SE531383C2 - System med poröst membran för understödjande av utveckling av somatiska barrträdsembryon - Google Patents

Description

20 25 30 35 531 383 2 och slutlig skörd för erhållande av virke eller från träd härledda produkter. De hjärtbladsförsedda somatiska em- bryona kan också undergå groning i ett groningsmedium och därefter överföras till jord för ytterligare tillväxt.

Ett fortsatt problem med somatisk kloning av barr- trädsembryon är stimulering av effektiv bildning av soma- tiska embryon med förmåga att gro för erhållande av växt- er. Företrädesvis är somatiska barrträdsembryon som bild- ats in vitro fysikaliskt och fysiologiskt likartade eller identiska med zygotiska barrträdsembryon som bildats in vivo i barrträdsfrön. Det föreligger därför ett fortsatt behov av förfaranden för framställning av viabla somat- iska barrträdsembryon med utgångspunkt från embryogena barrträdsceller.

Sammanfattning av uppfinningen Föreliggande uppfinnare har upptäckt att ett poröst membran, såsom ett nylonmembran, kan användas för under- stödjande av växtvävnad under utvecklingsfasen av produk- tionen av det somatiska växtembryot. De somatiska embryon som är under utveckling anbringas på ett poröst membran, som antingen kontinuerligt eller intermittent står i kon- takt med ett flytande utvecklingsmedium. Det porösa mem- branet kan t ex placeras på en absorbentdyna som är in- dränkt i ett utvecklingsmedium på så sätt att utveck- lingsmediet passerar genom nylonmembranet och kommer i kontakt med embryona. Nylonmembranet som uppbär embryon är vanligtvis inneslutet i ett tillslutet utrymme som innehåller en fuktig atmosfär som säkerställer att em- bryona förblir fuktiga. Embryona bör inte vara fullständ- igt nedsänkta i utvecklingsmediet. I föreliggande ansökan beskrivs ett representativt system för intermittent vät- ning av den undre ytan av membran som på sin övre yta uppbär somatiska embryon under utveckling. Föredragna porösa membraner är tillräckligt starka för att motstå sönderrivning när membranerna lyfts upp i syfte att över- föra somatiska embryon från utvecklingsskedet till efter- 10 15 20 25 30 35 53fi 383 3 följande skeden vid förfarandet för produktion av somat- iska embryon.

I en aspekt tillhandahålls med föreliggande uppfin- ning förfaranden för utveckling av hjärtbladsförsedda somatiska barrträdsembryon. Förfarandena enligt denna aspekt av uppfinningen inkluderar vart och ett stegen av odling av somatiska barrträdsembryon utan hjärtblad på ett poröst membran, som åtminstone intermittent bringas i kontakt med ett vätskeformigt utvecklingsmedium under en tidsperiod som är tillräcklig för framställning av hjärt- bladsförsedda somatiska barrträdsembryon med utgångspunkt från somatiska embryon utan hjärtblad.

I en annan aspekt tillhandahålls med föreliggande uppfinning förfaranden för framställning av hjärtblads- försedda somatiska barrträdsembryon, där varje förfarande inbegriper stegen av a) odling av somatiska barrträds- celler i eller på ett induktionsmedium för erhållande av embryogena celler; b) odling av de vid steg a) beredda embryogena cellerna i eller på ett underhållsmedium för bildning av somatiska barrträdsembryon utan hjärtblad och c) odling av somatiska barrträdsembryon utan hjärtblad som bildats vid steg b) på ett poröst membran, som åtmin- stone intermittent bringas i kontakt med ett flytande ut- vecklingsmedium under en tidsperiod som är tillräcklig för framställning av hjärtbladsförsedda somatiska barr- trädsembryon med utgångspunkt från de somatiska embryona utan hjärtblad.

Kort beskrivning av ritningarna Ovannämnda aspekter och många av de åtföljande för- delarna med föreliggande uppfinning framgår tydligare när dessa förklaras närmare med hänvisning till efterföljande detaljerade beskrivning betraktad tillsammans med de åt- följande ritningarna.

I figur 1 visas ett representativt system för inter- mittent eller kontinuerlig vätning av ett poröst membran med ett flytande utvecklingsmedium, varvid membranet understödjer utveckling av somatiska växtembryon. 10 15 20 25 30 35 531 383 4 Detaljerad beskrivning av den föredragna utföringsformen Såvida inget specifikt definieras här har samtliga här använda uttryck samma innebörd som de skulle ha för fackmannen på området för föreliggande uppfinning.

Såvida inget annat anges, är alla koncentrations- värden uttryckta som % vikt per volym.

I en aspekt tillhandahålls med föreliggande uppfin- ning förfaranden för utveckling av hjärtbladsförsedda somatiska barrträdsembryon. Förfarandena enligt denna aspekt av uppfinningen inkluderar vart och ett steget av odling av somatiska barrträdsembryon utan hjärtblad på ett poröst membran, som åtminstone intermittent bringas i kontakt med ett flytande utvecklingsmedium under en tids- period som är tillräcklig för framställning av hjärt- bladsförsedda somatiska barrträdsembryon med utgångspunkt från de somatiska embryona utan hjärtblad.

