialtaan 224 läpi. Torniin 208 tulee steriiliä vettä yhdys-20 putken 211 kautta ja se virtaa reunakouruun 226 ja täyttää sen. Reunakourun yli virtaava vesi valuu kaskadimaisesti . alas verhoa 228 pitkin altaaseen 224. Vettä poistetaan altaasta 224 yhdysputken 13 kautta kierrätettäväksi. Sy- • linterimäinen osa 230 ympäröi verhoa 228, jota estetään 25 alas valuvaa vettä roiskumasta ja tippumasta telineelle 231.

: .·' Tämän keksinnön mukaiset siemenanalogit 238 voidaan ’ · hapettamisensa ajaksi sijoittaa suoraan hyllyille 234.

Siemenanalogit 238 voidaan haluttaessa sijoittaa myös pet-j 30 rimaljoihin 236 tai muuhun sopivaan matalaan astiaan, jot-.* *. ta estetään siemenanalogien putoaminen hyllyiltä 234. Te line 231 (jossa siemenanalogit 238 ovat) sijoitetaan ha- '» “ pettämisen ajaksi torniin 208, joka suljetaan kannella * ‘ ’ 218. Tornin 208 läpi virtaa happea ja vettä edellä kuva- !'·*. 35 tulla tavalla.

* » ’ ' * 110870 33

Aika, joka kuluu siemenanalogien 238 hapettamiseen tornissa 208, ei ole erityisen ratkaiseva. 10 - 24 tunnin jaksot ovat osoittautuneet tyydyttäviksi. Todellisuudessa tarvittava aika riippuu jossakin määrin siemenanalogin 5 rakenteesta, erityisesti tornissa vallitsevalle atmosfäärille alttiina olevana geelipinnan määrästä. Siemenanalo-git, jotka ovat kuviossa IA, IB tai 1C esitettyä tyyppiä, saattaisivat esimerkiksi vaatia vähemmän hapetusaikaa kuin kuvion 2A, 2B tai 16 mukaiset. Yli noin 18 tuntia kestä-10 vistä hapetusjaksoista on normaalisti havaittu olevan vain vähän etua.

Hapetettuja geelejä sisältävistä siemenanalogeista tapahtuva itäminen

Kuviot 4 ja 5 ovat molemmat vaiheittaisia kuvia 15 paljassiemenisen kasvin alkiosta 12, joka itää kasvinsie-menanalogista 100. Vaikka analogi 100 esitetään ovoidin muotoisen hydratoidun hapetetun geelikapselin 101 käsittävänä, ymmärrettäneen, että kuvioita 4 ja 5 voidaan soveltaa myös muihin kapselisuoritusmuotoihin, kuten ulkokuoren 20 sisältäviin. Yksinkertaisuuden vuoksi siemenanalogi 100 esitetään "kylvettynä" asettamalla se maan pinnalle 102, ;t vaikka useimmiten analogi 100 kylvettäisiin maan pinnan 102 alle. Selkeyden vuoksi kukin kuva on poikkileikkausku- * · ’ ; va molempien kuvioiden 4 ja 5 oikeanpuolimmaista kuvaa ·’ 25 lukuun ottamatta.

* Kuvio 4 esittää alkion vaiheittaista itämistä kap- : .* selista 101, jolloin sekä alkeisjuuri 48 että sirkkalehdet ·’ ' tunkeutuvat ulos kapselin 101 eri päistä suurin piirtein samanaikaisesti. Ensimmäinen eli vasemmanpuoleisin kuva : ,· 30 esittää kapselia 101, joka sisältää alkion 12 sisälleen upotettuna. Toisessa kuvassa itäminen on alkanut ja kasvava alkeisjuuri 104 on kasvanut riittävästi tunkeutuakseen • j ulos kapselista 105. Myös sirkkalehdet 106 ovat kasvaneet riittävästi alkaakseen juuri tulla ulos kapselista 105. ;·: 35 Kolmannessa eli keskimmäisessä kuvassa juuri 108 (joka on 110870 34 kehittynyt alkeisjuuresta) tunkeutuu maan pinnan 102 läpi ja sirkkalehdet 110 ovat pidentyneet edelleen. Kapseli 112 pysyy siten kiinnittyneenä alkeisvarteen 114 samalla tavalla kuin helmi lankaan. Neljännessä kuvassa taimesta 116 5 on tullut pystympi, juuri 118 on kasvanut pitemmälle alaspäin ja sirkkalehdet 120 ovat alkaneet aueta. Kapseli 122 pysyy kuitenkin kiinnittyneenä alkeisvarteen 124. Lopuksi, kuvion 4 oikeanpuolimmaisessa kuvassa, kapseli on haljennut kahdeksi puoliskoksi 126 ja 128 ja pudonnut pois tai-10 meitä 130.

Vertailun vuoksi kuvio 5 esittää itämismallia, joka muistuttaa läheisesti luonnollisella siemenellä esiintyvää ja jossa siemenanalogissa 100 on tietynasteinen sirkkaleh-tipidäke, joka simuloi normaalia kasvinsiementä. Ensimmäi-15 sessä eli vasemmanpuolimmaisessa kuvassa kasvinsiemenana-logi 100 koostuu alkiosta 12, jossa on alkeisjuuri 48 ja sirkkalehdet 49, ja alkiota 12 ympäröivästä hydratoidusta hapetetusta geelikapselista 101. Toisessa kuvassa alkeis-juuri 132 on puhjennut ulos kapselista 134. Kolmannessa 20 kuvassa näkyy juuri 136 tunkeutumassa maan pinnan 102 läpi ja sirkkalehdet 138 ovat pidentyneet. Kapselista 140 on tehty riittävän luja estämään sirkkalehtiä 138 kasvamasta kapseliin 140 ja jäämästä sinne loukkuun, kun sirkkalehdet ; pitenevät, ja mahdollistettu siten kapselin 140 työntymi- 25 nen kasvavien sirkkalehtien 138 edellä. Neljännessä kuvas- 1 4 · * sa juuri 142 ja sirkkalehdet 144 ovat kasvaneet pidemmik- » , '.· si. Kapselin 146 pysyy kiinnittyneenä sirkkalehtiin 144 .· ϊ antaen niiden samalla pidetä luonnollisesti ilman epämuo dostumia ja loukkuun jäämistä. Viidennessä kuvassa taimi : * ,* 30 148 on pidentynyt riittävästi nostaakeen kapselin 150 irti maan pinnasta 102. Lopuksi, oikeanpuolimmaisessa kuviossa, , * , kapseli 152 on pudonnut pois sirkkalehdiltä 154 luonnon- • siemenen kuorta vastaavalla tavalla. Taimi 156 näyttää ‘ * normaalilta ja sillä on erinomaiset jatkokasvunäkymät.

• » » * * » t 35 110 8 7 0 Jäljempänä olevissa esimerkeissä kuviossa 4 esitetyn kaltaista kasvumallia, jossa kapseli pysyy jonkin aikaa kiinnittyneenä itäneen alkion alkeisvarteen, ei pidetä yhtä toivottavana kuin kuvion 5 esittämää, jossa kapseli 5 pidättää väliaikaisesti sirkkalehtiä luonnonsiemenen tavoin. Ei kuitenkaan ole olemassa todisteita, että kuvion 4 esittämä itämismalli olisi millään tavoin haitallinen taimenen elossapysymiselle. Edellä kuvioiden 4 ja 5 yhteydessä käsitellyt itämismallit on havaittu säännöllisesti 10 lukuisissa tutkimuksissa, jotka ovat koskeneet tämän keksinnön mukaisten kasvinsiemenanalogien erilaisia suoritusmuotoja. Vaikka kuvion 5 mukainen malli muistuttaa enemmän luonnonsiemenen itämismallia, sekä kuvion 4 että kuvion 5 mukaiset mallit johtavat normaalien taimien syntymiseen.

15 Sirkkalehtipidäke

Olemme havainneet, että siemenanalogirakenteet, jotka mahdollistavat kehittyvien sirkkalehtien ja/tai epi-kotyylin joutumisen loukkuun keinotekoisen gametofyytin sisään, eivät ole edullisia. Tällainen loukkuun jääminen 20 voi estää kasvavaa kasvia pääsemästä ulos siemenanalogista ja aiheuttaa siten epänormaalia kasvua ja jopa itävän al-. kion kuoleman. Kuten esitetään tarkemmin esimerkissä 14, siemenanalogi, joka mahdollistaa itävän alkion "luonnolli- ! « · • sen" esiintulon ja lopulta kapselin irtoamisen, on siten 25 edullisin.

Yksi mitä edullisin siemenanalogisuoritusmuoto, joka tarjoaa tämän keksinnön mukaisen sirkkalehtipidäk-keen, esitetään kuviossa 16, jossa siemenanalogi 250 käsittää ulkokuoren 252, joka ympäröi suurin piirtein koko-' ‘ 30 naan ravinnegeeliä 258, joka toimii keinotekoisena gameto- fyyttinä alkiolle 266. Ulkokuori helpottaa korotettujen » happipitoisuuksien ylläpitämistä siemenanalogissa 250 ja mahdollistaa samalla alkiosta 266 kehittyvän verson pääsyn : ulos siemenanalogista itämisen aikana.

36 110 8 7 0

Ulkokuorella 252 on avoin pää 254 ja suljettu pää 256. Ulkokuori 252 voidaan muodostaa ohuesta muovimateriaalista tai selluloosamateriaalista, josta on tehty veden-kestävä sellaisin keinoin kuin upottamalla sopivaan neste-5 mäiseen kuumaan vahaan, kuten parafiiniin. Jos käytetään ulkokuorta 252, se voi sisältää kemiallisia lisäaineita, kuten antibiootteja ja/tai fungisideja, ulkopuolisesta ympäristöstä mahdollisesti tapahtuvan mikro-organismihyök-käyksen torjumiseksi. Yksi tapa ulkokuoren 252 valmistami-10 seksi, joka on osoittautunut hyvin tyydyttäväksi, on muodostaa ulkokuori palasta tavallista paperista juomapilliä, jonka läpimitta on 6,5 mm ja pituus 10 - 20 mm. Selluloosasta tai muusta biologisesti helposti hajoavasta materiaalista valmistettu ulkokuori 252 on edullinen, jotta ai-15 emmista kasvatuseristä peräisin olevat käytetyt kuoret eivät sotke taimipenkkejä. Suljettu pää 256 voidaan muodostaa käyttämällä sopivaa tulppaa tai sulkua tai edullisesti yksinkertaisesti puristamalla kiinni, jolloin muodostuu jossakin määrin kupolimainen tai suppeneva pää. 20 Ulkokuoreen, jonka pituus on 14 - 18 mm, mahtuu noin 0,8 cm3 geeliä. Geelitilavuus 0,5 - noin 1,0 cm3 on taval-, lisesti hyvin tyydyttävä.

Ulkokuoren 252 koko voi vaihdella lisättävän kasvi- ·· lajin mukaan. Edellä mainitut mitat ja geelikapasiteetit 25 soveltuvat douglasinkuusen alkioiden lisäämiseen, eikä niitä tulisi katsoa rajoittaviksi tämän eikä muiden lajien ; ‘ _: suhteen.

:Alkio 266 on sisemmässä huokoisessa putkessa 260, jonka tarkoituksena on muodostaa ainakin osittain riittävä .· : 30 sirkkalehtipidäke. Sisemmällä huokoisella pitkella 260 on

i I

avoin pää 263 ja suljettu pää 264. Alkio 266 sijoitetaan siemenanalogiin 250 sillä tavalla, että sirkkalehdet 268 . ; suuntautuvat kohti suljettua päätä 264 ja latentti alkeis- juuri 270 kohden avointa päätä 263. Huokoinen putki 260 :v, 35 voidaan valmistaa erilaisista materiaaleista, jotka eivät i 37 1 10 8 7 0 ole kasveille myrkyllisiä ja mahdollistavat kosteuden ja ravinteiden riittävän siirtymisen alkioon 266. Sellaiset huokoiset materiaalit kuin suodatinpaperi, kipsi ja kohtuullisen jäykät avosoluiset vaahdot ovat osoittautuneet 5 tyydyttäviksi, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta. (Huokoisen putken muodostamista koskevia yksityiskohtia esitetään lisää jäljempänä.) Suodatinpaperista tai vastaavasta materiaalista valmistettu huokoinen putki voi mahdollisesti sisältää pieniä reikiä. Douglasinkuuden somaat-10 tisille alkioille on osoittautunut hyvin tyydyttäväksi huokoisen putken pituus 4-8 mm ja sisäläpimitta noin 1,5 - 3 mm. Huokoisen putken 260 sisäläpimitan tulisi olla sellainen, että se mahdollistaa alkion jonkin verran suurentuneen sirkkalehtiosan 268 olemisen läheisessä koske-15 tuksessa huokoisen putken 260 seinämien kanssa. Hapetetusta geelistä tulevat ravinteet kulkevat huokoisen putken 260 läpi ja imeytyvät kasvavaan alkioon ilmeisesti sirkkalehtien kautta. Kuten edellä mainittiin, geelin 258 tulisi olla kyllin lujaa estäkseen ylimääräistä nestettä tihku-20 masta geelistä 258 alkion 266 täyttämään onteloon 262.

Ulkokuori 252 voidaan täyttää ravinnegeelillä 259 , millä tahansa edellä kuvatuista keinoista. Yksi edullinen * menetelmä on automaattipipetin käyttö. Kukin ulkokuori 252 < · täytetään muutaman millimetrin päähän avoimesta päästä 254 » 25 ja geelin 258 annetaan kovettua jäähdyttämällä (jos käyte-tään agaria) tai tekemällä ioninvaihto (jos käytetään nat-riumalginaattia).

, Geeliin 258 muodostetaan samankeskinen sisäontelo huokoista putkea 260 varten. Ontelo voidaa muovata geeliin : 30 sen kovettumisen aikana tai jälkeen. Ontelon muodostaminen t · ,···, geelin kovettumisen jälkeen voidaan tehdä lukuisin tavoin.

I I

Esimerkiksi lävistimenä käytettävä ohutseinäinen sylinte- I * rimäinen teräsputki on osoittautunut hyvin sopivaksi. Te-räsputkeen jäävä geeliydin voidaan helposti poistaa ali-35 paineen avulla. Geeliin siten muodostetun ontelon sisälä- $ | 38 110 8 7 0 pimitän tulisi olla suunnilleen sama kuin huokoisen putken 260 ulkoläpimitta, niin että säilytetään läheinen kosketus niiden välillä. Huokoinen putki 260 voidaan sijoittaa onteloon käyttämällä karaa. Onteloon sijoitettu huokoinen 5 putki 260 esikostutetaan edullisesti vedellä, jotta vältetään veden imeytyminen geelistä. Huokoinen putki voidaan vaihtoehtoisesti muodostaa ontelon sisällä, kuten kuvataan yksityiskohtaisemmin jäljempänä.

