BRPI0704031B1 - método de produzir embriões somáticos cotiledonares coníferos - Google Patents

Abstract

metodo de produzir embriões somaticos cotiledonares coníferos em um aspecto, a presente invenção fornece métodos de produção de embriões somáticos cotiledonares coníferos a partir de embriões pré-cotiledonares. os métodos deste aspecto da invenção incluem a etapa de a) dispensar uma pluralidade de embriões pré-cotiledonares em um material poroso horizontalmente disposto sobre uma superficie não porosa em um volume de meio de diluição estéril suficiente para submergir pelo menos a superficie do material poroso, dispersando desta forma uniformemente os embriões pré-cotiledonares; b) remover o meio de diluição estéril do material poroso, aprisionando os embriões pré-cotiledonares uniformemente dispersos no material poroso; e c) colocar os embriões pré-cotiledonares aprisionados no material poroso em contato com o meio de desenvolvimento por um período de tempo suficiente para produzir embriões somáticos cotiledonares coníferos.

Description

“MÉTODO DE PRODUZIR EMBRIÕES SOMÁTICOS COTILEDONARES CONÍFEROS” CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito a métodos para produção de embriões de planta in vitro e, opcionalmente, à produção de plantas a partir de embriões de planta.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO A demanda de árvores coníferas, tais como pinheiros e abetos, para fazer produtos de madeira continua a aumentar. Uma solução proposta para o problema de fornecer um suprimento adequado de árvores coníferas é identificar árvores coníferas individuais que possuam características desejáveis, tal como taxa rápida de crescimento, e produzir muitos clones, geneticamente idênticos, da árvores superiores por clonagem somática.

Clonagem somática é o processo de criar árvores geneticamente idênticas a partir de tecido somático da árvore. O tecido somático da árvore é tecido de árvore sem ser os gametas masculino e feminino. Em uma abordagem de clonagem somática, tecido somático de árvore é cultivado em um meio de iniciação que inclui hormônios, tais como auxinas e/ou citoquininas, que iniciam a formação de células embriogênicas que são capazes de se desenvolver em embriões somáticos. As células embriogênicas são então adicionalmente cultivadas em um meio de manutenção que promove a multiplicação das células embriogênicas para formar embriões pré-cotiledonares (isto é, embriões que não possuem cotilédones). As células embriogênicas multiplicadas são então cultivadas em um meio de desenvolvimento que promove o desenvolvimento e maturação dos embriões somáticos cotiledonares que podem, por exemplo, ser colocados em sementes artificiais e semeados no solo onde eles germinam para produzir mudas coníferas. As mudas podem ser transplantadas para um local de crescimento para subseqüente crescimento e eventual colheita para produzir madeira cerrada ou produtos derivados de madeira. Altemativamente, os embriões somáticos cotiledonares também podem ser germinados em um meio de germinação e, daí em diante, transferidos para o solo para crescimento adicional, Um problema contínuo com clonagem somática de embriões coníferos é estimulação eficiente e formação barata de embriões somáticos que são capazes de germinar para produzir plantas. Preferivelmente, embriões somáticos coníferos formados in vitro são física e fisiologicamente similares, ou idênticos, aos embriões zigóticos coníferos formados in vivo em sementes coníferas. Existe, desta forma, uma necessidade contínua de métodos para produção de embriões somáticos coníferos viáveis a partir de células embriogênicas coníferas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos para produzir embriões somáticos cotiledonares coníferos a partir de embriões pré-cotiledonares. Os métodos deste aspecto da invenção incluem a etapa de (a) dispensar uma pluralidade de embriões pré-cotiledonares em um material poroso horizontalmente disposto sobre uma superfície não porosa em um volume de meio de diluição estéril suficiente para submergir pelo menos a superfície do material poroso, dispersando desta forma uniformemente os embriões pré-cotiledonares; (b) remover o meio de diluição estéril do material poroso, aprisionando os embriões pré-cotiledonares uniformemente dispersos no material poroso; e (c) colocar os embriões pré-cotiledonares aprisionados no material poroso em contato com o meio de desenvolvimento por um período de tempo suficiente para produzir embriões somáticos cotiledonares coníferos.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece métodos de produzir embriões somáticos cotiledonares coníferos a partir de células somáticas coníferas. Os métodos deste aspecto da invenção incluem as etapas de (a) cultivar células somáticas coníferas em um meio de introdução para produzir células embriogênicas; (b) cultivar as células embriogênicas preparadas na etapa (a) em um meio de manutenção líquido para formar embriões somáticos coníferos pré-cotiledonares; (c) dispensar uma pluralidade de embriões pré-cotiledonares preparados na etapa (b) em um material poroso horizontalmente disposto sobre uma superfície não porosa em um volume de meio de diluição estéril suficiente párea submergir pelo menos a superfície do material poroso, dispersando desta forma uniformemente os embriões pré-cotiledonares; (d) remover o meio de diluição estéril do material poroso, aprisionando os embriões pré-cotiledonares uniformemente dispersos no material poroso; e (e) colocar os embriões pré-cotiledonares aprisionados no material poroso em contato com o meio de desenvolvimento por um período de tempo suficiente para produzir embriões somáticos cotiledonares coníferos.

Os métodos da invenção produzem um rendimento mais alto de embriões somáticos coníferos que um método equivalente em que os embriões pré-cotiledonares não são dispersos uniformemente sobre um meio de desenvolvimento. Em algumas modalidades, a pluralidade dos embriões pré-cotiledonares é dispersa em meio de diluição estéril em uma densidade de menos que 0,1 grama em peso de célula úmida por polegada quadrada (6,45 cm2) de material poroso, tal como de 0,005 a 0,1 grama em peso de célula úmida por polegada quadrada (6,45 cm ) de material poroso. Em algumas modalidades, a pluralidade dos embriões pré-cotiledonares é dispersa em um meio de diluição estéril em uma densidade de menos que 0,05 grama em peso de célula úmida por polegada quadrada (6,45 cm ) de material poroso, tal como de 0,001 a 0,05 grama em peso de célula úmida por polegada quadrada (6,45 cm ) de material poroso.