Förfarandena enligt uppfinningen kan användas för framställning av hjärtbladsförsedda somatiska embryon med utgångspunkt från vilket barrträd som helst, såsom med- lemmar av släktet Pinus, såsom loblollytall (sydstatsgul- tall, Pinus taeda) och radiatatall. Som exempel kan också hjärtbladsförsedda somatiska embryon av douglasgran fram- ställas med hjälp av förfarandena enligt föreliggande uppfinning.

Membraner som är användbara vid utövandet av före- liggande uppfinning är porösa, har ingen matrispotential (eller väsentligen ingen matrispotential) och är sterili- serbara. Exempel pà användbara membraner inkluderar nylonmembraner, nylonfibrer, trådnät, plastnät och poly- merfibrer som inte absorberar utvecklingsmedium. Använd- bara pordiametrar i de porösa membranerna ligger i områd- et fràn ca 5 um till ca 1200 pm, såsom från ca 50 um till ca 500 um.

Utvecklingsmediet är ett vätskeformigt medium. Ut- vecklingsmediet innehåller näringsämnen som upprätthåller de somatiska embryona. Maltos kan vara inkluderat i ut- vecklingsmediet som huvudsaklig eller ensam sockerkälla 10 15 20 25 30 35 531 383 5 för de somatiska embryona. Användbara maltoskoncentra- tioner ligger i området från ca 1% till ca 2,5%. Lämliga utvecklingsmedier inkluderar vanligtvis inte några förök- ningshormoner, såsom auxiner och cytokininer.

Osmolaliteten för utvecklingsmediet kan justeras till ett värde som faller inom ett önskat område, såsom från ca 250 mM/kg till ca 450 mM/kg. Vanligtvis är en osmolalitet av 350 mM eller mer fördelaktig. Ett exempel på ett lämpligt utvecklingsmedium beskrivs i Exempel l nedan.

Som exempel kan nämnas att somatiska barrträds- embryon utan hjärtblad kan odlas på ett nylonmembran som åtminstone intermittent bringas i kontakt med utveck- lingsmediet under en period från 5 veckor till 12 veckor, såsom från 8 veckor till lO veckor, vid en temperatur av från lO°C till 30°C, såsom från l5°C till 25°C, eller så- som från 20°C till 23°C.

Vätskeformiga utvecklingsmedier kan t ex appliceras på ett absorbentsubstrat, såsom ett substrat tillverkat av cellulosa (t ex cellulosafibrer), såsom ett eller flera filterpapper, eller något annat absorbentpappers- material. Substratet absorberar det vätskeformiga utveck- lingsmediet, som passerar genom ett poröst membran an- bringat på substratet och kommer i kontakt med somatiska barrträdsembryon utan hjärtblad anbringade på nylonmem- branet. Utvecklingsmediet befrämjar utvecklingen av de somatiska barrträdsembryona utan hjärtblad för bildning av hjärtbladsförsedda somatiska embryon.

Som exempel kan åter nämnas att det porösa membranet kan bringas i kontakt med ett vätskeformigt utvecklings- medium genom användning av en finfördelningsanordning som besprutar det porösa membranet med utvecklingsmediet. De somatiska embryona är anbringade på en övre yta av mem- branet, och den motsatta undre ytan av membranet besprut- as vanligtvis med vätskeformigt utvecklingsmedium. Som ett ytterligare exempel kan nämnas att det porösa mem- branet som uppbär somatiska embryon kan vara anbringat 10 15 20 25 30 35 531 383 6 över ett vätskeformigt utvecklingsmedium som inkluderar en roterande omrörarstav som roterar tillräckligt snabbt för att spruta vätskeformigt utvecklingsmedium upp på den undre ytan av det porösa membranet.

I figur 1 visas ett representativt system 10 för kontinuerlig eller intermittent vätning av ett poröst membran med utvecklingsmedium, varvid membranet uppbär somatiska växtembryon. Systemet 10 inkluderar en första kammare 12 inkluderande en undre yta 14, en övre yta 16, en främre ände 18, en bakre ände 20, en första sida 22 och en andra sida 24. Den bakre änden 20 är försedd med tre luftventiler 26. Den första kammaren 12 är uppburen av fyra ben 28 som vart och ett sträcker ut sig vertikalt från den undre ytan 14 av den första kammaren 12 till en basplatta 30. Varje ben 28 inkluderar en proximal ände 32 fäst till den undre ytan 14 av den första kammaren 12, och en distal ände 34 som vilar på basplattan 30. Den distala änden 34 av varje ben 28 kan justeras roterbart kring längdaxeln för resp ben 28 för justering av höjden av den första kammaren 12 i förhållande till basplattan 30.

Den övre ytan 16, den undre ytan 14, den främre änd- en 18, den bakre änden 20, den första sidan 22 och den andra sidan 24 definierar tillsammans ett första kammar- utrymme 36. Anbringade inuti det första kammarutrymmet 36 finns två ramar 38 som var och en inkluderar en ramkropp 40, som uppbärs av fyra vertikalt orienterade ramben 42.