Kun huokoinen putki 260 on muodostettu ontelossa 10 tai sijoitettu sinne, alkio 266 voidaan sijoittaa huokoiseen putkeen 260 sirkkalehtipää edellä.

Kun alkio 266 on sijoitettu, siemenanalogi 250 voidaan hapettaa edellä kuvatulla tavalla. Olemme havainneet, että alkion sijoittamisen jälkeen tehtävä hapetus on edul-15 lisempaa kuin geelin hapettaminen ennalta automaatistani! -sen kannalta katsottuna, vaikka tulokset ovat käytännöllisesti katsoen samat.

Hapetuksen jälkeen geelin pinnalle ja huokoisen putken 260 ulkonevan avoimen pään 263 ympärille levitetään 20 ensimmäinen päätysulku 272. Ensimmäinen päätysulku 272 ei kuitenkaan saisi peittää huokoisen putken 260 avointa pää-tä 263. Tähän päästään helposti sijoittamalla sopiva kara huokoisen putken 260 päähän ensimmäisen sulun 272 muodos-; tamisen ajaksi.

·' 25 Monet materiaalit soveltuvat ensimmäiseksi päätysu- * luksi 272. Tavallinen parafiinivaha on osoittautunut hyvin : ’.· tyydyttäväksi. Ensimmäisen päätysulun 272 paksuus on tyy- pillisesti 2-4 mm, mutta tämä ei ole millään tavoin ratkaisevaa.

/· 30 Ensimmäisen päätysulun 272 päälle levitetään edul- lisesti toinen päätysulku 274 huokoisen putken 260 avoimen / > pään 263 peittämiseksi. Toisen päätysulun 274 tulisi olla ’· hyvin ohut, tyypillisimin korkeintaan noin 1 mm:n paksui- ' * nen. Se voidaan valmistaa samasta materiaalista kuin en- 35 simmäinen päätysulku 272. Yksi tapa muodostaa toinen pää- 39 110870 tysulku 274 on esimerkiksi kuumentaa ensimmäisen päätysu-lun 272 pintaa riittävästi pinnan sulattamiseksi ja vetää pieni määrä sulaa materiaalia avoimen pään 263 poikki, niin että avoimelle päälle 263 muodostuu kalvo.

5 Samoin kuin ulkokuoren 252 kohdalla, jos sellaista käytetään, ensimmäiseen ja toiseen päätysulkuun voidaan mahdollisesti lisätä patogeenejä torjuvia kemikaaleja.

Huokoisen putken 260 suljetun pään on havaittu olevan edullinen. Suljettu pää 264 estää huokoisen putken 10 sisällä kasvavia sirkkalehtiä 268 tunkeutumasta huokoisen putken läpi ja leviämästä geeliin 258. Olemme havainneet, että sirkkalehdet 268, jotka leviävät geeliin 258, jäävät loukkuun geeliin tavalla, joka estää kasvavaa kasvia pääsemästä ulos siemenanalogista. Tällaisen loukkuun jäämisen 15 otaksutaan olevan versojen epänormaaliuksien merkittävä aiheuttaja. Kasvavat sirkkalehdet pidetään edullisesti vain tilapäisesti huokoisen putken 260 sisällä. Kasvaessaan ja pidentyessään sirkkalehdet painuvat vasten huokoisen putken sisäpintoja ja tunkeutuvat ulos huokoisesta 20 putkesta ja siten ulos keinotekoisesta gametofyytistä.

Tässä suhteessa kuvion 16 mukainen suoritusmuoto simuloi , tehokkaasti luonnonsiementä.

< · · ; Ymmärrettäneen, että kuvion 16 mukaisen suoritus- : muodon samoin kuin muiden tässä esitettyjen suoritusmuoto- v 25 jen valmistus voidaan helposti automaatistaa käsityön eli-'”*· minoimiseksi.

; ',·* Asianmukainen sirkkalehtipidäke voidaan yleensä : : : saada aikaan lukuisin tavoin, mukaan luettuina seuraavat, mainittuhin kuitenkaan rajoittumatta: ;*· l 30 (1) Alkio suljetaan ennalta muodostettuun sylinte- * · riin, joka ympäröi alkiota ja on kosketuksessa sen kanssa, ja koteloidaan sylinteri ravinnegeeliin ("keinotekoinen ’· * gametofyytti") kuviossa 16 yleisesti esitetyllä tavalla.

’ ‘ Kuten edellä kuvattiin, ennalta muodostetun sylinterin 35 tulisi olla huokoinen, ja se voidaan valmistaa sopivista 1 f Ί i t 40 110870 materiaaleista, kuten lasi-, metalli-, elastomeeri-, ke-raami-, savi-, kipsi-, sementti-, tärkkelys-, kitti-, synteettisistä polymeeri-, luonnonpolymeeri- ja liimamateri-aaleista, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta.

5 (2) Muodostetaan geelikapseliin ontelo ja kiinnite tään huokoinen materiaali ontelon seinämiin ennen alkion sijoittamista onteloon. Huokosmateriaaliehdokkaisiin kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, dialyysilet-ku, luonnonainetta oleva makkarankuorimateriaali, paperi, 10 kangas ja kollageenimateriaalit.

(3) Muodostetaan ensimmäinen ontelo geelikapseliin, täytetään ontelo mukautuvalla huokoisella aineella ja sitten joko muodostetaan läpimitaltaan pienempi, ensimmäisen ontelon kanssa samankeskinen toinen ontelo huokoiseen ai-15 neeseen ennen alkion sijoittamista toiseen onteloon tai sijoitetaan alkio suoraan ensimmäisessä ontelossa olevaan huokoiseen aineeseen. Vaihtoehtoisesti ainakin alkion sirkkalehtipää kastetaan mukautuvaan huokoiseen aineeseen ennen alkion sijoittamista ensimmäiseen onteloon. Mukautu-20 vien huokoisten materiaalien edustajia ovat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, kipsi, sementti, luonnon- ja synteettiset polymeerit, puuhartsit, huokoiset vahat, agar tai alginaatti suurempana pitoisuutena kuin geelikapseliin • käytettävä sekä vahat.

·1 25 (4) "Kovetetaan" itse geeli esimerkiksi ennen onte- • · lon mudoostamista siihen tai sen jälkeen ja sijoitetaan • » t ; ,· siten alkio onteloon. Tässä käytettynä "kovettaminen" tar- : : : koittaa yleisesti keinotekoisen gametofyytin muodostavan geelin tekemistä jäykemmäksi. Kovettaminen voidaan tehdä i" 1 30 suurentamalla geelinmuodostusainepitoisuutta, tekemällä .geelin "pintakuivaus" tai lisäämällä geeliin hiukkasmate-riaalia. Hiukkasmateriaaliehdokkaisiin kuuluvat, mainit- • « 1 '· : tuihin kuitenkaan rajoittumatta, hiekka, kipsi, massakui- f I » i ♦ 1 dut, sementti ja polymeeriset aineet.

» * f f I i t 110870 41 (5) Sijoitetaan arkki tai pala huokoista materiaalia alkion ja geelin väliin alkion ollessa sijoitettuna geeliin. Huokosmateriaaliehdokkaisiin kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, polymeerissä liotettu pape- 5 ri, kangas ja polymeeriarkit.

(6) Muodostetaan geeliin ontelo ja levitetään sitten mukautuva huokoinen päällyste ontelon seinämille. Päällystysmateriaaliehdokkaisiin kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, kuivat jauhemaiset materiaalit, 10 kuten kipsi tai sementti, jotka geelistä tulevalla nesteellä kostuessaan muodostavat huokoisen sulun. Vaihtoehtoisesti voidaan ytimen seinämille levittää kudoksen muodostavaa materiaalia, kuten gelatiinijauhetta, sienimate-riaalia, luonnonkuitukudosta ja vaahtoja.

15 (7) Muodostetaan geelikapseli ( "keinotekoinen game- tofyytti") käyttämällä riittävästi konsentroitua geeliliu-osta, jotta estetään siinä itävää alkiota kasvamasta ja jäämästä loukkuun geeliin.

Kuvio 17 esittää paljassiemenisen kasvin alkion 266 20 asteittaista itämistä kuvion 16 mukaisesta siemenanalogi-suoritusmuodosta 250. Ensimmäinen eli vasemmanpuolisin kuva esittää siemenanalogia 250 maan tai vastaavan kasvualustan pinnalla 102. Analogi 250 esitetään yksinkertai-; suuden vuoksi "kylvettynä" pinnalle 102. Ymmärrettäneen ·’ 25 kuitenkin, että analogi 250 voidaan kylvää myös pinnan 102 alle. Vasemmanpuolisinmassa kuvassa viitenumerot ovat sa- ' » mat kuin kuviossa 16 käytetyt.

• > ί Toisessa kuvassa vasemmalta lukien itäminen on al kanut ja kasvava alkeisjuuri 302 on kasvanut riittävästi 30 rikkoakseen toisen päätysulun 274. Siten alkeisjuuri 302 t · alkaa kasva ulos- ja alaspäin kapselista 300 muodostaak-/ t seen lopulta juuren, joka kiinnittää verson maahan. Itämi- '· ' sen alussa, ennen alkion 266 puhkeamista siemenanalogista • · 250 geelissä 250 ("keinotekoisessa gametofyytissä") olevia ]'·'· 35 ravinteita (jos niitä on), happea ja muita kaasuja sekä 42 110870 vettä kulkee geelistä 258 huokoisen putken 260 läpi ja imeytyy alkioon 266. Heti kun kasvava alkeisjuuri 302 on rikkonut toisen päätysulun 274, ilmakehän happea pääsee onteloon 262 täydentämään geelistä 258 alkioon 266 tulevaa 5 happea. Toisesta kuvasta on nähtävissä myös, että sirkkalehdet 304 ovat alkaneet suurentua ja pidentyä, jolloin ne painuvat vasten huokoisen putken 260 sisäseinämiä ja helpottavat alkeisjuuren 302 pääsyä ulos kapselista 300.

Kuvion 17 keskimmäisessä kuvassa alkeisjuuri on 10 pidentynyt edelleen, tunkeutunut maahan ja muodostanut juuren 306. Sirkkalehdet 308 ovat pidenneet edelleen ja työntyvät edelleen vasten huokoisen putken 260 sisäseinämiä, huokoisen putken suljettu pääty 264 mukaan luettuna, helpottaen siten edelleen "luonnollista" itämistä. Huokoi-15 nen putki 260 mahdollistaa ravinteiden (jos niitä on), veden, hapen ja muiden kaasujen siirtymisen edelleen geelistä 258 versoon 310 ja estää samalla putken 260 sisällä kasvavia sirkkalehtiä 308 tunkeutumasta putken 260 läpi. Siten estetään sirkkalehtien 308 jääminen loukkuun geeliin 20 258.

Kuvion 17 neljännessä kuvassa vasemmalta lukien verso 312 on kasvanut edelleen, niin että sillä on pidempi juuri 314, ja (vaikkakaan ei aina) nostanut kapselin 300 ; irti pinnasta 102. Sirkkalehdet omaksuvat luonnollisen >' 25 "lintuhäkkimäisen" ulkonäön pidentyessään edelleen huokoi- * sen putken 260 ulkopuolelle.

Lopuksi, oikeanpuolimmaisimmassa kuvassa, versosta v ϊ 318 on tullut täysin pysty ja se on pudottanut kapselin 300 vastaavalla tavalla, kuin terve verso pudottaa luon-; · 30 nossa kasvinsiemenen jäännökset. Juuri 320 on jatkanut , kasvuaan alaspäin, ja sirkkalehdet 322 ovat avautuneet.

Versolla 318 on erinomaiset mahdollisuudet kehittyä ter-veeksi kasviksi.

I * f 43 110870

Lisämääritelmiä

Seuraavat esimerkeissä käytettävät termit määritellään seuraavasti: "Somaattinen alkio" on kasvialkio, joka on kehitty-5 nyt totipotenttien kasvisolujen laboratoriokasvatuksen tai indusoidun jakautumismonialkioisuuden kautta.

"Tsygoottinen alkio" on kasvialkio, joka on poistettu vastaavan kasvin siemenstä.

"Verso" on alkio, joka on kasvanut ja kehittynyt 10 riittävästi tunkeutuakseen ulos kapselista tavalla, joka vastaa tunkeutumista ulos luonnollisesta kasvinsiemenestä.

"Alkeisjuuri" on kasvialkion se osa, josta kehittyy tuloksena olevan kasvin primaarijuuri.

"Sirkkalehti" tarkoittaa yleisesti ensimmäistä leh-15 timäistä rakennetta tai ensimmäistä paria tai ensimmäistä kiehkuraa (kasvityypin mukaan) lehtimäisiä rakenteita kas-vialkiolla, joiden päätehtävänä on saattaa siemenessä olevia ravinneyhdisteitä kehittyävän alkion hyödynnettävissä olevaan muotoon, mutta jotka joissakin tapauksissa toimi-20 vat ravintovarastona tai fotosynteettisinä rakenteina.

"Alkeisvarsi" on se kasvialkion tai taimen osa, , joka sijaitsee sirkkalehtien alapuolella mutta alkeisjuu- : ren yläpuolella.

I · "Epikotyyli" on itämisen jälkeen varren kärjestä 25 kehittynyt kasvin osa.

"Kapseli" tarkoittaa ainakin hydratoitua geeliä, '/· joka ympäröi siihen upotettua kasvialkiota.

, "Alkeisvarren pituus" tarkoittaa alkeisvarren pi tuutta alkeisvarren mittaushetkellä.

: 30 "Alkeisvarren itäminen" tarkoittaa alkion verson • 1 f * t

« I I ? I

44 110870 "Turvonnut alkeisvarsi" on epänormaalin alkion ominaisuus, jolle on tunnusmerkillistä, että alkeisvarrella tai sen osalla on normaalia suurempi läpimitta verrattuna ravinneagarin tai vastaavan ravinnealustan pinnalla kas-5 vaneiden paljaiden vertailualkioiden alkeisvarsiin.

"Kiertynyt alkeisvarso" on epänormaalin alkion ominaisuus, jolle on tunnusmerkillistä, että alkeisvarressa on kierteisesti pituussuunnassa ylös- tai alaspäin kulkevia uria. Tämä vika esiintyy tavalisesti vain alkioissa, 10 joissa on turvonneita alkeisvarsia.

"Turvonneet sirkkalehdet" on paljassiemenisen kasvin epänormaalin alkion ominaisuus, jolle on tunnusmerkillistä epätavallisen suuri yksi tai useampi sirkkalehti verrattuna ravinneagarin tai vastaavan ravinnealustan pin-15 nalla kasvaneiden paljaiden vertailualkioiden sirkkaleh-tiin.

"Kiertynyt sirkkalehti" on paljassiemenisen kasvin epänormaalin alkion ominaisuus, jolle on tunnusmerkillistä, että yhdellä tai useammalla sirkkalehdellä on spiraa-20 limainen eli kiertynyt ulkonäkö.

