SE531226C2

SE531226C2 - Low density spreading methods for somatic embryogenesis

Info

Publication number: SE531226C2
Application number: SE0702034A
Authority: SE
Inventors: James A Grob; Stephanie A Brusig
Original assignee: Weyerhaeuser Co
Priority date: 2006-09-28
Filing date: 2007-09-12
Publication date: 2009-01-27
Also published as: FI20070735A0; CA2604700C; BRPI0704031B1; CN101240260B; SE0702034L; UY30608A1; AR062905A1; CN101240260A; AU2007216903B2; AU2007216903A1; NZ561856A; CA2604700A1; BRPI0704031A2; FI121727B; FI20070735A

Description

25 30 531 226 2 Ett ständigt problem med somatisk kloning av banträdsembryon är stimulering av effektiv och kostnadseffektiv framställning av somatiska embryon med förmåga att gro för erhållande av plantor. Företrädesvis är in vitro framställda somatiska barrträdsembryon fysiskt och fysiologiskt likartade eller identiska med zygotiska barrträdsembryon som framställts in vitro i barr- trädsfrön. Det föreligger därför ett fortsatt behov av förfaranden för framställ- ning av viabla somatiska barrträdsembryon med utgångspunkt från embryo- gena barrträdsceller. A constant problem with somatic cloning of pathway embryos is the stimulation of efficient and cost-effective production of somatic embryos capable of germinating to obtain seedlings. Preferably, in vitro somatic conifer embryos produced are physically and physiologically similar or identical to zygotic conifer embryos produced in vitro in conifer seeds. There is therefore a continuing need for procedures for the production of viable somatic conifer embryos based on embryonic conifer cells.

Sammanfattning av uggﬁnningen l en aspekt tillhandahålls med föreliggande uppfinning förfaranden för framställning av somatiska hjärtbladsförsedda barrträdsembryon med ut- gângspunkt från pre-hjärtförsedda embryon. Förfarandena i denna aspekt av uppﬁnningen inkluderar steget av (a) fördelning av ett flertal pre-hjärtförsedda embryon på ett poröst material horisontellt anbringat över en icke-porös yta i en volym av sterilt utspädningsmedium som är tillräcklig för nedsänkning av åtminstone ytan av det porösa materialet, varigenom de pre-hjärtbladsför- sedda embryona sprids enhetligt, (b) avlägsnande av det sterila utspädnings- mediet från det porösa materialet, varigenom de enhetligt spridda pre-hjärt- bladsförsedda embryona infàngas på det porösa materialet; och (c) kontakt mellan de pre-hjårtbladsförsedda embryona som infângats på det porösa materialet och ett utvecklingsmedium under en tidsperiod som är tillräcklig för framställning av hjärtbladsförsedda somatiska barrträdsembryon. l en annan aspekt tillhandahålls med föreliggande uppﬁnning förfarand- en för framställning av hjärtbladsförsedda somatiska barrträdsembryon med utgångspunkt från somatiska barrträdsceller. Förfarandena i denna aspekt av uppfinningen inkluderar stegen av (a) odling av somatiska barrträdsceller i ett induktionsmedium för erhållande av embryogena celler; (b) odling av de vid steg (a) framställda embryogena cellema i ett ﬂytande underhållsmedium för framställning av pre-hjärtbladsförsedda somatiska barrträdsembryon; (c) för- delning av ett ﬂertal av de vid steget (b) framställda pre-hjärtbladsförsedda embryona påiett poröst material horisontellt anbringat över en icke-porös yta i en volym av ett sterilt utspädningsmedium som är tillräcklig för nedsänkning av åtminstone ytan av det porösa materialet, varigenom de pre-hjärtbladsför- 10 15 20 25 30 53 'l 226 3 1 sedda embryona sprids enhetligt; (d) avlägsnande av det sterila utspädnings- mediet från det porösa materialet, varigenom de enhetligt spridda pre-hjärt- bladsförsedda embryona infångaspå det porösa materialet; och (e) kontakt mellan de pre-hjärtbladsförsedda embryona som infångats på det porösa materialet och ett utvecklingsmedium under en tidsperiod som är tillräcklig för framställning av hjärtbladsförsedda somatiska barrträdsembryon.SUMMARY OF THE INVENTION In one aspect, the present invention provides methods for producing somatic heart-leafed conifer embryos based on pre-hearted embryos. The methods in this aspect of the invention include the step of (a) distributing a plurality of pre-cardiac embryos on a porous material horizontally applied over a non-porous surface in a volume of sterile dilution medium sufficient to immerse at least the surface of the porous material , thereby uniformly dispersing the pre-cardiac embryos, (b) removing the sterile diluent from the porous material, thereby trapping the uniformly dispersed pre-cardiac embryos on the porous material; and (c) contacting the pre-cardiac embryos captured on the porous material with a development medium for a period of time sufficient to produce cardiac somatic conifer embryos. In another aspect, the present invention provides the method of making cardiac somatic conifer embryos based on somatic coniferous cells. The methods of this aspect of the invention include the steps of (a) culturing somatic conifer cells in an induction medium to obtain embryogenic cells; (b) culturing the embryogenic cells prepared in step (a) in a surface maintenance medium for the production of pre-cardiac somatic conifer embryos; (c) distributing a number of the pre-cardiac embryos prepared in step (b) on porous material horizontally applied over a non-porous surface in a volume of a sterile dilution medium sufficient to immerse at least the surface of the porous the material, whereby the pre-heart-leaf embryos are distributed uniformly; (d) removing the sterile diluent from the porous material, thereby trapping the uniformly dispersed pre-cardiac embryos on the porous material; and (e) contacting the pre-cardiac embryos captured on the porous material with a development medium for a period of time sufficient to produce cardiac somatic conifer embryos.

Med hjälp av förfarandena enligt föreliggande uppﬁnning erhålls ett högre utbyte av somatiska barrträdsembryon jämfört med vid en ekvivalent metod där depre-hjärtbladsförsedda embryona inte är enhetligt spridda över utvecklingsmediet. Vid vissa utföringsforrner fördelas mångfalden av de pre- hjärtbladsförsedda embryona i ett steriit utspädningsmedium med en densitet av mindre än 0,1 g cellvåtvikt per 6,5 cmz (kvadrattum) av poröst material, så- som från 0,005 till 0,1 g cellvåtvikt per 6,5 om: (kvadrattum) av poröst materi- al. Vid vissa utföringsformer fördelas mångfalden av pre-hjärtbladsförsedda embryon i ett sterilt utspädningsmedium med en densitet av mindre än 0,05 g cellvåtvikt per 6,5'cm2 (kvadrattum) av poröst material, såsom från 0,001 till 0,05 g cellvåtvikt per 6,5 omz (kvadrattum) av poröst material.Using the methods of the present invention, a higher yield of somatic conifer embryos is obtained compared to an equivalent method where the depre-leafed embryos are not uniformly distributed over the development medium. In some embodiments, the plurality of pre-cardiac embryos are distributed in a sterile dilution medium having a density of less than 0.1 g cell weight per 6.5 cm 2 (square inch) of porous material, such as from 0.005 to 0.1 g cell weight per 6.5 om: (square inch) of porous material. In some embodiments, the plurality of pre-cardiac embryos are distributed in a sterile dilution medium having a density of less than 0.05 g cell wet weight per 6.5 cm 2 (square inch) of porous material, such as from 0.001 to 0.05 g cell wet weight per 6 5 omz (square inch) of porous material.

Förfarandena enligt föreliggande uppﬁnning är användbara för t ex framställning av somatiska barrträdsembryon som kan användas för senare mognadssteg och/eller som kan underkastas groning för erhållande av barr- trädsplantor som kan växa till mogna barrträd, om så är önskvärt. Förfarande- na enligt uppﬁnningen kan tex således användas för framställning av kloner av individuella barrträd med en eller ﬂera önskvärda egenskaper, såsom ökad tillväxthastighet eller förbättrad träkvalitet. En population av somatiska barr- trädsembryon som framställts med hjälp av förfarandena enligt föreliggande uppﬁnning kan t ex användas för framställning av ett bestånd eller en skog av barrträd med en eller ﬂera önskvärda egenskaper, såsom hög tillväxthastighet eller förbättrad träkvalitet. Träden kan i sin tur användas för framställning av tråprodukter. A Kortglgeskrivnind av ritningaﬁg Ovannämnda aspekter och flera av de åtföljande fördelarna med före- liggande uppﬁnning inses lättare genom hänvisning till följande detaljerade beskrivning beaktad tillsammans med åtföljande ritningama. 10 15 20 25 30 531 226 4 l Figur 1 visas ett exempel på en utstrykningsstomme (”plating frame”) _ inbegripande poröst material anbringat på en stödram för användning enligt en utföringsform av förfarandet enligt uppﬁnningen.The methods of the present invention are useful for, for example, the production of somatic conifer embryos which can be used for later stages of maturation and / or which can be subjected to germination to obtain coniferous plants which can grow into mature conifers, if desired. The methods according to the invention can thus be used, for example, for the production of clones of individual conifers with one or more desirable properties, such as increased growth rate or improved wood quality. A population of somatic conifer embryos produced by the methods of the present invention can be used, for example, to produce a stand or forest of conifers with one or more desirable properties, such as high growth rate or improved wood quality. The trees can in turn be used for the production of wood products. A Brief description of the drawings ﬁ g The above aspects and several of the attendant advantages of the present invention will be more readily understood by reference to the following detailed description taken in conjunction with the accompanying drawings. Figure 1 shows an example of a plating frame including porous material applied to a support frame for use in an embodiment of the method according to the invention.

I Figurerna 2A-H visas fotograﬁer som åskådliggör att tillväxten av hjärtbladsförsedda embryon som strukits ut i enlighet med förfarandena enligt uppfinningenförbättras ijämförelse med en standardmässig utstryknings- metod, såsom beskrivs i Exempel 3. l_ Figurema 2A-D visas kontroller enligt dropputstrykningsmetoden för genotyperna A, E, F respektive B. l Figurerna 2E-H visas resultaten av utstrykningsmetoden för spridning genom samman- ﬂytning ivätska ("liquid dispersion conﬂuent spread plating method”) för geno- typerna A, E, F respektive B.Figures 2A-H show photographs illustrating that the growth of cardiac leaf embryos plated in accordance with the methods of the invention is improved over a standard smear method, as described in Example 3. Figures 2A-D show controls according to the droplet smear method A, E, F and B, respectively. Figures 2E-H show the results of the liquid dispersion con- uent spread plating method for genotypes A, E, F and B.

Detal|'erad beskrivning av den föredragna utföringsfonnen Såvida det inte speciﬁkt deﬁnierats här har samtliga här använda ut- tryck samma innebörd som de skulle ha för fackmannen inom området för föreliggande uppfinning.DETAILED DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENT Unless specifically specified herein, all terms used herein have the same meaning as they would be to one skilled in the art to the present invention.

Det här använda uttrycket ”embryogena celler” hänför sig till vilka celler som helst inkluderande celler som ärorganiserade för bildning av en vävnad eller ett organ härrörande från en växt av ordningen Coniferales och som har förmåga att producera ett eller ﬂera somatiska barrträdsembryon vid behand- ling med hjälp av förfarandena enligt föreliggande uppfinning. Således inklu- derar uttrycket ”embryogena celler" t ex embryonala suspensorrnassor hos barrträd.As used herein, the term "embryogenic cells" refers to any cell, including cells, which is organized to form a tissue or organ derived from a Coniferales plant and which is capable of producing one or more of its somatic coniferous embryos upon treatment with by means of the methods of the present invention. Thus, the term "embryogenic cells" includes, for example, embryonic suspender noses of conifers.