Ett horisontellt orienterat poröst nylonmembran 44 är ut- sträckt tvärs över varje ram 38.

Systemet 10 inkluderar en andra kammare l2', som in- kluderar samma beståndsdelar som den första kammaren 12.

Komponenterna i den andra kammaren 12' har samma nummer som motsvarande komponent i den första kammaren 12, bort- sett från att komponentnumret som används i samband den andra kammaren 12' inkluderar ett primtecken (').

Den andra kammaren 12' yta 14', en övre yta 16', inkluderar således en undre en främre ände 18', en bakre 10 15 20 25 30 35 53¶ 383 7 ände 20', en första sida 22' bakre änden 20' och en andra sida 24'. är försedd med tre luftventiler 26'. Den andra kammaren 12' är uppburen av fyra ben 28', som vart och ett sträcker ut sig vertikalt från den undre ytan 14' i den första kammaren 12' till en basplatta 30'. Varje ben 28' inkluderar en proximal ände 32', fäst till den undre ytan 14' ände 34', Den av den andra kammaren 12', och en distal som vilar på basplattan 30'. Den distala änden 34' av varje ben 28' kan justeras roterbart kring längd- axeln av resp ben 28' för justering av höjden av den andra kammaren 12' i förhållande till basplattan 30'.

Den övre ytan l6', den undre ytan l4', den främre änden l8', den bakre änden 20', den första sidan 22' och den andra sidan 24' definierar tillsammans ett andra kammarutrymme 36'. rymmet 36' Anbringade inuti det andra kammarut- finns tvà ramar 38', som båda inkluderar en ramkropp 40', som är uppburen av fyra vertikalt orien- terade ramben 42'. Ett horisontellt orienterat poröst nylonmembran 44' är utsträckt tvärs över varje ram 38'.

Systemet 10 inkluderar även en utvecklingsmediumbe- hållare 46 inkluderande en behållarkropp 48 som defi- nierar ett utrymme 50. En mängd vätskeformigt utveck- lingsmedium 52 är placerad i utrymmet 50. En luftventil 54 penetrerar mediumbehàllarkroppen 48. Systemet 10 in- kluderar även ett mediumutloppsrör 56, som inkluderar en proximal ände 58, vilken är nedsänkt i utvecklingsmediet 52 i behàllarutrymmet 50. Utloppsröret 56 är anslutet till en pump 60, som regleras av en timer 61. Nämnda timer 61 är eventuellt programmerbar.

Utloppsröret 56 förgrenar sig för bildning av en första del 62 av utloppsröret och en andra del 64 av ut- loppsröret. Den första delen 62 av utloppsröret är an- sluten till ett första utvecklingsmediumutlopp 66 som penetrerar den undre ytan 40 av den första kammaren 12 och sträcker sig in i det första kammarutrymmet 36. Den andra delen 64 av utloppsröret är ansluten till ett andra utvecklingsmediumutlopp 66, som penetrerar den undre ytan 10 15 20 25 30 35 531 383 8 14' av den andra kammaren 12' andra kammarutrymmet 36'. och sträcker sig in i det Systemet 10 inkluderar även ett första dräneringsrör 68 med en proximal ände 70 belägen inuti medíumbehàllar- utrymmet 50. Det första dräneringsröret 68 förgrenar sig för bildning av en första del 72 av ett dräneringsrör och en andra del 74 av ett dräneringsrör. Den första delen av det första dräneringsröret är ansluten till ett första mediumutlopp 76, som penetrerar den undre ytan 14 av den första kammaren 12. Den andra delen 74 av det första dräneringsröret är ansluten till ett första mediumutlopp 76' som penetrerar den undre ytan 14' kammaren 12'. av den andra Systemet 10 inkluderar även ett andra dräneringsrör 78 med en proximal ände 80 belägen inuti medíumbehàllar- utrymmet 50. Det andra dräneringsröret 78 förgrenar sig för bildning av en första del 82 av det andra dränerings- röret och en andra del 84 av det andra dräneringsröret.

Den första delen 82 av det andra dräneringsröret är an- sluten till ett andra mediumutlopp 86', som penetrerar (och är i jämnhöjd med) den undre ytan 14 av den första kammaren 12. Den andra delen 84 av det andra dränerings- röret är ansluten till ett andra mediumutlopp 86', som penetrerar (och är i jämnhöjd med) den undre ytan 14' av den andra kammaren 12'.

Somatiska tallembryon 88 under utveckling visas an- bringade på ett nylonmembran 44.

Vid drift matar pumpen 60 utvecklingsmediet 52 från behållaren 46 via mediumutloppsröret 56 till den första kammaren 12 och den andra kammaren 12' via den första delen 62 av utloppsröret och den andra delen 64 av ut- loppsröret. Pumpat utvecklingsmedium 52 stiger till nivån för det första mediumutloppet 76 och 76' och töms ut där- igenom i en första 72 del av det första dräneringsröret och en andra del 74 av det första dräneringsröret, som styr utvecklingsmediet tillbaka till mediumbehàllaren 46.

