SE531226C2 - Förfaranden för spridning med låg densitet för somatisk embryogenes - Google Patents

Description

25 30 531 226 2 Ett ständigt problem med somatisk kloning av banträdsembryon är stimulering av effektiv och kostnadseffektiv framställning av somatiska embryon med förmåga att gro för erhållande av plantor. Företrädesvis är in vitro framställda somatiska barrträdsembryon fysiskt och fysiologiskt likartade eller identiska med zygotiska barrträdsembryon som framställts in vitro i barr- trädsfrön. Det föreligger därför ett fortsatt behov av förfaranden för framställ- ning av viabla somatiska barrträdsembryon med utgångspunkt från embryo- gena barrträdsceller.

Sammanfattning av uggfinningen l en aspekt tillhandahålls med föreliggande uppfinning förfaranden för framställning av somatiska hjärtbladsförsedda barrträdsembryon med ut- gângspunkt från pre-hjärtförsedda embryon. Förfarandena i denna aspekt av uppfinningen inkluderar steget av (a) fördelning av ett flertal pre-hjärtförsedda embryon på ett poröst material horisontellt anbringat över en icke-porös yta i en volym av sterilt utspädningsmedium som är tillräcklig för nedsänkning av åtminstone ytan av det porösa materialet, varigenom de pre-hjärtbladsför- sedda embryona sprids enhetligt, (b) avlägsnande av det sterila utspädnings- mediet från det porösa materialet, varigenom de enhetligt spridda pre-hjärt- bladsförsedda embryona infàngas på det porösa materialet; och (c) kontakt mellan de pre-hjårtbladsförsedda embryona som infângats på det porösa materialet och ett utvecklingsmedium under en tidsperiod som är tillräcklig för framställning av hjärtbladsförsedda somatiska barrträdsembryon. l en annan aspekt tillhandahålls med föreliggande uppfinning förfarand- en för framställning av hjärtbladsförsedda somatiska barrträdsembryon med utgångspunkt från somatiska barrträdsceller. Förfarandena i denna aspekt av uppfinningen inkluderar stegen av (a) odling av somatiska barrträdsceller i ett induktionsmedium för erhållande av embryogena celler; (b) odling av de vid steg (a) framställda embryogena cellema i ett flytande underhållsmedium för framställning av pre-hjärtbladsförsedda somatiska barrträdsembryon; (c) för- delning av ett flertal av de vid steget (b) framställda pre-hjärtbladsförsedda embryona påiett poröst material horisontellt anbringat över en icke-porös yta i en volym av ett sterilt utspädningsmedium som är tillräcklig för nedsänkning av åtminstone ytan av det porösa materialet, varigenom de pre-hjärtbladsför- 10 15 20 25 30 53 'l 226 3 1 sedda embryona sprids enhetligt; (d) avlägsnande av det sterila utspädnings- mediet från det porösa materialet, varigenom de enhetligt spridda pre-hjärt- bladsförsedda embryona infångaspå det porösa materialet; och (e) kontakt mellan de pre-hjärtbladsförsedda embryona som infångats på det porösa materialet och ett utvecklingsmedium under en tidsperiod som är tillräcklig för framställning av hjärtbladsförsedda somatiska barrträdsembryon.

Med hjälp av förfarandena enligt föreliggande uppfinning erhålls ett högre utbyte av somatiska barrträdsembryon jämfört med vid en ekvivalent metod där depre-hjärtbladsförsedda embryona inte är enhetligt spridda över utvecklingsmediet. Vid vissa utföringsforrner fördelas mångfalden av de pre- hjärtbladsförsedda embryona i ett steriit utspädningsmedium med en densitet av mindre än 0,1 g cellvåtvikt per 6,5 cmz (kvadrattum) av poröst material, så- som från 0,005 till 0,1 g cellvåtvikt per 6,5 om: (kvadrattum) av poröst materi- al. Vid vissa utföringsformer fördelas mångfalden av pre-hjärtbladsförsedda embryon i ett sterilt utspädningsmedium med en densitet av mindre än 0,05 g cellvåtvikt per 6,5'cm2 (kvadrattum) av poröst material, såsom från 0,001 till 0,05 g cellvåtvikt per 6,5 omz (kvadrattum) av poröst material.

Förfarandena enligt föreliggande uppfinning är användbara för t ex framställning av somatiska barrträdsembryon som kan användas för senare mognadssteg och/eller som kan underkastas groning för erhållande av barr- trädsplantor som kan växa till mogna barrträd, om så är önskvärt. Förfarande- na enligt uppfinningen kan tex således användas för framställning av kloner av individuella barrträd med en eller flera önskvärda egenskaper, såsom ökad tillväxthastighet eller förbättrad träkvalitet. En population av somatiska barr- trädsembryon som framställts med hjälp av förfarandena enligt föreliggande uppfinning kan t ex användas för framställning av ett bestånd eller en skog av barrträd med en eller flera önskvärda egenskaper, såsom hög tillväxthastighet eller förbättrad träkvalitet. Träden kan i sin tur användas för framställning av tråprodukter. A Kortglgeskrivnind av ritningafig Ovannämnda aspekter och flera av de åtföljande fördelarna med före- liggande uppfinning inses lättare genom hänvisning till följande detaljerade beskrivning beaktad tillsammans med åtföljande ritningama. 10 15 20 25 30 531 226 4 l Figur 1 visas ett exempel på en utstrykningsstomme (”plating frame”) _ inbegripande poröst material anbringat på en stödram för användning enligt en utföringsform av förfarandet enligt uppfinningen.

I Figurerna 2A-H visas fotografier som åskådliggör att tillväxten av hjärtbladsförsedda embryon som strukits ut i enlighet med förfarandena enligt uppfinningenförbättras ijämförelse med en standardmässig utstryknings- metod, såsom beskrivs i Exempel 3. l_ Figurema 2A-D visas kontroller enligt dropputstrykningsmetoden för genotyperna A, E, F respektive B. l Figurerna 2E-H visas resultaten av utstrykningsmetoden för spridning genom samman- flytning ivätska ("liquid dispersion confluent spread plating method”) för geno- typerna A, E, F respektive B.

Detal|'erad beskrivning av den föredragna utföringsfonnen Såvida det inte specifikt definierats här har samtliga här använda ut- tryck samma innebörd som de skulle ha för fackmannen inom området för föreliggande uppfinning.

Det här använda uttrycket ”embryogena celler” hänför sig till vilka celler som helst inkluderande celler som ärorganiserade för bildning av en vävnad eller ett organ härrörande från en växt av ordningen Coniferales och som har förmåga att producera ett eller flera somatiska barrträdsembryon vid behand- ling med hjälp av förfarandena enligt föreliggande uppfinning. Således inklu- derar uttrycket ”embryogena celler" t ex embryonala suspensorrnassor hos barrträd.

Det här användauttrycket ”pre-hjärtbladsförsett embryo” hänför sig till ett embroy som ännu inte har några hjärtblad.

Det här använda uttrycket ”hjärtbladsförsett embryo” hänför sig till ett embryo som har minst ett hjärtblad.

Föreliggande uppfinnare har upptäckt att förfarandena enligt föreligg- ande uppfinning ger ett högre utbyte av somatiska barrträdsembryon än en ekvivalent metod där de pre-hjärtbladsförsedda embryona inte är enhetligt spridda över utvecklingsmediet. Uppfinnama har dessutom observerat att ut- strykning av pre-hjärtbladsförsedda embryon med hjälp av metoderna enligt föreliggande uppfinning med en utstrykningsdensitet av mindre än 0,1 g cellvåtvikt per 6,5 cmz (kvadrattum) av poröst material, såsom från 0,001 till '10 15 20 25 30 531 226 5 0,1 g cellvåtvikt per 6,5 cmz (kvadrattum)«av poröst material, ger ett ökat utbyte av hjärtbladsförsedda embryon per areaenhet jämfört med pre-hjärt- bladsförsedda embryon som strukits ut med en högre densitet och/eller strukits ut genom användning av en traditionell pipettdroppningsmetod, så- som beskrivs ytterligare i Exempel 2 och 3. .