Det här användauttrycket ”pre-hjärtbladsförsett embryo” hänför sig till ett embroy som ännu inte har några hjärtblad.This term "pre-leafed embryo" refers to an embryo that does not yet have any heart leaves.

Det här använda uttrycket ”hjärtbladsförsett embryo” hänför sig till ett embryo som har minst ett hjärtblad.The term "heart-leafed embryo" as used herein refers to an embryo that has at least one heart leaf.

Föreliggande uppﬁnnare har upptäckt att förfarandena enligt föreligg- ande uppfinning ger ett högre utbyte av somatiska barrträdsembryon än en ekvivalent metod där de pre-hjärtbladsförsedda embryona inte är enhetligt spridda över utvecklingsmediet. Uppﬁnnama har dessutom observerat att ut- strykning av pre-hjärtbladsförsedda embryon med hjälp av metoderna enligt föreliggande uppﬁnning med en utstrykningsdensitet av mindre än 0,1 g cellvåtvikt per 6,5 cmz (kvadrattum) av poröst material, såsom från 0,001 till '10 15 20 25 30 531 226 5 0,1 g cellvåtvikt per 6,5 cmz (kvadrattum)«av poröst material, ger ett ökat utbyte av hjärtbladsförsedda embryon per areaenhet jämfört med pre-hjärt- bladsförsedda embryon som strukits ut med en högre densitet och/eller strukits ut genom användning av en traditionell pipettdroppningsmetod, så- som beskrivs ytterligare i Exempel 2 och 3. .The present inventors have discovered that the methods of the present invention provide a higher yield of somatic conifer embryos than an equivalent method in which the pre-cardiac embryos are not uniformly distributed over the development medium. In addition, the inventors have observed that smearing of pre-cardiac embryos using the methods of the present invention with a smear density of less than 0.1 g cell weight per 6.5 cm 2 (square inch) of porous material, such as from 0.001 to 10 0.1 g of cell wet weight per 6.5 cm 2 (square inch) «of porous material, gives an increased yield of cardiac embryos per unit area compared to pre-cardiac embryos spread with a higher density and / or or ironed out using a traditional pipette dripping method, as further described in Examples 2 and 3..

Såsom nämnts ovan hänför sig föreliggande uppﬁnning i en aspekt til förfaranden för framställning av hjärtbladsförsedda somatiska barrträds- embryon med utgångspunkt från pre-hjärtbladsförsedda embryon. Förfaran- dena enligt denna aspekt av uppfinningen inkluderar steget av (a) fördelning av ett flertal pre-hjärtbladsförsedda embryon på ett poröst material horisontellt anbringat över en icke-porös yta i en volym av sterilt utspädningsmedium som är tillräcklig för nedsänkning av åtminstone ytan av det porösa materialet, var- igenom de pre-hjärtbladsförsedda embryona sprids enhetligt; (b) avlägsnande av det sterila utspädningsmedlet frán det porösa materialet, varvid de enhet- ligt spridda pre-hjärtbladsförsedda embryona infångas på det porösa material- et; och (c) kontakt mellan de pre-hjärtbladsförsedda embryona som infångats på det porösa materialet och ett utvecklingsmedium under en tidsperiod som är tillräcklig för framställning av hjärtbladsförsedda somatiska barrträds- embryon.As mentioned above, the present invention relates in one aspect to methods of making cardiac leaf somatic conifer embryos based on pre-cardiac embryos. The methods of this aspect of the invention include the step of (a) distributing a plurality of pre-cardiac embryos on a porous material horizontally applied over a non-porous surface in a volume of sterile dilution medium sufficient to immerse at least the surface of the porous material. porous material, through which the pre-cardiac embryos are distributed uniformly; (b) removing the sterile diluent from the porous material, capturing the uniformly dispersed pre-cardiac embryos on the porous material; and (c) contacting the pre-cardiac embryos captured on the porous material with a development medium for a period of time sufficient to produce cardiac somatic conifer embryos.

Förfarandena enligt föreliggande uppﬁnning kan användas för fram- ställning av hjärtbladsförsedda somatiska embryon från vilket barrträd som helst, såsom medlemmar av släktet Pinus, såsom sydstatsgultall ((loblo|lytall) (Pinus taeda)) och radiatatall. Hjärtbladsförsedda somatiska embryon från douglasgran kan tex också framställas med hjälp av förfarandena enligt före- liggande uppfinning.The methods of the present invention can be used for the production of cardiac somatic embryos from any coniferous tree, such as members of the genus Pinus, such as southern yellow pine ((loblo | lytall) (Pinus taeda)) and radiate pine. Heart-leafed somatic embryos from Douglas fir can also be produced, for example, by the methods of the present invention.

Med hjälp av förfarandena enligt föreliggande uppﬁnning nedsänks ett ﬂertal pre-hjärtbladsförsedda somatiska barrträdsembryon avsedda för ut- strykning ("plating”) i en volym av sterilt utspädningsmedium som är tillräcklig för nedsänkning av åtminstone ytan av det porösa materialet som är anbringat på_det icke-porösa substratet. Mångfalden av pre- hjärtbladsförsedda embryon kan åstadkommas genom användning av de här beskrivna metoderna. Suspensionskulturer av omogna somatiska embryon (pre-hjärtbladsförsedda embryon) kan t ex odlas i ett flytande 10 15 20 25 30 531 226 6 underhållsmedium, varefter cellema får sedimentera. Volymen av sedimenterade celler (SCV) mäts därefter genom användning av vilken lämplig metod som helst, såsom den i Exempel 2 beskrivna metoden. Den önskade mängden sedimenterade celler späds därefter ut med det sterila utspädningsmediet för utstrykning med en önskvärd densitet. Vid vissa utföringsforrner är mängden utspädningsmedium som används för utspädning av SCV baserad på ytarean av utstrykningsstommen i syfte att vara tillräcklig för nedsänkning av åtminstone ytan av det på stommen anbringade porösa materialet. SCV kan tex spädas ut med en mängd av sterilt utspädningsmedium som är minst ca 3-4 gånger eller mer i relation till SCV.Using the methods of the present invention, a plurality of pre-cardiac somatic conifer embryos intended for plating are immersed in a volume of sterile dilution medium sufficient to immerse at least the surface of the porous material applied to the non-porous material. The diversity of pre-cardiac embryos can be achieved using the methods described herein Suspension cultures of immature somatic embryos (pre-cardiac embryos) can be grown, for example, in a liquid maintenance medium, after which the cells are allowed to settle. The volume of sedimented cells (SCV) is then measured using any suitable method, such as the method described in Example 2. The desired amount of sedimented cells is then diluted with the sterile dilution medium for smearing at a desired density. the amount of dilution medium used for diluting SCV b applied to the surface area of the smear body in order to be sufficient to immerse at least the surface of the porous material applied to the body. SCV can, for example, be diluted with an amount of sterile dilution medium that is at least about 3-4 times or more in relation to SCV.

Det sterila utspädningsmediet kan vara vilket lämpligt vätskeformlgt medium som helst som upprätthåller embryonas förmåga att överleva och upprätthålla sin utvecklingsstatus, såsom underhållsmedier eller de såsom exempel angivna utspädningsmedierna som visas nedan i Tabell 2.The sterile dilution medium can be any suitable liquid medium that maintains the ability of the embryos to survive and maintain their developmental status, such as maintenance media or the exemplary dilution media shown in Table 2 below.

Vid vissa utföringsformer av förfarandet stryks de pre-hjärtbladsför- sedda embryona ut med en låg densitet, såsom mindre än ca 0,1 g cellvåtvikt per 6,5 om* (kvadrattum) av utstrykningsarean av poröst material, under an- tagande av en genomsnittlig våtyikt av ca 0,1 g/ml SCV. Den genomsnittliga våtvikten av SCV kan bestämmas såsom beskrivs i Exempel 2. Embryona . kan t ex strykas ut i en mängd av mindre än 0,05 g, eller mindre än 0,025 g cellvåtvikt per 6,5 cmz (kvadrattum) av utstrykningsarean av poröst material.In certain embodiments of the process, the pre-cardiac embryos are plated at a low density, such as less than about 0.1 g cell wet weight per 6.5 om * (square inch) of the porous material plating area, assuming an average wet thickness of about 0.1 g / ml SCV. The average wet weight of the SCV can be determined as described in Example 2. The embryos. can, for example, be spread in an amount of less than 0.05 g, or less than 0.025 g of cell wet weight per 6.5 cm 2 (square inch) of the coating area of porous material.

Vid vissa utföringsforrner stryks de pre-hjärtbladsförsedda embryona ut med en låg densitet inom ett intervall från ca 0,001 g till ca 0,1 g cellvåtvikt per 6,5 cmz (kvadrattum) av utstrykningsarean av poröst material (t ex från 1 ml SCV till 0,01 ml SCV per 6,5 cmz (kvadrattum) av utstrykningsarean av poröst material). Vid .en utföringsform stryks de pre-hjärtbladsförsedda embryona ut med en densitet i intervallet från 0,01 g till ca 0,08 g cellvåtvikt per 6,5 cmz (kvadrattum) av utstrykningsarean av poröst material, såsom från ca 0,02 g till ca 0,05 g cellvåtvikt per 6,5 cmz (kvadrattum) av utstrykningsarean av poröst material.In some embodiments, the pre-cardiac embryos are plated at a low density in the range of about 0.001 g to about 0.1 g of cell wet weight per 6.5 cm 2 (square inch) of the porous material smear area (e.g., from 1 ml SCV to 0 ml). .01 ml SCV per 6.5 cmz (square inch) of the porous material smear area). In one embodiment, the pre-cardiac embryos are plated at a density in the range of from 0.01 g to about 0.08 g of cell wet weight per 6.5 cm 2 (square inch) of the smear area of porous material, such as from about 0.02 g to about 0.05 g cell weight per 6.5 cm 2 (square inch) of the porous material smear area.

Porösa material som är användbara vid utövandet av föreliggande upp- ﬁnning har en pordiameter i området från ca 5 um till ca 1200 um, såsom från ca 50 um till ca 500 um, såsom från ca 70 till ca 150 um, såsom ca 100 um. 10 15 20 25 30 531 226 7 Det porösa materialet är vanligtvis plant och kan ha vilken önskad form och dimension som helst. Formen och dimensionen av det porösa materialet är vald i syfte att underlätta hantering och placering på ett tillväxtsubstrat, såsom ett utvecklingsmedium. Lämpliga former inkluderar kvadratiska, rektangulära eller cirkulära former. Exempel på dimensioner är från en ytarea från ca 90,3 cmz (14 kvadrattum) till 180,6 crnz (28 kvådrattum) eller mer, såsom 322,6 cmz (so kvadrauum), 645,2 cm2 (100 kvaçlranum) upp nu 32251: cm* (soo kvadrattum) eller mer. Föredragna porösa material är steriliserbara och till- räckligt starka för att motstå sönderdelning när materialen lyfts upp i syfte att överföra somatiska embryon efter utstrykning till efterföljande steg vid förfar- andet för produktion av somatiska embryon. Exempel på användbara porösa material inkluderar membraner, nylonﬁbrer, trådnätsväv (”woven mesh”) (t ex nylon, rostfritt stål eller plast) och polymerﬁbrer. Vid vissa utföringsformer är det porösa materialet ej absorberande. Vid vissa utföringsformer är det por- ösa materialet en trådnätsväv, såsom ett trådnät av rostfritt stål eller nylon.Porous materials useful in the practice of the present invention have a pore diameter in the range of from about 5 microns to about 1200 microns, such as from about 50 microns to about 500 microns, such as from about 70 to about 150 microns, such as about 100 microns. The porous material is usually flat and can have any desired shape and dimension. The shape and dimension of the porous material are chosen in order to facilitate handling and placement on a growth substrate, such as a development medium. Suitable shapes include square, rectangular or circular shapes. Examples of dimensions are from a surface area from about 90.3 cm 2 (14 square inches) to 180.6 cm 2 (28 square inches) or more, such as 322.6 cm 2 (so square space), 645.2 cm 2 (100 square inches) up to now 32251 : cm * (soo squared) or more. Preferred porous materials are sterilizable and strong enough to resist decomposition when the materials are lifted for transfer to somatic embryos after plating to subsequent steps in the somatic embryo production process. Examples of useful porous materials include membranes, nylon fibers, woven mesh (eg nylon, stainless steel or plastic) and polymer fibers. In some embodiments, the porous material is non-absorbent. In some embodiments, the porous material is a wire mesh fabric, such as a stainless steel or nylon wire mesh.