Os métodos da invenção são usados, por exemplo, para preparar embriões somáticos coníferos que podem ser usados para etapas de maturação posteriores e/ou que podem ser germinados para produzir plantas coníferas que podem crescer em árvores coníferas maduras, se desejado. Assim, por exemplo, os métodos da invenção podem ser usados para produzir clones de árvores coníferas individuais que possuem uma ou mais características desejáveis, tais como rápida taxa de crescimento ou melhor qualidade de madeira. Por exemplo, uma população de embriões somáticos coníferos produzida usando os métodos da invenção pode ser usada para produzir um grupo, ou floresta, de árvores coníferas que possuem uma ou mais características desejáveis, tais como rápida taxa de crescimento ou melhor qualidade de madeira. As árvores, por sua vez, podem ser utilizadas para produzir produtos de madeira.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS

Os aspectos precedentes e muitas das vantagens presentes desta invenção se tomarão mais prontamente aparentes à medida em que a mesma se tomar mais bem entendida pela referência à descrição detalhada seguinte, quando considerada em conjunto com os desenhos em anexo, em que: A figura 1 ilustra uma estrutura de plaqueamento exemplar que compreende material poroso disposto em uma estmtura de suporte para uso de acordo com uma modalidade do método da invenção; e As figuras 2A-H fornecem imagens fotográficas que demonstram que o crescimento de embriões cotiledonares plaqueados de acordo com os métodos da invenção é melhor em comparação a um método de plaqueamento padrão descrito no exemplo 3. As figuras 2A-D mostram os controles do método de plaqueamento por gota para genótipos A, E, F e B, respectivamente. As figuras 2E-H mostram os resultados do método de plaqueamento por espalhamento confluente de dispersão líquida para genótipos A, E, F e B, respectivamente, DESCRIÇÃO DETALHADA DA MODALIDADE PREFERIDA A menos que de outra forma especificamente aqui definido, todos os termos aqui usados têm o mesmo significado que eles teriam para um versado na técnica da presente invenção.

Da forma aqui usada, o termo “células embriogênicas” refere-se a qualquer célula, incluindo células que são organizadas para formar um tecido ou um órgão, derivadas de uma planta da ordem das Coniferales, que são capazes de produzir um ou mais embriões somáticos coníferos quando tratadas de acordo com os métodos da invenção. Assim, o termo “células embriogênicas” inclui, por exemplo, massas embrionares suspensoras coníferas.

Da fonna aqui usada, o termo “embrião pré-cotiledonar” refere-se a um embrião que ainda não possui nenhum cotilédone. A presente invenção descobriu que métodos da invenção produzem um rendimento maior de embriões somáticos coníferos que um método equivalente em que os embriões pré-cotiledonares não são uniformemente dispersos sobre um meio de desenvolvimento. Os inventores adicionalmente observaram que o plaqueamento de embriões pré-cotiledonares de acordo com os métodos da invenção em uma densidade de plaqueamento de menos que 0,1 grama em peso de célula úmida por polegada quadrada (6,45 cm2) de material poroso, tal como de 0,001 a 0,1 grama em peso de célula úmida por polegada quadrada (6,45 cm ) de material poroso, produz um maior rendimento de embriões cotiledonares por unidade de área quando comparados aos embriões pré-cotiledonares plaqueados em uma densidade maior e/ou plaqueados usando um método de gotejamento com pipeta tradicional adicionalmente descrito nos exemplos 2 e 3.

De acordo com o exposto, em um aspecto, a presente invenção fornece métodos de produzir embriões somáticos cotiledonares coníferos a partir de embriões pré-cotiledonares. Os métodos deste aspecto da invenção incluem a etapa de (a) dispensar uma pluralidade de embriões pré- cotiledonaxes em um material poroso disposto horizontalmente sobre uma superfície não porosa em um volume de meio de diluição estéril suficiente para submergir pelo menos a superfície do material poroso, dispersando assim uniformemente os embriões pré-cotiledonares; (b) remover o meio de diluição estéril do material poroso, aprisionando desta forma os embriões pré-cotiledonares dispersos uniformemente no material poroso; e (c) colocar os embriões pré-cotiledonares aprisionados no material poroso em contato com o meio de desenvolvimento por um período de tempo suficiente para produzir embriões somáticos cotiledonares coníferos.

Os métodos da invenção podem ser usados para produzir embriões somáticos cotiledonares a partir de qualquer conífera, tais como membros do gênero Pinus, tais como Loblolly Pine (Pinus taeda) e Radiata pine. Novamente, a título de exemplo, embriões somáticos cotiledonares de abeto de Douglas podem ser produzidos pelos métodos da invenção.

De acordo com os métodos da invenção, uma pluralidade de embriões somáticos coníferos pré-cotiledonares para ser plaqueados é suspensa em um volume de meio de diluição estéril suficiente para submergir pelo menos a superfície do material poroso disposto no substrato não poroso. A pluralidade de embriões pré-cotiledonares pode ser gerada usando os métodos aqui descritos. Por exemplo, culturas de suspensão de embriões somáticos imaturos (embriões pré-cotiledonares) podem ser cultivadas em um meio de manutenção líquido e as células depositadas naturalmente. O volume de célula depositada (SCV) é então medido, usando qualquer método adequado, tal como o método descrito no exemplo 2. A quantidade desejada de SCV é então diluída com o meio de diluição estéril para plaqueamento em uma densidade desejada. Em algumas modalidades, a quantidade de meio de diluição usada para diluir SCV é escolhida com base na área de superfície da estrutura de plaqueamento, de maneira a ser suficiente para submergir pelo menos a superfície do material poroso anexado à estrutura. Por exemplo, o SCV pode ser diluído com uma quantidade de meio de diluição estéril em pelo menos cerca de 3 a 4 vezes ou mais do volume SCV. O meio de diluição estéril pode ser qualquer meio líquido adequado que mantém a capacidade dos embriões de sobreviver e manter seu estado de desenvolvimento, tais como, por exemplo, meio de manutenção ou o meio de diluição exemplar apresentado a seguir na tabela 2.

Em algumas modalidades do método, os embriões pré-cotiledonares são plaqueados em uma baixa densidade, tal como 0,1 grama em peso de célula úmida por polegada quadrada (6,45 cm2) de área de plaqueamento de material poroso, supondo um peso úmido médio de cerca de 0,1 g/ml de SCV. O peso úmido médio de SCV pode ser determinado da forma descrita no exemplo 2. Por exemplo, os embriões podem ser plaqueados em menos que 0,05 grama, ou menos que 0,025 grama em peso de Λ célula úmida por polegada quadrada (6,45 cm ) de área de plaqueamento de material poroso. Em algumas modalidades, os embriões pré-cotiledonares são plaqueados em uma baixa densidade em uma faixa de cerca de 0,001 grama a cerca de 0,1 grama em peso de célula úmida por polegada quadrada (6,45 cm ) de área de plaqueamento de material poroso (por exemplo, de 1 ml de SVC a 0,01 ml de SVC por polegada quadrada (6,45 cm2) de área de plaqueamento de material poroso). Em uma modalidade, os embriões pré-cotiledonares são plaqueados em uma densidade na faixa de cerca de 0,01 grama a cerca de 0,08 grama em peso de célula úmida por polegada quadrada (6,45 cm ) de área de plaqueamento de material poroso, tal como de cerca de 0,02 grama a cerca de 0,05 grama em peso de célula úmida por polegada quadrada (6,45 cm2) de área de plaqueamento de material poroso.