Såsom nämnts ovan hänför sig föreliggande uppfinning i en aspekt til förfaranden för framställning av hjärtbladsförsedda somatiska barrträds- embryon med utgångspunkt från pre-hjärtbladsförsedda embryon. Förfaran- dena enligt denna aspekt av uppfinningen inkluderar steget av (a) fördelning av ett flertal pre-hjärtbladsförsedda embryon på ett poröst material horisontellt anbringat över en icke-porös yta i en volym av sterilt utspädningsmedium som är tillräcklig för nedsänkning av åtminstone ytan av det porösa materialet, var- igenom de pre-hjärtbladsförsedda embryona sprids enhetligt; (b) avlägsnande av det sterila utspädningsmedlet frán det porösa materialet, varvid de enhet- ligt spridda pre-hjärtbladsförsedda embryona infångas på det porösa material- et; och (c) kontakt mellan de pre-hjärtbladsförsedda embryona som infångats på det porösa materialet och ett utvecklingsmedium under en tidsperiod som är tillräcklig för framställning av hjärtbladsförsedda somatiska barrträds- embryon.

Förfarandena enligt föreliggande uppfinning kan användas för fram- ställning av hjärtbladsförsedda somatiska embryon från vilket barrträd som helst, såsom medlemmar av släktet Pinus, såsom sydstatsgultall ((loblo|lytall) (Pinus taeda)) och radiatatall. Hjärtbladsförsedda somatiska embryon från douglasgran kan tex också framställas med hjälp av förfarandena enligt före- liggande uppfinning.

Med hjälp av förfarandena enligt föreliggande uppfinning nedsänks ett flertal pre-hjärtbladsförsedda somatiska barrträdsembryon avsedda för ut- strykning ("plating”) i en volym av sterilt utspädningsmedium som är tillräcklig för nedsänkning av åtminstone ytan av det porösa materialet som är anbringat på_det icke-porösa substratet. Mångfalden av pre- hjärtbladsförsedda embryon kan åstadkommas genom användning av de här beskrivna metoderna. Suspensionskulturer av omogna somatiska embryon (pre-hjärtbladsförsedda embryon) kan t ex odlas i ett flytande 10 15 20 25 30 531 226 6 underhållsmedium, varefter cellema får sedimentera. Volymen av sedimenterade celler (SCV) mäts därefter genom användning av vilken lämplig metod som helst, såsom den i Exempel 2 beskrivna metoden. Den önskade mängden sedimenterade celler späds därefter ut med det sterila utspädningsmediet för utstrykning med en önskvärd densitet. Vid vissa utföringsforrner är mängden utspädningsmedium som används för utspädning av SCV baserad på ytarean av utstrykningsstommen i syfte att vara tillräcklig för nedsänkning av åtminstone ytan av det på stommen anbringade porösa materialet. SCV kan tex spädas ut med en mängd av sterilt utspädningsmedium som är minst ca 3-4 gånger eller mer i relation till SCV.

Det sterila utspädningsmediet kan vara vilket lämpligt vätskeformlgt medium som helst som upprätthåller embryonas förmåga att överleva och upprätthålla sin utvecklingsstatus, såsom underhållsmedier eller de såsom exempel angivna utspädningsmedierna som visas nedan i Tabell 2.

Vid vissa utföringsformer av förfarandet stryks de pre-hjärtbladsför- sedda embryona ut med en låg densitet, såsom mindre än ca 0,1 g cellvåtvikt per 6,5 om* (kvadrattum) av utstrykningsarean av poröst material, under an- tagande av en genomsnittlig våtyikt av ca 0,1 g/ml SCV. Den genomsnittliga våtvikten av SCV kan bestämmas såsom beskrivs i Exempel 2. Embryona . kan t ex strykas ut i en mängd av mindre än 0,05 g, eller mindre än 0,025 g cellvåtvikt per 6,5 cmz (kvadrattum) av utstrykningsarean av poröst material.

Vid vissa utföringsforrner stryks de pre-hjärtbladsförsedda embryona ut med en låg densitet inom ett intervall från ca 0,001 g till ca 0,1 g cellvåtvikt per 6,5 cmz (kvadrattum) av utstrykningsarean av poröst material (t ex från 1 ml SCV till 0,01 ml SCV per 6,5 cmz (kvadrattum) av utstrykningsarean av poröst material). Vid .en utföringsform stryks de pre-hjärtbladsförsedda embryona ut med en densitet i intervallet från 0,01 g till ca 0,08 g cellvåtvikt per 6,5 cmz (kvadrattum) av utstrykningsarean av poröst material, såsom från ca 0,02 g till ca 0,05 g cellvåtvikt per 6,5 cmz (kvadrattum) av utstrykningsarean av poröst material.

Porösa material som är användbara vid utövandet av föreliggande upp- finning har en pordiameter i området från ca 5 um till ca 1200 um, såsom från ca 50 um till ca 500 um, såsom från ca 70 till ca 150 um, såsom ca 100 um. 10 15 20 25 30 531 226 7 Det porösa materialet är vanligtvis plant och kan ha vilken önskad form och dimension som helst. Formen och dimensionen av det porösa materialet är vald i syfte att underlätta hantering och placering på ett tillväxtsubstrat, såsom ett utvecklingsmedium. Lämpliga former inkluderar kvadratiska, rektangulära eller cirkulära former. Exempel på dimensioner är från en ytarea från ca 90,3 cmz (14 kvadrattum) till 180,6 crnz (28 kvådrattum) eller mer, såsom 322,6 cmz (so kvadrauum), 645,2 cm2 (100 kvaçlranum) upp nu 32251: cm* (soo kvadrattum) eller mer. Föredragna porösa material är steriliserbara och till- räckligt starka för att motstå sönderdelning när materialen lyfts upp i syfte att överföra somatiska embryon efter utstrykning till efterföljande steg vid förfar- andet för produktion av somatiska embryon. Exempel på användbara porösa material inkluderar membraner, nylonfibrer, trådnätsväv (”woven mesh”) (t ex nylon, rostfritt stål eller plast) och polymerfibrer. Vid vissa utföringsformer är det porösa materialet ej absorberande. Vid vissa utföringsformer är det por- ösa materialet en trådnätsväv, såsom ett trådnät av rostfritt stål eller nylon.

Enligt en utföringsfonn av förfarandet enligt uppfinningen används ett poröst material, såsom en trådnätsväv, för utstrykning och uppbäring av växt- vävnad under utvecklingsfasen vid framställning av somatiska växtembryon.

De pre-hjärtbladsförsedda somatiska ernbryona fördelas initiait på ett plant poröst material som är horisontellt anbringat över en icke-porös yta. Den icke- porösa ytan kan vara vilken lämplig steril yta som helst, såsom ytan av ett fast eller halvfast tillväxtmedium, såsom en petriskål innehållande utvecklings- medium, eller vilken annan steril eller steriliserbar yta som helst som har för- måga att kvarhålla vätska, såsom en plast-, gummi- eller glasyta. \f|d vissa utföringsformer är den icke-porösa ytan ett halvfast utvecklingsmedium inne- slutet i en behållare, såsom en cambrobehàllare. Vid vissa utföringsformer är den icke-porösa ytan innesluten i ett bioreaktorkårl, varvid detta bioreaktorkärl är avtappningsbart.