Enligt en utföringsfonn av förfarandet enligt uppfinningen används ett poröst material, såsom en trådnätsväv, för utstrykning och uppbäring av växt- vävnad under utvecklingsfasen vid framställning av somatiska växtembryon.According to one embodiment of the method according to the invention, a porous material, such as a wire mesh fabric, is used for smearing and supporting plant tissue during the development phase in the production of somatic plant embryos.

De pre-hjärtbladsförsedda somatiska ernbryona fördelas initiait på ett plant poröst material som är horisontellt anbringat över en icke-porös yta. Den icke- porösa ytan kan vara vilken lämplig steril yta som helst, såsom ytan av ett fast eller halvfast tillväxtmedium, såsom en petriskål innehållande utvecklings- medium, eller vilken annan steril eller steriliserbar yta som helst som har för- måga att kvarhålla vätska, såsom en plast-, gummi- eller glasyta. \f|d vissa utföringsformer är den icke-porösa ytan ett halvfast utvecklingsmedium inne- slutet i en behållare, såsom en cambrobehàllare. Vid vissa utföringsformer är den icke-porösa ytan innesluten i ett bioreaktorkårl, varvid detta bioreaktorkärl är avtappningsbart.The pre-cardiac somatic membranes are initially distributed on a flat porous material which is applied horizontally over a non-porous surface. The non-porous surface may be any suitable sterile surface, such as the surface of a solid or semi-solid growth medium, such as a petri dish containing developing medium, or any other sterile or sterilizable surface capable of retaining liquid, such as a plastic, rubber or glass surface. In some embodiments, the non-porous surface is a semi-solid developing medium enclosed in a container, such as a cambro container. In some embodiments, the non-porous surface is enclosed in a bioreactor vessel, this bioreactor vessel being drainable.

Vid en utföringsform av förfarandet är det porösa materialet fäst på en utstrykningsstomme. Ett representativt exempel på en utstrykningsstomme 10 visas i Figur 1. Såsom framgår av Figur 1 inbegriper utstrykningsstommen 10 ett plant poröst material 20 fästtill en stödram 30 som omger det porösa materialet 20. Eventuella handtag 40A och 40B fästade till stödramen 30 10 15 20 25 30 53 'l 225 8 tillhandahålls också. Utstrykningsstornmen är företrädesvis tillverkad av ster- iliserbara material. Stödramen 30 kan tex vara tillverkad av ett metall- eller plastmaterial: Handtagen 40A och 40B kan vara tillverkade av vilket lämpligt steriliserbart material som helst, såsom tex en autoklaverbar slang. Ett exem- pel på ett förfarande för konstruktion av utstrykningsstommen 10 beskrivs i Exempel 2. Vid en utföringsform är stödramen 30 tillverkad av metall, och det porösa materialet är ett nylontrådnät som fästs till ramen före autoklavering och som krymper måttligt efter autoklavering för àstadkommande av en stram anslutning till ramen och en väsentligen jämn utstrykningsyta.In one embodiment of the method, the porous material is attached to a smear frame. A representative example of a spreader body 10 is shown in Figure 1. As shown in Figure 1, the spreader body 10 includes a flat porous material 20 attached to a support frame 30 surrounding the porous material 20. Any handles 40A and 40B attached to the support frame 30 10 15 20 25 30 53 'l 225 8 is also provided. The spreading storm is preferably made of sterilizable materials. The support frame 30 may, for example, be made of a metal or plastic material: The handles 40A and 40B may be made of any suitable sterilizable material, such as an autoclavable hose. An example of a method of constructing the smear frame 10 is described in Example 2. In one embodiment, the support frame 30 is made of metal, and the porous material is a nylon wire mesh attached to the frame prior to autoclaving and shrinking moderately after autoclaving to provide a tight connection to the frame and a substantially smooth spread surface.

Med hjälp av förfarandena enligt föreliggande uppfinning fördelas ett ﬂertal pre-hjärtbladsförsedda embryon ut på ett poröst material anbringat på en icke-porös yta i en volym av sterilt utspädningsmedium som är tillräcklig för nedsänkning av åtminstone ytan av det porösa materialet. De pre-hjärt- bladsförsedda embryona sprids därigenom enhetligt över den nedsänkta ytan av det porösa materialet. Vid vissa utföringsformer blandas eller skakas de fördelade embryona varsamt för underlättande av spridning av embryona i det sterila utspädningsmediet. Varsam skaknïing kan åstadkommas med hjälp av vilka lämpliga medel som helst, såsom via användning av ett instrument som kommer i kontakt med embryona eller via vibration av det porösa materialet och/eller det icke-porösa substratet. .By means of the methods of the present invention, a number of pre-cardiac embryos are distributed on a porous material applied to a non-porous surface in a volume of sterile dilution medium sufficient to immerse at least the surface of the porous material. The pre-cardiac embryos are thereby spread uniformly over the immersed surface of the porous material. In some embodiments, the distributed embryos are gently mixed or shaken to facilitate dispersal of the embryos in the sterile dilution medium. Gentle shaking can be accomplished by any suitable means, such as through the use of an instrument that contacts the embryos or through vibration of the porous material and / or the non-porous substrate. .

När vä|.de nedsänkta pre-hjärtbladsförsedda embryona är väsentligen enhetligt spridda över det porösa materialet, avlägsnas det sterila utspäd- ningsmediet från det porösa materialet. Vid en utföringsform avlägsnas det sterila utspädningsmediet från det porösa materialet genom vertikal upplyft- ning av det porösa materialet från det icke-porösa substratet, varigenom de enhetligt spridda pre-hjärtbladsförsedda embryona infångas på ytan av det porösa materialet. Det porösa materialet som är fäst till en utstryknings- stomme 10 inbegripande handtag 40A och 40B kan tex lyftas vertikalt med hjälp av handtagen genom användning av vilka lämpliga medel som helst, såsom manuellt eller med hjälp av robotanordningar.When the submerged pre-cardiac embryos are substantially uniformly distributed over the porous material, the sterile dilution medium is removed from the porous material. In one embodiment, the sterile dilution medium is removed from the porous material by vertically lifting the porous material from the non-porous substrate, thereby trapping the uniformly dispersed pre-cardiac embryos on the surface of the porous material. The porous material attached to a spread body 10 including handles 40A and 40B can, for example, be lifted vertically by means of the handles by using any suitable means, such as manually or by means of robotic devices.

Vid en alternativ utföringsform när väl de fördelade pre-hjärtbladsför- sedda embryona är väsentligen enhetligt spridda över det porösa materialet, avlägsnas det sterila utspädningsmediet genom reduktion av volymen av det 10 15 20 25 30 531 226 9 sterila utspädningsmediet till en nivå under ytan för det porösa materialet, var- igenom de enhetligt spridda pre-hjärtbladsförsedda embryona infångas på ytan av det porösa materialet. Volymen av sterilt utspädningsmedium kan reduceras genom användning av vilken metod som helst som undviker stör- ning av spridningen av de utstrukna cellema, såsom sugning, avtappning, avhällning eller läskning av det sterila utspädningsmediet.In an alternative embodiment, once the distributed pre-cardiac embryos are substantially uniformly distributed over the porous material, the sterile dilution medium is removed by reducing the volume of the sterile dilution medium to a level below the surface of the porous material. porous material, whereby the uniformly dispersed pre-cardiac embryos are trapped on the surface of the porous material. The volume of sterile dilution medium can be reduced by using any method that avoids interfering with the spread of the spread cells, such as aspiration, draining, pouring or quenching of the sterile dilution medium.

De enhetligt spridda pre-hjärtbladsförsedda embryona som infångats på ytan av det porösa materialet bringas därefter i kontakt med utvecklings- mediet under en tidsperiod som är tillräcklig för framställning av hjärtbladsför- sedda somatiska barrträdsembyon.The uniformly dispersed pre-cardiac embryos captured on the surface of the porous material are then contacted with the development medium for a period of time sufficient to produce cardiac somatic conifer embryos.

Vid en utföringsform bringas det porösa materialet i antingen kontinuer- lig eller tillfällig kontakt med det ﬂytande utvecklingsmediet. Det porösa mater- ialet kan t ex placeras på en absorbentdyna som är indränkt i utvecklings- medium pà så sätt att utvecklingsmediet passerar genom det porösa material- et och kommer i kontakt med embryona. Det porösa materialet, såsom ett nylontràdnät som uppbär embryoceller, är vanligtvis inneslutet i ett tillslutet ut- rymme innehållande en fuktig atmosfär som säkerställer att embryona förblir fuktiga. Vid en annan utföringsfonn är det porösa materialet anbringat på ett tillväxtsubstrat inbegripande fasta eller halvfasta utvecklingsmedier.In one embodiment, the porous material is brought into either continuous or temporary contact with the surface developing medium. The porous material can, for example, be placed on an absorbent pad which is soaked in development medium in such a way that the development medium passes through the porous material and comes into contact with the embryos. The porous material, such as a nylon wire mesh carrying embryonic cells, is usually enclosed in an enclosed space containing a humid atmosphere which ensures that the embryos remain moist. In another embodiment, the porous material is applied to a growth substrate including solid or semi-solid development media.

Utvecklingsmediet som skall användas vid förfarandena enligt föreligg- ande uppfinning innehåller näringsämnen som upprätthåller de somatiska embryona. Maltos och glukoskan vara inkluderade i utvecklingsmediet som huvudsaklig eller enda sockerkälla för desomatiska embryona. Användbara maltos- och glukoskoncentrationer ligger 'i området från ca 1% till ca 2,5%.The development medium to be used in the methods of the present invention contains nutrients that maintain the somatic embryos. Maltose and glucoscan be included in the development medium as the main or only source of sugar for the desomatic embryos. Useful maltose and glucose concentrations range from about 1% to about 2.5%.

Lämpliga utvecklingsmedier inkluderar vanligtvis inte några tillväxtbefrämj- ande hormoner, såsom auxiner och cytokiner, men kan inkludera hormonet abscisinsyra. :När abscisinsyra används i utvecklingsmediet utnyttjas det vanligtvis i en: koncentration i området från ca 1 mg/I till ca 200 mg/I. Utveck- lingsmediet kan innehålla gellangummi, som vanligtvis föreligger i en koncen- tration av upp till ca 0,40%. Osmolaliteten för utvecklingsmediet kan justeras till ett värde som faller inom ett önskat område genom användning av osmos- reglerande ämnen, såsom PEG med en molekylvikt av 8000, såsom från ca 250 mM/kg till ca 450 mM/kg. Vanligtvis är en osmolalitet av 300-350 mM 10 15 20 25 30 53 'l 226 10 eller mer fördelaktigt. Ett exempel på ett lämpligt ﬂytande eller fast utveck- lingsmedium visas i Exempel 1 och Exempel 2.Suitable developmental media usually do not include any growth-promoting hormones, such as auxins and cytokines, but may include the hormone abscisic acid. When abscisic acid is used in the development medium, it is usually used in a: concentration in the range from about 1 mg / L to about 200 mg / L. The development medium may contain gellan gum, which is usually present in a concentration of up to about 0.40%. The osmolality of the development medium can be adjusted to a value that falls within a desired range by using osmosis regulators, such as PEG having a molecular weight of 8000, such as from about 250 mM / kg to about 450 mM / kg. Generally, an osmolality of 300-350 mM or more is more advantageous. An example of a suitable surface or solid development medium is shown in Example 1 and Example 2.