"Alkeisjuuren pituus" tarkoittaa alkeisjuuren pi-, tuutta alkeisjuuren mittaushetkellä.

1 t "Alkeisjuuren itäminen" tarkoittaa juuren ilmaantu- s · • mistä tai tunkeutumista ulos kapselista, jonka aiheuttaa V 25 alkeisjuuren piteneminen riittävästi kapselin puhkaisemi-‘ · seksi. Tämän termin yhteydessä ei oteta huomioon pituus- : kriteerejä.

: "Kasvu kapselin läpi" tapahtuu, kun kapselin sisäl lä olevan alkion sekä alkeisjuuri että alkeisvarsi kasva-• j 30 vat ja puhkaisevat kapselin molemmista päistä. Tämä ilmenee tavallisesti kapselin jäämisenä joksikin aika kiinni alkeisvarren ympärille pallomaisena kappaleena.

: "Normaalius" tarkoittaa kaikkien osien (alkeisjuu- · ren, alkeisvarren, yhden tai useamman sirkkalehden ja epi- ",35 kotyylin) läsnäoloa arviointihetkellä, jolloin paljassie- 45 110870 menisten ollessa kyseessä alkeisjuuren pituus on yli 3 mm, ja silmin havaittavissa olevien epämuodostumien puuttumista verrattuna ravinneagarin tai vastaavan ravinnealustan pinnalla kasvaneiden paljaiden vertailualkioiden ulkonä-5 köön.

On tärkeää huomata, että kunhan kaikki alkionosat ovat itäneet, vastaavalla versolla on todennäköisesti mahdollisuudet kasvaa normaaliksi taimeksi- Meillä ei ole mitään syytä otaksua, että seuraavissa esimerkeissä il-10 menevät epämuodostumat ovat kohtalokkaita versoille. Epämuodostumien määrän ja laadun tarkkailu on kätevä tapa tehdä vertailevia arvioita kasvinsiemenanalogien valmistukseen käytettävistä erilaisista menetelmistä ja keinoista. Kasvin alkiokudos on onneksi erittäin herkkää luonnot-15 tornille olosuhteille, ja tämä herkkyys ilmenee harjaantu neen tarkkailija havaittavissa olevilla tavoilla.

Esimerkki 1 Tässä esimerkissä arvioidaan vertailua varten alkion itämistä hapettamattomista kapseleista, jotka ovat 20 EP-hakemusjulkaisussa 0 107 141 esitettyä tyyppiä. (Tällä EP-hakemuksella, josta käytetään tässä lyhennettä EPÄ '141, vaaditaan prioriteettia US-patenttijulkaisuhakemuk- i sen nro 06/433 688 nojalla, joka on jätetty 12 lokakuuta » » ; 1982.) Erillisille sarjoille metsäkuusen tsygoottisia ai- ·’ 25 kioita tehtiin yksi seuraavista käsittelyistä: * Käsittely (1): "Vertailukoe", jossa paljaat alkiot ,· sijoitettiin suoraan ravinneagarin pinnalle alalla tunne- : tulla tavalla.

Käsittely (2): Alkiot koteloitiin natriumalgnaat-;* _| 30 tiin EPÄ '141:ssä esitetyllä tavalla.

" . Käsittely (3): Muodostettiin kapseleita ilman alki oita EPÄ '141:ssä esitetyllä tavalla, minkä jälkeen kukin '· ! kapseli leikattiin kahtia, sijoitettiin alkio sen keskelle * · ja painettiin kapselin puoliskot yhteen alkion ympärille j'. . 35 kapselin kiinnittämiseksi alkion ympärille.

I 1 s - » 46 110 8 7 0

Kaikki käsitellyt näytteet laitettiin peitetyille petrimaljoille ravinneagaralustan (1 % agaria) pinnalle. Kullekin maljalle sijoitettiin kuusi alkiota ja kunkin käsittelyn kohdalla valmistettiin kuusi rinnakkaismaljaa.

5 Kaikki maljat laitettiin inkubaattoriin, jossa lämpötila oli 23 °C, jatkuvan suodatetun fluoresenssivalon alle itämisen stimuloimiseksi. Maljat poistettiiin inkubaattorista 28 vuorokauden kuluttua ja tutkittiin versojen laatu ja määrä.

10 Tarkastelussa havaittiin, että EPÄ '141:n mukaiset kokonaiset kapselit [käsittely (2)] eivät mahdollistaneet alkeisjuuren pidentymistä. Vaikka käsittelyn (2) kohteena olevien alkioiden alkeisvarret pitenivät tavallisesti, ne olivat epämuotoisia (kiertyneitä ja turvonneita). Nämä 15 tulokset osoittavat, että alkion täytyy käyttää itselleen vahingollista liiallista voimaa itääkseen EPÄ '141:n mukaisesta kapselista.

Käsittelyllä (3) koteloidut alkiot halkesivat kahtia itävän alkion työntövoiman vaikutuksesta, tavallisesti 20 kahden ensimmäisen viikon aikana. Versot eivät kuitenkaan kehittyneet normaalisti. Käsittelyn (3) kohteena olleista , alkioista iti kuitenkin suurempi prosentuaalinen osuus kuin käsittelyn (2) kohteena olleista alkioista. Käsittelyn (3) kohteena olleiden alkioiden normaalin kehityksen * ·’ 25 puuttuminen ei ilmeisesti johtunut kapselin aiheuttamasta * * 6 · ’ * liiallisesta pidäkkeestä, sillä kapselien havaittiin hai- * I * : .* keavan helposti.

·.· - Käsittelyn (1) kohteena olleista "vertailualkiois- ta" 75 % iti normaalisti. Sitä vastoin käsittelyn (2) koh-30 teenä olleista alkioista vain 6 % iti normaalisti. Nämä tulokset osoittavat, että vaikka alkioiden kotelointi hel- .· t pommin rikkoutuvaan alginaattikapseliin [käsittely (3)] • · paransi alkion itämistä, jokin muu tekijä, kuten kyvyttö- » * ♦ * * »Tl»

» I

' * myys saada happea rikkoutumattoman kapselin läpi, näyttää

35 aiheuttavan alkion heikkoa kehitystä, joka havaitaan EP

47 110870 '141:n mukaisesti koteloiduilla alkioilla, verrattuna ra-vinneagarille sijoitettuihin paljaisiin alkioihin, joilla on käytettävissään rajoittamattomasti happea.

Esimerkki 2 5 Tässä esimerkissä määritettiin, onko alkion asema geelikapselissa merkitsevä tekijä alkion itämisen ja normaalin kehityksen onnistumisasteen kannalta.

Erillisille sarjoille metsäkuusen tsygoottisia alkioita tehtiin yksi seuraavista käsittelyistä: 10 Käsittely (1): "Vertailukoe", jossa paljaat alkiot sijoitettiin suoraan ravinneagarin pinnalle alalla tunnetulla tavalla.

Käsittely (2): Muodostettiin kapseleita ilman alkioita EPÄ '141:ssä esitetyllä tavalla, minkä jälkeen kukin 15 kapseli leikattiin kahtia, sijoitettiin alkio siihen siten, että alkeisjuuripää tuli suhteellisen lähelle kapselin ulkopintaa versoon verrattuna, ja suljettiin sitten kapseli uudelleen alkion ympärille puristamalla puoliskot yhteen.

20 Käsittely (3): Samanlainen kuin esimerkin 1 mukai nen käsittely (3).

, Kaikki käsitellyt näytteet laitettiin peitetyille " petrimaljoille ravinneagaralustan pinnalle. Kullekin mal- ;·; jalle sijoitettiin kuusi alkiota ja kunkin käsittelyn koh- ·'·’ 25 dalla valmistettiin kuusi rinnakkaismaljaa. Kaikki maljat · laitettiin inkubaattoriin, jossa lämpötila oli 23 °C, jat- : ',· kuvan suodatetun fluoresenssivalon alle itämisen stimuloisi : miseksi. Maljat poistettiiin inkubaattorista 28 vuorokau den kuluttua ja tutkittiin versojen laatu ja määrä. Tulok-30 set esitetään taulukossa I.

4β 110870 48

Taulukko I

Käsittely Normaaleja Alkeisvarsien Alkeisjuurien versoja (%) keskipituus keskipituus 1 (vertailu) 81 % 1,26 cm 1,44 cm 5 2 (sivussa) 17 % 0,63 cm 0,98 cm 3 (keskellä) 8 % 0,62 cm 0,72 cm

Taulukossa I esitetyt tulokset osoittavat seuraa- vaa: 10 (a) Alkiot, jotka koteloitiin siten, että alkeis- juuret olivat lähellä kapselin pintaa [käsittely (2)], johtivat kaksinkertaiseen määrään normaaleja versoja verrattuna alkioihin, jotka koteloitiin kapselin keskelle [käsittely (3)]. Tämä osoittaa, että työntövoiman mini-15 mointi, joka itävän alkeisjuuren täytyy kehittää tunkeutu-akseen ulos kapselista, on edullista itävälle alkiolle.

(b) Vaikka keskimääräiset alkeisvarren pituudet olivat suunnilleen samat käsittelyjen (2) ja (3) kohdalla, oli alkeisjuuri pidempi käsittelyn (2) yhteydessä, mikä 20 osoittaa, että alkeisjuuren kasvuolosuhteet olivat edullisemmat käsittelyn (2) yhteydessä.

(c) Alkeisjuuren heikko pidentyminen käsittelyjen * (2) ja (3) yhteydessä näyttää johtuvan jostakin rajoittani' vasta tekijästä, kuten alhaisesta happipitoisuudesta, en- V: 25 nen kapselin halkeamista. Tapauksissa, joissa alkeisjuuri jäi kokonaan pidentymättä, alkeis juurelle muodostui rus-kehtavaa haavasolukkoa muistuttavaa kudosmassaa, mikä ,viittaa alkeisjuuren kärjen muodostavien solujen todennä- l » · köiseen kuolemaan. Vaikka kapselit käsittelyjen (2) ja (3) , , 30 yhteydessä näyttivät halkeavan helposti itämisen aikana, ; ne eivät ilmeisesti haljenneet kyllin aikaisin kudoksen ’··>' kuoleman estämiseksi. Se, että suurempi prosentuaalinen :’· ; osuus alkeis juurista pidentyi käsittelyn (2) yhteydessä, : johtui todennäköisesti kapselin halkeamisen ansiosta al- 35 keisjuurelle pääsevästä suuremmasta happimäärästä.

49 110870

Esimerkki 3 Tässä esimerkissä arvioitiin tsygoottisilla alkioilla ilman vaikutuksen alaisena olevan pinta-alan muuttumisen vaikutuksia alkion itämiseen.

5 Erillisille sarjoille metsäkuusen tsygoottisia al kioita tehtiin yksi seuraavista käsittelyistä: Käsittely (1): "Vertailukoe", jossa paljaat alkiot sijoitettiin suoraan ravinneagarin pinnalle alalla tunnetulla tavalla.

10 Käsittely (2): Paljaita alkioita asetettiin agarin sijasta kompleksoitua alginaattia sisältävän ravinnealus-tan (1,5 % alginaattia) pinnalle.

Käsittely (3): Alkiot koteloitiin ravinnegarkappa-leiden (0,8 % agaria) keskelle; kappaleet laitettiin sit- 15 ten ravinneagarin pinnalle.

Käsittely (4): Alkiot koteloitiin ravinneagarkappa-leisiin (0,8 %) siten, että alkeisjuuret pistivät ulos kappaleesta; kappaleet laitettiin sitten ravinneagarin pinnalle.

20 Käsittely (5): Alkiot koteloitiin EPÄ '141:ssä ku vatulla tavalla, paitsi että alginaattipitoisuus oli 1,5 % , ja käytettiin vesipohjaista ravinnenestettä, joka sisälsi * samanlaisia liuenneita ravinteita kuin "MS-neste", veden '· sijasta alginaatin liuottamiseen; kapselin läpimitta oli ,,· 25 noin 3 mm; kapselit laitettiin sitten ravinneagarin pin- nalle.

• > i : : Alginaatin valmistamiseksi käsittelyä (2) varten : valmistettiin 1,5 % alginaattia sisältävä liuos käyttämäl lä "MS-nesteen" kaltaista ravinnenestettä ja kaadettiin . .· 30 liuosta hitaasti steriileihin petrimaljoihin, kunnes kun- , , kin maljan pohja peittyi. Maljoihin ruiskutettiin sitten > · 1 Na(N03)2 -liuosta käyttämällä muovista suihkupulloa algi- \ : naatin kompleksoitumisen (geeliytyrni sen) käynnistämiseksi.

Kun alginaatti oli alkanut geeliytyä (noin 3 min), kaadet-; , , 35 tiin lisää Ca(N03)2:n liuosta ravinnenesteessä kuhunkin t ; ( < t 50 1 10 8 7 0 maljaan geelityneen alginaatin peittävä määrä noin 20 min:n ajaksi. Ca(N03)2 -liuos kaadettiin sitten pois ja kompleksoitua alginaattia huuhdottiin ravinnenesteellä 5 min.

5 Agarkappaleiden valmistamiseksi käsittelyjä (3) ja (4) varten leikattiin ravinnepitoisesta agarista pienellä spaattelilla kappaleita, joiden mitat olivat noin 4 x 4 x 5 mm. Käyttämällä steriilejä pinsettejä kuhunkin kappaleeseen sijoitettiin alkio, kappaleen keskelle käsittelyn (3) 10 ollessa kyseessä ja käsittelyn (4) yhteydessä siten, että alkeisjuuri ulottui kappaleen ulkopuolelle. Alkiot sijoitettiin kappaleisiin alkeisjuuripää edellä käsittelyn (3) yhteydessä ja sirkkalehtipää edellä käsittelyn (4) yhteydessä. Käsittelyn (4) ollessa kyseessä noin puolet alkion 15 pituudesta jätettiin agarkappaleen ulkopuolelle.

Paljaat alkiot [käsittely (1)] ja koteloidut alkiot [käsittelyt (2) - (5)] sijoitettiin petrimaljoihin ravin-neagarpinnoille. Maljat peitettiin ja laitettiin inkubaat-toriin, jossa lämpötila oli 23 °C, jatkuvan suodatetun 20 fluoresenssivalon alle 35 vuorokaudeksi. Sitten tehty tar kastelu antoi taulukossa II esitettävät tulokset.