Materiais porosos que são usados na prática da presente invenção têm um diâmetro de poro na faixa de cerca de 5 mícrons a cerca de 1.200 mícrons, tal como de cerca de 50 mícrons a cerca de 500 mícrons, tal como de cerca de 70 mícrons a cerca de 150 mícrons, tal como cerca de 100 mícrons. O material poroso é tipicamente planar e pode ser de qualquer forma e dimensão desejadas. A forma e dimensão do material poroso são escolhidas para facilidade de manipulação e para colocação em um substrato de crescimento, tal como meio de desenvolvimento. Formas adequadas incluem formas quadrada, retangular e circular. Dimensões exemplares são de uma λ área de superfície de cerca de 14 polegadas quadradas (90,3 cm ) a cerca de A 28 polegadas quadradas (180,7 cm ) ou mais, tal como 50 polegadas quadradas (322,6 cm2), 100 polegadas quadradas (645,2 cm2) até 500 polegadas quadradas (0,32 m2) ou mais. Materiais porosos preferidos são esterilizáveis e suficientemente fortes para resistir a dilaceração quando os materiais são suspensos a fim de transferir embriões somáticos depois do plaqueamento para estágios subseqüentes do processo de produção de embriões somáticos. Exemplos de materiais porosos usados incluem membranas, fibra de náilon, malha tecida (por exemplo, náilon, aço inoxidável ou plástico) e fibras poliméricas. Em algumas modalidades, o material poroso não é absorvente. Em algumas modalidades, o material poroso é uma malha tecida, tal como uma malha de aço inoxidável ou náilon.

De acordo com uma modalidade do método da invenção, um material poroso, tal como, por exemplo, uma malha tecida, é usado para plaquear e suportar tecido de planta durante a fase de desenvolvimento da produção do embrião somático de planta. Os embriões somáticos pré-cotiledonares são inicialmente dispensados em um material poroso planar que é disposto horizontalmente sobre uma superfície não porosa. A superfície não porosa pode ser qualquer superfície estéril adequada, tal como, por exemplo, a superfície de um meio de crescimento sólido ou semi-sólido, tal como uma placa de petri contendo meio de desenvolvimento, ou qualquer outra superfície estéril ou esterilizável capaz de reter líquido, tais como uma superfície de plástico, borracha ou vidro. Em algumas modalidades, a superfície não porosa é meio de desenvolvimento semi-sólido contido em uma caixa, tal como um caixa cambro. Em algumas modalidades, a superfície não porosa é contida em um vaso biorreator, em que o vaso biorreator é drenável.

Em uma modalidade do método, o material poroso é anexado a uma estrutura de plaqueamento. Um exemplo representativo de uma estrutura de plaqueamento 10 é apresentado na figura 1. Da forma apresentada na figura 1, a estrutura de plaqueamento 10 compreende um material poroso planar 20 anexado a uma estrutura de suporte 30 que rodeia o material poroso 20. Cabos adicionais 40A, 40B que são anexados à estrutura de suporte são fornecidos. A estrutura de plaqueamento é preferivelmente feita de materiais que são esterilizáveis. Por exemplo, a estrutura de suporte 30 pode ser feita de um material metálico ou plástico. Os cabos 40A, 40B podem ser feitos de qualquer material esterilizável adequado, tal como, por exemplo, tubo autoclavável. Um método exemplar para construir a estrutura de plaqueamento 10 está descrito no exemplo 2. Em uma modalidade, a estrutura de suporte 30 é metálica e o material poroso é uma malha de náilon que é anexada à estrutura antes da autoclavação e moderadamente encolhe depois da autoclavação para produzir uma anexação firme na estrutura e uma superfície de plaqueamento substancialmente plana.

De acordo com os métodos da invenção, uma pluralidade de embriões pré-cotiledonares é dispensada em um material poroso disposto sobre uma superfície não porosa em um material. Os embriões pré-cotiledonares são, desta forma, unifonnemente dispersos ao longo da superfície submersa do material poroso. Em algumas modalidades, os embriões dispensados são suavemente misturados ou agitados para facilitar a dispersão dos embriões no meio de diluição estéril. Agitação suave pode ser alcançada por qualquer um dos meios adequados, tais como, por exemplo, por meio do uso de um instrumento que coloca os embriões em contato ou por meio de vibração do material poroso e/ou o substrato não poroso.

Uma vez que os embriões pré-cotiledonares dispensados são substancialmente uniformemente dispersos sobre o material poroso, o meio de diluição estéril é removido do material poroso. Em uma modalidade, o meio de diluição estéril é removido do material poroso levantando verticalmente o material poroso para fora do substrato não poroso, aprisionando, desta forma, os embriões pré-cotiledonares uniformemente dispersos na superfície do material poroso. Por exemplo, o material poroso anexado a uma estrutura de plaqueamento 10 compreendendo cabos 40A, 40B pode ser verticalmente levantado pelos cabos usando qualquer um dos meios adequados, tais como manualmente ou por meios robóticos.

Em uma modalidade alternativa, uma vez que os embriões pré-cotiledonares dispensados são substancialmente uniformemente dispersos sobre o material poroso, o meio de diluição estéril é removido reduzindo o volume do meio de diluição estéril para um nível abaixo da superfície do material poroso, aprisionando desta forma os embriões pré-cotiledonares uniformemente dispersos na superfície do material poroso. O volume de meio de diluição estéril pode ser reduzido usando qualquer método que evita perturbação na distribuição das células plaqueadas, tais como, por exemplo, succionamento, drenagem, gotejamento ou manchamento fora do meio de diluição estéril.

Os embriões pré-cotiledonares uniformemente dispersos aprisionados na superfície do material poroso são então colocados em contato com o meio de desenvolvimento por um período de tempo suficiente para produzir embriões somáticos cotiledonares coníferos.