Pumpen 60 kan drivas kontinuerligt eller intermittent. 10 15 20 25 30 35 530 383 9 Nivån av utvecklingsmediet 52 i den första kammaren 12 och den andra kammaren 12' är vanligtvis tillräckligt hög för att utvecklingsmediet 52 skall komma i kontakt med nylonmembranet 44 och därigenom väta en portion av varje somatiskt embryo 88 som är anbringat på nylonmembranet 44. De somatiska embryona 88 bör inte vara fullständigt nersänkta i utvecklingsmediet 52. En fuktig atmosfär in- uti behållarutrymmena 50 och 50' befuktar kontinuerligt de somatiska embryona 88.

När pumpen 60 är inaktiverad, töms utvecklingsmediet 52 ut från den första kammaren 12 och den andra kammaren 12' genom de andra mediumutloppen 86 och 86' och förs tillbaka till behållaren 46 via det andra dräneringsröret 78.

De första mediumutloppen 76 och 76' är båda in- ställda på en höjd i den första kammaren 12 respektive den andra kammaren 12' som motsvarar den önskade nivån av utvecklingsmediet 52 i den första kammaren 12 och den andra kammaren 12'. Vanligtvis är höjden av de första mediumutloppen 76 och 76' samma eller något högre än av- ståndet mellan nylonmembranerna 44 resp 44' och den undre ytan av den första kammaren 14 resp den undre ytan av den andra kammaren 14'. Medan pumpen 60 är aktiverad bringas följaktligen åtminstone en del av varje somatiskt embryo 88 under utveckling i kontakt med utvecklingsmediet 52.

Pumpen 60 inkluderar en programmerbar timer som aktiverar och deaktiverar pumpen 60.

De andra mediumutloppen 86 och 86' är i jämnhöjd med den undre ytan av den första kammaren 14 respektive den undre ytan av den andra kammaren 14', så att när pumpen 60 inte är i drift töms utvecklingsmediet 52 fullständigt eller nästan fullständigt ut från den första kammaren 12 och den andra kammaren 12'.

Vid vissa utföringsformer tillhandahålls med före- liggande uppfinning förfaranden för framställning av hjärtbladsförsedda somatiska barrträdsembryon, där varje förfarande inkluderar stegen av a) odling av somatiska 10 15 20 25 30 35 531 383 10 barrträdsceller i eller på ett induktionsmedium för er- b) odling av de vid steget a) beredda embryogena cellerna i eller på ett underhålls- medium för framställning av barrträdsembryon utan hjärt- blad; och c) odling av somatiska barrträdsembryon utan hjärtblad som bildats vid steget b) på ett poröst mem- bran, som åtminstone intermittent bringas i kontakt med vätskeformigt utvecklingsmedium under en tidsperiod som är tillräcklig för framställning av hjärtbladsförsedda somatiska barrträdsembryon med utgångspunkt från somat- iska embryon utan hjärtblad. De somatiska barrträdscell- erna och de resulterande hjärtbladsförsedda somatiska embryona kan vara genetiskt identiska. hållande av embryogena celler; Vid vissa utföringsformer odlas således somatiska barrträdsceller i eller pà ett induktionsmedium för er- hållande av embryogena celler. Embryogena celler har för- måga att producera ett eller flera somatiska barrträds- embryon. Exempel på embryogena celler är embryonala sus- pensormassor (ESM). Induktionsmediet inkluderar vanligt- vis oorganiska salter och organiska näringsämnen. Osmola- liteten för induktionsmediet är vanligtvis ca 160 mM/kg eller t o m lägre, men kan vara så hög som 170 mM/kg. In- duktionsmediet inkluderar vanligtvis tillväxthormoner.

Exempel på hormoner som kan inkluderas i induktionsmediet är auxiner (t ex 2,4-diklorfenoxiättiksyra (2,4-D)) och cytokininer (t ex 6-bensylaminpurin (BAP)). Auxiner kan t ex utnyttjas i en koncentration av från l mg/l till 200 mg/l. Cytokininer kan t ex utnyttjas i en koncentration av från O,l mg/l till 10 mg/l.

Induktionsmediet kan innehålla en adsorbentkomposi- särskilt när mycket höga halter av tillväxthormoner används. Adsorbentkompositionen kan vara vilken komposi- tion som helst som inte är toxisk för de embryogena cell- erna vid de koncentrationer som används vid utövandet av tion, föreliggande förfaranden och som har förmåga att adsor- bera i mediet närvarande tillväxtbefrämjande hormoner och toxiska föreningar som produceras av växtcellerna under 10 15 20 25 30 35 531 383 ll embryoutvecklingen. Ej begränsande exempel på användbara adsorbentkompositioner inkluderar aktiverat träkol, lös- ligt poly(vinylpyrrolidon), olösligt poly(vinylpyrro- lidon), aktiverad aluminiumoxid och silikagel. Adsorbent- kompositionen kan vara närvarande i en mängd av t ex från ca 0,1 g/l till ca 5 g/l. Induktionsmediet är vanligtvis fast och kan solidifieras genom inklusion av ett gel- ningsmedel.