« * »

Taulukko II

' I · , t* Käsittely Normaaleja Versoja, joiden alkeis- Versoja, joiden sirkka- ·*. 25 versoja (X) varret turvonneita (X) lehdet turvonneita (X) * 1 (agarvertailu) 90 % 0 % 0 % > « » · ' ' 2 (alginaattivertailu) 8 * 36 * 0 % ,'·3 0 * 91 * 47 % 4 61 * 37 * 26 % ' I · ' 30 5 20 * 75 * 3 %

Tuloksista ja johtopäätöksistä voidaan tehdä seu- r § ; ‘: raava yhteenveto: (a) Agarkappaleet, joista alkeisjuuret työntyivät * ; 35 ulos [käsittely (4)] antoivat tulokseksi 61 % normaaleja versoja, joiden alkeisjuuren ja alkeisvarren pituudet oli-vat vastaavat kuin vertailualkioiden. Tämä osoittaa, että 51 110870 fysikaalisen pidäkkeen puuttuminen, vapaa hapensaanti ja ravinnelähde ovat tärkeitä alkeisjuuren optimaaliselle kasvulle.

(b) Alginaattiin koteloidut alkiot [käsittely (5)] 5 antoivat tulokseksi vain 20 % normaaleja versoja. 55 % alkeisjuurista ja 97 % alkeisvarsista iti, mutta 74 % al-keisvarsista oli turvonneita eivätkä siten kehittyneet normaalisti. Tämä osoittaa, että kotelointi kokonaan algi-naatin sisään merkitsee normaalille itämiselle ainakin 10 yhtä ympäristöestettä, kuten hapenpuutetta.

(c) Kompleksoidun alginaatin pinnalle asetetuilla paljailla alkioilla [käsittely (2)] oli sama määrä alkio-kudosta ilman vaikutuksen alaisena kuin agarille sijoitetuilla vertailualkioilla [käsittely (1)]. Käsittelyn (2) 15 kohteena olevissa alkioissa esiintyi kuitenkin paljon vähemmän normaalia itämistä kuin vertailualkioissa. Syy tähän on epäselvä.

(d) Ravinneagarkappaleiden sisään kokonaan suljetut alkiot [käsittely (3)] eivät tuottaneet ollenkaan normaa- 20 leja versoja. Kaikki alkeisvarret itivät, mutta 92 % niistä oli turvonneita. Tämä osoittaa samoin kuin käsittelyn (5) yhteydessä, että täydellinen kotelointi huolehtimatta hapensaannista, näyttää olevan ympäristöeste menestykselliselle itämiselle.

• ** 25 Esimerkki 4 • ' · · Tässä esimerkissä arvioidaan itämistehoa, joka on : .* metsäkuusen alkioilla, jotka sijoitetaan yksitellen puo- v : liksi ravinneagaralustakappaleisiin, verrattuna ravinne- geelialustayksikön pinnalle yksitellen sijoitettuihin al-30 kioihin kunkin geelialustayksikön ollessa ympäröitynä jäy- * > källä "suojakuorella", joka on valmistettu joko ohuesta , läpinäkyvästä muovista tai lasista.

; Erillisille sarjoille metsäkuusen tsygoottisia al kioita tehtiin yksi seuraavista käsittelyistä: 52 110870 Käsittely (1): "Vertailukoe", jossa paljaat alkiot sijoitettiin suoraan ravinneagarin pinnalle alalla tunnetulla tavalla.

Käsittely (2): Valmistettiin kuviossa 6 esitettä-5 väliä tavalla lasisia sylinterimäisiä kapselikuoria 160, joiden pituus oli noin 12 mm, ulkoläpimitta noin 7 mm ja sisäläpimitta noin 5,6 mm. Kunkin kuoren toinen pää 161 suljettiin elastomeeritulpalla 162. Steriloinnin jälkeen kuoret asetettin pystyyn avoin pää ylöspäin ja täytettin 10 noin 2/3 niiden tilavuudesta ravinneagaralustalla 163. Puolet tsygoottisesta alkiosta 164 painettiin kunkin kuoren paljaaseen agarpintaan 165 sirkkalehtipää 166 edellä, jolloin alkeisjuuri 167 jäi ilmakehän vaikutuksen alaiseksi. Tuloksena olevat kapselit 168 käännettiin kyljelleen 15 ravinneagarpinnalle inkubointia varten.

Käsittely (3): Muuten sama kuin käsittely (2), paitsi että alkioiden agariin sijoittamisen jälkeen lasi-kuorien avoimet päät suljettiin osittain atmosfäärin vaikutukselta käyttämällä PARAFILM-laboratoriokalvoa (rekis-20 teröity tavaramerkki, American National Can, Greenwich,

Connecticut). Kalvo levitettiin avoimeen päähän tavalla, joka jätti pienen aukon, jonka kautta alkeisjuuri pääsi ulos itämisen aikana.

; Käsittely (4): Valmistettiin kuviossa 7 esitettä- 25 väliä tavalla jäykkiä kuoria 170 leikkaamalla kirkas muo- • * * · vinen juomapilli, jonka läpimitta oli 4 mm, 4 mm:n pituisiksi paloiksi. Steriloinnin jälkeen kukin kuori 170 ase-/ ·’ tettiin vaakasuoraan ja täytettiin noin puoliksi ravinne agaralustalla 171, niin että kunkin kuoren sisään jäi :*·.· 30 päästä päähän ulottuva tasainen agarpinta 172. Alkio 173 * # sijoitettiin agarpinnalle (eli "hyllylle") kunkin kuoren , sisään. Kunkin kuoren toinen pää 174 suljettiin parafii- : nilla 175; toinen pää 176 jätettiin auki; kuoressa olevan ' * alkion 173 alkeisjuuri 177 suuntautui avointa päätä 176 53 110870 kohti. Tuloksena oleva kapselit 178 laitettiin kyljelleen ravinneagarpinnalle inkubointia varten.

Käsittely (5): Sama kuin käsittely (4), paitsi että alkion kapseliin sijoittamisen jälkeen kuoren avoin pää 5 suljettiin osittain PARAFILM -kalvolla käsittelyn (3) yhteydessä kuvatulla tavalla.

Käsittely (6): Valmistettiin kuviossa 8 esitettävällä tavalla jäykkiä kuoria 180 leikkaamalla kirkas muovinen juomapilli, jonka läpimitta oli 4 mm, 8 mm:n pitui-10 siksi paloiksi. Steriloinnin jälkeen kukin kuori 180 asetettiin vaakasuoraan ja täytettiin noin puoliksi ravinne-agaralustalla 181, niin että kunkin kuoren sisään jäi päästä päähän ulottuva tasainen agarpinta 182. Kunkin kuoren toinen pää suljettiin sitten kastamalla 4 mm:n syvyy-15 delle parafiiniin 184, niin että parafiini 184 täytti noin puolet kuoren sisällä olevasta ilmatilasta. Alkio 185 sijoitettiin agarpinnalle 182 (eli "hyllylle") kunkin kuoren sisään, niin että alkesjuuri 186 suntautui avointa päätä 187 kohden, joka jätettiin auki. Tuloksena olevat kapselit 20 188 sijoitettiin sitten kyljelleen ravinneagarpinnalle itämisen ajaksi.

Käsittely (7): Sama kuin käsittely (6), paitsi että alkion kapseliin sijoittamisen jälkeen kuoren avoin pää suljettiin osittain PARAFILM -kalvolla käsittelyn (3) yh-25 teydessä kuvatulla tavalla.

Kaikkia käsiteltyjä näytteitä inkuboitiin peitetyissä petrimaljoissa, joiden läpimitta oli 100 mm, itämi-> ' sen aikaansaamiseksi. Käsittelyssä (1) käytettiin kuutta maljaa, joista kukin sisälsi kuusi alkiota. Käsittelyissä 30 (2)-(7) käytettiin kussakin kolmea maljaa ja kuutta al- : : kiota maljaa kohden. Maljoja inkuboitiin 35 vuorokautta . esimerkissä 1 kuvatuissa olosuhteissa. Tulokset esitetään I taulukossa III.

35 Taulukko III

54 110870 Käsittely Normaaleja Turvonneita Turvonneita Täysin loukkuun Loukkuun jää- alkioita alkeisvarsia sirkkalehtiä jääneitä neltä sirkka- (X) (X) (X) alkiolta (X) lehtiä (X)

1 (vertailu) 72 X 22 X 6 X OX OX

5 2 39 * 44 * 11 * 6 * 78 * 3 6 * 78 * 45 % 28 % 61 as 4 12 % 17 % 0 % 11 % 61 * 5 12 % 45 % O % 39 % 61 % 6 50 % 34 % 6 % 6 % 61 * 10 7 34 * 45 * 6 * 11 % 79 *

Taulukon III ja muiden havaintojen perusteella tehdyt johtopäätökset voidaan koota yhteen seuraavasti: (a) Kaikissa käsittelyissä, joista puuttui PARA- 15 FILM-kalvolla suljettu pää [käsittelyt (1), (2), (4) ja (6) ] normaalin itämisen prosentuaalinen osuus oli korkeampi, mikä osoittaa alkioiden vapaan hapensaannin edun.

(b) Vertailunäytteillä [käsittely (1)] samoin kuin käsittelyn (4) saaneilla näytteillä normaalien versojen 20 prosentuaaliset osuudet olivat korkeimmat (72 %) ja niitä seurasivat käsittely (6), jossa osuus oli 50 %, ja käsittely (2), jossa osuus oli 39 %. Kapselin pieni massa yhdistyneenä ainakin alkeisjuurien oloon hapen vaikutuksen alaisena itämisen aikana oli ilmeisesti edullista.

25 (c) Käsittelyn (4) tai käsittelyn (5) kohteina ol- leissa alkioissa ei havaittu turvonneita sirkkalehtiä, V: mikä osoittaa kevyiden kapseleiden edun.

;·'* (d) Käsittelyissä (3) - (6) loukkuun jääneiden sirkkalehtien osuus oli sama, vaikka alustan määrä kapse-30 leissa oli erilainen käsittelyssä (3), käsittelyissä (4) • * · ja (5) ja käsittelyssä (6). Nämä kapselin muodot eivät ilmeisesti ole ihanteellisia varhaisen vapautumisen mah- * * * • ' dollistamiseksi paljassiemenisten kasvien itämisen aikana.

(e) Kapselien alkeisjuuripään osittainen sulkeminen : 35 PARAFLM -kalvolla johti alkeisvarsien ja alkeis juurien ; alempiin keskimääräisiin pituuksiin (tuloksia ei esitetä), mikä todennäköisesti osoittaa, että alkeisjuureen kohdistuvalla osittaisella (vaikkakaan ei liiallisella) fysikaa 55 110870 lisella esteellä ennen PARAFILM -kalvossa olevan aukon läpi tunkeutumista on lievä negatiivinen vaikutus.

(f) Käsittelyn (4) kohteena olleilla alkioilla normaalien versojen prosentuaalinen osuus oli sama kuin kä-5 sittelyn (1) kohteena olleilla vertailunäytteillä. Käsittelyn (4) kohteena olleiden alkioiden alkeisvarsien ja alkeisjuurien keskimääräisen pituudet samoin kuin taimien painot (tuloksia ei esitetä) olivat kuitenkin pienemmät kuin vertailualkioiden. Tällaiset alentuneet arvot heijasit) tavat kuitenkin todennäköisesti vain käsittelyssä (4) alkioon itäisen aikana kohdistuneita hieman suurempia fysikaalisia esteitä verrattuna "paljaaseen" alkioon.

Esimerkki 5 Tässä esimerkissä tutkittiin alkion sulkemista ra-15 vinnepitoiseen geeliin upotettuun huokoiseen putkeen parannettuna keinona alkion kiinnittämiseksi fysikaalisesti geelikapselin sisään upottamatta alkiota varsinaisesti suoraan geeliin. Tätä menetelmää tutkittiin, koska "hylly-kapseleita", kuten esimerkin 4 käsittelyn (4) yhteydessä 20 kuvattuja, ei yleensä voi kääntää tai käsitellä alkion putoamatta "geelihyllyltä". Tässä esimerkissä testatut kapselit sisälsivät myös jäykän ulkokuoren fysikaalisena lisäsuojana. Alkion kiinnitys tehtiin käyttämällä suoda-; tinpaperista valmistettua putkea, jolloin suodatinpaperi ·’ 25 toimi "nestesiltana” geelin ja alkion välissä.

’ Erillisille sarjoille metsäkuusen alkioita tehtiin yksi seuraavista käsittelyistä: v : Käsittely (1): "Vertailukoe", samanlainen kuin esi merkin 4 käsittely (1).

30 Käsittely (2): Kuten esimerkin 4 käsittely (4).

Käsittely (3): Valmistettiin lasikuoria, joiden , , sisäläpimitta oli 5,2 mm, esimerkin 4 käsittelyn (2) yh- | teydessä kuvatulla tavalla. Kunkin kuoren toinen pää sul jettiin elastomeerikorkilla ja kuoret steriloitiin. Kukin 35 kuori täytettiin sitten ravinneagarilla. Valmistettiin 56 110870 pieniä paperiputkia, joiden sisäläpimitta oli 2,5 mm ja pituus noin 5 mm, leikkaamalla kvalitatiivinen suodatinpaperi Whatman #1 5 mm:n levyisiksi liuskoiksi, joita kukin kierrettiin puikon ympärille, jonka ulkoläpimitta oli 5 2,5 mm, paperiputken muodostamiseksi. Putkien aukeaminen estettiin käyttämällä pientä palaa etikettiteippiä (2 x 8 mm). Putket autoklavoitiin ja suljettiin toisesta päästä kastamalla kuumaan parafiiniin. Kukin putki asetettiin akselin suuntaisesti suljettu pää edellä omaan agaria si-10 sältävään lasukuoreensa, niin että putken avoin pää tuli samaan tasoon kuoren aukon kanssa. Kuhunkin putkeen asetettiin alkio sirkkalehtipää edellä, niin että alkeisjuu-ren kärki tuli samaan tasoon putken aukon kanssa.

Käsittely (4): Muuten sama kuin käsittely (3), mut-15 ta paperiputkien sisäläpimitta oli 2,5 mm:n sijasta 3,6 mm.

Kussakin käsittelyssä käytettiin kuutta sarjaa ja kuutta alkiota sarjaa kohden. Käsittelyissä (2) - (4) tuloksena olevat kapselit asetettiin kyljelleen ravinneagar-20 pinnoille steriileihin peitettyihin petrimaljoihin ja in-kuboitiin 35 vuorokautta lämpötilassa 23 °C jatkuvan valon . alla. Tulokset on koottu taulukkoon IV.

• 1 • 1 ·

Taulukko IV

** 25 Käsittely lforaaaleja Loukkuun jääneitä Loukkuun jääneitä» mutta ' 1 alkiolta (X) alkioita (yhteensä, I) normaaleja alkioita (k) » 1 (vertailu) 91 - 2 86 92 85 : I : 3 20 87 19 30 4 33 75 16

Itämisen jälkeen tehdyt havainnot ja johtopäätökset koottiin yhteen seuraavasti: - 1 (a) Vertailukoe, jossa alkiot olivat paljaina [kä- | 35 sittely (1)] ja "hyllykapseli" [käsittely (2)] johtivat suunnilleen samaoihin määriin normaaleja versoja; käsitte-' lyt (3) ja (4), joissa käytettiin paperiputkella ympäröi- 57 110870 tyjä alkioita, johtivat pienempiin määriin normaaleja versoja. Tämä saattaa osoittaa, että kosketus hydratoidun geelin kanssa edistää paremmin alkion normaalia kehitystä kuin kosketus paperin kanssa. On todennäköistä, että ohu-5 empien paperiputkien käyttö johtaisiin suurempiin määriin normaaleja versoja.