Em uma modalidade, o material poroso é tanto continua quanto intermitentemente colocado em contato com o meio de desenvolvimento líquido. Por exemplo, o material poroso pode ser colocado em uma almofada absorvente que é impregnada em meio de desenvolvimento de maneira tal que o meio de desenvolvimento passe através do material poroso e entre em contato com os embriões. O material poroso, tal como uma malha de náilon que sustenta as células embriônicas, é tipicamente fechado em um espaço selado que contém uma atmosfera úmida que garante que os embriões permaneçam úmidos. Em uma outra modalidade, o material poroso é disposto em um substrato de crescimento compreendendo meio de desenvolvimento sólido ou semi-sólido. O meio de desenvolvimento para uso nos métodos da invenção contém nutrientes que sustentam os embriões somáticos. Maltose e glicose podem ser incluídas no meio de desenvolvimento como a principal ou única fonte de açúcar para os embriões somáticos. Concentrações de maltose e glicose usadas são na faixa de cerca de 1% a cerca de 2,5%. Meio de desenvolvimento adequado tipicamente não inclui hormônios que promovem o crescimento, tais como auxinas e citoquininas, mas pode incluir o hormônio ácido abscísico. Quando ácido abscísico é usado no meio de desenvolvimento ele é utilizado em uma concentração na faixa de cerca de 1 mg/L a cerca de 200 mg/L. O meio de desenvolvimento pode conter goma gelana, tipicamente presente em uma concentração de até cerca de 0,40%. A osmolalidade do meio de desenvolvimento pode ser ajustada para um valor que cai em uma faixa desejada, usando osmoticante, tal como PEG de peso molecular 8.000, tal como de cerca de 250 mM/kg a cerca de 450 mM/kg. Tipicamente, uma osmolalidade de 300-350 mM ou maior é vantajosa. Um exemplo de meio de desenvolvimento líquido ou sólido adequado é fornecido no exemplo 1 e exemplo 2. A título de exemplo, embriões somáticos coníferos pré-cotiledonares podem ser cultivados em um material poroso, tais como uma malha ou membrana de náilon, que é pelo menos intermitentemente colocado em contato com o meio de desenvolvimento por um período de 4 semanas a 14 semanas, tal como de 8 semanas a 12 semanas ou tal como cerca de 12 semanas, em uma temperatura de 10°C a 30°C, tal como de 15°C a 25°C ou tal como de 20°C a 23°C.

Em uma modalidade, os embriões somáticos coníferos pré-cotiledonares são cultivados em um material poroso colocado em contato com um meio de desenvolvimento líquido que é aplicado a um substrato absorvente, tal como um substrato feito de celulose (por exemplo, fibras de celulose), tais como um ou mais filtros de papel ou algum outro material absorvente. O substrato absorve o meio de desenvolvimento líquido que passa através do material poroso disposto em um substrato e entre em contato com embriões somáticos pré-cotiledonares coníferos dispostos no material poroso. O meio de desenvolvimento promove o desenvolvimento dos embriões somáticos pré-cotiledonares coníferos para formar embriões somáticos cotiledonares.

Em uma outra modalidade, os embriões somáticos coníferos pré-cotiledonares são cultivados em um material poroso colocado em contato com meio de desenvolvimento líquido usando um atomizador que jateia o material poroso com o meio de desenvolvimento. Os embriões somáticos são dispostos em uma superfície superior do material poroso e o oposto, superfície inferior do material poroso, é j ateado com meio de desenvolvimento líquido. A título de exemplo adicional, o material poroso que sustenta embriões somáticos pode ser disposto sobre meio de desenvolvimento líquido que inclui uma barra de agitação rotativa que gira suficientemente rápido para jatear meio de desenvolvimento líquido para cima na superfície inferior do material poroso.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece métodos de produzir embriões somáticos cotiledonares coníferos a partir de células somáticas coníferas. Os métodos deste aspecto da invenção incluem a etapa de (a) cultivar células somáticas coníferas em um meio de introdução para produzir células embriogênicas; (b) cultivar as células embriogênicas preparadas na etapa (a) em um meio de manutenção líquido para formar embriões somáticos coníferos pré-cotiledonares; (c) dispensar uma pluralidade de embriões pré-cotiledonares preparados na etapa (b) em um material poroso horizontalmente disposto sobre uma superfície não porosa em um volume de meio de diluição estéril suficiente párea submergir pelo menos a superfície do material poroso, dispersando desta forma uniformemente os embriões pré-cotiledonares; (d) remover o meio de diluição estéril do material poroso, aprisionando os embriões pré-cotiledonares uniformemente dispersos no material poroso; e (e) colocar os embriões pré-cotiledonares aprisionados no material poroso em contato com o meio de desenvolvimento por um período de tempo suficiente para produzir embriões somáticos cotiledonares coníferos.

Assim, em algumas modalidades, células somáticas coníferas são cultivadas em um meio de indução para produzir células embriogênicas. Células embriogênicas são capazes de produzir um ou mais embriões somáticos coníferos cotiledonares. Exemplos de células embriogênicas são massas embrionares suspensoras (ESMs). O meio de indução tipicamente inclui sais inorgânicos e materiais nutrientes orgânicos. A osmolalidade do meio de indução é tipicamente cerca de 160 mM/kg ou mesmo menor, mas ela deve ser alta até 170 mM/kg. O meio de indução tipicamente inclui hormônios de crescimento. Exemplos de hormônios de crescimento que podem ser incluídos no meio de indução são auxinas (por exemplo, ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D)) e citoquininas (por exemplo, 6-benzilaminopurina (BAP)). Auxinas podem ser utilizadas, por exemplo, em uma concentração de 1 mg/L a 200 mg/L. Citoquininas podem ser utilizadas, por exemplo, em uma concentração de 0,1 mg/L a 10 mg/L. O meio de indução pode conter uma composição absorvente, especialmente quando níveis muito altos de hormônios de crescimento são usados. A composição absorvente pode ser qualquer composição que é atóxica para as células embriogênicas nas concentrações utilizadas na prática dos presentes métodos, e que é capaz de absorver hormônios que promovem o crescimento, e compostos tóxicos produzidos pelas células da planta durante o desenvolvimento do embrião, que estão presentes no meio. Exemplos não limitantes de composições absorventes usadas incluem carvão ativado, poü(vinil pirrolidona) solúvel, polÍ(vinil pirrolidona) insolúvel, alumina ativada e sílica gel. A composição absorvente pode estar presente em uma quantidade, por exemplo, de cerca de 0,1 g/L a cerca de 5 g/L. O meio de indução é tipicamente sólido e pode ser solidificado por inclusão de um agente de geleificação. Um exemplo de um meio de indução usado na prática da presente invenção é apresentado no exemplo 1. Células somáticas coníferas são tipicamente cultivadas em um meio de indução por um período de 3 semanas a 12 semanas, tal como de 8 semanas a 10 semanas ou tal como cerca de 8 semanas, em uma temperatura de 10 °C a 30 °C, tal como de 15 °C a 25 °C ou tal como de 20 °C a 23 °C. O meio de manutenção pode ser um meio sólido ou ele pode ser um meio líquido que pode ser agitado para promover crescimento e multiplicação do tecido embriogênico. A osmolalidade do meio de manutenção é tipicamente maior que a osmolalidade do meio de indução, tipicamente na faixa de 180-400 mM/kg. O meio de manutenção pode conter nutrientes que sustentam o tecido embriogênico e pode incluir hormônios, tais como uma ou mais auxinas e/ou citoquininas, que promovem a divisão e crescimento celular do tecido embriogênico. Tipicamente, as concentrações de hormônios no meio de manutenção são menores que sua concentração no meio de indução.