Vid en utföringsform av förfarandet är det porösa materialet fäst på en utstrykningsstomme. Ett representativt exempel på en utstrykningsstomme 10 visas i Figur 1. Såsom framgår av Figur 1 inbegriper utstrykningsstommen 10 ett plant poröst material 20 fästtill en stödram 30 som omger det porösa materialet 20. Eventuella handtag 40A och 40B fästade till stödramen 30 10 15 20 25 30 53 'l 225 8 tillhandahålls också. Utstrykningsstornmen är företrädesvis tillverkad av ster- iliserbara material. Stödramen 30 kan tex vara tillverkad av ett metall- eller plastmaterial: Handtagen 40A och 40B kan vara tillverkade av vilket lämpligt steriliserbart material som helst, såsom tex en autoklaverbar slang. Ett exem- pel på ett förfarande för konstruktion av utstrykningsstommen 10 beskrivs i Exempel 2. Vid en utföringsform är stödramen 30 tillverkad av metall, och det porösa materialet är ett nylontrådnät som fästs till ramen före autoklavering och som krymper måttligt efter autoklavering för àstadkommande av en stram anslutning till ramen och en väsentligen jämn utstrykningsyta.

Med hjälp av förfarandena enligt föreliggande uppfinning fördelas ett flertal pre-hjärtbladsförsedda embryon ut på ett poröst material anbringat på en icke-porös yta i en volym av sterilt utspädningsmedium som är tillräcklig för nedsänkning av åtminstone ytan av det porösa materialet. De pre-hjärt- bladsförsedda embryona sprids därigenom enhetligt över den nedsänkta ytan av det porösa materialet. Vid vissa utföringsformer blandas eller skakas de fördelade embryona varsamt för underlättande av spridning av embryona i det sterila utspädningsmediet. Varsam skaknïing kan åstadkommas med hjälp av vilka lämpliga medel som helst, såsom via användning av ett instrument som kommer i kontakt med embryona eller via vibration av det porösa materialet och/eller det icke-porösa substratet. .

När vä|.de nedsänkta pre-hjärtbladsförsedda embryona är väsentligen enhetligt spridda över det porösa materialet, avlägsnas det sterila utspäd- ningsmediet från det porösa materialet. Vid en utföringsform avlägsnas det sterila utspädningsmediet från det porösa materialet genom vertikal upplyft- ning av det porösa materialet från det icke-porösa substratet, varigenom de enhetligt spridda pre-hjärtbladsförsedda embryona infångas på ytan av det porösa materialet. Det porösa materialet som är fäst till en utstryknings- stomme 10 inbegripande handtag 40A och 40B kan tex lyftas vertikalt med hjälp av handtagen genom användning av vilka lämpliga medel som helst, såsom manuellt eller med hjälp av robotanordningar.

Vid en alternativ utföringsform när väl de fördelade pre-hjärtbladsför- sedda embryona är väsentligen enhetligt spridda över det porösa materialet, avlägsnas det sterila utspädningsmediet genom reduktion av volymen av det 10 15 20 25 30 531 226 9 sterila utspädningsmediet till en nivå under ytan för det porösa materialet, var- igenom de enhetligt spridda pre-hjärtbladsförsedda embryona infångas på ytan av det porösa materialet. Volymen av sterilt utspädningsmedium kan reduceras genom användning av vilken metod som helst som undviker stör- ning av spridningen av de utstrukna cellema, såsom sugning, avtappning, avhällning eller läskning av det sterila utspädningsmediet.

De enhetligt spridda pre-hjärtbladsförsedda embryona som infångats på ytan av det porösa materialet bringas därefter i kontakt med utvecklings- mediet under en tidsperiod som är tillräcklig för framställning av hjärtbladsför- sedda somatiska barrträdsembyon.

Vid en utföringsform bringas det porösa materialet i antingen kontinuer- lig eller tillfällig kontakt med det flytande utvecklingsmediet. Det porösa mater- ialet kan t ex placeras på en absorbentdyna som är indränkt i utvecklings- medium pà så sätt att utvecklingsmediet passerar genom det porösa material- et och kommer i kontakt med embryona. Det porösa materialet, såsom ett nylontràdnät som uppbär embryoceller, är vanligtvis inneslutet i ett tillslutet ut- rymme innehållande en fuktig atmosfär som säkerställer att embryona förblir fuktiga. Vid en annan utföringsfonn är det porösa materialet anbringat på ett tillväxtsubstrat inbegripande fasta eller halvfasta utvecklingsmedier.

Utvecklingsmediet som skall användas vid förfarandena enligt föreligg- ande uppfinning innehåller näringsämnen som upprätthåller de somatiska embryona. Maltos och glukoskan vara inkluderade i utvecklingsmediet som huvudsaklig eller enda sockerkälla för desomatiska embryona. Användbara maltos- och glukoskoncentrationer ligger 'i området från ca 1% till ca 2,5%.

Lämpliga utvecklingsmedier inkluderar vanligtvis inte några tillväxtbefrämj- ande hormoner, såsom auxiner och cytokiner, men kan inkludera hormonet abscisinsyra. :När abscisinsyra används i utvecklingsmediet utnyttjas det vanligtvis i en: koncentration i området från ca 1 mg/I till ca 200 mg/I. Utveck- lingsmediet kan innehålla gellangummi, som vanligtvis föreligger i en koncen- tration av upp till ca 0,40%. Osmolaliteten för utvecklingsmediet kan justeras till ett värde som faller inom ett önskat område genom användning av osmos- reglerande ämnen, såsom PEG med en molekylvikt av 8000, såsom från ca 250 mM/kg till ca 450 mM/kg. Vanligtvis är en osmolalitet av 300-350 mM 10 15 20 25 30 53 'l 226 10 eller mer fördelaktigt. Ett exempel på ett lämpligt flytande eller fast utveck- lingsmedium visas i Exempel 1 och Exempel 2.

Pre-hjärtbladsförsedda somatiska barrtrådsembryon kan t ex odlas på ett poröst material, såsom ett nylontrådnåt eller -membran som står i åtmin- stone tillfällig ákontakt med utvecklingsmediet, under en period av från 4 veck- or till 14 veckor, såsom från 8 veckor till 12 veckor, eller såsom ca 12 veckor, vid en temperatur av från 10°C till 30°C, såsom från 15°C till 25°C, eller så- som från 20°.C till 23°C.

Vid en utföringsform odlas de pre-hjärtbladsförsedda somatiska barr- trädsembryona pà ett poröst material som ståri kontakt med ett flytande ut- vecklingsmedium som är anbringat på ett absorbentsubstrat, såsom ett sub- strat tillverkat av cellulosa (t ex cellulosafibrer), såsom ett eller flera filter- papper, eller något annat absorbentmaterial. Substratet absorberar det flyt- ande utvecklingsmediet, som passerar genom det på substratet anbringade porösa materialet och kommer i kontakt med de på det porösa materialet anbringade pre-hjärtbladsförsedda somatiska barrträdsembryona. Utveck- lingsmediet befrämjar utveckling av de pre-hjärtbladsförsedda somatiska barrträdsembryona för bildning av hjärtbladsförsedda somatiska embryon.

Vid en annan utföringsforrn odlas de pre-hjärtbladsförsedda somatiska barrträdsembryona på ett poröst materialsom står i kontakt med ett flytande utvecklingsmedium genom användning av ett spridningsmunstycke som be- sprutar det porösa materialet med utvecklingsmedium. De somatiska em- bryona är anbringade på en övre yta av det porösa materialet, och den mot- satta undre ytan av det porösa materialet besprutas med flytande utvecklings- medium. Som ett ytterligare exempel kan det porösa materialet som uppbär somatiska embryon anbringas över det flytande utvecklingsmediet i vilket finns en roterande omrörarstav som roterar tillräckligt snabbt för att spruta upp flytande utvecklingsmedium på den undre ytan av det porösa materialet. l en annan aspekt tillhandahålls med föreliggande uppfinning förfaran- den för framställning av hjärtbladsförsedda somatiska barrträdsembryon med utgångspunkt från somatiska barrträdsceller. Förfarandena enligt denna as- pekt av uppfinningen inkluderar steget av (a) odling av somatiska barrträds- celler i ett induktionsmedium för erhållande av embryogena celler, (b) odling 10 15 20 25 30 531 226 11 av de vid steg (a) framställda embryogena cellerna i ett flytande underhålls- medium för bildning av pre-hjärtbladsförsedda somaliska barrträdsembryon, (c) fördelning av ett flertal pre-hjärtbladsförsedda embryon som framställts vid steget (b) på ett poröst material anbringat över en icke-porös yta i en volym av sterilt utspädningsmedium som är tillräcklig för nedsänkning av åtminstone ytan av det porösa materialet, varigenom de pre-hjärtbladsförsedda embryo- na sprids enhetligt, (d) avlägsnande av det sterila utspädningsmediet från det porösa materialet, varigenom de enhetligt spridda pre-hjärtbladsförsedda embryona infångas på det porösa materialet, och (e) kontakt mellan de på det porösa materialet infångade pre-hjärtbladsförsedda embryona och utveck- lingsmediet under en tidsperiod som är tillräcklig för framställning av hjärt- bladsförsedda somatiska barrträdsembryon.