Pre-hjärtbladsförsedda somatiska barrtrådsembryon kan t ex odlas på ett poröst material, såsom ett nylontrådnåt eller -membran som står i åtmin- stone tillfällig ákontakt med utvecklingsmediet, under en period av från 4 veck- or till 14 veckor, såsom från 8 veckor till 12 veckor, eller såsom ca 12 veckor, vid en temperatur av från 10°C till 30°C, såsom från 15°C till 25°C, eller så- som från 20°.C till 23°C.Pre-cardiac somatic coniferous embryos can be grown, for example, on a porous material, such as a nylon wire mesh or membrane that is in at least temporary contact with the development medium, for a period of from 4 weeks to 14 weeks, such as from 8 weeks to 12 weeks. weeks, or such as about 12 weeks, at a temperature of from 10 ° C to 30 ° C, such as from 15 ° C to 25 ° C, or such as from 20 ° C to 23 ° C.

Vid en utföringsform odlas de pre-hjärtbladsförsedda somatiska barr- trädsembryona pà ett poröst material som ståri kontakt med ett flytande ut- vecklingsmedium som är anbringat på ett absorbentsubstrat, såsom ett sub- strat tillverkat av cellulosa (t ex cellulosaﬁbrer), såsom ett eller flera ﬁlter- papper, eller något annat absorbentmaterial. Substratet absorberar det ﬂyt- ande utvecklingsmediet, som passerar genom det på substratet anbringade porösa materialet och kommer i kontakt med de på det porösa materialet anbringade pre-hjärtbladsförsedda somatiska barrträdsembryona. Utveck- lingsmediet befrämjar utveckling av de pre-hjärtbladsförsedda somatiska barrträdsembryona för bildning av hjärtbladsförsedda somatiska embryon.In one embodiment, the pre-cardiac somatic conifer embryos are grown on a porous material in contact with a liquid developing medium applied to an absorbent substrate, such as a substrate made of cellulose (eg cellulose fibers), such as one or more ter filter paper, or any other absorbent material. The substrate absorbs the surface developing medium which passes through the porous material applied to the substrate and comes into contact with the pre-cardiac somatic coniferous embryos applied to the porous material. The development medium promotes the development of the pre-cardiac somatic conifer embryos for the formation of cardiac somatic embryos.

Vid en annan utföringsforrn odlas de pre-hjärtbladsförsedda somatiska barrträdsembryona på ett poröst materialsom står i kontakt med ett ﬂytande utvecklingsmedium genom användning av ett spridningsmunstycke som be- sprutar det porösa materialet med utvecklingsmedium. De somatiska em- bryona är anbringade på en övre yta av det porösa materialet, och den mot- satta undre ytan av det porösa materialet besprutas med ﬂytande utvecklings- medium. Som ett ytterligare exempel kan det porösa materialet som uppbär somatiska embryon anbringas över det ﬂytande utvecklingsmediet i vilket ﬁnns en roterande omrörarstav som roterar tillräckligt snabbt för att spruta upp ﬂytande utvecklingsmedium på den undre ytan av det porösa materialet. l en annan aspekt tillhandahålls med föreliggande uppfinning förfaran- den för framställning av hjärtbladsförsedda somatiska barrträdsembryon med utgångspunkt från somatiska barrträdsceller. Förfarandena enligt denna as- pekt av uppfinningen inkluderar steget av (a) odling av somatiska barrträds- celler i ett induktionsmedium för erhållande av embryogena celler, (b) odling 10 15 20 25 30 531 226 11 av de vid steg (a) framställda embryogena cellerna i ett ﬂytande underhålls- medium för bildning av pre-hjärtbladsförsedda somaliska barrträdsembryon, (c) fördelning av ett flertal pre-hjärtbladsförsedda embryon som framställts vid steget (b) på ett poröst material anbringat över en icke-porös yta i en volym av sterilt utspädningsmedium som är tillräcklig för nedsänkning av åtminstone ytan av det porösa materialet, varigenom de pre-hjärtbladsförsedda embryo- na sprids enhetligt, (d) avlägsnande av det sterila utspädningsmediet från det porösa materialet, varigenom de enhetligt spridda pre-hjärtbladsförsedda embryona infångas på det porösa materialet, och (e) kontakt mellan de på det porösa materialet infångade pre-hjärtbladsförsedda embryona och utveck- lingsmediet under en tidsperiod som är tillräcklig för framställning av hjärt- bladsförsedda somatiska barrträdsembryon.In another embodiment, the pre-cardiac somatic coniferous embryos are grown on a porous material in contact with a surface developing medium using a spreading nozzle which sprays the porous material with developing medium. The somatic embryos are applied to an upper surface of the porous material, and the opposite lower surface of the porous material is sprayed with ﬂ surface developing medium. As a further example, the porous material carrying somatic embryos can be applied over the surface developing medium in which there is a rotating agitator rod which rotates fast enough to spray surface developing medium onto the lower surface of the porous material. In another aspect, the present invention provides methods for producing cardiac somatic conifer embryos based on somatic conifer cells. The methods of this aspect of the invention include the step of (a) culturing somatic conifer cells in an induction medium to obtain embryogenic cells, (b) culturing the embryogens prepared in step (a). the cells in a surface maintenance medium for the formation of pre-cardiac Somali conifer embryos; dilution medium sufficient to immerse at least the surface of the porous material, thereby uniformly spreading the pre-cardiac embryos; the material, and (e) contact between the pre-cardiac embryos trapped on the porous material and the development medium over a period of time. period sufficient for the production of heart-bearing somatic conifer embryos.

Vid vissa utföringsformer odlas således somatiska barrträdsceller i eller på ett induktionsmedium för erhållande av embryogena celler. Embryogena celler har förmåga att producera ett eller ﬂera hjärtbladsförsedda somatiska barrträdsembryon. Exempel på embryogena celler är embryonala suspensor- massor (ESM). Y induktionsmediet inkluderar vanligtvis oorganiska salter och organiska näringsämnesmaterial. Osmolaliteten för induktionsmediet är vanligtvis ca 160 mM/kg eller t o m lägre, men kan vara så hög som 170 mM/kg. induk- tionsmediet inkluderar vanligtvis tillväxthorrnoner. Exempel på hormoner som kan inkluderas i induktionsmediet är auxiner (t ex 2,4-diklorfenoxiättiksyra (2,4-D)) och cytokininer (t ex 6-bensylaminopurin (BAP)). Auxiner kan tex användas i en koncentration från 1 mg/I till 200 mgll. Cytokininer kan tex an- vändas i en koncentration från 0,1 mg/l till 10 mgll. induktionsmediet kan innehålla en adsorbentkomposition, särskilt när mycket höga halter av tillväxthorrnoner används. Adsorbentkompositionen kan vara vilken komposition som helst som inte är toxisk för de embryogena cellerna vid de koncentrationer som utnyttjas vid utövandet av de aktuella för- farandena och som har förmåga att adsorbera tillväxtbefrämjande hormoner och toxiska föreningar som produceras av växtoellerna under embryoutveck- ling, vilka är närvarande i mediet. Ej begränsande exempel på användbara adsorbentkompositioner inkluderar aktivt kol, lösligt poly(vinylpyrrolidon), “ 10 15 20 25 30 531 226 12 olösligt poly(vinylpyrrolidon), aktiverad aluminiumoxid och silikagel. Adsor- bentkompositionen kan föreligga i en mängd av t ex från ca 0,1 g/l till ca 5 gll. lnduktionsmediet är vanligtvis fast och kan solidiﬁeras genom inklusion av ett gelningsmedel. Ett exempel på ett induktionsmedium som är användbart vid utövandet av föreliggande uppﬁnning beskrivs i Exempel 1.Thus, in certain embodiments, somatic conifer cells are cultured in or on an induction medium to obtain embryogenic cells. Embryogenic cells are capable of producing one or more of their heart-shaped somatic coniferous embryos. Examples of embryogenic cells are embryonic suspensory masses (ESM). The induction medium usually includes inorganic salts and organic nutrients. The osmolality of the induction medium is usually about 160 mM / kg or even lower, but can be as high as 170 mM / kg. the induction medium usually includes growth hormones. Examples of hormones that can be included in the induction medium are auxins (eg 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D)) and cytokinins (eg 6-benzylaminopurine (BAP)). Auxins can be used, for example, in a concentration from 1 mg / l to 200 mg / l. Cytokinins can be used, for example, in a concentration from 0.1 mg / l to 10 mg / l. the induction medium may contain an adsorbent composition, especially when very high levels of growth hormones are used. The adsorbent composition may be any composition which is non-toxic to the embryogenic cells at the concentrations used in the practice of the present processes and which is capable of adsorbing growth-promoting hormones and toxic compounds produced by the plant cells during embryonic development, which are present in the medium. Non-limiting examples of useful adsorbent compositions include activated carbon, soluble poly (vinylpyrrolidone), insoluble poly (vinylpyrrolidone), activated alumina and silica gel. The adsorbent composition may be present in an amount of, for example, from about 0.1 g / l to about 5 g / l. The induction medium is usually solid and can be solidified by the inclusion of a gelling agent. An example of an induction medium useful in the practice of the present invention is described in Example 1.

Somatiska barrträdsceller odlas vanligtvis i eller på ett induktions- medium under en period av från 3 veckor till 12 veckor, såsom från 8 veckor till 10 veckor, eller ca 8 veckor, vid en temperatur av från 10°C till 30°C, så- som från 15°C till 25°C, eller såsom från 20°C till 23°C.Somatic coniferous cells are usually grown in or on an induction medium for a period of from 3 weeks to 12 weeks, such as from 8 weeks to 10 weeks, or about 8 weeks, at a temperature of from 10 ° C to 30 ° C, so as from 15 ° C to 25 ° C, or as from 20 ° C to 23 ° C.

Underhållsmedlet kan vara ett fast medium, eller kan det vara ett flyt- ande medium som kan omröras för befrämjande av tillväxt och förökning av den embryogena vävnaden. Osmolaliteten för underhållsmediet är vanligtvis högre än osmolaliteten för induktionsmediet och ligger vanligtvis i området 180-400 mM/kg. Underhållsmediet kan innehålla näringsämnen som upprätt- håller den embryogena vävnaden och kan inkludera hormoner, såsom en eller flera auxiner och/eller cytokininer, som befrämjar celldelning och tillväxt av embrogen vävnad. Koncentrationen av homioner i underhållsmediet är vanligtvis lägre än koncentrationen däravi lnduktionsmediet.The maintenance agent may be a solid medium, or it may be a liquid medium which can be agitated to promote growth and proliferation of the embryogenic tissue. The osmolality of the maintenance medium is usually higher than the osmolality of the induction medium and is usually in the range 180-400 mM / kg. The maintenance medium may contain nutrients that maintain the embryogenic tissue and may include hormones, such as one or more auxins and / or cytokinins, which promote cell division and growth of embryonic tissue. The concentration of homions in the maintenance medium is usually lower than the concentration thereof in the induction medium.

Det är i allmänhet önskvärt, dock ej nödvändigt, att inkludera maltos som enda eller huvudsaklig metaboliserbar sockerkälla i underhållsmediet.It is generally desirable, but not necessary, to include maltose as the sole or major metabolizable sugar source in the maintenance medium.