(b) Käsittelyissä (2) - (4), joissa alkiot koteloitiin, sirkkalehdet olivat suuressa osassa versoja edelleen kapselin sisällä viiden viikon inkuboinnin jälkeen. Tämä 10 ei vaikuttanut haitallisesti normaaliuteen käsittelyn (2) yhteydessä, mutta vaikutti käsittelyissä (3) ja (4).

(c) Alkeisvarsien pidentyminen oli voimakkainta käsittelyissä (1) ja (2), sen jälkeen käsittelyssä (4) ja sitten käsittelyssä (3), mikä osoittaa, että paperiputket, 15 joiden läpimitta oli 2,5 mm, olivat liian rajoittavia alkioille. Alkeisjuurien pidentyminen oli parasta vertailu-näytteissä [käsittely (1)] ja sen jälkeen käsittelyn (2) "hyllykapseleissa".

(d) 4 mm:n "hyllykapseli" [käsittely (2)] näyttää 20 olevan tehokas kotelointimenetelmä, joka antaa tulokseksi alkion hyvän kehityksen, todennäköisesti riittävän hapen- . saannin ansiosta.

* * *

Esimerkki 6 ; Tässä esimerkissä alkioita koteloitiin erilaisiin 25 geeliformuloihin, jotka käsittivät alginaattia ja perfluo- ' ‘ rihiilivetyemulsiota, mainitunlaisten formuloiden vaiku tusten määrittämiseksi alkion itämisen ja normaalin kehi-: tyksen suhteen.

Valmistettiin emulsio, joka sisälsi 30 % perfluori-

'· f 30 hiilivetyä FC-77 (perfluoributyylitetrahydrofuraani, 3M

»

Co., St. Paul, Minnesota), lisäämällä FC-77:ään steriiliä pinta-aktiivisuusainetta Pluronic F-68 [1,5 % (paino/tila-: vuus) suhteessa FC-77:ään] loppuosan nesteestä ollessa vettä. Pluronic F-68 on oksipropeeni-oksieteenipolymeeri, 35 jota valmistaa BASF Corp., Parsippany, N.J. Seos emulgoi- 58 110870 tiin käyttämällä 30 s:n ajan Polytron-homogenaattoria [Brinkman Instruments Model # 10 20 35D, generaattori #PT-DA 3020/2TM), joka oli säädetty asentoon "High". Erilaisia määriä tuloksena olevaa emulsiota lisättiin eri pitoisuuk-5 siin alginaattia sisältävää ravinnenestettä. Erilaisten ravinnenesteen pitoisuuksien käytön tarkoituksena oli kompensoida eriasteisesti laimennus, jonka aiheuttaa nesteen lisääminen FC-77-emulsioon. Sekoitussuhteet ja pitoisuudet ovat seuraavat: 10 Käsittely (1): Standardipitoisuus alginaattia si sältävää ravinnenestettä.

Käsittely (2): 30-%:isen FC-77-emulsion ja pitoisuudeltaan kaksinkertaisen alginaattipitoisen ravinnenesteen seos tilavuussuhteessa 1:1.

15 Käsittely (3): 30-%:isen FC-77-emulsion ja pitoi suudeltaan kolminkertaisen alginaattipitoisen ravinnenesteen seos tilavuussuhteessa 2:1.

Käsittely (4): 30-%risen FC-77-emulsion ja pitoisuudeltaan nelinkertaisen alginaattipitoisen ravinnenes- 20 teen seos tilavuussuhteessa 3:1.

Käsittely (5): 30-%risen FC-77-emulsion ja pitoi- . suudeltaan viisinkertaisen alginaattipitoisen ravinnenes- » » 1 *; teen seos tilavuussuhteessa 4:1.

•j Käsittely (6): "Vertailukäsittely"; paljas alkio 25 asetettiin pitoisuudeltaan yksinkertaisella agarpitoiselle » ravinnenesteelle.

» ,· Käsittelyjen (1) - (5) yhteydessä emulsion ja algi- ; : naattipitoisen ravinnenesteen seokset siirrettiin heti valmistuksen jälkeen steriiliin kaasunpesupulloon ja hape- ; 30 tettiin johtamalla sen läpi 30 minrn ajan steriiliä hap- » , pea. Hapetetut seokset laitettiin sitten yksitellen ero- tussuppiloon. Alkiot koteloitiin EPÄ ’141:ssä esitetyllä : tavalla käyttämällä Na(N03)2 -liuosta (100 mmol/dm3) komp- leksointiin ja ravinnenestettä huuhteluun. Koteloinnin : 35 jälkeen kapselit sijoitettiin ravinneagarin pinnalle pei- 59 110870 tettyihin petrimaljoiin. Kunkin käsittelyn yhteydessä preparoitiin kolme maljaa, joista kukin sisälsi kuusi alkiota. Kaikkia käsiteltyjä näytteitä inkuboitiin jatkuvan valon alla huoneenlämpötilassa. Alustava normaaliusarvi-5 ointi tehtiin kahden viikon inkuboinnin jälkeen ja lopullinen arviointi viiden viikon kuluttua.

Tulokset on koottu taulukkoon V ja niitä valaistaan lisäksi kuvioissa 9A - 9F.

10 Taulukko V

Käsittely 2 viikkoa, 2 viikkoa, 5 viikkoa, 5 viikkoa, normaaleja kasvu kapselin normaaleja kasvu kapselin alkioita (%) läpi (%) alkioita (X) läpi (K) 1 6 34 0 17 15 2 0 28 12 89 3 0 61 O 67 4 12 56 28 50 5 6 62 23 78 6 (vertailu) 84 - 88 20

Tuloksista ja johtopäätöksistä tehdään seuraava yhteenveto: (a) Kuten taulukossa V esitetään, hapetettujen per-fluorihiilivetyjen läsnäolo emulsion muodossa kotelointiin • · ; 25 käytettävässä hydratoidussa geelissä edistää itämistä ja Γ kasvialkioiden kehitystä alginaattikapselista, erityisesti viiden viikon kuluttua. Tämän osoittaa erityisesti se, että suuren prosentuaalisen osuuden alkeisjuurista havaittiin pidentyvän itämisen jälkeen perfluorihiilivetyjä si-30 sältävissä kapseleissa, kuten esitetään kuvioissa 9A ja 9D.

• . (b) Turvonneiden alkeisvarsien prosentuaalinen , ‘ osuus oli suunnilleen sama käsittelyissä (1) - (5) kahden viikon inkuboinnin jlkeen, kuten esitetään kuviossa 9B.

· 35 Viiden viikon inkuboinnin jälkeen suuremmat FC-77-emulsio- : pitoisuudet johtivat kuitenkin harvempiin turvonneisiin ;'· alkeisvarsiin, kuten esitetään kuviossa 9E. Koska suurem- 4 ! I * * · t so 110870 millä emulsiopitoisuuksilla hapenabsorbtiokapasiteetti oli vastaavasti suurempi, näyttää siltä, että alkiot, jotka oli koteloitu geeleihin, joissa emulsiopitoisuus oli suurempi, kehittyivät normaalimmin sen ansiosta, että ne sai-5 vat enemmän happea.

(c) Alkeisvarsien piteneminen oli parasta vertailu-näytteillä [käsittely (6)]. Kaikissa kotelointikäsitte-lyissä [(1) - (5)] piteneminen oli lähes samanlaista sekä kahden että viiden viikon inkuboinnin jälkeen (kuviot 9C

10 ja 9F). Se, että FC-77-pitoisuuden nostolla ei ollut olennaista vaikutusta alkeisvarren pituuteen, ei ollut odottamatonta, sillä aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että happi ei ole yhtä voimakkaasti rajoittava tekijä alkeisvarsien pidentymiselle kuin alkeisjuurin pidentymiselle. 15 Hapen vähyyden parempi osoittaja alkeisvarsissa on turpoaminen .

(d) Kahden viikon inkuboinnin jälkeen vertailualki-oilla [käsittely (6)] oli suurin keskimääräinen alkeisjuu-ren pituus, kuten esitetään kuviossa 9C. Käsittelyissä 20 (1)-(5) alkeisjuurten pituudet vaihtelivat jonkin ver ran. Viiden viikon kuluttua vertailunäytteen keskimääräi-nen alkeis juuren pituus oli edelleen suurin, mutta käsit- t telyissä (1) - (5) keskimääräiset pituudet olivat keske- > * nään suurin piirtein samanlaiset, kuten esitetään kuviossa 25 9F. Alkeisjuurten parempi kasvu kahden viikon kuluttua kä- » · sittelyissä, joissa FC-77-pitoisuudet ovat suurempia, kor-: .· reloi hapensaannin tärkeyden kanssa alkeisjuuren kasvun v ·’ kannalta. Alkeisjuurten suurin piirtein samanlainen kasvu käsittelyissä (3) - (5) osoittaa, että on olemassa hydra-30 toidun geelin happipitoisuus, jonka yläpuolella ei havaita alkeisjuuren kasvun lisäparannusta. Kuten kuviossa 9F esi-,' , tettävät viiden viikon kuluttua saadut tulokset osoitta vat, alemmat happipitoisuudet eivät estä pysyvästi alkeis-juuren kasvua. Kun alkeisjuuri kasvaa ulos hapen suhteen ei 110870 rajoitetusta ympäristöstä (ts. geelikapselista), kasvu näyttää kiihtyvän.

(e) Kuten kuviossa 9A esitetään, itävien alkeisjuurien prosentuaalinen osuus kahden viikon inkuboinnin jäl-5 keen kasvoi kotelointigeelin PFC-pitoiuuden kasvaessa. Viiden viikon kuluttua malli muuttui, kuten esitetään kuviossa 9D. Tämä osoittaa, että suurempi happimäärä on eduksi itämiselle alussa, kun solut alkavat jakautua ja pidentyä nopeasti.

10 (f) Kapselien läpi kasvaneita alkioita koskevat tulokset (taulukko V) osoittavat, että olisi edullista pidättää sirkkalehtiä fysikaalisesti itämisen aikana. Tällainen pidäke pitää rikkoutuneen kapselin jonkin aikaan kosketuksessa sirkkalehtien kanssa alkeisvarren sijasta 15 (katso kuvio 4). Sirkkalehdet puolestaan kuljettaisivat kapselin ylöspäin ulos maasta, samalla tavalla kuin rikkoutunut siemenpeite tulee kuljetetuksi ulos maasta. Kun sirkkalehdet sitten avautuvat, kapseli putoaa pois. Tässä esimerkissä 5 kuvatulla tavalla testattu hyllykapseli, 20 jonka läpimitta on 4 mm, on yksi esimerkki tavasta saada aikaan tällainen pidäke. Kuten edellä mainittiin, kapse-lien läpi kasvavat alkiot ovat alkioita, jotka pidentyes-sään tunkeutuvat kapselin molempin päiden läpi ja jättävät ; kapselin riippumaan alkeisvarren ympärille (katso kuvio 25 4). Tämä tilanne saattaa johtaa turvonneisiin alkeisvar- siin. Ei kuitenkaan ole olemassa todisteita, että turvonneet alkeisvarret heikentäisivät taimien yleistä selviyty-*, ’ mistä.

(g) Vaikka tässä esimerkissä testattujen koteloin-• : 30 tikäsittelyjen yhteydessä ei havaita mitään sarjaan liit tyvää normaaliusmallia, näyttää siltä, että suuremmat PFC-pitoisuudet johtavat normaalimman näköisiin taimiin tarjo- ; amalla enemmän happea itävälle alkiolle.

62 110 8 7 0

Esimerkki 7 Tässä esimerkissä tutkittiin PFC-emulsiota sisältävän alginaattikapselin kykyä tukea eri havupuutajien alkioiden itämistä. Kapselimateriaali valmistettiin kahtena 5 erillisenä komponenttina, jotka yhdistettiin hydratoidun geelin muodostamiseksi.

Alginaattikomponentin valmistamiseksi valmistettiin 333 cm3 liuosta, joka sisälsi 4,5 % Protanal LF-60-algi-naattia (Protan, Inc.) ja tavanomaisia ravinteita. pH sää-10 dettiin arvoon 5,7 ja liuosta autoklavoitiin 20 min.

Perfluorihiilivetyemulsiokomponentti valmistettiin emulsiona, joka sisälsi 30 % FC-77:ää ja 1,5 % Pluronic F-68:aa, seuraavasti: noin 200 cm3 FC-77:ää ja 70 cm3 liuosta, joka sisälsi 0,643 % (paino/tilavuus) Pluronic F68:aa, 15 autoklavoitiin erikseen. Autoklavoinnin jIkeen yhdistettiin 30 cm3 FC-77:ää ja 70 cm3 F-68-liuosta steriileissä olosuhteissa ja emulgoitiin käyttämällä 30 s:n ajan Poly-tron-homogenaattoria säädöllä "High". Tuloksena olevaan emulsioon (80 cm3) lisättiin 20 cm3 alginaattikomponenttia, 20 jolloin lopulliseksi alginaattipitoisuudeksi tuli 0,9 %. Seos pidettiin sekoituslevyllä, kunnes saatiin homogeeni-nen seos. Tuloksena oleva geelisuspensio siirrettiin sitten steriiliin kaasunpesupulloon ja hapetettiin steriileissä olosuhteissa 30 min.

25 Kapseleiden valmistamiseksi kasvialkioiden ympäril- ‘ le hapetettu geelisuspensio siirrettiin steriiliin erotus- suppiloon. Eritussuppilon hana säädettiin, niin että muo-·, · dostui hitaasti ja asteittaisesti pisaroita. Aina kun ero- tussuppilon kärkeen muodostui geelipisara, kasvialkio si-• 30 joitettiin pisaraan sirkkalehdet suuntautuneina ylöspäin . käyttämällä steriilejä pinsettejä. Alkio upotettiin koko naan pisaran sisään. Pisara laitettiin sitten liuokseen, j joka sisälsi 100 mmol/dm3 Ca(N03)2:a ja ravinteita. Tämän, "kompleksointiliuokseksi" kutsuttavan liuoksen pH säädet-35 tiin arvoon 5,7 ja se autoklavoitiin ennen käyttöä. Kapse- es 110870 lien annettiin kovettua kalsiumnitraattiliuoksessa 20 min. Siten kalsiumnitraattiliuos heitettiin pois ja kapseleita huuhdottiin 5 min ravinnenesteellä ennen tuloksena olevien kapseleiden sijoittamista ravinneagarpinnalle steriileihin 5 peitettyihin petrimaljoihin.