Vid vissa utföringsformer odlas således somatiska barrträdsceller i eller på ett induktionsmedium för erhållande av embryogena celler. Embryogena celler har förmåga att producera ett eller flera hjärtbladsförsedda somatiska barrträdsembryon. Exempel på embryogena celler är embryonala suspensor- massor (ESM). Y induktionsmediet inkluderar vanligtvis oorganiska salter och organiska näringsämnesmaterial. Osmolaliteten för induktionsmediet är vanligtvis ca 160 mM/kg eller t o m lägre, men kan vara så hög som 170 mM/kg. induk- tionsmediet inkluderar vanligtvis tillväxthorrnoner. Exempel på hormoner som kan inkluderas i induktionsmediet är auxiner (t ex 2,4-diklorfenoxiättiksyra (2,4-D)) och cytokininer (t ex 6-bensylaminopurin (BAP)). Auxiner kan tex användas i en koncentration från 1 mg/I till 200 mgll. Cytokininer kan tex an- vändas i en koncentration från 0,1 mg/l till 10 mgll. induktionsmediet kan innehålla en adsorbentkomposition, särskilt när mycket höga halter av tillväxthorrnoner används. Adsorbentkompositionen kan vara vilken komposition som helst som inte är toxisk för de embryogena cellerna vid de koncentrationer som utnyttjas vid utövandet av de aktuella för- farandena och som har förmåga att adsorbera tillväxtbefrämjande hormoner och toxiska föreningar som produceras av växtoellerna under embryoutveck- ling, vilka är närvarande i mediet. Ej begränsande exempel på användbara adsorbentkompositioner inkluderar aktivt kol, lösligt poly(vinylpyrrolidon), “ 10 15 20 25 30 531 226 12 olösligt poly(vinylpyrrolidon), aktiverad aluminiumoxid och silikagel. Adsor- bentkompositionen kan föreligga i en mängd av t ex från ca 0,1 g/l till ca 5 gll. lnduktionsmediet är vanligtvis fast och kan solidifieras genom inklusion av ett gelningsmedel. Ett exempel på ett induktionsmedium som är användbart vid utövandet av föreliggande uppfinning beskrivs i Exempel 1.

Somatiska barrträdsceller odlas vanligtvis i eller på ett induktions- medium under en period av från 3 veckor till 12 veckor, såsom från 8 veckor till 10 veckor, eller ca 8 veckor, vid en temperatur av från 10°C till 30°C, så- som från 15°C till 25°C, eller såsom från 20°C till 23°C.

Underhållsmedlet kan vara ett fast medium, eller kan det vara ett flyt- ande medium som kan omröras för befrämjande av tillväxt och förökning av den embryogena vävnaden. Osmolaliteten för underhållsmediet är vanligtvis högre än osmolaliteten för induktionsmediet och ligger vanligtvis i området 180-400 mM/kg. Underhållsmediet kan innehålla näringsämnen som upprätt- håller den embryogena vävnaden och kan inkludera hormoner, såsom en eller flera auxiner och/eller cytokininer, som befrämjar celldelning och tillväxt av embrogen vävnad. Koncentrationen av homioner i underhållsmediet är vanligtvis lägre än koncentrationen däravi lnduktionsmediet.

Det är i allmänhet önskvärt, dock ej nödvändigt, att inkludera maltos som enda eller huvudsaklig metaboliserbar sockerkälla i underhållsmediet.

Exempel på användbara maltoskoncentrationer ligger inom området från ca 1% till ca 2,5%. Ett exempel på ett lämpligt underhållsmedium beskrivs i Exempel 1 nedan. j Embryogena barrträdsceller odlas 'vanligtvis i eller på ett underhålls- medium under en tidsperiod av upp till 6 månader genom subodling varje vecka vid en temperatur från 10°C till 30°C, såsom från 15°C till 25°C, eller såsom från 20°C till 23°C.

Embryogena barrträdsceller överförs vanligtvis till färskt underhålls- medium en gång per vecka eller när tillväxten förbrukat mediumkomponent- erna.

Användbara utvecklingsmedier beskrivs ovan. Efter odling vid kontinu- erlig eller periodvis kontakt med utvecklingsmedium, kan de somatiska hjärt- 10 15 20 25 30 531 226 13 bladsförsedda embryona eventuellt överföras till ett mognadsmedium och därefter till ett stratifieringsmedium under en ytterligare odllngsperiod.

Förfarandena enligt föreliggande uppfinning kan tex användas för produktion av' kloner av individuella barrträd med en eller flera önskvärda egenskaper, såsom hög tillväxthastighet. I en aspekt tillhandahålls med före- liggande uppfinning således förfaranden för framställning av en population av genetiskt identiska hjärtbladsförsedda somatiska barrträdsembryon. Förfaran- dena enligt denna aspekt av uppfinningen inkluderar vart och ett steget av odling av genetiskt identiska pre-hjärtbladsförsedda somatiska barrträds- embryon på ett poröst material (t ex ett poröst nylontrâdnät) som står i kon- tinuerlig eller periodvis kontakt med ett utvecklingsmedium under en tids- period som är tillräcklig för produktion av genetiskt identiska hjärtbladsför- sedda somatiska barrträdsembryon med utgångspunkt från pre-hjärtb|ads- försedda somatiska embryon, varvid utvecklingsmediet passerar genom det porösa materialet och kommer i kontakt med de somatiska embryona.

De hjärtbladsförsedda somatiska barrträdsembryona som framställts genom användning av förfarandena enligt föreliggande uppfinning kan even- tuellt underkastas groning för bildning av barrträdsplantor, som kan odlas till barrträd, om så är önskvärt. De hjärtblladsförsedda embryona kan också placeras i artificiella frön för efterföljande groning. De hjärtbladsförsedda somatiska barrträdsembryona kan t ex underkastas groning på ett fast gro- ningsmedium, såsom det i Exempel 2 nedan beskrivna groningsmediet. De grodda plantorna kan överföras till jord för ytterligare tillväxt. De grodda plantorna kant ex planteras i jord i ett växthus och tillåtas växa innan de förflyttas till ett ställe utomhus. De hjärtbladsförsedda somatiska embryona belyses vanligtvis för stimulering av groningen. Vanligtvis utförs samtliga av stegen vid förfarandena enligt föreliggande uppfinning i mörker, bortsett från groning. i Vid förfarandena enligt föreliggande uppfinning erhålls ett högre utbyte av somatiska barrträdsembryon per utstrykningsytarea jämfört med en ekvi- valent metod vid vilken de embryogena cellerna stryks ut med en högre den- sitet och/eller i närvaro av överskottsvätska, såsom beskrivs ytterligare i Exempel 2 och 3 nedan. 10 15 20 531 226 14 Förfarandena enligt föreliggande uppfinning kan t ex användas för framställning av kloner av individuella barrträd som har en eller flera önskade egenskaper, såsom hög tillväxthastighet. De här beskrivna förfarandena kan användas för framställning av populationer av genetiskt identiska mogna somatiska barrträdsembryon.

Följande exempel endast belyser det för närvarande bästa sättet att utöva uppfinningen och bör inte tolkas som begränsande för uppfinningen.