Somatiska barrträdsceller odlas vanligtvis i eller på ett induktionsmedium under en period från 3 veckor till 10 veckor, såsom från 6 veckor till 8 veckor, vid en temperatur av från 10°C till 30°C, såsom från l5°C till 25°C, eller såsom från 20°C till 23°C.

Underhàllsmediet kan vara ett fast medium, eller kan det vara ett vätskeformigt medium som kan omröras för be- främjande av tillväxt och förökning av den embryogena vävnaden. Osmolaliteten för underhàllsmediet är vanligt- vis högre än osmolaliteten för induktionsmediet, vanligt- vis inom området 120-180 mM/kg. Underhållsmediet kan innehålla näringsämnen som upprätthåller den embryogena vävnaden och kan inkludera hormoner, såsom en eller flera auxiner och/eller cytokininer, som befrämjar celldelning och tillväxt av den embryogena vävnaden. Vanligtvis är koncentrationerna av hormoner i underhàllsmediet lägre än deras koncentration i induktionsmediet.

Det är i allmänhet önskvärt, dock ej nödvändigt, att inkludera maltos som enda eller huvudsakliga metaboliser- bara sockerkälla i underhållsmediet. Exempel på använd- bara maltoskoncentrationer ligger inom omrâdet från ca 1% till ca 3,0%. Embryogena barrträdsceller överförs van- ligtvis till färskt uppehållsmedium en gång per vecka.

Användbara utvecklingsmedier beskrivs ovan. Efter att ha odlats i kontinuerlig eller periodvis kontakt med ett utvecklingsmedium, kan de somatiska hjärtbladsför- sedda embryona eventuellt överföras till ett mognads- medium och därefter till ett stratifieringsmedium för en ytterligare odlingsperiod. 10 15 20 25 30 35 531 383 12 Förfarandena enligt uppfinningen kan t ex användas för framställning av kloner av individuella barrträd som har en eller flera önskvärda egenskaper, såsom snabb tillväxthastighet. I en aspekt tillhandahålls med före- liggande uppfinning således förfaranden för framställning av en population av genetiskt identiska hjärtbladsför- sedda somatiska barrträdsembryon. Förfarandena enligt denna aspekt av uppfinningen inkluderar vart och ett stegen av odling av genetiskt identiska somatiska barr- trädsembryon utan hjärtblad på ett poröst membran (t ex ett poröst nylonmembran) som står i kontinuerlig eller periodvis kontakt med ett utvecklingsmedium under en tidsperiod som är tillräcklig för produktion av genetiskt identiska hjärtbladsförsedda somatiska barrträdsembryon med utgångspunkt från de somatiska embryona utan hjärt- blad, varvid utvecklingsmediet passerar genom det porösa membranet och kommer i kontakt med de somatiska embryona.

De hjärtbladsförsedda somatiska barrträdsembryona som producerats genom användning av förfarandena enligt uppfinningen kan eventuellt underkastas groning för bild- ning av barrträdsplantor, som kan växa till barrträd om så är önskvärt. De hjärtbladsförsedda embryona kan också placeras i artificiella frön för efterföljande groning.

De hjärtbladsförsedda somatiska barrträdsembryona kan underkastas groning på t ex ett fast groningsmedium, så- som det groningsmedium som beskrivs i Exempel 1 nedan.

Växterna som grott kan överföras till jord för ytterlig- are tillväxt. Växterna som grott kan t ex planteras i jord i ett växthus och tillåtas växa innan de transplan- teras till en plats utomhus. Vanligtvis belyses de hjärt- bladsförsedda somatiska barrträdsembryona för stimulering av groning. Samtliga stegen vid förfarandena enligt upp- finningen, bortsett från groningen, utförs vanligtvis i mörker.

I en annan aspekt tillhandahålls med föreliggande uppfinning system för utveckling av somatiska växt- embryon, där varje system inkluderar: (a) en mediumbe- 10 15 20 25 30 35 53¶ 383 13 hållare innehållande ett vätskeformigt utvecklingsmedium; (b) en odlingskammare inbegripande en kropp som defini- erar ett utvecklingsmediuminlopp och ett utvecklings- mediumutlopp, varvid utvecklingsmediumutloppet är anslut- et till mediumbehållaren; (c) ett poröst membran placerat på en membranbärare i odlingskammaren; (d) en pump som är ansluten till mediumbehàllaren och till utvecklings- mediuminloppet till odlingskammaren, varvid pumpen vid drift matar utvecklingsmediet från behållaren till odlingskammaren via utvecklingsmediuminloppet, och ut- vecklingsmediet töms ut från odlingskammaren via utveck- lingsmediumutloppet och återförs till utvecklingsmedium- behållaren. Ett exempel pà ett system enligt föreliggande uppfinning visas i figur 1. Systemet kan eventuellt in- kludera en timer (t ex en programmerbar timer) som är an- sluten (t ex elektriskt ansluten) aktiverar och deaktiverar pumpen. till pumpen och som I systemen enligt föreliggande uppfinning är utveck- lingsmediumutloppet arrangerat på avstånd i förhållande till membranbäraren, så att utvecklingsmediet inte full- ständigt täcker de somatiska växtembryona som är under utveckling och som är placerade på det porösa membranet (d v s utvecklingsmediumutloppet möjliggör att utveck- lingsmediet kan tömmas ut från odlingskammaren innan mediet fullständigt indränker embryona som är anbringade pà det porösa membranet.