Alginaattiliuos, josta puuttuu PFC-emulsio, valmistettiin yhdistämällä 1 dm3 ravinnenestettä ja 15 g Protanal LF-60 -alginaattia. Autoklavoinnin jälkeen geeliliuos hapetettiin (tarvittaessa) käyttämällä kaasunpesupulloa 10 edellä kuvatulla tavalla ja siirrettiin steriiliin erotus-suppiloon. Kasvialkiot koteloitiin alginaattiin edellä kuvatulla tavalla.

Tutkittiin 16 erilaista alkiolajin ja kapseliformu-lan yhdistelmää. Käsittelyt olivat seuraavat: 15 Käsittely (1): "Vertailukäsittely", jossa sijoitet tiin paljaita metsäkuusen alkioita ravinneagarin pinnalle.

Käsittely (2): Metsäkuusen alkiot koteloitiin ha-pettamattomaan alginaattiin, josta puuttui PFC.

Käsittely (3): Metsäkuusen alkiot koteloitiin hape-20 tettuun alginaattiin, josta puuttui PFC.

Käsittely (4): Metsäkuusen alkiot koteloitiin hape-tettuun PFC-pitoiseen alginaattiin.

!" Käsittely (5): "Vertailukäsittely", jossa sijoitet tiin paljaita douglasinkuusen alkioita ravinneagarin pin-25 nalle.

Käsittely (6): Douglasinkuusen alkiot koteloitiin hapettamattomaan alginaattiin, josta puuttui PFC.

: Käsittely (7): Douglasinkuusen alkiot koteloitiin hapetettuun alginaattiin, josta puuttui PFC.

• 30 Käsittely (8): Douglasinkuusen alkiot koteloitiin : hapetettuun PFC-pitoiseen alginaattiin.

Käsittely (9): "Vertailukäsittely", jossa sijoitet-; tiin paljaita loblollymännyn alkioita ravinneagarin pin nalle.

64 110870 Käsittely (10): Loblollymännyn alkiot koteloitiin hapettamattomaan alginaattiin, josta puuttui PFC.

Käsittely (11): Loblollymännyn alkiot koteloitiin hapetettuun alginaattiin, josta puuttui PFC.

5 Käsittely (12): Loblollymännyn alkiot koteloitiin hapetettuun PFC-pitoiseen alginaattiin.

Käsittely (13): "Vertailukäsittely", jossa sijoitettiin metsäkuusen paljaita somaattisia alkioita ravinne-agarin pinnalle.

10 Käsittely (14): Metsäkuusen somaattiset alkiot kot eloitiin hapettamattomaan alginaattiin, josta puuttui PFC.

Käsittely (15): Metsäkuusen somaattiset alkiot koteloitiin hapetettuun alginaattiin, josta puuttui PFC.

Käsittely (16): Metsäkuusen somaattiset alkiot ko-15 teloitiin hapetettuun PFC-pitoiseen alginaattiin.

Kaikkia käsiteltyjä näytteitä inkuboitiin jatkuvassa valossa huoneenlämpötilassa 5 viikkoa, minkä jälkeen niistä tutkittiin itäminen ja versojen kehittyminen. Tulokset esitetään taulukossa VI ja kuvioissa 10A ja 10B.

20

Taulukko VI

, Käsittely Normaaleja Kapselin läpi Klkeisjuurten Alkeisvarsien Alkeisvarsien ja * · · >,l versoja kasvaneita itMainen itäminen alkei sj uurten ·· (X) (X) (X) (X) itäainen (X) * 25 1 (vertailu) 92 - '·’ 2 7 28 17 92 17 i ’· 3 17 37 45 97 45 • · 4 46 87 87 100 87 * · ·* 5 (vertailu) 88 - - : : 30 6 3 24 21 100 21 7 9 24 56 94 56 8 30 55 59 92 59 ' ! 9 (vertailu) 92 - » 1, 10 9 37 40 95 40 35 11 3 12 15 54 15 I 12 32 70 71 98 71 | 13 (vertailu) 32 - - ‘ * 14 3 28 30 100 30 . \ 15 10 34 35 100 35 40 16 21 42 47 100 47 * * * t t 65 110 8 7 0

Tuloksista voidaan tehdä seuraava yhteenveto: (a) Kuten taulukossa VI esitetään, hapetettu PFC-pitoinen alginaattikapseli paransi kaikkien testattujen lajien itämistä ja normaaliutta, erityisesti verrattuna 5 PFC:tä sisältämättömien kapseleiden yhteydessä havaittuun itämiseen ja normaaliuteen.

(b) Kuten taulukko VI osoittaa, kaikkien muiden lajien paitsi loblollymännyn kohdalla hapetetut alginaat-tikapselit, joista puuttui PFC, johtivat suurempaan mää- 10 rään normaaleja versoja kuin hapettamattomat kapselit, joista puuttui PFC.

(c) Kuten taulukko VI osoittaa, kapselin molempien päiden läpi kasvaneiden alkioiden lukumäärä oli suurempi hapetettujen PFC-pitoisten alginaattikapseleiden kohdalla 15 kuin muiden kapselityyppien yhteydessä. Tämä osoittaa, että hapetetuista PFC-pitoisista kapseleista itävillä alkioilla oli enemmän elinvoimaa, sillä kasvavat alkiot olivat kyllin vahvoja tunkeutuakseen kapseleiden molempien päiden läpi. Ei ole olemassa todisteita, että tämäntyyppi-20 nen kasvukäyttäytyminen olisi haitallista alkiolle.

(d) Kuten taulukko VI osoittaa, alkeisvarsien itä- . minen oli hyvä kaikissa käsittelyissä (lukuun ottamatta loblollymännyn alkioita), joissa tehtiin kotelointi hape- t · tettuihin alginaattikapseleihin, joista puuttui PFC. Al-25 keisjuurten itäminen oli parhainta hapetettuun PFC-pitoi- • seen alginaattiin koteloidulla alkioilla kaikkien tutkit- .·’ tujen lajien kohdalla.

(e) Kuten kuvio 10A osoittaa, turvonneet alkeisvar-ret olivat edelleen yleisin epänormaalius, mutta turpoa- • 30 mistä tapahtui harvemmin alkioilla, jotka oli koteloitu hapetettuun PFC-pitoiseen alginaattiin.

(f) Kuten kuvio 10B osoittaa, alkeisvarsien pituu- : det kasvoivat hapensaannin parantuessa kapselissa. Tämän ‘ osoittaa se, että hapetetut PFC-pitoiset alginaattikapse- 35 lit antoivat tulokseksi pisimmät alkeisvarret. Alkeisjuur- 66 110 8 7 0 ten pituudet olivat suurimpia alkioilla, jotka oli koteloitu hapetettuihin PFC-pitoisiin alginaattikapseleihin, ja ylittivät jopa loblollymännyn paljaiden alkioiden pituudet .

5 Esimerkki 8 Tässä esimerkissä tutkittiin muutamia pinta-aktii-visuusaine-ehdokkaita käytettäviksi perfluorihiilivety-emulsion valmistuksessa.

Tässä esimerkissä käytetyt menetelmät olivat suurin 10 piirtein samat kuin esimerkissä 7, paitsi että käytettiin muita pinta-aktiivisuusaineita ja pinta-aktiivisuusainepi-toisuuksia. Tämä tutkimus käsitti kuusi käsittelyä, jotka olivat seuraavat: Käsittely (1): Valmistettiin PFC-emulsio käyttämäl-15 lä 1,5 % PLURONIC F-68:aa pinta-aktiivisuusaineena; metsä-kuusen alkiot koteloitiin hapetettuun PFC-pitoiseen algi-naattiin.

Käsittely ( 2): Valmistettiin PFC-emulsio käyttämällä 4,0 % muna-albumiinia pinta-aktiivisuusaineena; metsä-20 kuusen alkiot koteloitiin hapetettuun PFC-pitoiseen algi-naattiin.

Käsittely (3): Valmistettiin PFC-emulsio käyttämäl- ' ; lä 1,5 % natriumdodekyylisulfaattia pinta-aktiivisuusai- < · : neena; metsäkuusen alkiot koteloitiin hapetettuun PFC-pi- .* 25 toiseen alginaattiin.

* Käsittely (4): Metsäkuusen alkiot koteloitiin hape- : tettuun PFC:tä sisältämättömään alginaattiin.

: Käsittely (5): Metsäkuusen alkiot koteloitiin ha- pettamattomaan PFC:tä sisältämättömään alginaattiin.

,* 30 Käsittely (6): "Vertailukäsittely", jossa paljaat metsäkuusen alkiot laitettiin ravinneagarin pinnalle.

t

Kaikissa käsittelyissä käytettiin tsygoottisia met- : säkuusen alkioita ja kussakin preparoitiin kuusi koteloi- : tua alkiota peitettyä petrimaljaa kohden; maljoja oli kuu- 35 si kussakin käsittelyssä. Kaikkia maljoja inkuboitiin jät- 67 110870 kuvasssa valossa huoneenlämpötilassa viisi viikkoa, minkä jälkeen versoista arvioitiin itämismenestys ja muita parametreja. Tulokset esitetään taulukossa VII ja kuvioissa 11A ja HB.

i r · ' * · 68 1 10870

Taulukko VII

Käsittely Normaaleja Kapselin läpi Alkeisjuurten Alkeisvarsien Alkeisvarsien ja versoja kasvaneita itäminen itäminen alkeis juurten 5 (*) (*) (*) <*) itätoinen (*) 1 56 94 94 100 94 2 70 86 86 97 86 3 0 0 0 0 0 4 15 57 59 100 59 10 5 24 35 41 89 35 6 (vertailu) 100 *

Tuloksista tehdyt johtopäätökset voidaan koota seuraavasti : 15 (a) Kuten taulukosta VI käy ilmi, käsittelyssä (3) käytetty natriumdodekyylisulfaatti ei ole tehokas pinta-aktiivisuusaine, koska se aiheutti kaikkien kanssansa kosketukseen joutuneiden alkioiden kuoleman.

(b) Kuten taulukosta VI käy ilmi, käsittelyissä (2) 20 ja (1) käytetyt muna-albumiini ja vastaavasti Pluronic F-68 ovat molemmat tehokkaita pinta-aktiivisuusaineita PFC:iden, kuten FC-77:n, yhteydessä. Muna-albumiini antoi tulokseksi enemmän normaaleja versoja, mutta Pluronic F-68 johti suurempaan määrään itäneitä alkioita.

» ♦ · · : 25 (c) Kuten taulukosta VII ja kuviosta 11A käy ilmi, hapetetut PFC-pitoiset alginaattikapselit johtivat korkeampaan normaaliustasoon ja suurempaan versojen kokonaislu-kumäärään kuin PFC:tä sisältämättömät alginaattikapselit, olivatpa ne hapetettuja tai ei.

\· 30 (d) Agarilla kasvavat paljaat alkiot tuottivat odo tetusti normaaleimpia versoja.

: (e) Käsittely (1) johti suurimpaan määrään kapselin läpi kasvaneita alkioita (taulukko VII).

Esimerkki 9 ,·, 35 Tässä esimerkissä tutkittiin erilaisten perfluori- hiilivetyjen kykyä antaa happea koteloiduille alkioille.

69 110870 Tässä esimerkissä käytetyt menetelmät olivat suurin piirtein samat kuin esimerkissä 7, paitsi että käytettiin muutamia erilaisia perfluorihiilivetyjä. Testatut käsittelyt olivat seuraavat: 5 Käsittely (1): Metsäkuusen alkioita koteloitiin ha petettuun alginaattiin, joka sisälsi emulsiota, jossa oli 30 % FC-77:ää ynnä 1,5 % Pluronic F-68:aa.

Käsittely (2): Metsäkuusen alkioita koteloitiin hapetettuun alginaattiin, joka sisälsi emulsiota, jossa 10 oli 30 % perfluoridekaliinia (eräs toinen PFC-tyyppi) ja 1,5 % Pluronic F-68:aa.

Käsittely (3): Metsäkuusen alkioita koteloitiin hapetettuun alginaattiin, joka sisälsi emulsiota, jossa oli 30 % perfluoritributyyliamiinia (eräs toinen PFC-tyyp-15 pi) ja 1,5 % Pluronic F-68:aa.

Käsittely (4): Metsäkuusen alkioita koteloitiin hapetettuun alginaattiin, josta puuttui PFC.

Käsittely (6): "Vertailukäsittely”, jossa paljaat metsäkuusen alkiot laitettiin ravinneagarin pinnalle.

20 Kaikissa käsittelyissä käytettiin tsygoottisia met säkuusen alkioita ja kukin koostui kuudesta peitetystä . petrimaljasta, jotka sisälsivät kuusi koteloitua alkiota 1 * · ' ; maljaa kohden. Käsiteltyjä näytteitä inkuboitiin jatkuvas- : sa valossa huoneenlämpötilassa viisi viikkoa, minkä jäl- 25 keen versoista arvioitiin itämismenestys ja muita paramet-reja. Tulokset esitetään taulukossa VIII ja kuvioissa 12A : ja 12B.

' I ‘ ' » 70 110870

Taulukko Vili Käsittely Ro maaleja Kapselin lSpl Alkeisjuurten Alkeisvarsien Aikaistamien Ja versoja kasvaneita itäsinen itäalnen alkeisjuurten (*) (%) (*) (*) itäminen (X) 5 1 69 92 95 100 97 2 35 70 77 100 77 3 61 81 86 100 86 4 34 56 56 100 56 5 29 60 65 100 65 10 6 (vertailu) 97 - -

Tuloksista tehdyt johtopäätökset voidaan koota seuraavasti : (a) Kuten taulukossa Vili esitetään, käy ilmi, et-15 tei perfluoridekaliini [käsittely (2)] anna tulokseksi yhtä paljon normaaleja versoja kuin FC-77 [käsittely (1)] ja perfluoritributyyliamiini [käsittely (3)]. Perfluoridekaliini antaa kuitenkin tulokseksi suurin piirtein saman määrän normaaleja versoja kuin PFC:tä sisältämätön hape-20 tettu alginaatti [käsittely (4)]. Tämä voisi johtua per-fluoridekaliiniemulsion lyhyestä puoliintumisajasta.

(b) Käy ilmi, että FC-77 on edullinen perfluorihii-livety tässä esimerkissä testattujen joukossa käytettäväksi kasvinsiemenanalogeissa, ainakin havupuiden ollessa ky- » · * 25 seessä.

(c) Normaalien versojen prosentuaalinen osuus oli odotetusti suurin paljailla alkioilla [käsittely (6)], .kuten taulukko VIII osoittaa. Käsittelyssä (5), jossa käy- : tettiin hapettamatonta alginaattikapselia, normaalien ver- » * ; 30 sojen prosentuaalinen osuus oli alhaisin.

(d) Kapselin läpi kasvaneiden alkioiden prosentuaalinen osuus oli korkein käsittelyssä (1) (taulukko VIII).