Exemgel 1 I detta exempel visas ett representativt förfarande enligt uppfinningen för framställning av somatiska tallembryon från sydstatsgultall (Ioblollytall).

Hongametofyter innehållande zygotiska embryon avlägsnas från frön fyra till fem veckor efter befruktning. Fröhöljena avlägsnas, men embryona dissekeras inte ut ytterligare från den omgivande gametofyten mer än att den nucellära änden skärs ut. Kottama ("cones”) förvarades vid 4°C fram till an- vändning. Omedelbart före avlägsnande av de omogna embryona, steriliseras fröerna genom användning av en initial tvättnings- och detergensbehandling, följt av sterilisering under 10 min i 15% H2O2. Explantaten tvättades utförligt med sterilt destillerat vatten efter varje behandling. l Tabell 1 och 2 beskrivs exempel på sammansättningar av medier som är användbara för framställning av somatiska tallembryon. 531 225 15 Tabell 1 Basmedium för Pinus taeda Beståndsdel Koncentration N 1 0 909 9 136 1 236 50 0 246 5 256 5 50 0 4 15 15 5 10 5 14 4 0 125 0 125 0125 27 86 37 36 30 000 200 500 L min 1000 Tiamin-HCI 1 00 n-HCI 0 50 N 0 50 00 Gelrite* 1600 5 7 * Används om ett fast medium är önskvärt. 531 226 16 Tabell 2 Sammansättning av medier för olika behandlingssteg BM1-- induktionsmedium BM+2,4-D (15 uM)+kinetin (2 uM)+BAP (2 pM).

BM-g - underhållsmedium BM+2,4-D (5 pM)+kinetin (0,5 pM)+BAP (0,5 uM).

GELRITE (1600 mg/l) tillsätts när ett fast medium är önskvärt Utspädningsmedium BM + 10 mg/ml abscisinsyra + 100-1000 mg/mi ytterligare myoinositol, + 2,5% maltos. Följande aminosyrablandning tillsätts: L-prolin (100 mgll), L- asparagin (100 mgll), L-arginin (50 mg/I), L-alanin (20 mg/I) och L-serin (20 mg/l). Företrädesvis finns inga underhâllshormoner närvarande.

BM3 - utvecklingsmedium BM+25 mg/l abscisinsyra + 12% PEG-8000 + 800 mg/I ytterligare myoinositol + 0,1% aktiverad träkol + 1% glukos + 2,5% maltos. Följande amino- syrablandning tillsätts: L-prolin (100 mgll), L- asparagin (100 mgll), L-arginin (50 mg/I), L-alanin (20 mg/I) och L-serin (20 mg/l). GELRITE (2500 mgjl) tillsätts när ett fast medium är önskvärt BM5 - stratifieringsmedium BM3 modifierat genom uteslutning av abscisinsyra, och PEG-8000. GELRITE (2500 mg/l) tillsätts när ett fast medium är önskvärt.

BMG - groningsmedium BM modifierat genom ersättning av maltos med 2% sackaros. Myoinositol reduceras till 100,0 mgll, och glutamin och kasaminosyror reduceras till 0,0 mg/l. FeSO4'7H2O reduceras till 13,9 mg/I och NagEDTA reduceras till 18,6 mgll, Agar i en - halt av 0,8% och aktiverat träkol i en halt av 0,25% tillsätts.

Induktion: sterila gametofyter med intakta embryon placeras på ett fast BM1-odlingsmedium och förvaras i en miljö av 22-25°C under en mörk foto- period av 24 h under en tidsperiod av 3-5 veckor. Tidslängden beror på den särskilda genotyp som odlas. Vid slutet av denna tidsperiod bildas en slem- artad massa associerad med ursprungsexplantaten. Mikroskopisk undersök- ning avslöjar vanligtvis åtskilliga embryon i ett tidigt skede associerade med massan. Dessa karaktäriseras i allmänhet som att ha en lång tunnväggig sus- pensor associerad med ett litet huvud med tät cytoplasma och stora kämor. 10 15 20 25 30 35 531 225 17- Osmolaliteten för induktionsmediet kan i vissa fall vara så hög som 150 mM/kg. Vanligtvis är den ca 120 mM/kg eller t o m lägre (såsom 110 mM/kg).

Upprätthållande och förökning av pre-hjärtbladsförsedda embryon: Embryon i ett tidigt skede som avlägsnats från massorna som bildats vid in- duktionssteget placeras först på ett gelat BM-g-underhålls- och -föröknings- medium. Detta skiljer sig från induktionsmediet i det att tillväxthorrnonerna (både auxiner och cytokininer) är reducerade med åtminstone en fullständig storleksordning. Osmolaliteten för detta medium är 130 mM/kg eller högre (vanligtvis inom omrâdet ca 120-150 mM/kg för Pinus taeda). Temperaturen är även här 22-25°C i mörker. Embryon odlas under 12-14 dagar på det fasta BMZ-mediet före överföring till ett vätskeforrnigt medium för ytterligare sub- odling. Detta vätskeformiga medium har samma sammansättning som BM2, men saknar gelningsmedlet. Embryona hari slutet av underhållssteget på fast medium vanligtvis liknande utseende som de från induktionssteget. Efter sub- odlingar under 5-6 veckor på det vätskeformiga underhållsmediet har långt framskridna embryon i det tidiga skedet bildats. Dessa karaktäriseras av jäm- na embryonala huvuden, som uppskattas att vanligtvis ha mer än 100 indivi- duella celler med multipla suspensorer.

Embryoutveckling: Embryoutvecklingen utförs genom användning av systemet som visas nedan i Exempel 2 och 3.

Den osmotiska potentialen för detta utvecklingsmedium kan ökas väs- entligen jämfört med den för underhållsmediet. Det har visat sig vara fördel- aktigt att ha en så hög osmolalitet som 350 mM/kg eller t o m högre. Utveck- lingen utförs företrädesvis i fullständigt mörker vid en temperatur av 22-25°C tills hjärtbladsförsedda embryon har utvecklats. Utvecklingstiden är vanligtvis flera veckor, såsom 7-12 veckor.

Stratifiering: Hjärtbladsförsedda embryon singulariseras och överförs till stratifieringsmediet BM5. Detta medium är likartat utvecklingsmediet, men saknar abscisinsyra, PEG-8000 och gellangummi. Embryon odlas på strati- fieringsmediet vid mellan ca 1°C och ca 10°C i mörker under mellan 3 och 6 veckor.

Konditionering över vatten: Demogna embryona som fortfarande be- finner sig på den porösa bäraren lyfts bort från tillväxtsubstratet och placeras i en sluten behållare över H20 vid en relativ fuktighet av 97% under en period av ca 3 veckor.

Groning: De konditionerade mogna embryona placerades på fast BMB- medium för groning. Detta är ett basmedlum som saknar tillväxthorrnoner och 10 15 20 25 30 531 226 18» som har modifierats genom reduktion av sackaros, myoinositol och organiskt kväve. Embryona inkuberas på BMG-medium under en tillräcklig tid vid omgiv- ande betingelser av 23-25°C tills de resulterande småplantoma har ett väl utvecklat rotämne och en dito hypokotyl samt grön hjärtbladsstruktur och epikotyl. 4 _ » På grund av den reducerade kolhydratkoncentrationen är den osmot- iska potentialen för groningsmediet ytterligare reducerad till under den för ut- vecklingsmediet. Den är vanligtvis lägre än ca 150 mM/kg (såsom ca 100 mM/kg).

Exemgel 2 'i I detta exempel beskrivs konstruktionen av ett exempel på en utstryk- ningsstomme och användning enligt en utföringsforrn av förfarandet enligt föreliggande uppfinning.