Följande exempel tillhandahålls i belysande, dock ej begränsande, Exempel l I detta exempel visas ett representativt förfarande enligt uppfinningen för framställning av somatiska tall- embryon med utgångspunkt från sydstatsgultall.

Hongametofyter innehållande zygotiska embryon av- lägsnas från frön 4-6 veckor efter fertilisering. Frö- syfte. höljena avlägsnas, men embryona dissekeras inte ytterlig- are ut från den omgivande gametofyten mer än att den nucellära änden skärs bort. Konerna (”cones”) förvarades 10 531 383 14 vid 4°C till användning. Omedelbart före avlägsnande av de omogna embryona steriliseras fröna för utförande av en initial tvättnings- och detergensbehandling, följt av sterilisering under 10 min i 15% Hfib. Explantaten tvätta- des utförligt med sterilt destillerat vatten efter varje behandling.

I Tabell 1 och 2 visas sammansättningarna av medier som är användbara för framställning av somatiska tall- embryon. 535 383 15 Tabell 1 Basalmedium (BM) för Pinus taeda Beståndsdel Koncentration (mg/l) NH4NO3 150,0 KNog 909, 9 KH2PO4 136,1 Ca(NO3)2.41-¶2O 236,2 CaCl2.4H2O 50,0 MgSO4. 7H2O 246,5 Mg(NO3)2.6H2O 256,5 MgCl2.6H2O 50,0 KI 4,15 H3BO3 15,5 MnSO4.H2O 10,5 ZnSO4. 71-120 14, 4 NaMoO4.2H2O 0,125 CuSO4.5H2O 0,125 CoCl2.6H2O 0,125 FeSO4. 7H2O 27, 86 Na2EDTA 37,36 Maltos 30000 Myoinositol 200 Kasaminosyror 500 L-glutamin 1000 Tiamin-HCl 1,00 Pyridoxin'HCl 0,50 Nikotinsyra 0,50 Glycin 2, 00 Gelrite+ 1600 pH justerat till 5,7 + Används om ett fast medium är önskvärt.

Tabell 2 531 383 16 Sammansättning av medier för olika behandlingssteg BM1- induktions- medium BM+2,4-D (2 MM). (15 pM)+kinetin (2 uM)+BAP BM2- underhålls- medium BM+2,4-D (5 uM)+kinecin (0,5 uM)+BAP (0,5 um). GELRITE (1600 mg/1) tili- sätts när ett fast medium är önskvärt BM3- utvecklings- medium BM+25 mg/l abscisinsyra + 12% PEG- 8000 + 800 mg/l ytterligare myoino- sitol + 0,l% aktiverad träkol + 1% glukos + 2,5% maltos. Följande amino- syrablandning tillsätts: L-prolin (100 mg/l), L-asparagin (100 mg/l), (50 mg/l), L-alanin (20 mg/l) och L-serin (20 mg/1).

GELRITE (2500 mg/l) tillsätts när ett fast medium är önskvärt L-arginin BM5- stratifierings- medium BM3 modifierat genom uteslutning av abscisinsyra, och PEG-8000.

GELRITE (2500 mg/l) tillsätts när ett fast medium är önskvärt.

BM6- groningsmedium BM modifierat genom ersättning av maltos med 2% sackaros. Myoinositol reduceras till 100,0 mg/l, och glut- amin och kasaminosyror reduceras till 0,0 mg/l. FeSO4"HüO reduceras till 13,9 mg/l och Na2EDTA reduceras till 18,6 mg/l. aktiverat tillsätts.

Agar i en halt av 0,8% och träkol i en halt av 0,25% Induktion: sterila gametofyter med intakta embryon placeras på ett fast BM1-odlingsmedium och förvaras i en miljö av 22-25°C under en mörk fotoperiod av 24 h under en tidsperiod av 3-5 veckor.

Tidslängden beror på den särskilda genotyp som odlas. Vid slutet av denna tids- period bildas en slemartad massa i association med ur- sprungsexplantaten. Mikroskopisk undersökning avslöjar 10 15 20 25 30 35 531 383 17 vanligtvis åtskilliga embryon i ett tidigt skede associ- erade med massan. Dessa karaktäriseras i allmänhet som att ha en lång tungväggig suspensor associerad till ett litet huvud med tät cytoplasma och stora kärnor.