Em geral é desejável, apesar de não essencial, incluir maltose como a única, ou principal, fonte de açúcar metabolizável no meio de manutenção. Exemplos de concentrações de maltose usadas são na faixa de cerca de 1% a cerca de 2,5%. Um exemplo de meio de manutenção adequado é apresentado no exemplo 1 aqui. Células embriogênicas coníferas são tipicamente cultivadas em um meio de manutenção por um período de até 6 meses por subcultura semanalmente, em uma temperatura de 10°C a 30°C, tal como de 15°C a 25°C ou tal como 20°C a 23°C. Células embriogênicas coníferas são tipicamente transferidas para meio de manutenção fresco uma vez por semana ou como componentes de meio de esgotamento de crescimento.

Meios de desenvolvimento usados são descritos supra. Depois de serem cultivados em contato com um meio de desenvolvimento contínuo ou periódico, os embriões somáticos cotiledonares podem ser opcionalmente transferidos para um meio de maturação e então para um meio de estratificação por um período adicional de cultura.

Os métodos da invenção podem ser usados, por exemplo, para produzir clones de árvores coníferas individuais que possuem uma ou mais características desejáveis, tal como rápida taxa de crescimento. Assim, em um aspecto, a presente invenção fornece métodos de produzir uma população de embriões somáticos geneticamente idênticos, coníferos, cotiledonares. Os métodos deste aspecto da invenção incluem cada qual a etapa de cultivar embriões somáticos geneticamente idênticos, coníferos, pré-cotiledonares em um material poroso (por exemplo, malha de náilon poroso) que está em contato contínuo ou periódico com um meio de desenvolvimento por um período de tempo suficiente para produzir embriões somáticos geneticamente idênticos, coníferos, cotiledonares a partir de embriões somáticos pré-cotiledonares, em que o meio de desenvolvimento passa através do material poroso e entra em contato com os embriões somáticos.

Os embriões somáticos cotiledonares coníferos produzidos usando os métodos da invenção podem ser opcionalmente germinados para formar plantas coníferas que podem crescer em árvores coníferas, se desejado. Os embriões cotiledonares também podem ser dispostos em sementes artificiais para subseqüente germinação. Os embriões somáticos cotiledonares coníferos podem ser germinados, por exemplo, em um meio de germinação sólido, tal como o meio de germinação descrito no exemplo 2 aqui. As plantas germinadas podem ser transferidas para o solo para crescimento adicional. Por exemplo, as plantas germinadas podem ser plantadas no solo em uma estufa e crescerem naturalmente antes de serem transplantadas para um local fora. Tipicamente, os embriões somáticos cotiledonares coníferos são iluminados para estimular a germinação. Tipicamente todas as etapas dos métodos da invenção, exceto germinação, são conduzidas no escuro.

Os métodos da invenção produzem um rendimento maior de embriões somáticos coníferos por área de superfície plantada que um método equivalente em que as células embriogênicas são plaqueadas em uma densidade maior e/ou na presença de líquido em excesso, da forma adicionalmente descrita nos exemplos 2 e 3 anteriores.

Os métodos da invenção podem ser usados, por exemplo, para produzir clones de árvores coníferas individuais que possuem uma ou mais características, tal como uma rápida taxa de crescimento. Os métodos aqui descritos podem ser usados para produzir populações de embriões somáticos coníferos maduros geneticamente idênticos.

Os seguintes exemplos meramente ilustram o melhor modo atualmente contemplado para prática da invenção, mas não devem ser interpretados como limitantes da invenção. EXEMPLO 1 Este exemplo mostra um método representativo da invenção para produção de embriões de pinheiro somáticos a partir de Loblolly Pine.

Embriões zigóticos contendo gametófitos femininos são removidos das sementes quatro a cinco semanas depois da fertilização. Os revestimentos da semente são removidos, mas os embriões não são adicionalmente dissecados fora do gametófito em volta a não ser para cortar a extremidade nuclear. Os cones foram armazenados a 4 °C até ser usados. Imediatamente antes da remoção dos embriões imaturos, as sementes são esterilizadas utilizando uma lavagem inicial e tratamento detergente seguido por dez minutos de esterilização em H202 15%. Os tecidos foram completamente lavados com água destilada estéril depois de cada tratamento.

As tabelas 1 e 2 apresentam composições exemplares de meios usados para produzir embriões somáticos de pinheiro.

Tabela 1 i + Usado se um meio sólido for desejado Tabela 2 Indução: Gametófitos estéreis com embriões intactos são colocados em um meio de cultura MB 1 sólido e mantidos em um ambiente em 22-25 °C com um fotoperíodo escuro de 24 horas por um tempo de 3-5 semanas. A extensão do tempo depende de um genótipo particular sendo cultivado. Ao final deste período, uma massa mucilaginosa branca se forma em associação com os tecidos originais. Exame microscópico tipicamente revela muitos embriões em estágio precoce associados à massa. Estes são, em geral, caracterizados por ter um longo suspensor de parede fina com uma cabeça pequena com citoplasma denso e grande núcleo.

Osmolalidade do meio de indução pode em alguns casos ser tanto quanto 150 mM/kg. Normalmente ela é cerca de 120 mM/kg ou ainda menos (tal como 110 mM/kg).

Manutenção e Multiplicação de Embriões Pré-cotiledonares: Embriões em estágio precoce removidos das massas geradas no estágio de indução são primeiramente colocados em um meio de manutenção e multiplicação geleifícado MB2. Este difere do meio de indução em que os hormônios de crescimento (tanto auxinas quanto citoquininas) são reduzidos em, pelo menos, uma ordem completa de magnitude. A osmolalidade deste meio é em 130 mM/kg ou mais (tipicamente na faixa de cerca de 120-150 mM/kg para Pinus taeda). A temperatura é novamente 22-25 °C no escuro. Embriões são cultivados 12-14 dias no meio sólido MB2 antes da transferência para um meio líquido para adicional subcultura. Este meio líquido tem a mesma composição que MB2, mas falta o geleificante. Os embriões no final do estágio de manutenção sólido são tipicamente similares na aparência dos do estágio de indução. Depois de 5 a 6 subculturas semanais no meio de manutenção líquido, embriões em estágio precoce avançado se formaram. Estes são caracterizados por cabeças embrionares macias, estimadas tipicamente para ter acima de 100 células individuais, com suspensores múltiplos.

Desenvolvimento do Embrião: O desenvolvimento do embrião é conduzido da forma descrita a seguir nos exemplos 2 e 3. O potencial osmótico deste meio de desenvolvimento pode ser aumentado substancialmente acima do meio de manutenção. Observou-se vantajoso ter uma alta osmolalidade de até 300 mM/kg ou ainda maior. O desenvolvimento é preferivelmente realizado em escuridão total em uma temperatura de 22-25 °C até que os embriões cotiledonares se desenvolvam. O tempo de desenvolvimento é tipicamente várias semanas, tal como 7 a 12 semanas.