Konstruktion av en utstrykningsstomme: En utstrykningsmetallstomme konstruerades, till vilken ett nylontrådnät av 100 um fästes med hjälp av sili- kon. Utstrykningsstommen (10) visas i Figur 1. Vid utföringsfonnen av utstryk- ningsstommen (10) som visas i Figur 1 är nylontrådnätet (20) rektanguiärt till formen och har en längd av 17,8 cm (7 tum) och en bredd av 10,2 cm (4 tum), varvid den exponerade ytarean är 180,6 cmz (28 kvadrattum). Handtag av slang (40A och 40B) fästes till metallramen (30) för underlättande av förflytt- ning av utstrykningsstommen (10). En silikonsträng tillfördes längs kanten av ramen och över mitten av ramen för åstadkommande av tvâ åtskilda utstryk- ningsytor med likvärdig storlek (ej visat). Utstrykningsstommen (10) autoklav- erades därefter, vilket resulterade i en stram utstrykningsyta p g a krympning av nylontrådnätet (20) på metallramen (30) under autoklaveringen.

Utstrykning av celler på utstrykningsstommen: Beredning av SCV för utstrykning: Somatiska barrträdsembryoceller av genotyp A sorn odlats i proliferationsmedium (framställt såsom beskrivs i Tabell 4) i Erlemeyerkolvar av 1 I fick sedimentera. Volymen av sedimentera- de celler (SC\_/) mättes genom dragning av en linje på kolven, och superna- tanten ovanför de sedimenterade oellemá avlägsnades med hjälp av en stav av sintrat glas under aspiration. De sedirnenterade cellerna återsuspendera- des i en komplementerande mängd av 3 SCV av sterilt utspädningsmedium, som framställts såsom beskrivs i Exempel 1. 10 15 20 25 531 225 19 Bestämning av våtvikten av SCV: I syfte att bestämma våtvikten av SCV, mättes SCV såsom beskrivits ovan. Supematanten avlägsnades där- efter genom användning av en Buchner-tratt (33,0 mm (13 tum) Hg), och 1 ml av SCV-provet placerades på ett i förväg vägt och befuktat filterpapper av kvaliteten VW'R_417. Viktmätningar utfördes vid en fixerad tidpunkt (30 sek) på en fyrpunktsvåg. Våtviktsmätningar av fyra representativa genotyper per ml SCV visas nedan i Tabell 3.

Tabell 3 Genotyp Våtvikt mg/ml SCV A 92 mg/ml B 102 mg/ml C 102 mg/ml D 118 mg/ml Av resultaten i Tabell 3 framgår» det att .den genomsnittliga våtvikten för de fyra testade genotyperna var 103,5 mglml SCV. Därför är den genomsnitt- liga våtvikten för 1 ml SCV för de fyra testade genotyperna ca 0,1 g/ml SCV.

En utstrykningsstomme (10) som framställts såsom beskrivits ovan till- handahölls och placerades på ytan av ett halvfast utvecklingsmedium (fram- ställt såsom beskrivs i Tabell 5). Volymen av de sköljda sedimenterade cell- ema mättes därefter och ströks ut på den första halvan av utstryknings- stommen med en densitet av 3 ml SCV (0,3 gI90,3 cmz (14 kvadrattum) = 0,02 g/6,5 cmz (kvadrattum)) och på den andra halvan av utstryknings- stommen med en densitet av 12 ml SCVV(1,2 g/90,3 cmz (14 kvadrattum) = 0,08 g/6,5 cmz (kvadrattum)), vardera i en total volym av 9 respektive 36 ml.

Utstrykning av cellerna utfördes över utstrykningsstommen, som var placerad på ytan av ett halvfast utvecklingsmedium inneslutet i en behållare.

Detta möjliggjorde att celler och medier spriddes ut jämnt över nylonnätverket i syfte att minimera variation av oelldensitet och initialt celldjup. När väl de ut- strukna cellema varjämnt spridda över det neclsänkta nylontrådnätet, lyftes utstrykningsstommen (10) upp vertikalt från det halvfasta utvecklingsmediet, varigenom de_ jämnt spridda embryona infångades och möjliggjorde att över- skottsmedium spreds medan det fanns kvari den första behållaren. Utstryk- ningsstommen innehållande de jämnt spridda embryona placerades därefter 531 226 20 på ytan av ett-»halvfast utvecklingsmedium med samma formulering som det första i en ny behållare. De utstrukna cellema på utstrykningsstommen fick därefter växaunder 12 veckor och övervakades med avseende pá total bio- massa, embryosuspensomiassa och embryostrukturbildning, såsom visas nedan i Tabell 6.

Tabell 4 Proliferation/Underhállsmedium (sydstatsgultall) Beståndsdel , Koncentration (mg/l) NH4NO3 150,0 KNOg 909,9 KH2PO4 136,1 Ca(NO3)2'4H2O 236,2 C8C|2'2H2Û 5Ü,0 _|yl_gSO4'7H20 246,5 M_Q(NÛ3)2'ÖHQO 256,5 _M_QC|2'ÖH2O 50,Û Kl i 4,15 H3BO3 15,5 MnS04'H-20 10,5 ZnSOfl H20 14,4 Na2MoO4'2 H20 0,125 CuSO4'5H20 i 0,125 i CoClíöHzO 0,125 Fesoniizo 27,86 i Na2EDTA'2H2O 37,36 Maltos 30 000 i Myoinositol 200 Kasaminosyror 500 _L-_g|utamin 1000 Tiamin-HCI 1,00 Pyridoxin-HCl 0,50 Nikotinsyra 0,50 Glycin 2,00 *Ge|rite* . 1600* 2,4 D (10 mg/ml) 1,1 mg/l 6-BAP (10 mg/ml) 0,1 mg/l 531 226 21 l Kinetin (10 mg/ml) 0,1 mg/I *ABA (2 mg/ml) ' 1,0 mg/I -ß pH justerat till 5,7 * = eventuellt Tabell 5 , m I Beståndsdel Konceritration N ' 150 0 909 9 136 0 236 15 50 0 246 5 256 5 50 0 4 15 15 5 10 5 14 4 0 125 0 125 0 125 27 86 37 36 25 000 10 000 100-1000 500 L 1000 Tiamin-HCI 1 00 oxin-HCl 0 50 N 0 50 2 00 Prolin 100 L min so 1 L ' 100 10 531 226 22 L-alanin 20 L-serin 20 i PEG 100 000 Träkol 1000 Gelrite* 2500 ABA (2 mg/ml) 25,0 mg/l pH justerat till 5,7 Resultat: Kulturerna som strukits ut med olika densiteter på utstryknings- stommen undersöktes efter 12 veckor i odling med avseende på total bio- massa, embryosuspensormassa (ESM) och embryostrukturbildning. Uttrycket selekterade embryon avser närvaro av minst 4 hjärtblad och inga fiälldefor- mationer. Resultaten visas i Tabell 6.

Tabell 6 Utstryknings- Slutlig våt Total torr Torr ESM Torrt Antal densitet biomassa biomassa (mg) embryo selekterade (9) (m9) (m9) embryon Låg densitet 17,0 g 1277,6 mg 235 mg 291,8 mg 720 totalt (halva totalt totalt totalt totalt stommen) _ (5,67 g/ml (425,87 (78,33 (97,27 (240 per ml 3 ml SCV SCV mg/ml SCV mg/ml SCV mg/ml SCV SCV utstruket utstruket) utstruket) utstruket) utstruket) utstruket) Hög densitet 14,0 g 1302,4 mg 138,7 mg 312,0 mg 771 total + (halva _ totalt totalt totalt totalt (64,25 per stommen) g (1 ,17 g/ml (108,53 (11,56 (26,0 ml SCV 12 ml SCV SCV mg/ml SCV mg/ml SCV mg/ml SCV utstruket) utstruket utstruket) utstruket) utstruket) utstruket) Såsom visas i Tabell 6 ovan, när embryona ströks ut med en lägre densitet (t ex 3 ml SCV/90,3 cmz (14 :kvadrattum) (ca 0,3 g/90,3 cmz (14 kvadrattum) = 0,02 g/6,5 cm* (kvadrattum))), gav den efterföljande prolifera- tionen av embryosuspensorrnassorna lika mycket total biomassa som celler- na som strukits ut med en högre densitet av 12 ml SCV/90,3 cmz (14 kvadrat- tum) (ca 1,2 g/90,3 cmz (14 kvadrattum) = 0,08 g/6,5 cmz (kvadrattum)). Så- som visas ytterligare i Tabell 6, var totalmängden producerade embryon på 10 15 20 25 30 531 226 23 areabasis nästan likartad mellan lågdensitets- och högdensitetsförsöken.