Exempel på användbara maltoskoncentrationer ligger inom området från ca 1% till ca 2,5%. Ett exempel på ett lämpligt underhållsmedium beskrivs i Exempel 1 nedan. j Embryogena barrträdsceller odlas 'vanligtvis i eller på ett underhålls- medium under en tidsperiod av upp till 6 månader genom subodling varje vecka vid en temperatur från 10°C till 30°C, såsom från 15°C till 25°C, eller såsom från 20°C till 23°C.Examples of useful maltose concentrations range from about 1% to about 2.5%. An example of a suitable maintenance medium is described in Example 1 below. Embryogenic coniferous cells are usually grown in or on a maintenance medium for a period of up to 6 months by subculturing weekly at a temperature of from 10 ° C to 30 ° C, such as from 15 ° C to 25 ° C, or as from 20 ° C to 23 ° C.

Embryogena barrträdsceller överförs vanligtvis till färskt underhålls- medium en gång per vecka eller när tillväxten förbrukat mediumkomponent- erna.Embryogenic coniferous cells are usually transferred to fresh maintenance medium once a week or when the growth has consumed the medium components.

Användbara utvecklingsmedier beskrivs ovan. Efter odling vid kontinu- erlig eller periodvis kontakt med utvecklingsmedium, kan de somatiska hjärt- 10 15 20 25 30 531 226 13 bladsförsedda embryona eventuellt överföras till ett mognadsmedium och därefter till ett stratiﬁeringsmedium under en ytterligare odllngsperiod.Useful development media are described above. After culturing by continuous or periodic contact with development medium, the somatic cardiac embryos may be transferred to a maturation medium and then to a stratification medium for an additional culture period.

Förfarandena enligt föreliggande uppﬁnning kan tex användas för produktion av' kloner av individuella barrträd med en eller ﬂera önskvärda egenskaper, såsom hög tillväxthastighet. I en aspekt tillhandahålls med före- liggande uppﬁnning således förfaranden för framställning av en population av genetiskt identiska hjärtbladsförsedda somatiska barrträdsembryon. Förfaran- dena enligt denna aspekt av uppﬁnningen inkluderar vart och ett steget av odling av genetiskt identiska pre-hjärtbladsförsedda somatiska barrträds- embryon på ett poröst material (t ex ett poröst nylontrâdnät) som står i kon- tinuerlig eller periodvis kontakt med ett utvecklingsmedium under en tids- period som är tillräcklig för produktion av genetiskt identiska hjärtbladsför- sedda somatiska barrträdsembryon med utgångspunkt från pre-hjärtb|ads- försedda somatiska embryon, varvid utvecklingsmediet passerar genom det porösa materialet och kommer i kontakt med de somatiska embryona.The methods of the present invention can be used, for example, for the production of clones of individual conifers with one or more desirable properties, such as high growth rate. In one aspect, the present invention thus provides methods for producing a population of genetically identical heart-leafed somatic conifer embryos. The methods of this aspect of the invention include each step of culturing genetically identical pre-cardiac somatic conifer embryos on a porous material (e.g., a porous nylon filament) that is in continuous or periodic contact with a developing medium under a a sufficient period of time for the production of genetically identical cardiac somatic conifer embryos based on pre-cardiac somatic embryos, the development medium passing through the porous material and coming into contact with the somatic embryos.

De hjärtbladsförsedda somatiska barrträdsembryona som framställts genom användning av förfarandena enligt föreliggande uppﬁnning kan even- tuellt underkastas groning för bildning av barrträdsplantor, som kan odlas till barrträd, om så är önskvärt. De hjärtblladsförsedda embryona kan också placeras i artiﬁciella frön för efterföljande groning. De hjärtbladsförsedda somatiska barrträdsembryona kan t ex underkastas groning på ett fast gro- ningsmedium, såsom det i Exempel 2 nedan beskrivna groningsmediet. De grodda plantorna kan överföras till jord för ytterligare tillväxt. De grodda plantorna kant ex planteras i jord i ett växthus och tillåtas växa innan de förflyttas till ett ställe utomhus. De hjärtbladsförsedda somatiska embryona belyses vanligtvis för stimulering av groningen. Vanligtvis utförs samtliga av stegen vid förfarandena enligt föreliggande uppﬁnning i mörker, bortsett från groning. i Vid förfarandena enligt föreliggande uppﬁnning erhålls ett högre utbyte av somatiska barrträdsembryon per utstrykningsytarea jämfört med en ekvi- valent metod vid vilken de embryogena cellerna stryks ut med en högre den- sitet och/eller i närvaro av överskottsvätska, såsom beskrivs ytterligare i Exempel 2 och 3 nedan. 10 15 20 531 226 14 Förfarandena enligt föreliggande uppﬁnning kan t ex användas för framställning av kloner av individuella barrträd som har en eller flera önskade egenskaper, såsom hög tillväxthastighet. De här beskrivna förfarandena kan användas för framställning av populationer av genetiskt identiska mogna somatiska barrträdsembryon.The heart-leafed somatic coniferous embryos prepared using the methods of the present invention may be subjected to germination to form coniferous plants which can be grown into conifers, if desired. The heart-leafed embryos can also be placed in artificial seeds for subsequent germination. The heart-shaped somatic coniferous embryos can, for example, be subjected to germination on a solid germination medium, such as the germination medium described in Example 2 below. The germinated plants can be transferred to soil for further growth. The sprouted plants edge ex are planted in soil in a greenhouse and allowed to grow before being moved to a place outdoors. The heart-bearing somatic embryos are usually illuminated to stimulate germination. Usually, all of the steps of the procedures of the present invention are performed in the dark, except germination. In the methods of the present invention, a higher yield of somatic conifer embryos per smear area is obtained compared to an equivalent method in which the embryogenic cells are smeared with a higher density and / or in the presence of excess fluid, as further described in Example 2 and 3 below. The methods of the present invention can be used, for example, to produce clones from individual conifers having one or more desired properties, such as high growth rate. The methods described herein can be used to produce populations of genetically identical mature somatic conifer embryos.

Följande exempel endast belyser det för närvarande bästa sättet att utöva uppﬁnningen och bör inte tolkas som begränsande för uppﬁnningen.The following examples only illustrate the currently best way to exercise the exercise and should not be construed as limiting the exercise.

Exemgel 1 I detta exempel visas ett representativt förfarande enligt uppfinningen för framställning av somatiska tallembryon från sydstatsgultall (Ioblollytall).Example Gel 1 This example shows a representative process according to the invention for the preparation of somatic pine embryos from southern yellow pine (Ioblolly pine).

Hongametofyter innehållande zygotiska embryon avlägsnas från frön fyra till fem veckor efter befruktning. Fröhöljena avlägsnas, men embryona dissekeras inte ut ytterligare från den omgivande gametofyten mer än att den nucellära änden skärs ut. Kottama ("cones”) förvarades vid 4°C fram till an- vändning. Omedelbart före avlägsnande av de omogna embryona, steriliseras fröerna genom användning av en initial tvättnings- och detergensbehandling, följt av sterilisering under 10 min i 15% H2O2. Explantaten tvättades utförligt med sterilt destillerat vatten efter varje behandling. l Tabell 1 och 2 beskrivs exempel på sammansättningar av medier som är användbara för framställning av somatiska tallembryon. 531 225 15 Tabell 1 Basmedium för Pinus taeda Beståndsdel Koncentration N 1 0 909 9 136 1 236 50 0 246 5 256 5 50 0 4 15 15 5 10 5 14 4 0 125 0 125 0125 27 86 37 36 30 000 200 500 L min 1000 Tiamin-HCI 1 00 n-HCI 0 50 N 0 50 00 Gelrite* 1600 5 7 * Används om ett fast medium är önskvärt. 531 226 16 Tabell 2 Sammansättning av medier för olika behandlingssteg BM1-- induktionsmedium BM+2,4-D (15 uM)+kinetin (2 uM)+BAP (2 pM).Hongamethophytes containing zygotic embryos are removed from seeds four to five weeks after fertilization. The seed coatings are removed, but the embryos are not dissected further from the surrounding gametophyte other than the nuclear end is excised. The cones were stored at 4 ° C until use Immediately before removal of the immature embryos, the seeds were sterilized using an initial wash and detergent treatment, followed by sterilization for 10 minutes in 15% H 2 O 2. tables 1 and 2 describe examples of compositions of media useful for the preparation of somatic pine embryos. 246 5 256 5 50 0 4 15 15 5 10 5 14 4 0 125 0 125 0125 27 86 37 36 30 000 200 500 L min 1000 Thiamine-HCl 1 00 n-HCl 0 50 N 0 50 00 Gelrite * 1600 5 7 * Used if a solid medium is desired 531 226 16 Table 2 Composition of media for different treatment steps BM1-- induction medium BM + 2,4-D (15 μM) + kinetin (2 μM) + BAP (2 pM).

BM-g - underhållsmedium BM+2,4-D (5 pM)+kinetin (0,5 pM)+BAP (0,5 uM).BM-g - maintenance medium BM + 2,4-D (5 pM) + kinetin (0.5 pM) + BAP (0.5 μM).

GELRITE (1600 mg/l) tillsätts när ett fast medium är önskvärt Utspädningsmedium BM + 10 mg/ml abscisinsyra + 100-1000 mg/mi ytterligare myoinositol, + 2,5% maltos. Följande aminosyrablandning tillsätts: L-prolin (100 mgll), L- asparagin (100 mgll), L-arginin (50 mg/I), L-alanin (20 mg/I) och L-serin (20 mg/l). Företrädesvis ﬁnns inga underhâllshormoner närvarande.GELRITE (1600 mg / l) is added when a solid medium is desired Dilution medium BM + 10 mg / ml abscisic acid + 100-1000 mg / ml additional myoinositol, + 2.5% maltose. The following amino acid mixture is added: L-proline (100 mg / l), L-asparagine (100 mg / l), L-arginine (50 mg / l), L-alanine (20 mg / l) and L-serine (20 mg / l). Preferably no maintenance hormones are present.

BM3 - utvecklingsmedium BM+25 mg/l abscisinsyra + 12% PEG-8000 + 800 mg/I ytterligare myoinositol + 0,1% aktiverad träkol + 1% glukos + 2,5% maltos. Följande amino- syrablandning tillsätts: L-prolin (100 mgll), L- asparagin (100 mgll), L-arginin (50 mg/I), L-alanin (20 mg/I) och L-serin (20 mg/l). GELRITE (2500 mgjl) tillsätts när ett fast medium är önskvärt BM5 - stratiﬁeringsmedium BM3 modifierat genom uteslutning av abscisinsyra, och PEG-8000. GELRITE (2500 mg/l) tillsätts när ett fast medium är önskvärt.BM3 - development medium BM + 25 mg / l abscisic acid + 12% PEG-8000 + 800 mg / I additional myoinositol + 0.1% activated charcoal + 1% glucose + 2.5% maltose. The following amino acid mixture is added: L-proline (100 mg / l), L-asparagine (100 mg / l), L-arginine (50 mg / l), L-alanine (20 mg / l) and L-serine (20 mg / l ). GELRITE (2500 mg / ml) is added when a solid medium is desired BM5 - stratification medium BM3 modified by exclusion of abscisic acid, and PEG-8000. GELRITE (2500 mg / l) is added when a solid medium is desired.

BMG - groningsmedium BM modifierat genom ersättning av maltos med 2% sackaros. Myoinositol reduceras till 100,0 mgll, och glutamin och kasaminosyror reduceras till 0,0 mg/l. FeSO4'7H2O reduceras till 13,9 mg/I och NagEDTA reduceras till 18,6 mgll, Agar i en - halt av 0,8% och aktiverat träkol i en halt av 0,25% tillsätts.BMG - germination medium BM modified by replacing maltose with 2% sucrose. Myoinositol is reduced to 100.0 mg / l, and glutamine and casamino acids are reduced to 0.0 mg / l. FeSO4'7H2O is reduced to 13.9 mg / l and NagEDTA is reduced to 18.6 mg / l, Agar in a content of 0.8% and activated charcoal in a content of 0.25% are added.