(e) Kaikki alkeisvarret itivät kaikissa käsittelyissä (taulukko VIII). Alkeisjuurten itämisprosentit ja 35 sekä alkeisjuuren että alkeisvarren itämisprosentit olivat : korkeimmat käsittelyissä, joissa alginaatti sisälsi per- fluorihiilivetyemulsioita, kuten taulukko VIII osoittaa.

• i » ' * 7i 110870 (f) Kuten kuviossa 12A esitetään, käsittelyt (2), (4) ja (5) antoivat tulokseksi noin kaksinkertaisen määrän epänormaaliuksia muihin käsittelyihin nähden turvonneiden alkeisvarsien ollessa yleisin epänormaalius.

5 (g) Koteloitujen alkioiden joukossa alkeisjuurten pituudet ja alkeisvarsien pituudet olivat suurimmat, kun alkiot itivät hapetetuista PFC-pitoisista geelikapseleista (kuvio 12B).

Esimerkki 10 10 Tässä esimerkissä päämäärä oli kaksinkertainen: (1) tutkia vain pinta-aktiivisuusainetta mutta ei PFC:tä sisältävän alginaattikapselin vaikutusta normaaliin itämiseen; (2) tutkia, mikä vaikutus on normaaliin itämiseen alkioiden koteloinnilla hapettamattomiin PFC-pitoisiin 15 alginaattikapseleihin.

Alkioiden kotelointiin käytetyt menetelmät ovat edellä esimerkissä 7 kuvattujen kaltaiset. Erillisile sarjoille metsäkuusen alkiota tehtiin yksi seuraavista käsittelyistä: 20 Käsittely (1): Alkiot kapseloitiin hapetettuun, FC- 77-emulsiota sisältävään alginaattiin esimerkin 7 mukai-;t sesti.

! Käsittely (2): Alkiot kapseloitiin hapettamatto- ; maan, FC-77-emulsiota sisältävään alginaattiin.

·* 25 Käsittely (3): Alkiot kapseloitiin hapetettuun al- ' ginaattiin, josta puuttui PFC, mutta joka sisälsi 1,5 % ,· Pluronic F-68:aa.

: Käsittely (4): Alkiot kapseloitiin hapettamattomaan alginaattiin, josta puuttui PFC, mutta joka sisälsi 1,5 % • 30 Pluronic F-68:aa.

Käsittely (5): Alkiot kapseloitiin hapettamattomaan alginaattiin, josta puuttui sekä PFC että pinta-aktiivi-suusaine.

72 1 10 8 7 0 Käsittely (6): Alkiot kapseloitiin hapetettuun al-ginaattiin, josta puuttui sekä PFC että pinta-aktiivisuus-aine.

Käsittely (7): "Vertailukäsittely", jossa kasvatet-5 tiin paljaita alkioita ravinneagarin pinnalla.

Pluronic F-68 -pitoisuus oli käsittelyissä (3) ja (4) käytetyissä alginaattikapseleissa sama kuin käsittelyissä (1) ja (2). Kukin käsittely käsitti kuusi peitettyä petrimaljaa, joista kukin sisälsi kuusi alkiota. Kaikkia 10 käsiteltyjä näytteitä inkuboitiin jatkuvassa valossa huoneenlämpötilassa 35 vuorokautta. Tulokset esitetään taulukossa IX ja kuvioissa 13A ja 13B.

Taulukko IX

15 Käsittely Normaaleja Kapselin läpi Alkelsjuurten Alkeisvareien Klkeisvarsien ja versoja kasvaneita Itäminen Itäminen alkeisjuurten (S) (S) (X) (X) Itäminen (X) 1 35 82 82 100 82 2 27 52 49 100 49 20 3 18 36 36 97 36 4 6 19 20 95 20 5 9 28 28 100 28 6 6 34 34 100 34 7 (vertailu) 94 - - :· 25 *· Tuloksista tehdyt johtopäätökset voidaan koota seu- I ♦ raavasti: (a) Kuten taulukossa IX esitetään, sekä hapetetut että hapettamattomat PFC-pitoiset alginaattikapselit [kä-30 sittelyt (1) ja (2)] antoivat tulokseksi enemmän versoja ja suuremman normaalien versojen prosentuaalisen osuuden kuin PFC:tä sisältämättömät alginaattikapselit.

· (b) Kuten taulukossa IX esitetään, Pluronic F-68 : näyttää PFCrtä sisältämättömässä alginaattikapselissa pa- ; 35 rantavan itämistä, kun kapseli on hapetettu [käsittely ! (3)], ja heikentävän pitämistä, kun kapseli on hapettama- ton [käsittely (4)].

73 110870 (c) Tutkittujen kapseleiden joukossa hapetettu, PFC-emulsiota sisältävä alginaattikapseli näyttää olevan paras.

(d) Näyttää siltä, että etu, joka saadaan lisäämäl-5 lä PFC-emulsiota alginaattikapseliin, johtuu PFC:n eikä pelkästään emulsion sisältämän pinta-aktiivisuusaineen läsnäolosta.

(e) Kapselin läpi kasvaneiden alkioiden prosentuaalinen osuus oli suurin käsittelyssä (1) (taulukko IX).

10 (f) Alkeisvarsien itäminen oli hyvä kaikissa käsit telyissä (taulukko IX). Sekä alkeisjuurten että alkeisvarsien prosentuaaliset itämisarvot olivat korkeimmat käsittelyssä (1).

(g) Ainoat havaitut epämuodostumatyypit olivat tur- 15 vonneet alkeisvarret ja kiertyneet sirkkalehdet (kuvio 13A).

(h) Alkeisjuuret ja alkeisvarret olivat pisimpiä vertailunäytteissä [käsittely (7)] (kuvio 13B). Käsittelyllä (1) saatiin aikaan pisimmät alkeisvarret samoin kuin 20 pisimmät alkeisjuuret koteloitujen alkioiden joukossa.

Esimerkki 11 , Tehtiin kuusi koekäsittelyä alginaattigeelien ver- ; taamiseksi agargeeleihin. Testattu siemenanalogisuoritus- * muoto käsitti geeliytetystä materiaalista koostuvan sylin- ,· 25 terin, jonka läpimitta oli noin 6 mm ja pituus noin 8 mm.

Sylinterin toisesta päästä poistettiin ydinosa, jonka pituus oli noin 6 mm ja läpimitta 1,5 mm ja joka sijaitsi sylinterin pituusakselilla, niin että muodostui ontelo alkiota varten. Kuhunkin onteloon sijoitettiin alkio sirkka-.: 30 lehtipää edellä. Tämän esimerkin kaikissa testeissä käy tettiin tsygoottisia douglasinkuusen alkioita. Noudatettiin standardimenettelyä, jossa käytettiin kuutta rinnak-. ,* kaisnäytettä ja kuutta alkiota rinnakkaisnäytettä kohden.

Alginaattisylinterit valmistettiin seuraavasti.

35 Ensin valmistettiin kaksi (viisinkertaisesti) konsentroi- 74 110870 tua geeliliuosta. Toinen konsentroiduista geeliliuoksista käsitti 4,5 % natriumalginaattia, toinen 6,0 %. Kumpikin konsentroitu geeliliuos oli koostumukseltaan samanlainen kuin aiemmissa esimerkeissä käytetyt alginaattiliuokset.

5 Kummastakin konsentroidusta geeliliuoksesta poistettiin kaasut pitämällä niitä alipaineessa 14 - 16 tuntia ja au-toklavoitiin liuokset sitten. Autoklavoitiin erikseen per-fluorihiilivety (FC-77) ja vesiliuos, joka sisälsi 1,5 % (paino/tilavuus) ionitonta pinta-aktiivisuusainetta (Plu-10 ronic F-68). Yhdistettiin autoklavoinnin jälkeen 30 cm3 perfluorihiilivetyä ja 70 cm3 pinta-aktiivisuusaineliuosta ja emulgoitiin steriileissä olosuhteissa. Sitten yhdistettiin 80 cm3 tuloksena olevaa emulsiota ja 20 cm3 konsentroitua geeliliuosta, jolloin saatiin "geelialustan" 0,9 % 15 ja vastaavasti l,2-%:inen liuos (keinotekoinen alginaatti-gametofyytti). Geelialustat kaadettiin erillisiin suoda-tinpaperisylintereihin, joiden läpimitta oli 6 mm ja jotka oli ennalta kyllästetty CaN03-liuoksella (100 mmol/dm3). Täytetyt sylinterit laitettiin 15 minuutiksi CaN03-liuok-20 seen (200 mmol/dm3). Suodatinpaperi poistettiin ja tuloksena olevia alginaattigeelisylinterejä käsiteltiin vielä , 45 min CaN03-liuoksessa (100 mmol/dm3) täydellisen ionin vaihdon takaamiseksi. Sitten poistettiin akselin suuntai-; set ydinosat edellä kuvatulla tavalla alkioiden sijoitta- 25 miseksi myöhemmin tuloksena oleviin onteloihin.

• Agarsylinterit valmistettiin seuraavasti. Ensin valmistettiin kolme (viisinkertaisesti) konsentroitua : agarliuosta, jotka sisälsivät 8,0, 9,0 ja 10 % agaria.

Kukin konsentroitu liuos autoklavoitiin ja laitettiin vie-: 30 lä kuumana vesihauteeseen, jonka lämpötila oli 50 °C. Val mistettiin edellä kuvatulla tavalla perfluorihiilivety-emulsio ja sekoitettiin sitä vielä lämpimän konsentroidun . : agarliuoksen kanssa suhteessa 4 osaa emulsioa 1 osaa koh- • den konsentroitua geeliliuosta, jolloin saatiin 1,6 %, 35 1,8 ja 2,0-%:inen "agaralusta" (keinotekoinen agargameto- 75 110 8 7 0 fyytti). Agargeelialustat laadettiin omiin steriileihin maljoihinsa ja niiden annettiin kovettua huoneenlämpötilassa. Geelistä leikattiin sylinterejä, joiden läpimitta oli 6 mm, ja poistettiin ytimet edellä kuvatulla tavalla 5 alkioiden sijoittamista varten.

Douglasinkuusen tsygoottisia alkioita leikattiin irti siemenistä. Agar- ja alginaattisylinterien kuhunkin onteloon sijoitettiin yksi alkio siemenanalogien muodostamiseksi. Siemenanalogeja hapetettiin sitten 18 tuntia 10 käyttämällä edellä kuvioiden 14 ja 15 yhteydessä kuvattua menettelyä. Siemenanalogit laitettiin sitten agarpinnalle ympärivuorikautiseen valoon itämistä varten. Tuloksena olevat versot tutkittiin ja arvosteltiin 35 vuorokauden kuluttua. Vertailunäytteessä, joka käsitti paljaita tsy-15 goottisia alkioita sijoitettuina agarpinnalle petrimal- jaan, versojen kehitys oli käytännöllisesti katsoen normaalia. 0,9 % ja 1,2 % alginaattia sisältävistä siemenana-logeista iti 50 % ja vastaavasti 89 % sekä alkeisjuuren että alkeisvarren sisältäviksi kasveiksi. Näiden kasvien 20 normaalius oli kuitenkin vain 14 % ja vastaavasti 17 %. Vallitsevat epänormaaliudet olivat turvonneet alkeisvarret , ja turvonneet sirkkalehdet. 1,6 %, 1,8 % ja 2,0 % agaria • sisältävien siemenanalogien itämisprosentit olivat 89 %, • 63 % ja vastaavasti 75 %. Näiden versojen normaalius oli . 25 25 %, 17 % ja vastaavasti 25 %. Samoin kuin alginaattisie- menanalogien kohdalla epänormaaliudet olivat pääasiassa turvonneita alkeisvarsia ja sirkkalehtiä. Suuri osa ver-soista halkaisi geelisylinterin kehittyessään. Tämä ongelma on ratkaistu myöhemmissä tutkimuksissa käyttämällä ; 30 jäykkää ulkokuorta geelimassan ympärillä. Versojen epämuo dostumat vähenivät merkittävästi ulkokuoren käytön myötä.

» Tämän esimerkin tulokset osoittavat, että ainakin : tämän esimerkin olosuhteissa agar on ainakin vastaava ja mahdollisesti parempi kuin kompleksoitu alginaatti käytet- 76 110870 täväksi geelinä tämän keksinnön mukaisissa siemenanalo-geissa.

Esimerkki 12

Valmistettiin edellä esimerkissä 11 kuvatulla ta-5 valla agaralustoja, jotka sisälsivät 1,8 % agaria. Hapen-kantaja oli joko esimerkissä 11 käytetty perfluorihiilive-ty tai vastaava tilavuus silikoniöljyä perfluorihiilivedyn sijasta. Silikoniöljy oli "DC-200", polydimetyylisiloksaa-ni, jonka viskositeetti on 5 cSt ja jota myy Dow Corning 10 Corp., Midland, Michigan. Valmistettiin joukko agaralusta-liuoksia, joista kukin sisälsi myös emulgointiainetta. Tutkittiin neljää eri emulgointiainetta, jotka sisälsivät 1,5 % (paino/tilavuus) ionitonta Pluronic F-68 -pinta-ak-tiivisuusainetta, 4,0 % (paino/tilavuus) muna-albumiinia, 15 4,0 % (paino/tilavuus) munalesitiiniä ja 0,5 % (paino/ti lavuus) DC-193:a, kaikki vedessä. DC-193 on dimetyylisi-loksaani-eteenioksidilohkopolymeeri, jota myös myy Dow Corning Corp. Kaikki siemenanalogit, jotka valmistettiin käyttämällä näitä agaralustoja, hapetettiin esimerkissä 11 20 kuvatulla tavalla. Näytteet olivat seuraavat: näyte 1: vertailunäyte, paljaita alkioita agarmal- joilla; ; näyte 2: perfluorihiilivety FC-77 Pluronic F-68- * · j emulgointiaineen kera; 25 näyte 3: silikoniöljy DC-200 Pluronic F-68 -emul- * gointiaineen kera; näyte 4: perfluorihiilivety FC-77 muna-albumiini-; emulgointiaineen kera; näyte 5: silikoniöljy DC-200 muna-albumiiniemul- •: 30 gointiaineen kera; näyte 6: perfluorihiilivety FC-77 munalesitiini- emulgointiaineen kera; • ! näyte 7: silikoniöljy DC-200 munalesitiiniemulgoin- • tiaineen kera; 77 110870 näyte 8: silikoniöljy DC-200 DC-193-emulgointiai-neen kera.

Kun näytteiden oli annettu itää 5 viikkoa ravinne-agargeelin pinnalla jatkuvassa valossa, havaittiin seuraa-5 vat tulokset.