Detta möjliggjordes pga den starkt ökade tillväxten av embryosuspensor- massa (ESM), såsom visas genom skillnaden i torrvikt, tex 235 mg torr ESM från lågdensitetsförsöket kontra endast 138,7 mg torr ESM från högdensitets» försöket pà utstrykningsstommen. Antalet selekterade embryon (slutprodukt- en av intresse) per ml utstruken SCV vandärför klart bättre vid lågdensitets- utstrykningsförsöket (240 embryon/ml SCV) jämfört med högdensitetsutstryk- ningsförsöket, (64,25 embryon/ml SCV).

Exempel 3 I I detta exempel beskrivs en jämförelse mellan embryoutbyten vid an- vändning av en standardmässig utstrykningsmetod med pipettdroppning och utstrykningsmetoden för spridning genom sammanflytning i vätska enligt en utföringsform av föreliggande uppfinning genom användning av fyra olika typer av sydstatsgultall.

Förfaranden: Ett försök utfördes för direkt jämförelse av metoderna för utstrykning av celler på utstrykningsstommar (10) genom användning av samma mängd av biomassa för fyra olika genotyper av sydstatsgultall, dvs A, B, E och F, men med variation av utstrykningsdensiteten för utstruken SCV.

Utbytet av embryon och groningsgraden mättes.

Embryonala somatiska (ESM) celler från genotyperna A, B, E och F odlades i proliferationsmedium (framställt såsom beskrivs i Exempel 2) i Erlenmeyerkolvar av 1 l. ESM-cellerna fick sedimentera, och den sedimen- terade cellvolymen (SCV) mättes såsom beskrivs i Exempel 2.

Som en kontroll som representerar den standardmässiga dropputstryk- ningsmetoden ströks för varje genotyp 6 ml SCV direkt ut som 12 droppar (0,5 ml SCV vardera) på hela utstrykningsstommen (en total area av 17,8 x 10,2 cm (7 x 4 rum) = 11,1 om* (za kvaarauum» placerad på eu haivfasi ur- vecklingsmedium i en grund utstrykningsbehållare. I detta exempel användes en cambrobehâllare (Cambro Manufacturing Co., Huntington Beach, CA) som är försedd med två utstrykningsstommar (10). För test av utstrykningsmetod- en för spridning sköljdes en andra alikvot av 6 ml SCV från varje genotyp med 3 x (18 ml) av utvecklingsmediet. 24 ml SCV samt sköljmedium ströks där- efter ut på hela utstrykningsstommen (71,1 om: (28 kvadrattum)), som var 10 15 20 25 30 531 225 24 anbringad över ett första halvfast utvecklingsmedium i en cambrobehållare på så sätt att E$M-cel|erna flöt i mediet och spreds enhetligt över den nedsänkta ytan av utstrykningsstommen. Den enhetliga spridningen underlättades genom varsam skakning av utstrykningsstommen. Utstrykningsstommarna lyftes därefter vertikalt upp fràn det första halvfasta mediet i cambrobehållar- en genom användning av de anslutna handtagen under samtidigt upprätthåll- ande av utstrykningsytan i horisontell orientering, varigenom de enhetligt spridda ESM-cellerna infàngades under samtidigt flöde av mediet genom det porösa trådnätet.

Utstrykningsstommama innehållande utstrukna celler förflyttades där- efter till en ny cambrobehâllare innehållande ett halvfast utvecklingsmedium (såsom beskrivs i Exempel 2) och tilläts utvecklas under 12 veckor. I slutet av 12-veckorsperioden underkastades embryona sena utvecklingsbehandlingar för induktion av groning och räknades, och ett prov underkastades groning.

En normal grodd registrerades som närvaro av 1 mm vit rot, närvaro av ca 5 epikotylblad med en längd av ca 5 mm, inga stora fiällhypokotylrupturer och en hypokotyl utan någon böjning av merxän 90 grader.

Totalutbytet av utvecklade embryon räknades efter utvecklingsperiod- en av 12 veckor. Resultaten visas nedan i Tabell 7. Fotografier togs vid slutet av utvecklingsperioden, såsom visasi Figur 2. Figurerna 2A-D visar kontroll- erna för genotyperna A, E, F respektive B. Figurema 2E-H visar resultatet av utstrykningsmetoden för spridning genom sammanflytning i vätska för geno- typerna A, E. F respektive B.

I slutet av de tolv veckoma stratifierades embryona genom användning av stratifieringsmediet BM5 (beskrivet i Exempel 1) under 4 veckor. Efter stra- tifiering under4 veckor separerades embryona genom besprutning och kondi- tionerades över vatten under 10 dagar. j För varje genotyp selekterades 25 embryon för bedömning av groning.

Embryona selekterades för groning med basis på närvaron av minst 4 hjärt- blad och frånvaro av stora deformationer eller kluvna hypokotyler.

Resultat: i 10 15 20 '25 531 226 25 Tabell 7 Genotyp Droppningsmetoden, Spridningsmetoden, Mångfald av ökning av embryoutbyte per embryoutbyte per embryoutbyte genom behållare behållare användning av (% groning) (% grgiing) spridniggsmetoden A n 2241 (52%) 5416 (49%) 2,4 E 2267 (15%) 3187 (27%) 1,4 F 1803 (8%) 2545 (3%) 1,4 B 2356 (10%) 3188 (19%) 1,3 Såsom visas ovan i Tabell 7 uppvisade samtliga fyra testade genotyper minst en 1,3-fa|dig eller större ökning av embryoutbyte vid användning av spridningsmetoden med sammanflytning vid låg densitet jämfört med den tra- ditionella utstrykningsmetoden med pipettdroppning. Resultaten av gronings- studierna uppvisade ingen statistiskt signifikant skillnad mellan framgångsrik groning av prover som strukits ut genom användning av droppningsmetoden i förhållande till spridningsmetoden.

När resultaten för de fyra genotyperna som visas i Tabell 7 kombiner- as, är det totala genomsnittliga kontrollvärdet för producerade embryon 1266,? vid användning av droppningsmetoden jämfört med ett totalt medel- värde av 3692 embryon som producerats genom användning av förfarandet för spridning genom sammanflytning i vätska, vilket är ett 1,7-faldigt högre embryoutbyte med ett p-värde av 0,0708. Detta är en mycket signifikant för- bättring av embryoutbyten, vilket möjliggör att en genotyp kan strykas ut i en enda cambroenhet för uppnående av det genomsnittliga' målutbytet för gro- ning och reducerar antalet erforderliga enheter för hantering av en enda klon ner till endast en, till skillnad från de åtminstone 30 separata enheter (petriskàlar) som krävs vid användning av den traditionella utstryknings- metoden med pipettdroppning.