Osmolaliteten för induktionsmediet kan i vissa fall vara så hög som 150 mM/kg. Vanligtvis är den ca 120 mM/kg eller t o m lägre (såsom 110 mM/kg).

Upprätthållande och förökning: Embryon i ett tidigt skede som avlägsnats från massorna som bildats vid induk- tionssteget placeras först på ett gelat BM2-underhålls- och -förökningsmedium. Detta skiljer sig från induktions- mediet i det att tillväxthormonerna (både auxiner och cytokininer) är reducerade med åtminstone en fullständig storleksordning. Osmolaliteten för detta medium är 130 mM/kg eller högre (vanligtvis inom området ca 120-150 mM/kg för Pinus taeda). Temperaturen är även här 22-25°C i mörker. Embryon odlas under 12-14 dagar på det fasta BM2-mediet före överföring till ett vätskeformigt medium för ytterligare subodling. Detta vätskeformiga medium har samma sammansättning som BM2, men saknar gelningsmedlet.

Embryona har i slutet av underhållssteget på fast medium vanligtvis liknande utseende som de från induktionssteg- et. Efter subodlingar under 5-6 veckor på det vätskeform- iga underhàllsmediet har långt framskridna embryon i det tidiga skedet bildats. Dessa karaktäriseras av jämna embryonala huvuden, som uppskattas att vanligtvis ha mer än 100 individuella celler med multipla suspensorer.

Embryoutveckling: Embryoutvecklingen utförs genom användning av systemet som visas i figur 1.

Den osmotiska potentialen för detta utvecklings- medium kan ökas väsentligen jämfört med den för under- hållsmediet. Det har visat sig vara fördelaktigt att ha en så hög osmolalitet som 350 mM/kg eller t o m högre.

Utvecklingen utförs företrädesvis i fullständigt mörker vid en temperatur av 22-25°C tills hjärtbladsförsedda embryon har utvecklats. flera veckor, Utvecklingstiden är vanligtvis såsom 7-12 veckor. 10 15 20 25 30 35 531 383 18 Stratifiering: Hjärtbladsförsedda embryon singulari- seras och överförs till stratifieringsmediet BM5. Detta medium är likartat utvecklingsmediet, men saknar abscisinsyra, PEG-8000 och gellangummi. Embryon odlas på stratifieringsmediet vid mellan ca l°C och ca lO°C i mörk- er under mellan 3 och 6 veckor.

Konditionering över vatten: De mogna embryona som fortfarande befinner sig på nylonmembranbäraren lyfts bort från dynan och placeras i en sluten behållare över H20 vid en relativ fuktighet av 97% under en period av ca 3 veckor.

Gröning: De torkade mogna embryona rehydratiserades genom placering av dem, medan de fortfarande befinner sig pà nylonmembranbäraren, under ca 24 h på en dyna som är mättad med vätskeformigt groningsmedium. Embryona placerades därefter individuellt pà fast BM;-medium för groning. Detta är ett basalt medium som saknar tillväxt- hormoner och som har modifierats genom reduktion av sackaros, myoinositol och organiskt kväve. Embryona in- kuberas på BMG-medium under ca 12 veckor vid omgivande betingelser av 23-25°C och en fotoperiod av 16 h ljus och 8 h mörker tills de resulterande småplantorna har ett väl utvecklat rotämne och en dito hypokotyl samt grön hjärt- bladsstruktur och epikotyl.

På grund av den reducerade kolhydratkoncentrationen är den osmotiska potentialen för groningsmediet ytterlig- are reducerad till under den för utvecklingsmediet, Den är vanligtvis lägre än ca 150 mM/kg, såsom ca 100 mM/kg.

Exempel 2 I detta exempel visas att somatiska embryon av syd- statsgultall kan utvecklas på ett poröst nylonmembran anbringat på cellulosadynor som är indränkta i vätske- formigt utvecklingsmedium.

Embryobehandling: Genotyperna A, B och C av syd- statsgultall sattes som bulk till en stor kolv. 0,75 ml av celler applicerades på antingen filterpapper av typ Whatman No. 4 eller på nylonmembran (SeFar Co., produktnr 10 15 20 25 30 35 531 383 19 0-100-44 med en porstorlek av 100 um), anbringade på ett dubbelskikt av absorbentdynor i en petriskål. Varje dyna hade en diameter av 50,8 mm (2 tum), och dubbelskiktet av dynor indränktes med ca 40 ml utvecklingsmedium.

Efter utvecklingsbehandlingen stratifierades samt- liga plattor under fyra veckor i kyla. Embryona singula- riserades därefter på torrt filterpapper och suspendera- des över vatten i stora lådor under tre veckor i syfte att konditionera embryona. Embryona blötlades därefter på vätskeformigt groningsmedium under 24 h och planterades därefter i fast groningsmedium. Groningslàdorna innehåll- ande de groende embryona förflyttades till ljus efter sju dagars mörkerbehandling.