Induktion: sterila gametofyter med intakta embryon placeras på ett fast BM1-odlingsmedium och förvaras i en miljö av 22-25°C under en mörk foto- period av 24 h under en tidsperiod av 3-5 veckor. Tidslängden beror på den särskilda genotyp som odlas. Vid slutet av denna tidsperiod bildas en slem- artad massa associerad med ursprungsexplantaten. Mikroskopisk undersök- ning avslöjar vanligtvis åtskilliga embryon i ett tidigt skede associerade med massan. Dessa karaktäriseras i allmänhet som att ha en lång tunnväggig sus- pensor associerad med ett litet huvud med tät cytoplasma och stora kämor. 10 15 20 25 30 35 531 225 17- Osmolaliteten för induktionsmediet kan i vissa fall vara så hög som 150 mM/kg. Vanligtvis är den ca 120 mM/kg eller t o m lägre (såsom 110 mM/kg).Induction: sterile gametophytes with intact embryos are placed on a solid BM1 culture medium and stored in an environment of 22-25 ° C for a dark photo period of 24 hours for a period of 3-5 weeks. The length of time depends on the particular genotype being grown. At the end of this time period, a mucous mass associated with the original explants is formed. Microscopic examination usually reveals several embryos at an early stage associated with the mass. These are generally characterized as having a long thin-walled suspension associated with a small head with a dense cytoplasm and large nuclei. 10 15 20 25 30 35 531 225 17- The osmolality of the induction medium can in some cases be as high as 150 mM / kg. Usually it is about 120 mM / kg or even lower (such as 110 mM / kg).

Upprätthållande och förökning av pre-hjärtbladsförsedda embryon: Embryon i ett tidigt skede som avlägsnats från massorna som bildats vid in- duktionssteget placeras först på ett gelat BM-g-underhålls- och -föröknings- medium. Detta skiljer sig från induktionsmediet i det att tillväxthorrnonerna (både auxiner och cytokininer) är reducerade med åtminstone en fullständig storleksordning. Osmolaliteten för detta medium är 130 mM/kg eller högre (vanligtvis inom omrâdet ca 120-150 mM/kg för Pinus taeda). Temperaturen är även här 22-25°C i mörker. Embryon odlas under 12-14 dagar på det fasta BMZ-mediet före överföring till ett vätskeforrnigt medium för ytterligare sub- odling. Detta vätskeformiga medium har samma sammansättning som BM2, men saknar gelningsmedlet. Embryona hari slutet av underhållssteget på fast medium vanligtvis liknande utseende som de från induktionssteget. Efter sub- odlingar under 5-6 veckor på det vätskeformiga underhållsmediet har långt framskridna embryon i det tidiga skedet bildats. Dessa karaktäriseras av jäm- na embryonala huvuden, som uppskattas att vanligtvis ha mer än 100 indivi- duella celler med multipla suspensorer.Maintenance and reproduction of pre-cardiac embryos: Early-stage embryos removed from the masses formed at the induction stage are first placed on a gelled BM-g maintenance and propagation medium. This differs from the induction medium in that the growth hormones (both auxins and cytokinins) are reduced by at least a full order of magnitude. The osmolality of this medium is 130 mM / kg or higher (usually in the range of about 120-150 mM / kg for Pinus taeda). The temperature here too is 22-25 ° C in the dark. Embryos are grown for 12-14 days on the solid BMZ medium before transfer to a liquid medium for further subculture. This liquid medium has the same composition as BM2, but lacks the gelling agent. The embryos at the end of the solid medium maintenance stage usually have a similar appearance to those from the induction stage. After subculturing for 5-6 weeks on the liquid maintenance medium, advanced embryos have formed in the early stages. These are characterized by even embryonic heads, which are estimated to usually have more than 100 individual cells with multiple suspensions.

Embryoutveckling: Embryoutvecklingen utförs genom användning av systemet som visas nedan i Exempel 2 och 3.Embryo development: Embryo development is performed using the system shown below in Examples 2 and 3.

Den osmotiska potentialen för detta utvecklingsmedium kan ökas väs- entligen jämfört med den för underhållsmediet. Det har visat sig vara fördel- aktigt att ha en så hög osmolalitet som 350 mM/kg eller t o m högre. Utveck- lingen utförs företrädesvis i fullständigt mörker vid en temperatur av 22-25°C tills hjärtbladsförsedda embryon har utvecklats. Utvecklingstiden är vanligtvis flera veckor, såsom 7-12 veckor.The osmotic potential of this development medium can be significantly increased compared to that of the maintenance medium. It has proven to be advantageous to have an osmolality as high as 350 mM / kg or even higher. The development is preferably carried out in complete darkness at a temperature of 22-25 ° C until cardiac embryos have developed. The development period is usually several weeks, such as 7-12 weeks.

Stratiﬁering: Hjärtbladsförsedda embryon singulariseras och överförs till stratifieringsmediet BM5. Detta medium är likartat utvecklingsmediet, men saknar abscisinsyra, PEG-8000 och gellangummi. Embryon odlas på strati- ﬁeringsmediet vid mellan ca 1°C och ca 10°C i mörker under mellan 3 och 6 veckor.Stratification: Cardiac embryos are singularized and transferred to the BM5 stratification medium. This medium is similar to the development medium, but lacks abscisic acid, PEG-8000 and gellan gum. Embryos are grown on the stratification medium at between about 1 ° C and about 10 ° C in the dark for between 3 and 6 weeks.

Konditionering över vatten: Demogna embryona som fortfarande be- ﬁnner sig på den porösa bäraren lyfts bort från tillväxtsubstratet och placeras i en sluten behållare över H20 vid en relativ fuktighet av 97% under en period av ca 3 veckor.Conditioning over water: The mature embryos that are still on the porous support are lifted away from the growth substrate and placed in a closed container over H 2 O at a relative humidity of 97% for a period of about 3 weeks.

Groning: De konditionerade mogna embryona placerades på fast BMB- medium för groning. Detta är ett basmedlum som saknar tillväxthorrnoner och 10 15 20 25 30 531 226 18» som har modiﬁerats genom reduktion av sackaros, myoinositol och organiskt kväve. Embryona inkuberas på BMG-medium under en tillräcklig tid vid omgiv- ande betingelser av 23-25°C tills de resulterande småplantoma har ett väl utvecklat rotämne och en dito hypokotyl samt grön hjärtbladsstruktur och epikotyl. 4 _ » På grund av den reducerade kolhydratkoncentrationen är den osmot- iska potentialen för groningsmediet ytterligare reducerad till under den för ut- vecklingsmediet. Den är vanligtvis lägre än ca 150 mM/kg (såsom ca 100 mM/kg).Germination: The conditioned mature embryos were placed on solid BMB medium for germination. This is a base medium that lacks growth hormones and has been modified by the reduction of sucrose, myoinositol and organic nitrogen. The embryos are incubated on BMG medium for a sufficient time at ambient conditions of 23-25 ° C until the resulting seedlings have a well-developed root substance and a ditto hypocotyl as well as green heart leaf structure and epicotyl. 4 »» Due to the reduced carbohydrate concentration, the osmotic potential of the germination medium is further reduced to below that of the development medium. It is usually lower than about 150 mM / kg (such as about 100 mM / kg).

Exemgel 2 'i I detta exempel beskrivs konstruktionen av ett exempel på en utstryk- ningsstomme och användning enligt en utföringsforrn av förfarandet enligt föreliggande uppﬁnning.Example Gel 2 'i This example describes the construction of an example of a smear frame and use according to an embodiment of the method of the present invention.

Konstruktion av en utstrykningsstomme: En utstrykningsmetallstomme konstruerades, till vilken ett nylontrådnät av 100 um fästes med hjälp av sili- kon. Utstrykningsstommen (10) visas i Figur 1. Vid utföringsfonnen av utstryk- ningsstommen (10) som visas i Figur 1 är nylontrådnätet (20) rektanguiärt till formen och har en längd av 17,8 cm (7 tum) och en bredd av 10,2 cm (4 tum), varvid den exponerade ytarean är 180,6 cmz (28 kvadrattum). Handtag av slang (40A och 40B) fästes till metallramen (30) för underlättande av förflytt- ning av utstrykningsstommen (10). En silikonsträng tillfördes längs kanten av ramen och över mitten av ramen för åstadkommande av tvâ åtskilda utstryk- ningsytor med likvärdig storlek (ej visat). Utstrykningsstommen (10) autoklav- erades därefter, vilket resulterade i en stram utstrykningsyta p g a krympning av nylontrådnätet (20) på metallramen (30) under autoklaveringen.Construction of a spreading frame: A spreading metal frame was constructed, to which a 100 μm nylon wire mesh was attached by means of silicone. The spreader body (10) is shown in Figure 1. In the embodiment of the spreader body (10) shown in Figure 1, the nylon wire mesh (20) is rectangular in shape and has a length of 17.8 cm (7 inches) and a width of 10, 2 cm (4 inches), with the exposed surface area being 180.6 cmz (28 square inches). Hose handles (40A and 40B) are attached to the metal frame (30) to facilitate movement of the ironing body (10). A silicone string was applied along the edge of the frame and over the center of the frame to provide two spaced-apart smoothing surfaces (not shown). The spreader body (10) was then autoclaved, resulting in a tight spreading surface due to shrinkage of the nylon wire mesh (20) on the metal frame (30) during autoclaving.

Utstrykning av celler på utstrykningsstommen: Beredning av SCV för utstrykning: Somatiska barrträdsembryoceller av genotyp A sorn odlats i proliferationsmedium (framställt såsom beskrivs i Tabell 4) i Erlemeyerkolvar av 1 I ﬁck sedimentera. Volymen av sedimentera- de celler (SC\_/) mättes genom dragning av en linje på kolven, och superna- tanten ovanför de sedimenterade oellemá avlägsnades med hjälp av en stav av sintrat glas under aspiration. De sedirnenterade cellerna återsuspendera- des i en komplementerande mängd av 3 SCV av sterilt utspädningsmedium, som framställts såsom beskrivs i Exempel 1. 10 15 20 25 531 225 19 Bestämning av våtvikten av SCV: I syfte att bestämma våtvikten av SCV, mättes SCV såsom beskrivits ovan. Supematanten avlägsnades där- efter genom användning av en Buchner-tratt (33,0 mm (13 tum) Hg), och 1 ml av SCV-provet placerades på ett i förväg vägt och befuktat filterpapper av kvaliteten VW'R_417. Viktmätningar utfördes vid en ﬁxerad tidpunkt (30 sek) på en fyrpunktsvåg. Våtviktsmätningar av fyra representativa genotyper per ml SCV visas nedan i Tabell 3.Smoothing of cells on the smear frame: Preparation of SCV for smearing: Somatic coniferous embryo cells of genotype A were grown in proliferation medium (prepared as described in Table 4) in Erlemeyer flasks of 1 I ﬁ ck sediment. The volume of sedimented cells (SC The sedimented cells were resuspended in a complementary amount of 3 SCV of sterile dilution medium, prepared as described in Example 1. Determination of the wet weight of SCV: In order to determine the wet weight of SCV, SCV was measured as described above. The supernatant was then removed using a Buchner funnel (33.0 mm (13 inches) Hg), and 1 ml of the SCV sample was placed on a pre-weighed and humidified filter paper of grade VW'R_417. Weight measurements were performed at an tidxated time (30 sec) on a four-point scale. Wet weight measurements of four representative genotypes per ml SCV are shown below in Table 3.