De kombinerade resultaten som registrerats för de fyra testade geno- typerna tillhandahålls nedan i Tabell 10 15 531 228 26 Tabell 8 Parameter Kontroll: Utstrykning genom p-värde utstrykning genom spridning (6 ml SCV droppning (6 ml utspädd i 18 ml) SCV i droppar av 0,5 ml x 12) Totalt embryoutbyte per 2167 3692 0,0708 behållare Genomsnittligt embryo- 180,6 307,6 utbyte per ml SCV Groningav kateggfi 1 17,2 20,9 0,4261 Groddar per ml SCV 40 88,9 0,1768 Genomsnittlig rotlängd 32,1 23,7 0,1481 mm) De ovan visade värdena i Tabell 8 indikerar en statistiskt signifikant (ett p-tröskelvärde av 0,10) 70% ökning av embryoutbytet utan någon uppenbar förlust i groningsgrad, även om det finns en viss indikation på skillnad i rot- längd. Utan att binda sig till någon teori, kan den observerade skillnaden i' rot- storlek bero på näringsmässiga faktorer förknippade med den större tillväxt- ' en. De näringsmässiga faktorema kan påverkas genom antingen förflyttning av de utstrukna embryona till ett färskt tillväxtsubstrat efter en viss tidsperiod eller genom justering av mediumkompositionen till en högre koncentration och/eller modifiering av utstrykningsdensiteten för särskilda cellinjer med basis på deras tillväxthastighet. i Såsom visas i Tabell 8 resulterade utstrykningsmetoden med hjälp av. spridning enligt föreliggande uppfinning i 120% utbyte av groddar jämfört med utstrykningsmetoden med droppning, vilket tyder på en mycket stor förbättring vad gäller odlingsproduktivitet jämfört med både embryobildning och -groning med basis på per behållarenhet och ytarea. Denna observerade förbättring i embryoutbyte möjliggör uppskalning utan någon begränsning av storleken av utstrykningsytan jämfört med den tidigare droppningsmetoden med odling i petriskålar. Sådan uppskalning ökar mängden bildade embryon per utstryk- 10 15 20 25 30 531 225 27 ningsenhet och reducerar enhetskostnaden genom reduktion av den erforder- liga omfattningen av hantering. Även om detta exempel beskriver användning av cambrobehållare som utstrykningsbehållare, kan utstrykningsbehållaren för utvecklingssteget efter utstrykning vara vilken lämplig utstrykningsyta som helst, såsom vilken behåll- artyp som helst, tex kommersiellt tillgängliga livsmedelsberedningsbehållare som är värrnestabila och har ett fungerande lock.

Förfarandet för spridning genom sammanflytning i vätska har också med framgång utförts genom användning av en utstrykningsstomme anbring- ad över ett flertal icke-porösa sterila ytor förutom halvfasta medier, såsom ett sterilt plastlock eller ett silikonark eller en gummimatta placerad i ett kärl med förmåga att bevara vätska, följt av kontakt mellan de utstrukna embryona och utvecklingsmedium.

Förfarandet för spridning genom sammanflytning i vätska har med framgång också använts genom först utstrykning av en mängd av sterilt ut- spädningsmedium som är tillräcklig för nedsänkning av en utstrykningsyta inbegripande ett poröst material anbringat över ett fast (icke-poröst) substrat.

Den önskade SCV sätts därefter till utspädningsmediet och blandas varsamt med en pipett. De flytande oellema sprids därefter med eventuell hjälp av en plpett och/eller varsam skakning av den .första utstrykningsytan. Utstryknings- stommen tas därefter upp och placeras över ett andra tlllväxtsubstrat inbe- gripande utvecklingsmedium och inkuberas såsom beskrivits ovan.

Slutligen har förfarandet för spridning genom sammanflytning också med framgång använts för åstadkommande av embryon från olika genotyper av sydstatsgultall genom användning av alikvoter av från 1 ml upp till 12 ml SCV utstrukna på en hel utstrykningsstomme (17,8 x 10,2 cm (7 x 4 tum)) placerad på ett halvfast utvecklingsmedium. . Även om den föredragna utföringsformen av uppfinningen har belysts och beskrivits, inses det att olika förändringar kan göras därav utan att man frångår innebörden av skyddsomfånget för föreliggande uppfinning.

Claims (13)

10 15 20 25 30 531 226 28 PATENTKRAV

1. Förfarande för framställning av hiärtbladsförsedda somatiska barr- trädsembryon, varvid förfarandet inbegriper: a) fördelning genom utstrykning med sammanflytning vid låg densitet av ett flertal pre-hjärtbladsförsedda embryon på ett poröst material hori- sontellt anbringat över en icke-porös yta i en volym av sterilt utspäd- ningsmedium som är tillräcklig för nedsänkning av åtminstone ytan av det porösa materialet, varigenom de pre-hjärtbladsförsedda embryona sprids enhetligt, b) avlägsnande av det sterila utspädningsmedlet från det porösa material- et, varigenom de enhetligt spridda pre-hjärtbladsförsedda embryona infångas på det porösa materialet, och c) kontakt mellan de pre-hjärtbladsförsedda embryona som infångats på det porösa materialet och ett utvecklingsmedium under en tidsperiod som är tillräcklig för framställning av hjärtbladsförsedda somatiska barrträdsembryon. _

2. Förfarande enligt kravet 1, varvid mångfalden av pre-hjärtbladsför- sedda embryon fördelas i det sterila utspädningsmediet enligt steget (a) med en densitet av mindre än 0,1 g cellvåtvikt per 6,5 cmz (kvadrattum) av poröst material.

3. Förfarande enligt kravet 1, varvid mångfalden av pre-hjärtbladsför- seddaembryon fördelas i det sterila utspadningsmediet enligt steget (a) med en densitet av mindre än 0,05 g cellvâtvikt per 6,5 cmz (kvadrattum) av poröst material. v

4. Förfarande enligt kravet 1, varvid mångfalden av pre-hjärtbladsför- sedda embryon fördelas i det sterila utspädningsmediet enligt steget (a) med en densitet av från 0,1 g till 0,001 g oellvàtvikt per 6,5 cmz (kvadrattum) av poröst material. g

5. Förfarande enligt kravet 1, varvid det porösa materialet inbegriper porer med en genomsnittlig pordiameter i området från 5 pm till 1200 pm.

6. Förfarande enligt kravet 1, varvid det porösa materialet är icke- absorberande. 10 15 20 25 30 531 225 29

7. Förfarande enligt kravet 5, varvid det porösa materialet är en tråd- nätsväv.

8. Förfarande enligt kravet 1, varvid det porösa materialet är fäst till en stödram inbegripande handtag. i

9. Förfarande enligt kravet 8, varvid det sterila utspädningsmediet avlägsnas från det porösa materialet enligt steget (b) genom vertikal upplyft- ning av stödramen från det icke-porösa substratet.

10. Förfarande enligt kravet 1, varvid det sterila utspädningsmediet avlägsnas från det porösa materialet enligt steget (b) genom reduktion av det sterila utspädningsmediet till en nivå som ligger under ytan för det porösa materialet.

11. . Förfarande enligt kravet 1, varvid utvecklingsmediet enligt steget (c) är ett vätskeformigt medium.

12. Förfarande enligt kravet 1, varvid utvecklingsmediet enligt steget (c) är ett fast medium.

13. Förfarande för framställning av hjärtbladsförsedda somatiska barr- trädsembryon, varvid det inbegriper; (a) odling av somatiska barrträdsoellerli ett induktionsmedium för erhåll- ande av embryogena oeller; (b) odling av de vid steg (a) framställda embryogena cellerna i ett flytande underhållsmedium för framställning av pre-hjärtbladsförsedda somat- iska barrträdsembryon; i E (c) fördelning genom utstrykning med sammanflytning vid låg densitet av ett flertal av de vid steg (b) framställda pre-hjärtbladsförsedda embryo- na på ett poröst material som är horisontellt anbringat över en icke- porös yta i en volym av sterilt utspädningsmedium som är tillräcklig för nedsänkning av åtminstone ytan av det porösa materialet, varigenom de pre-hjärtbladsförsedda embryona sprids enhetligt; (d) avlägsnande av det sterila utspädningsmediet från det porösa materialet, varigenom de enhetligt spridda pre-hjärtbladsförsedda embryona infângas på det porösa materialet; och (e) kontakt mellan de pre-hjärtbladsförsedda embryona som infångats på 531 226 304 det porösa materialet och ett utvecklingsmedium under en tidsperiod som är tillräcklig för framställning av hjärtbladsförsedda somatiska barrträdsembryon.