Estratificação: Embriões cotiledonares são singulados e transferidos para meio de estratificação MBS. Este meio é similar ao meio de desenvolvimento, mas falta ácido abscísico, PEG-8.000 e goma gelana. Embriões são cultivados em meio de estratifícação entre cerca de 1 °C a cerca de 10 °C no escuro por entre três a seis semanas.

Condicionamento sobre água: Os embriões maduros ainda no material poroso são levantados do substrato de crescimento e colocados em um recipiente fechado sobre H20 em uma umidade relativa de 97% por um período de cerca de três semanas.

Germinação: Os embriões maduros condicionados foram colocados em meio MB6 sólido para germinação. Este é um meio basal que falta hormônios de crescimento que foi modificado reduzindo sacarose, mio-inositol e nitrogênio orgânico. Os embriões são encubados em meio MB6 por tempo suficiente em condições ambientais de 23-25 °C, até que os tecidos resultantes tenham um radículo e hipocótilo e estrutura cotiledonar verde e epicótilo bem desenvolvidos.

Em virtude da concentração de carboidrato reduzida, o potencial osmótico do meio de germinação é adicionalmente reduzido abaixo da concentração do meio de desenvolvimento. Ela é normalmente abaixo de cerca de 150 mM/kg (tal como cerca de 100 mM/kg). EXEMPLO 2 Este exemplo descreve a construção de uma estrutura de plaqueamento exemplar e uso de acordo com uma modalidade do método da invenção.

Construção de uma Estrutura de Plaqueamento: Uma estrutura de plaqueamento metálica foi construída na qual uma trama de náilon de 100 mícrons foi anexada por silicone. A estrutura de plaqueamento 10 é apresentada na figura 1. Na modalidade da estrutura de plaqueamento (10) apresentada na figura 1, a malha de trama de náilon (20) é de forma retangular com um comprimento de 7 polegadas (17,8 centímetros) e uma largura de 4 polegadas (10,16 centímetros) com uma área de superfície exposta de 28 polegadas quadradas (180,6 cm2). As alças de tubo (40A, 40B) foram anexados à estrutura metálica (30) para facilitar o movimento da estrutura de plaqueamento (10). Uma esfera de silício foi adicionada ao longo da borda da estrutura e ao longo do meio da estrutura para criar 2 áreas de plaqueamento separadas de tamanho igual (não mostrado). A estrutura de plaqueamento (10) foi então autoclavada, resultando em uma superfície de plaqueamento firme devido ao encolhimento da malha de trama de náilon (20) na estrutura metálica (30) durante a autoclavação. Células de plaqueamento na Estrutura de Plaqueamento: Preparação de SCV para plaqueamento: Células de embrião somático conífero de genótipo A que cresceram em meio de proliferação (feito da forma descrita na tabela 4) em frascos Erlenmeyer de 1 litro assentaram naturalmente. O volume de células assentadas (SCV) foi medido desenhando uma linha do frasco e o sobrenadante acima das células assentadas foi retirado por meio de um bastão de vidro fritado mediante aspiração. As células assentadas foram então re-suspensas em uma quantidade suplementar de 3 x SCV de meio de diluição estéril, feito da forma descrita no exemplo 1.

Determinação do peso úmido de SCV: De maneira a determinar o peso úmido de SCV, SCV foi medido da forma descrita anteriormente. O sobrenadante foi então removido usando um funil de Buchnar (13 polegadas (33,0 centímetros) de Hg) e 1 ml da amostra de SCV foi colocado em um papel de filtro pré-umedecido VWR grau 417, pré-pesado. As medições de peso foram feitas em um tempo fixo (30 segundos) em uma balança de 4 casas decimais. As medições de peso úmido de quatro genótipos representativos por ml de SCV estão apresentadas na tabela 3.

Tabela 3 A partir destes resultados apresentados na tabela 3, o peso úmido médio ao longo dos 4 genótipos testados: 103,5 mg/ml de SCV. Desta forma, o peso úmido médio de 1 ml de SCV dos quatro genótipos testados é cerca de 0,1 g/ml de SCV.

Uma estrutura de plaqueamento (10), feita da forma descrita anteriormente, foi fornecida e colocada na superfície de meio de desenvolvimento semi-sólido (feito da forma descrita na tabela 5). O volume das células rinsadas assentadas foi então medido e plaqueado na primeira metade da estrutura de plaqueamento em uma densidade de 3 ml de SCV (0,3 g/14 polegadas quadradas (90,3 cm2) = 0,02 g/polegada quadrada (6,45 cm2)) e na segunda metade da estrutura de plaqueamento em uma densidade de 12 ml de SCV (1,2 g/14 polegadas quadradas (90,3 cm2) = 0,08 g/polegada quadrada (6,45 cm )) cada um em um volume total de 9 ml e 36 ml, respectivamente. O plaqueamento das células foi feito sobre a estrutura de plaqueamento na superfície de um meio de desenvolvimento semi-sólido contido em uma caixa. Isto permitiu que as células e o meio dispensassem igualmente ao longo da malha de náilon de maneira a minimizar a variação na densidade celular e profundidade celular inicial. Uma vez que as células plaqueadas foram uniformemente dispersas sobre a malha de náilon submersa, a estrutura de plaqueamento (10) foi levantada verticalmente para fora do meio de desenvolvimento semi-sólido, capturando desta forma os embriões dispersos uniformemente e permitindo que o meio em excesso dispersasse enquanto que permanece na primeira caixa. A estrutura de plaqueamento contendo os embriões dispersos uniformemente foi então colocada na superfície de um meio de desenvolvimento semi-sólido da mesma formulação que o primeiro em uma nova caixa. As células plaqueadas na estrutura de plaqueamento cresceram então por 12 semanas e foram monitoradas para a biomassa total, massa suspensora embrionária e formação da estrutura do embrião, da forma apresentada na tabela 6.

Tabela 4 Tabela 5 Resultados: As culturas plaqueadas em diferentes densidades na estrutura de plaqueamento foram examinadas depois de 12 semanas em cultura para biomassa total, massa embrionar suspensora (ESM) e formação de estrutura embrionária. Embriões selecionados referem-se à presença de pelo menos 4 cotilédones e nenhuma deformidade de grande escala. Os resultados estão apresentados a seguir na tabela 6.