Taulukko X

Näytteen nro Itäminen (%) Normaalius (%) 1 (vertailu) 100 92 10 2 97 3 3 50 0 4 81 0 5 47 0 6 97 0 15 7 89 0 8 66 0

Kuten aiemmin mainittiin, tavallisimmat epänormaalisuudet olivat turvonneet alkeisvarret ja sirkkalehdet. 20 Näitä epänormaaliuksia aiheuttaa ilmeisesti joko nesteen läsnäolo alkion sisältävässä ontelossa tai verson epäon-. nistuminen sirkkalehtiensä täydellisessä vapauttamisessa keinotekoisesta gametofyytistä.

: Silikoniöljy näyttää olevan tehokan hapenkantaja, 25 vaikka tämän esimerkin olosuhteissa silikoniöljy näyttää • olevan vähemmän edullista kuin perfluorihiilivety. Tämän otaksutaan johtuvan silikoniemulsioiden suuremmasta hiuk-kaskoosta perfluorihiilivetyemulsioihin verrattuna, joka ongelma voidaan helposti voittaa esimerkiksi käyttämällä > : 30 suurempia leikkausvoimia emulsiota valmistettaessa.

Kun keksinnön periaatteita on valaistu ja kuvattu usein suoritusmuodoin ja esimerkein, ammattimiehille pi- ; täisi olla ilmeistä, että keksintöä voidaan muuntaa jär- » * jestelyjen ja yksityiskohtien suhteen poikkeamatta maini- , 35 tunlaisista periaatteista. Haemme patenttia kaikille muun- » 78 110 8 7 0 noksille, jotka ovat seuraavien patenttivaatimusten hengen mukaisia ja niiden suoja-alan piirissä.

f > t

Claims (25)

110870 79

1. Kasvinsiemenanalogi, tunnettu siitä, että se käsittää totipotenttia kasvikudosta, joka on koske-5 tuksessa kasveille myrkyttömän hydratoidun geelin kanssa, jolloin hydratoitu geeli sisältää geeliä hapettavaa yhdistettä, jotta geeli pystyy absorboimaan tai kantamaan mole-kylaarista happea ja siten tuottamaan geeliin happipitoisuuden, joka on korkeampi kuin molekylaarisen hapen pitoi-10 suus, joka muuten on läsnä hydratoidussa geelissä, jossa ei ole geeliä hapettavaa yhdistettä, pelkästään hapen absorboitumisen perusteella atmosfääristä normaalilämpötilassa ja -paineessa, jolloin absorboidun molekylaarisen hapen korkeampi pitoisuus hydratoidussa geelissä saa aikaan sen, 15 että siemenanalogilla on korkeampi itämisnopeus kuin muuten samanlaisella kontrollisiemenanalogilla, jossa ei ole korkeampaa molekylaarisen hapen pitoisuutta, jolloin geeliä hapettava yhdiste on hapenkantaja yhdiste tai happea absorboiva yhdiste.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen kasvinsie menanalogi, tunnettu siitä, että kasvin alkio si-:* sältää alkeisjuuren ja liuenneen hapen pitoisuus geelissä ·· on riittävä tukemaan alkeisjuuren pidentymistä geelin ulko- '. puolelle. , 25

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen kasvinsie- menanalogi, tunnettu siitä, että geeli sisältää hapenkantajayhdistettä. ► i *

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen kasvinsie menanalogi, tunnettu siitä, että hapenkantajayh- • I I * i i 30 diste käsittää perfluorihiilivetyä. » t *

5. Patenttivaatimuksen 3 mukainen kasvinsie-: menanalogi, tunnettu siitä, että hapenkantajayh- (iii; diste on silikoniöljy.

. 6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen kasvinsie- : ',* 35 menanalogi, tunnettu siitä, että happea absorboiva t I 110870 80 yhdiste valitaan perfluorihiilivetyjen ja silikoniöljyn joukosta.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen kasvinsie-menanalogi, tunnettu siitä, että mainittu kasveil- 5 le myrkytön hydratoitu hapetettu geeli ympäröi kasvin al-kiokudosyksikköä ja mainittu kasvinsiemenanalogi lisäksi sisältää hydratoitua geeliä ympäröivän ulkokuoren.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen kasvinsiemenanalogi, tunnettu siitä, että se lisäksi käsit- 10 tää kasvin alkiokudosyksikön, jolloin geeli on kosketuksessa kasvin alkiokudosyksikön kanssa, ja jäykän kuoren, joka ympäröi kasvin alkiokudosyksik-köä ja hydratoitua hapetettua geelimassaa.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen kasvinsie menanalogi, tunnettu siitä, että se lisäksi käsittää kasvin alkiokudosyksikön; jolloin mainittu hydratoitu geeli sisältää pinta-aktiivisuusainetta siihen liuen-20 neena ja emulgoituja hapenkantajayhdistepisaroita siihen suspendoituneina, jolloin hapenkantajayhdiste antaa hydra-!’ toidulle geelille kyvyn absorboida atmosfääristä suuremman ;· määrän molekulaarista happea, kuin mitä muuten olisi hapen kanta j ayhdistettä sisältämättömän hydratoidun geelin absor-25 hoitavissa atmosfääristä normaalilämpötilassa ja -paineessa. . 1

10. Menetelmä kasvinsiemenanalogin valmistamiseksi, * * tunnettu siitä, että hankitaan kovettamattomassa tilassa olevaa kasveil-; 30 le myrkytöntä hydratoitua geeliä, jolloin mainittu geeli sisältää geeliä hapettavaa yhdistettä; : sisällytetään molekulaarista happea geeliin pitoi- suudeksi, joka on korkeampi kuin molekulaarisen hapen pi-> toisuus, joka muuten olisi mainitun hydratoidun geelin mo- ,* 35 lekyylien absorboitavissa atmosfääristä normaalilämpötilas- "* sa ja -paineessa; 110870 81 koteloidaan geeliin totipotentti kasvikudosyksikkö; ja kovetetaan geeli.

11. Kasvinsiemenanalogi, tunnettu siitä, 5 että se käsittää (a) totipotenttia kasvikudosta, jossa on sirkkaleh- tipää; (b) sirkkalehtiä pidättävän välineen, joka on kosketuksessa ainakin sirkkalehtipään kanssa ja sulkee sen si- 10 säänsä ja joka mainittu sirkkalehtiä pidättävä väline vastustaa mainitun sirkkalehtiä pidättävän välineen sisäpuolelta päin kasvavien sirkkalehtien tunkeutumista lävitseen estämättä kaasujen ja nesteiden kulkua mainitun sirkkalehtiä pidättävän välineen läpi totipotenttiin kasvikudokseen; 15 (c) kasveille myrkytöntä hydratoitua geeliä, joka sisältää geeliä hapettavaa yhdistettä ja joka ympäröi totipotenttia kasvikudosta ja sirkkalehtiä pidättävää välinettä .

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen kasvinsie- 20 menanalogi, tunnettu siitä, että mainittu sirkka lehtiä pidättävä väline käsittää huokoisen putken, joka :* sulkee pituussuunnassa sisäänsä totipotentin kasvikudoksen ·· ja jolla huokoisella putkella on suljettu pää, jolloin kas- vikudoksen sirkkalehtipää suuntautuu huokoisessa putkessa 25 kohden suljettua päätä.

13. Patenttivaatimuksen 11 mukainen kasvinsie- ‘,,1 menanalogi, tunnettu siitä, että mainittu sirkka- ’ lehtiä pidättävä väline käsittää huokoista ainetta, joka ympäröi ja myötäilee ainakin kasvikudoksen sirkkalehtipää-30 tä.

.., ’ 14. Patenttivaatimuksen 11 mukainen kasvinsie- : menanalogi, tunnettu siitä, että hydratoitu geeli on hapetettu.

. 15. Patenttivaatimuksen 1 mukainen kasvinsie- : · 35 menanalogi, tunnettu siitä, että se lisäksi käsit- tää 110870 82 (a) kasvin alkion, jossa on sirkkalehtipää ja vastapuolella oleva alkeisjuuri; ja (b) sirkkalehtiä pidättävän välineen, joka on kosketuksessa ainakin alkion sirkkalehtipään kanssa ja sulkee 5 sen sisäänsä ja joka mainittu sirkkalehtiä pidättävä väline vastustaa mainitun sirkkalehtiä pidättävän välineen sisäpuolelta päin kasvavien sirkkalehtien tunkeutumista lävitseen estämättä kaasujen ja nesteiden kulkua mainitun sirkkalehtiä pidättävän välineen läpi alkioon; 10 jolloin kasveille myrkytön hydratoitu geeli ympäröi alkiota ja sirkkalehtiä pidättävää välinettä.

16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen kasvinsie- menanalogi, tunnettu siitä, että mainittu sirkka lehtiä pidättävä väline käsittää huokoisen putken, joka 15 sulkee pituussuunnassa sisäänsä alkion ja jolla huokoisella putkella on suljettu pää, jotka kohden putken sisällä olevan alkion sirkkalehtipää suuntautuu, ja vastakkainen avoin pää, jota kohden putken sisällä olevan alkion alkeisjuuri suuntautuu.

17. Menetelmä totipotentin kasvikudosyksikön idät tämiseksi, tunnettu siitä, että ;· (a) sijoitetaan totipotentti kasvikudosyksikkö kos- ;· ketukseen kasveille myrkyttömän hydratoidun geeliyksikön » j*. kanssa niin, että muodostuu siemenanalogi, jolloin hydra- 2. toitu geeli sisältää geeliä hapettavaa yhdistettä ja mole-kulaarisen hapen pitoisuus hydratoidussa geelissä on korke-ampi kuin molekulaarisen hapen pitoisuus, jonka mainitun ·’’ hydratoidun geelin molekyylit muuten absorboisivat atmo sfääristä normaalilämpötilassa ja -paineessa; ! 30 (b) inkuboidaan siemenanalogia kasvin kasvua edis- tävissä ympäristöolosuhteissa totipotentin kasvikudoksen , : saattamiseksi kasvamaan ja kehittymään versoksi.

18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaihe (a) käsittää totipoten-35 tin kasvikudosyksikön koteloinnin mainittuun hydratoituun : hapetettuun geeliyksikköön. 83 1 10870

19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että totipotentti kasvikudosyksikkö käsittää kasvin sirkkalehtipäällä varustetun alkion ja vaihe (a) käsittää seuraavat vaiheet: 5 suljetaan ainakin sirkkalehtipää huokoiseen materi aaliin, joka vastustaa kasvavien sirkkalehtien tunkeutumista lävitseen; ja koteloidaan alkio ja huokoinen materiaali mainittuun hydratoituun hapetettuun geeliyksikköön.

20. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että siinä lisäksi (a) sijoitetaan totipotentti kasvikudosyksikkö kosketukseen kasveille myrkyttömän hydratoidun geeliyksikön kanssa, niin että muodostuu siemenanalogi; 15 (b) lisätään molekulaarisen hapen pitoisuutta sie- menanalogissa tasolle, joka on korkeampi kuin se molekulaarisen hapen taso, jonka mainitun hydratoidun geelin molekyylit muuten absorboisivat ilmakehästä standardilämpöti-lassa ja -paineessa.

21. Menetelmä totipotentin kasvikudosyksikön idät tämiseksi, tunnettu siitä, että j' (a) valmistetaan kasveille myrkytön hydratoitu gee- :· li, joka käsittää hapenkantajayhdistettä, joka antaa hydra- t toidulle geelille kyvyn absorboida atmosfääristä suuremman 25 määrän molekulaarista happea, kuin mitä muuten olisi hapen- • •t kantajayhdistettä sisältämättömän hydratoidun geelin absor- ! hoitavissa atmosfääristä normaalilämpötilassa ja -painees- 1 · ’ sa; (b) sijoitetaan totipotentti kasvikudosyksikkö kos- » · · '· h 30 ketukseen kasveille myrkyttömän hydratoidun geeliyksikön ’ kanssa, niin että muodostuu siemenanalogi; ja : (c) inkuboidaan siemenanalogia kasvin kasvua edis- tävissä ympäristöolosuhteissa totipotentin kasvikudoksen saattamiseksi kasvamaan ja kehittymään versoksi.

22. Patenttivaatimuksen 21 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että totipotentti kasvikudosyksikkö 84 110 8 7 0 käsittää kasvin sirkkalehtipäällä varustetun alkion ja menetelmä käsittää lisäksi ennen vaihetta (b) vaiheen, jossa suljetaan ainakin sirkkalehtipää huokoisen materiaalin sisään; ja 5 koteloidaan alkio ja huokoinen materiaali mainit tuun hydratoituun geeliyksikköön.

23. Menetelmä kasvin alkion idättämiseksi, jossa on sirkkalehtipää, tunnettu siitä, että (a) suljetaan ainakin sirkkalehtipää huokoiseen ma- 10 teriaaliin, joka vastustaa kasvavien sirkkalehtien tunkeutumista lävitseen; (b) koteloidaan alkio ja huokoinen materiaali hydratoituun geeliin, jolloin mainittu geeli sisältää geeliä hapettavaa yhdistettä; ja 15 (c) inkuboidaan siemenanalogia kasvin kasvua edis tävissä ympäristöolosuhteissa totipotentin kasvikudoksen saattamiseksi kasvamaan ja kehittymään versoksi.

24. Laitteisto hydratoitua geeliä sisältävien sie-menanalogien hapettamiseksi, tunnettu siitä, että 20 se käsittää siemenanalogien pitimen siemenanalogien pitämistä » j· varten; ;· suljettavissa olevan astian siemenanalogien pidintä ja siemenanalogeja varten; 25 välineet happikaasun syöttämiseksi astiaan, niin . että siemenanalogit joutuvat hapen vaikutuksen alaisiksi; ja ' ’ välineet siemenanalogien käsittelyyn käytettävän happikaasun kyllästämiseksi vesihöyryllä, niin että este- ♦ » ; 30 tään nappikaasua kuivaamasta siemenanalogeja.

,,· 25. Patenttivaatimuksen 1 mukainen kasvinsie- , : menanalogi, tunnettu siitä, että se käsittää toti- .....; potenttia kasvikudosta koteloituna kasveille myrkyttömään hydratoituun geeliin, joka sisältää geeliä hapettavaa ai- 35 netta, jolloin geeliä hapettava aine valitaan seuraavien ;' = : joukosta: 85 110 8 7 0 (a) hydratoidun geelin joukkoon sekoitetut hapen-kantajayhdisteet, joiden tarkoituksena on antaa hydra-toidulle geelille kyky absorboida atmosfääristä suuremmpi määrä molekulaarista happea, kuin mitä muuten olisi hapen- 5 kantajayhdistettä sisältämättömän hydratoidun geelin absorboitavissa atmosfääristä normaalilämpötilassa ja -paineessa; (b) molekulaarinen happi absorboituna hydratoituun geeliin pitoisuudeksi, joka on korkeampi kuin molekulaari- 10 sen hapen pitoisuus, joka muuten olisi läsnä geelissä mainitun hydratoidun geelin vain absorboidessa happea atmosfääristä normaalilämpötilassa ja -paineessa. * * · * · » · 86 110 8 7 0