Tabell 3 Genotyp Våtvikt mg/ml SCV A 92 mg/ml B 102 mg/ml C 102 mg/ml D 118 mg/ml Av resultaten i Tabell 3 framgår» det att .den genomsnittliga våtvikten för de fyra testade genotyperna var 103,5 mglml SCV. Därför är den genomsnitt- liga våtvikten för 1 ml SCV för de fyra testade genotyperna ca 0,1 g/ml SCV.Table 3 Genotype Wet weight mg / ml SCV A 92 mg / ml B 102 mg / ml C 102 mg / ml D 118 mg / ml The results in Table 3 show that the average wet weight for the four genotypes tested was 103.5 mglml SCV. Therefore, the average wet weight of 1 ml SCV for the four genotypes tested is about 0.1 g / ml SCV.

En utstrykningsstomme (10) som framställts såsom beskrivits ovan till- handahölls och placerades på ytan av ett halvfast utvecklingsmedium (fram- ställt såsom beskrivs i Tabell 5). Volymen av de sköljda sedimenterade cell- ema mättes därefter och ströks ut på den första halvan av utstryknings- stommen med en densitet av 3 ml SCV (0,3 gI90,3 cmz (14 kvadrattum) = 0,02 g/6,5 cmz (kvadrattum)) och på den andra halvan av utstryknings- stommen med en densitet av 12 ml SCVV(1,2 g/90,3 cmz (14 kvadrattum) = 0,08 g/6,5 cmz (kvadrattum)), vardera i en total volym av 9 respektive 36 ml.A smear frame (10) prepared as described above was provided and placed on the surface of a semi-solid development medium (prepared as described in Table 5). The volume of the rinsed sedimented cells was then measured and plated on the first half of the smear with a density of 3 ml SCV (0.3 gI90.3 cmz (14 square inches) = 0.02 g / 6.5 cmz (square inch)) and on the other half of the smear frame with a density of 12 ml SCVV (1.2 g / 90.3 cmz (14 square inches) = 0.08 g / 6.5 cmz (square inch)), each in a total volume of 9 and 36 ml, respectively.

Utstrykning av cellerna utfördes över utstrykningsstommen, som var placerad på ytan av ett halvfast utvecklingsmedium inneslutet i en behållare.Spreading of the cells was performed over the spreading body, which was placed on the surface of a semi-solid development medium enclosed in a container.

Detta möjliggjorde att celler och medier spriddes ut jämnt över nylonnätverket i syfte att minimera variation av oelldensitet och initialt celldjup. När väl de ut- strukna cellema varjämnt spridda över det neclsänkta nylontrådnätet, lyftes utstrykningsstommen (10) upp vertikalt från det halvfasta utvecklingsmediet, varigenom de_ jämnt spridda embryona infångades och möjliggjorde att över- skottsmedium spreds medan det fanns kvari den första behållaren. Utstryk- ningsstommen innehållande de jämnt spridda embryona placerades därefter 531 226 20 på ytan av ett-»halvfast utvecklingsmedium med samma formulering som det första i en ny behållare. De utstrukna cellema på utstrykningsstommen ﬁck därefter växaunder 12 veckor och övervakades med avseende pá total bio- massa, embryosuspensomiassa och embryostrukturbildning, såsom visas nedan i Tabell 6.This allowed cells and media to spread evenly over the nylon network in order to minimize variation in cell density and initial cell depth. Once the spread cells were evenly distributed over the nickel-plated nylon wire mesh, the smear frame (10) was lifted vertically from the semi-solid development medium, capturing the evenly distributed embryos and allowing excess medium to disperse while the first container remained. The smear frame containing the evenly distributed embryos was then placed on the surface of a semi-solid development medium with the same formulation as the first in a new container. The plated cells on the smear frame then grew for 12 weeks and were monitored for total biomass, embryo suspension mass and embryo structure formation, as shown below in Table 6.

Tabell 4 Proliferation/Underhállsmedium (sydstatsgultall) Beståndsdel , Koncentration (mg/l) NH4NO3 150,0 KNOg 909,9 KH2PO4 136,1 Ca(NO3)2'4H2O 236,2 C8C|2'2H2Û 5Ü,0 _|yl_gSO4'7H20 246,5 M_Q(NÛ3)2'ÖHQO 256,5 _M_QC|2'ÖH2O 50,Û Kl i 4,15 H3BO3 15,5 MnS04'H-20 10,5 ZnSOﬂ H20 14,4 Na2MoO4'2 H20 0,125 CuSO4'5H20 i 0,125 i CoClíöHzO 0,125 Fesoniizo 27,86 i Na2EDTA'2H2O 37,36 Maltos 30 000 i Myoinositol 200 Kasaminosyror 500 _L-_g|utamin 1000 Tiamin-HCI 1,00 Pyridoxin-HCl 0,50 Nikotinsyra 0,50 Glycin 2,00 *Ge|rite* . 1600* 2,4 D (10 mg/ml) 1,1 mg/l 6-BAP (10 mg/ml) 0,1 mg/l 531 226 21 l Kinetin (10 mg/ml) 0,1 mg/I *ABA (2 mg/ml) ' 1,0 mg/I -ß pH justerat till 5,7 * = eventuellt Tabell 5 , m I Beståndsdel Konceritration N ' 150 0 909 9 136 0 236 15 50 0 246 5 256 5 50 0 4 15 15 5 10 5 14 4 0 125 0 125 0 125 27 86 37 36 25 000 10 000 100-1000 500 L 1000 Tiamin-HCI 1 00 oxin-HCl 0 50 N 0 50 2 00 Prolin 100 L min so 1 L ' 100 10 531 226 22 L-alanin 20 L-serin 20 i PEG 100 000 Träkol 1000 Gelrite* 2500 ABA (2 mg/ml) 25,0 mg/l pH justerat till 5,7 Resultat: Kulturerna som strukits ut med olika densiteter på utstryknings- stommen undersöktes efter 12 veckor i odling med avseende på total bio- massa, embryosuspensormassa (ESM) och embryostrukturbildning. Uttrycket selekterade embryon avser närvaro av minst 4 hjärtblad och inga ﬁälldefor- mationer. Resultaten visas i Tabell 6.Table 4 Proliferation / Maintenance Medium (Southern Yellow Number) Ingredient, Concentration (mg / l) NH4NO3 150.0 KNOg 909.9 KH2PO4 136.1 Ca (NO3) 2'4H2O 236.2 C8C | 2'2H2Û 5Ü, 0 _ | yl_gSO4 ' 7H20 246.5 M_Q (NO3) 2'ÖHQO 256.5 _M_QC | 2'ÖH2O 50, Û Kl i 4.15 H3BO3 15.5 MnSO4'H-20 10.5 ZnSO ﬂ H20 14.4 Na2MoO4'2 H20 0.125 CuSO4 '5H 2 O and 0.125 in CoCl , 00 * Ge | rite *. 1600 * 2.4 D (10 mg / ml) 1.1 mg / l 6-BAP (10 mg / ml) 0.1 mg / l 531 226 21 l Kinetin (10 mg / ml) 0.1 mg / l * ABA (2 mg / ml) '1.0 mg / I -ß pH adjusted to 5.7 * = possibly Table 5, m I Ingredient Concentration N' 150 0 909 9 136 0 236 15 50 0 246 5 256 5 50 0 4 15 15 5 10 5 14 4 0 125 0 125 0 125 27 86 37 36 25 000 10 000 100-1000 500 L 1000 Thiamine-HCl 1 00 oxine-HCl 0 50 N 0 50 2 00 Proline 100 L min so 1 L '100 10 531 226 22 L-alanine 20 L-serine 20 in PEG 100,000 Charcoal 1000 Gelrite * 2500 ABA (2 mg / ml) 25.0 mg / l pH adjusted to 5.7 Results: The cultures smeared with Different densities on the smear frame were examined after 12 weeks in culture with respect to total biomass, embryo suspension mass (ESM) and embryo structure formation. The term selected embryos refers to the presence of at least 4 heart leaves and no ﬁ age deformations. The results are shown in Table 6.

Tabell 6 Utstryknings- Slutlig våt Total torr Torr ESM Torrt Antal densitet biomassa biomassa (mg) embryo selekterade (9) (m9) (m9) embryon Låg densitet 17,0 g 1277,6 mg 235 mg 291,8 mg 720 totalt (halva totalt totalt totalt totalt stommen) _ (5,67 g/ml (425,87 (78,33 (97,27 (240 per ml 3 ml SCV SCV mg/ml SCV mg/ml SCV mg/ml SCV SCV utstruket utstruket) utstruket) utstruket) utstruket) utstruket) Hög densitet 14,0 g 1302,4 mg 138,7 mg 312,0 mg 771 total + (halva _ totalt totalt totalt totalt (64,25 per stommen) g (1 ,17 g/ml (108,53 (11,56 (26,0 ml SCV 12 ml SCV SCV mg/ml SCV mg/ml SCV mg/ml SCV utstruket) utstruket utstruket) utstruket) utstruket) utstruket) Såsom visas i Tabell 6 ovan, när embryona ströks ut med en lägre densitet (t ex 3 ml SCV/90,3 cmz (14 :kvadrattum) (ca 0,3 g/90,3 cmz (14 kvadrattum) = 0,02 g/6,5 cm* (kvadrattum))), gav den efterföljande prolifera- tionen av embryosuspensorrnassorna lika mycket total biomassa som celler- na som strukits ut med en högre densitet av 12 ml SCV/90,3 cmz (14 kvadrat- tum) (ca 1,2 g/90,3 cmz (14 kvadrattum) = 0,08 g/6,5 cmz (kvadrattum)). Så- som visas ytterligare i Tabell 6, var totalmängden producerade embryon på 10 15 20 25 30 531 226 23 areabasis nästan likartad mellan lågdensitets- och högdensitetsförsöken.Table 6 Smear- Final wet Total dry Dry ESM Dry Number of density biomass biomass (mg) embryos selected (9) (m9) (m9) embryos Low density 17.0 g 1277.6 mg 235 mg 291.8 mg 720 total (half total total total total body) _ (5.67 g / ml (425.87 (78.33 (97.27 (240 per ml 3 ml SCV SCV mg / ml SCV mg / ml SCV mg / ml SCV SCV streaked streaked) streaked) streaked) streaked) High density 14.0 g 1302.4 mg 138.7 mg 312.0 mg 771 total + (half _ total total total total (64.25 per body) g (1.17 g / ml (108.53 (11.56 (26.0 ml SCV 12 ml SCV SCV mg / ml SCV mg / ml SCV mg / ml SCV streaked) streaked streaked (streaked) streaked) streaked) As shown in Table 6 above, when the embryos were plated at a lower density (eg 3 ml SCV / 90.3 cmz (14: square inch) (approx. 0.3 g / 90.3 cmz (14 square inches) = 0.02 g / 6.5 cm * ( square inch))), the subsequent proliferation of the embryosuspensor noses yielded as much total biomass as the cells streaked at a higher density a v 12 ml SCV / 90.3 cmz (14 square inches) (about 1.2 g / 90.3 cmz (14 square inches) = 0.08 g / 6.5 cmz (square inches)). As further shown in Table 6, the total amount of embryos produced on an area basis was almost similar between the low density and high density experiments.

Detta möjliggjordes pga den starkt ökade tillväxten av embryosuspensor- massa (ESM), såsom visas genom skillnaden i torrvikt, tex 235 mg torr ESM från lågdensitetsförsöket kontra endast 138,7 mg torr ESM från högdensitets» försöket pà utstrykningsstommen. Antalet selekterade embryon (slutprodukt- en av intresse) per ml utstruken SCV vandärför klart bättre vid lågdensitets- utstrykningsförsöket (240 embryon/ml SCV) jämfört med högdensitetsutstryk- ningsförsöket, (64,25 embryon/ml SCV).This was made possible by the greatly increased growth of embryo suspension mass (ESM), as shown by the difference in dry weight, eg 235 mg dry ESM from the low density test versus only 138.7 mg dry ESM from the high density test on the smear frame. The number of selected embryos (end product of interest) per ml of plated SCV is therefore clearly better in the low-density smear test (240 embryos / ml SCV) compared with the high-density smear test (64.25 embryos / ml SCV).