Tabela 6 Da forma apresentada anteriormente na tabela 6, quando os embriões foram plaqueados em uma densidade mais baixa (por exemplo, 3 ml de SCV/14 polegadas quadradas (aproximadamente 0,3 g/14 polegadas quadradas (90,3 cm2) = 0,02 g/polegada quadrada (6,45 cm2))), a proliferação subseqüente das massas suspensoras embrionares rendeu tanta biomassa total quanto as células plaqueadas em uma densidade mais alta de 12 ml de SCV/14 polegadas quadradas (90,3 cm2) (aproximadamente 1,2 g/14 polegada quadrada (90,3 cm2) = 0,08 g/polegada quadrada (6,45 cm2))). Da forma adicionalmente apresentada na tabela 6, a quantidade total de embriões produzidos em uma base por área foi aproximadamente igual entre a baixa densidade e alta densidade. Isto foi possível pelo crescimento de massa suspensora embrionar (ESM) consideravelmente melhor apresentado pela diferença no peso seco, por exemplo, 235 mg de ESM seca a partir de baixa densidade em função de somente 138,7 mg de ESM seca a partir de estrutura de plaqueamento de alta densidade. Desta forma, a formação do embrião selecionado (o produto final de interesse) por ml de SCV plaqueado foi claramente melhor no plaqueamento de baixa densidade (240 embriões/ml de SCV) comparada ao plaqueamento de alta densidade (64,25 embriões/ ml de SCV). EXEMPLO 3 Este exemplo descreve uma comparação entre os rendimentos de embrião usando um método de plaqueamento de gota de pipeta padrão e o método de plaqueamento de espalhamento confluente de dispersão de líquido de acordo com uma modalidade da presente invenção usando quatro genótipos diferentes de Loblolly Pine. Métodos: Um experimento foi realizado para comparar diretamente métodos de plaqueamento de células em estruturas de plaqueamento (10) usando a mesma quantidade de biomassa de quatro diferentes genótipos de Loblolly Pine, A, B, E e F, ao mesmo tempo em que varia a densidade do SCV plaqueado. O rendimento de embriões e germinação resultante foram medidos. Células somáticas embriônicas (ESM) de genótipos A, B, E e F cresceram em meio de proliferação (feito da forma descrita no exemplo 2) em frascos erlenmeyer de 1 litro. As células ESM assentaram naturalmente e o volume de células assentadas (SCV) foi medido da forma descrita no exemplo 2.

Para cada genótipo, como um controle que representa o método de plaqueamento de gota padrão, 6 ml de SCV foram diretamente plaqueados na forma de 12 gotas (0,5 ml de SCV cada) em uma estrutura de plaqueamento completa (7” x 4” de área total = 45,2 cm x 25,8 cm )) colocados em meio de desenvolvimento semi-sólido em uma caixa de plaqueamento rasa. Neste exemplo, uma caixa cambro (Cambro Manufacturing Co., Huntington Beach, CA) que sustenta duas estruturas de plaqueamento (10) foi utilizada. Para testar o método de plaqueamento de espalhamento, uma segunda alíquota de 6 ml de SCV de cada genótipo foi rinsada com 3x (18 ml) de meio de desenvolvimento. Os 24 ml de SCV mais meio de rinsagem foram então plaqueados em toda estrutura de plaqueamento (28 polegadas quadradas) (180,6 cm2) dispostos sobre um primeiro meio de desenvolvimento semi-sólido em uma caixa cambro de maneira que as células ESM flutuassem no meio e dispersassem uniformemente sobre a superfície submersa da estrutura de plaqueamento. A dispersão uniforme foi com o auxílio de agitação suave da estrutura de plaqueamento. As estruturas de plaqueamento foram então levantadas verticalmente fora do primeiro meio semi-sólido na caixa cambro usando as alças anexadas, mantendo ao mesmo tempo a superfície de plaqueamento em uma orientação horizontal, aprisionando desta forma as células ESM uniformemente dispersas, permitindo ao mesmo tempo que o meio flua através da malha porosa.

As estruturas de plaqueamento contendo células plaqueadas foram então movidas para uma caixa cambro fresca contendo meio de desenvolvimento semi-sólido (descrito no exemplo 2) e se desenvolveram naturalmente por 12 semanas. Ao final das 12 semanas, os embriões foram submetidos a tratamentos de desenvolvimento posterior para induzir germinação, foram postos em contato e uma amostra germinou. Um germinante normal foi classificado com a presença de uma raiz branca de 1 mm, a presença de aproximadamente 5 folhas de epicótilo aproximadamente de 5 mm de comprimento, nenhuma ruptura de hipocótilo de grande escala e um hipocótilo sem um arqueamento maior que 90 graus. O rendimento total de embriões desenvolvidos foi contado depois de 12 semanas de período de desenvolvimento. Os resultados são apresentados a seguir na tabela 7. Fotografias foram tiradas no final do período de desenvolvimento, da forma apresentada na figura 2. As figuras 2A-D mostram os controles para genótipos A, E, F e B, respectivamente. As figuras 2E-H mostram os resultados do método de plaqueamento de espalhamento confluente de dispersão de líquido para genótipos A, E, F e B, re sp ectivamente.

No final de 12 semanas, os embriões foram estrati ficados usando meio de estratificação MBS (descrito no exemplo 1) por 4 semanas. Depois de 4 semanas de estratificação, os embriões foram separados por aspersão e condicionados em água por 10 dias.

Para cada genótipo, 25 embriões foram selecionados para estimação da germinação. Os embriões foram selecionados para germinação com base na presença de pelo menos 4 cotilédones e na ausência de deformidades grosseiras ou hipocótilos divididos.

Resultados: Tabela 7 Da forma apresentada anteriormente na tabela 7, todos os quatro genótipos testados apresentaram pelo menos um aumento 1,3 vezes ou maior no rendimento do embrião usando o método de espalhamento confluente de baixa densidade quando comparado ao método de plaqueamento de gota por pipeta tradicional. Os resultados dos estudos de germinação não apresentaram nenhuma diferença estatisticamente significativa entre a germinação bem sucedida de amostras plaqueadas usando o método de gota com relação ao método de espalhamento.

Quando os resultados dos quatro genótipos apresentados na figura 7 são combinados, o valor de controle médio geral de embriões produzidos é 2.166,7 usando o método de gota em função do valor médio geral de 3.692 embriões produzidos usando o método de espalhamento confluente de dispersão de líquido, que é um rendimento de embrião 1,7 vezes maior, com um valor de p de 0,0708. Isto é uma melhoria muito significativa em rendimentos de embrião que permite que um genótipo seja plaqueado em uma unidade cambro única para alcançar o rendimento médio alvo para rendimentos de germinação e diminui o número de unidades necessárias para manusear um único clone para somente um, ao contrário das pelo menos 30 unidades separadas (placas de petri) necessárias usando o método de plaqueamento de gota por pipeta tradicional.

Os resultados combinados registrados ao longo dos quatro genótipos testados são fornecidos a seguir na tabela 8.