Embryoutbyte efter utvecklingsbehandling: Embryona räknades i början av konditioneringsbehandlingen. Embryo- antalet beräknades per ml celler som strukits ut för varje genotyp. Embryoutbytet för embryona som utvecklats pà filterpapper (kombination av samtliga genotyper) var 48:28. Embryoutbytet för embryon som utvecklats på nylon- membran (samtliga genotyper kombinerade) var 55:14.

Den genomsnittliga procentuella groningen för embry- on (samtliga genotyper kombinerade) som odlats på filter- papper var 30i5. Den genomsnittliga procentuella groning- en för embryon (samtliga genomtyper kombinerade) som od- lats på nylonmembran var 32i7.

Således förelåg inte någon statistiskt signifikant skillnad i antal embryon som erhållits efter utveckling, eller groning, genom användning av filterpapper jämfört med nylonmembran.

Exempel 3 I detta exempel beskrivs framgångsrik användning av en bioreaktor för utveckling av somatiska embryon av syd- statsgultall på ett nylonmembran som intermittent bringas i kontakt med utvecklingsmedium.

Genotyp A av sydstatsgultall användes. 12 ml per be- handling ströks ut till halva storleken av Cambro-lådor.

Pâ varje platta fanns 0,5 ml av celler. 10 15 20 531 383 20 Det i figur 1 visade bioreaktorsystemet användes för utförande av de i detta exempel utförda försöken.

Fyra utvecklingsbehandlingar användes: Vid behand- ling 1 anbringades 10% C.C.(cellulosa)-dyna med ett nylonmembran (100 um i porstorlek) på dynan. Vid behand- ling 2 användes 10% C.C.-dyna med filterpapper (Whatman No. 4 f.p.) i stället för nylonmembranet. Vid behandling 3 var ett filterpapper anbringat ovanpå nylonmembranet (ingen dyna), och vid behandling 4 förekom endast nylon- membran (ingen dyna, inget filterpapper).

Utvecklingsmedium pumpades in i Cambro-lådorna tills mediet rörde vid nylonmembranet. Mediet började tömmas ut 15 minuter efter det att pumpningen stoppats. levererade medium en gång var 24:e h.

Försöket stoppades efter 8 veckor. Varje behandling gav embryon. Embryon av god kvalitet (zygotliknande) ut- vecklades särskilt på membranet som inte uppburits av en cellulosadyna.

Pumpen Även om föredragna utföringsformer av uppfinningen har belysts och beskrivits, bör det inses att olika för- ändringar därav kan göras utan att man frångår innebörden och skyddsomfånget för uppfinningen.

Claims (12)

10 15 20 25 30 531 333 21 PATENTKRAV

1. l. System för utveckling av somatiska växtembryon, varvid det inbegriper: (a) en mediumbehållare innehållande flytande utveck- lingsmedium; (b) en odlingskammare inbegripande en kropp som de- finierar ett utvecklingsmediuminlopp och ett ut- vecklingsmediumutlopp, varvid utvecklingsmedium- utloppet är anslutet till mediumbehàllaren; (C) ett poröst membran anbringat på en membranbärare i odlingskammaren, varvid utvecklingsmediumut- loppet är beläget på avstånd i förhållande till membranbäraren på så sätt att utvecklingsmediet inte fullständigt täcker de somatiska växtembryo- na som är under utveckling och som är anbringade på det porösa membranet; och (d) en pump som är ansluten till mediumbehàllaren och till utvecklingsmediuminloppet till odlings- kammaren, varvid pumpen vid drift aktiveras kon- tinuerligt eller intermittent och matar utveck- lingsmedium från behållaren till odlingskammaren via utvecklingsmediuminloppet, och varvid utveck- lingsmediet töms ut från odlingskammaren via ut- vecklingsmediumutloppet och återförs till utveck- lingsmediumbehållaren.

2. System enligt kravet l, varvid det dessutom inbe- griper en timer som aktiverar och deaktiverar pumpen.

3. System enligt kravet 2, programmerbar. varvid nämnda timer är

4. System enligt kravet l, membranet är ett nylonmembran. varvid det porösa

5. System enligt kravet 1, membranet är ett trådnät. varvid det porösa 10 15 20 531 383 22

6. System enligt kravet 1, varvid det porösa membranet inbegriper polymerfiber som inte absorberar utvecklingsmediet.

7. System enligt kravet l, varvid det porösa membranet har en pordiameter som ligger i området från 5 till 1200 pm.

8. System enligt kravet 7, varvid det porösa membranet har en pordiameter som ligger i området från 50 till 500 pm.

9. System enligt kravet 1, varvid det dessutom inbegriper ett absorbentsubstrat som är beläget mellan membranbäraren och det porösa membranet.

10. System enligt kravet 9, varvid absorbent- substratet inbegriper cellulosa.

11. ll. System enligt kravet 1, varvid det dessutom inbegriper ett flertal somatiska växtembryon under utveckling anordnade på ytan av det porösa membranet.

12. System enligt kravet 12, varvid åtminstone en del av varje somatiskt växtembryo under utveckling står i kontakt med utvecklingsmediet medan pumpen är aktiverad.