Tabela 8 Os dados apresentados anteriormente na tabela 8 mostram um aumento de 70% estatisticamente significativo (valor de p 0,10) no rendimento de embrião sem nenhuma perda aparente na porcentagem de germinação, embora exista alguma indicação de diferença no comprimento da raiz. Embora sem querer ficar preso à teoria, a diferença no tamanho da raiz observada pode ser devida a assuntos nutricionais associados a uma maior quantidade de crescimento. Os problemas nutricionais podem ser abordados tanto movendo os embriões plaqueados para um substrato de crescimento fresco depois de um período de tempo quanto ajustando a composição do meio para uma concentração maior e/ou modificando a densidade de plaqueamento para linhas celulares particulares com base na sua taxa de crescimento.

Da forma apresentada na tabela 8, o método de plaqueamento por espalhamento da invenção resultou em rendimento de 120% de germinantes quando comparado ao método de plaqueamento por gota, sugerindo uma melhoria muito grande na produtividade da cultura da forma medida, tanto por geração quanto por germinação de embrião em uma unidade por caixa e base de área de superfície. Esta melhoria observada no rendimento do embrião leva permite o aumento de escala sem nenhuma limitação do tamanho da superfície plaqueada, ao contrário do crescimento do método da gota anterior em placas de petri. Tal aumento de escala aumenta a quantidade de embriões formados por unidade plaqueada e diminui custos por unidade reduzindo a quantidade de manipulação necessária.

Embora este exemplo descreva o uso de caixas Cambro como recipientes de plaqueamento, os recipientes de plaqueamento para a etapa de desenvolvimento depois do plaqueamento podem ser qualquer superfície de plaqueamento adequada, tal como qualquer recipiente tipo caixa, tal como recipientes de preparo de alimento disponíveis que são estáveis termícamente e têm uma tampa que pode ser usada. O método de espalhamento confluente de dispersão de líquido também foi realizado com êxito usando uma estrutura de plaqueamento disposta sobre uma variedade de superfícies estéreis não porosas além de meio semi-sólido, tais como, por exemplo, uma tampa plástica estéril ou uma folha de silício ou pires de borracha colocado em um vaso capaz de reter líquido, seguido pelo contato dos embriões plaqueados com o meio de de senvol vimento. O método de espalhamento confluente de dispersão de líquido também foi realizado com êxito primeiramente plaqueando uma quantidade de meio de diluição estéril suficiente para submergir uma superfície de plaqueamento compreendendo um material poroso disposto sobre um substrato sólido (não poroso). O volume desejado de SCV é então adicionado ao meio de diluição e suavemente misturado com uma pipeta. As células flutuantes são então dispersas com a ajuda opcional de uma pipeta e/ou agitação suave da primeira superfície de plaqueamento. A estrutura de plaqueamento é então separada e colocada sobre um segundo substrato de crescimento compreendendo meio de desenvolvimento e incubada da firma supradescrita.

Finalmente, o método de espalhamento confluente também foi usado com êxito para gerar embriões a partir de vários genótipos de Loblolly Pine usando alíquotas de 1 ml até 12 ml de SCV plaqueada em uma estrutura de plaqueamento total (45,2 cm x 25,8 cm) colocada em meio de desenvolvimento semi-sólido.

Embora a modalidade preferida da invenção tenha sido ilustrada e descrita, percebe-se que várias alterações podem ser feitas a elas sem fugir do espírito e escopo da invenção.

As modalidades da invenção em que uma propriedade ou privilégio exclusivos reivindicados são da forma definida como se segue.

REIVINDICAÇÕES

Claims (13)

1. Método de produzir embriões somáticos cotiledonares coníferos, caracterizado pelo fato de que o método compreende: a) dispensar uma pluralidade de embriões pré-cotiledonares em um material poroso horizontalmente disposto sobre uma superfície não porosa em um volume de meio de diluição estéril suficiente para submergir pelo menos a superfície do material poroso, dispersando desta forma uniformemente os embriões pré-cotiledonares; b) remover o meio de diluição estéril do material poroso, aprisionando os embriões pré-cotiledonares uniformemente dispersos no material poroso; e c) colocar os embriões pré-cotiledonares aprisionados no material poroso em contato com o meio de desenvolvimento por um período de tempo suficiente para produzir embriões somáticos cotiledonares coníferos.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de embriões pré-cotiledonares é dispensada em meio de diluição estéril de acordo com a etapa (a) em uma densidade menor que 0,1 grama em peso de célula úmida por polegada quadrada (6,45 cm2) de material poroso.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de embriões pré-cotiledonares é dispensada em meio de diluição estéril de acordo com a etapa (a) em uma densidade menor que 0,05 grama em peso de célula úmida por polegada quadrada (6,45 cm2) de material poroso.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de embriões pré-cotiledonares é dispensada em meio de diluição estéril de acordo com a etapa (a) em uma densidade de 0,1 grama em peso de célula úmida por polegada quadrada (6,45 cm2) a 0,001 grama em peso de célula úmida por polegada quadrada (6,45 cm ) de material poroso.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o material poroso compreende poros com um diâmetro de poro médio na faixa de 5 mícrons a 1.200 mícrons.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1. caracterizado pelo fato de que o material poroso é não absorvente.

7. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o material poroso é uma malha tecida.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o material poroso é anexado a uma estrutura de suporte compreendendo alças.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o meio de diluição estéril é removido do material poroso de acordo com a etapa (b) levantando verticalmente a estrutura de suporte para fora do substrato não poroso.

10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio de diluição estéril é removido do material poroso de acordo com a etapa (b) reduzindo o meio de diluição estéril para um nível abaixo da superfície do material poroso.

11. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio de desenvolvimento de acordo com a etapa (c) é um meio líquido.

12. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio de desenvolvimento de acordo com a etapa (c) é um meio sólido.

13. Método de produzir embriões somáticos cotiledonares coníferos, caracterizado pelo fato de que compreende (a) cultivar células somáticas coníferas em um meio de indução para produzir células embriogênicas; (b) cultivar as células embriogênicas preparadas na etapa (a) em um meio de manutenção líquido para formar embriões somáticos coníferos pré-cotiledonares; (c) dispensar uma pluralidade de embriões pré-cotiledonares preparados na etapa (b) em um material poroso horizontalmente disposto sobre uma superfície não porosa em um volume de meio de diluição estéril suficiente para submergir pelo menos a superfície do material poroso, dispersando desta forma uniformemente os embriões pré-cotiledonares; (d) remover o meio de diluição estéril do material poroso, aprisionando os embriões pré-cotiledonares uniformemente dispersos no material poroso; e (e) colocar os embriões pré-cotiledonares aprisionados no material poroso em contato com o meio de desenvolvimento por um período de tempo suficiente para produzir embriões somáticos cotiledonares coníferos.