Exempel 3 I I detta exempel beskrivs en jämförelse mellan embryoutbyten vid an- vändning av en standardmässig utstrykningsmetod med pipettdroppning och utstrykningsmetoden för spridning genom sammanﬂytning i vätska enligt en utföringsform av föreliggande uppﬁnning genom användning av fyra olika typer av sydstatsgultall.Example 3 I This example describes a comparison between embryo yields using a standard pipette dripping method and the liquid dispersion method according to an embodiment of the present invention using four different types of Southern yellow.

Förfaranden: Ett försök utfördes för direkt jämförelse av metoderna för utstrykning av celler på utstrykningsstommar (10) genom användning av samma mängd av biomassa för fyra olika genotyper av sydstatsgultall, dvs A, B, E och F, men med variation av utstrykningsdensiteten för utstruken SCV.Methods: An experiment was performed to directly compare the methods for smearing cells on smear frames (10) using the same amount of biomass for four different genotypes of southern yellow pine, ie A, B, E and F, but with variation of the smear density for smeared SCV .

Utbytet av embryon och groningsgraden mättes.The yield of embryos and the degree of germination were measured.

Embryonala somatiska (ESM) celler från genotyperna A, B, E och F odlades i proliferationsmedium (framställt såsom beskrivs i Exempel 2) i Erlenmeyerkolvar av 1 l. ESM-cellerna ﬁck sedimentera, och den sedimen- terade cellvolymen (SCV) mättes såsom beskrivs i Exempel 2.Embryonic somatic (ESM) cells from genotypes A, B, E and F were grown in proliferation medium (prepared as described in Example 2) in Erlenmeyer flasks of 1 l. The ESM cells did not settle, and the sedimented cell volume (SCV) was measured as described in Example 2.

Som en kontroll som representerar den standardmässiga dropputstryk- ningsmetoden ströks för varje genotyp 6 ml SCV direkt ut som 12 droppar (0,5 ml SCV vardera) på hela utstrykningsstommen (en total area av 17,8 x 10,2 cm (7 x 4 rum) = 11,1 om* (za kvaarauum» placerad på eu haivfasi ur- vecklingsmedium i en grund utstrykningsbehållare. I detta exempel användes en cambrobehâllare (Cambro Manufacturing Co., Huntington Beach, CA) som är försedd med två utstrykningsstommar (10). För test av utstrykningsmetod- en för spridning sköljdes en andra alikvot av 6 ml SCV från varje genotyp med 3 x (18 ml) av utvecklingsmediet. 24 ml SCV samt sköljmedium ströks där- efter ut på hela utstrykningsstommen (71,1 om: (28 kvadrattum)), som var 10 15 20 25 30 531 225 24 anbringad över ett första halvfast utvecklingsmedium i en cambrobehållare på så sätt att E$M-cel|erna ﬂöt i mediet och spreds enhetligt över den nedsänkta ytan av utstrykningsstommen. Den enhetliga spridningen underlättades genom varsam skakning av utstrykningsstommen. Utstrykningsstommarna lyftes därefter vertikalt upp fràn det första halvfasta mediet i cambrobehållar- en genom användning av de anslutna handtagen under samtidigt upprätthåll- ande av utstrykningsytan i horisontell orientering, varigenom de enhetligt spridda ESM-cellerna infàngades under samtidigt ﬂöde av mediet genom det porösa trådnätet.As a control representing the standard droplet smear method, for each genotype, 6 ml SCV was smeared directly as 12 drops (0.5 ml SCV each) on the entire smear frame (a total area of 17.8 x 10.2 cm (7 x 4) rum) = 11.1 if * (za kvaarauum »placed on eu haivasi development medium in a shallow smear container. To test the spread method, a second aliquot of 6 ml SCV from each genotype was rinsed with 3 x (18 ml) of the development medium, then 24 ml SCV and rinsing medium were applied to the entire spread body (71.1 if: ( 28 square inches)), which was applied over a first semi-solid development medium in a cambro container in such a way that the E $ M cells ﬂ ate in the medium and spread uniformly over the submerged surface of the smear frame. the spread was facilitated by gentle so-called akning of the smear frame. The smear frames were then lifted vertically from the first semi-solid medium in the cambro container by using the connected handles while simultaneously maintaining the smear surface in horizontal orientation, whereby the uniformly dispersed ESM cells were captured during simultaneous desertion of the medium through the porous wire mesh.

Utstrykningsstommama innehållande utstrukna celler förﬂyttades där- efter till en ny cambrobehâllare innehållande ett halvfast utvecklingsmedium (såsom beskrivs i Exempel 2) och tilläts utvecklas under 12 veckor. I slutet av 12-veckorsperioden underkastades embryona sena utvecklingsbehandlingar för induktion av groning och räknades, och ett prov underkastades groning.The smear frames containing smeared cells for ﬂ were then transferred to a new cambro container containing a semi-solid development medium (as described in Example 2) and allowed to develop for 12 weeks. At the end of the 12-week period, the embryos underwent late developmental treatments for induction of germination and were counted, and a sample was subjected to germination.

En normal grodd registrerades som närvaro av 1 mm vit rot, närvaro av ca 5 epikotylblad med en längd av ca 5 mm, inga stora ﬁällhypokotylrupturer och en hypokotyl utan någon böjning av merxän 90 grader.A normal sprout was registered as the presence of 1 mm white root, the presence of about 5 epicotyledons with a length of about 5 mm, no large ﬁ äll hypocotyl ruptures and a hypocotyl without any bending of merxän 90 degrees.

Totalutbytet av utvecklade embryon räknades efter utvecklingsperiod- en av 12 veckor. Resultaten visas nedan i Tabell 7. Fotograﬁer togs vid slutet av utvecklingsperioden, såsom visasi Figur 2. Figurerna 2A-D visar kontroll- erna för genotyperna A, E, F respektive B. Figurema 2E-H visar resultatet av utstrykningsmetoden för spridning genom sammanﬂytning i vätska för geno- typerna A, E. F respektive B.The total yield of developed embryos was calculated after the development period of 12 weeks. The results are shown below in Table 7. Photographs were taken at the end of the development period, as shown in Figure 2. Figures 2A-D show the controls for genotypes A, E, F and B, respectively. fluid for genotypes A, E. F and B.

I slutet av de tolv veckoma stratiﬁerades embryona genom användning av stratifieringsmediet BM5 (beskrivet i Exempel 1) under 4 veckor. Efter stra- tiﬁering under4 veckor separerades embryona genom besprutning och kondi- tionerades över vatten under 10 dagar. j För varje genotyp selekterades 25 embryon för bedömning av groning.At the end of the twelve weeks, the embryos were stratified using the stratification medium BM5 (described in Example 1) for 4 weeks. After straining for 4 weeks, the embryos were separated by spraying and conditioned over water for 10 days. For each genotype, 25 embryos were selected for evaluation of germination.

Embryona selekterades för groning med basis på närvaron av minst 4 hjärt- blad och frånvaro av stora deformationer eller kluvna hypokotyler.The embryos were selected for germination based on the presence of at least 4 heart leaves and the absence of large deformations or cleaved hypocotyls.

Resultat: i 10 15 20 '25 531 226 25 Tabell 7 Genotyp Droppningsmetoden, Spridningsmetoden, Mångfald av ökning av embryoutbyte per embryoutbyte per embryoutbyte genom behållare behållare användning av (% groning) (% grgiing) spridniggsmetoden A n 2241 (52%) 5416 (49%) 2,4 E 2267 (15%) 3187 (27%) 1,4 F 1803 (8%) 2545 (3%) 1,4 B 2356 (10%) 3188 (19%) 1,3 Såsom visas ovan i Tabell 7 uppvisade samtliga fyra testade genotyper minst en 1,3-fa|dig eller större ökning av embryoutbyte vid användning av spridningsmetoden med sammanﬂytning vid låg densitet jämfört med den tra- ditionella utstrykningsmetoden med pipettdroppning. Resultaten av gronings- studierna uppvisade ingen statistiskt signiﬁkant skillnad mellan framgångsrik groning av prover som strukits ut genom användning av droppningsmetoden i förhållande till spridningsmetoden.Results: i 10 15 20 '25 531 226 25 Table 7 Genotype Drip method, Dissemination method, Diversity of increase of embryo yield per embryo exchange per embryo exchange by container container use of (% grgiing) the spreading method A n 2241 (52%) 5416 ( 49%) 2.4 E 2267 (15%) 3187 (27%) 1.4 F 1803 (8%) 2545 (3%) 1.4 B 2356 (10%) 3188 (19%) 1.3 As shown above in Table 7, all four tested genotypes showed at least a 1.3-fold or greater increase in embryo yield when using the low-density spread method compared to the traditional pipette-drip smear method. The results of the germination studies showed no statistically significant difference between successful germination of samples deleted using the dripping method in relation to the dispersion method.

När resultaten för de fyra genotyperna som visas i Tabell 7 kombiner- as, är det totala genomsnittliga kontrollvärdet för producerade embryon 1266,? vid användning av droppningsmetoden jämfört med ett totalt medel- värde av 3692 embryon som producerats genom användning av förfarandet för spridning genom sammanﬂytning i vätska, vilket är ett 1,7-faldigt högre embryoutbyte med ett p-värde av 0,0708. Detta är en mycket signiﬁkant för- bättring av embryoutbyten, vilket möjliggör att en genotyp kan strykas ut i en enda cambroenhet för uppnående av det genomsnittliga' målutbytet för gro- ning och reducerar antalet erforderliga enheter för hantering av en enda klon ner till endast en, till skillnad från de åtminstone 30 separata enheter (petriskàlar) som krävs vid användning av den traditionella utstryknings- metoden med pipettdroppning.When the results for the four genotypes shown in Table 7 are combined, the total average control value for produced embryos is 1266 ,? when using the drip method compared to a total mean value of 3692 embryos produced using the method of dispersion by conjugation in liquid, which is a 1.7-fold higher embryo yield with a p-value of 0.0708. This is a very significant improvement in embryo yields, enabling a genotype to be plotted in a single camber unit to achieve the average 'germination target yield' and reducing the number of units required to handle a single clone down to only one, in contrast to the at least 30 separate units (petri dishes) required when using the traditional pipette dripping method.

De kombinerade resultaten som registrerats för de fyra testade geno- typerna tillhandahålls nedan i Tabell 10 15 531 228 26 Tabell 8 Parameter Kontroll: Utstrykning genom p-värde utstrykning genom spridning (6 ml SCV droppning (6 ml utspädd i 18 ml) SCV i droppar av 0,5 ml x 12) Totalt embryoutbyte per 2167 3692 0,0708 behållare Genomsnittligt embryo- 180,6 307,6 utbyte per ml SCV Groningav kateggﬁ 1 17,2 20,9 0,4261 Groddar per ml SCV 40 88,9 0,1768 Genomsnittlig rotlängd 32,1 23,7 0,1481 mm) De ovan visade värdena i Tabell 8 indikerar en statistiskt signiﬁkant (ett p-tröskelvärde av 0,10) 70% ökning av embryoutbytet utan någon uppenbar förlust i groningsgrad, även om det ﬁnns en viss indikation på skillnad i rot- längd. Utan att binda sig till någon teori, kan den observerade skillnaden i' rot- storlek bero på näringsmässiga faktorer förknippade med den större tillväxt- ' en. De näringsmässiga faktorema kan påverkas genom antingen förﬂyttning av de utstrukna embryona till ett färskt tillväxtsubstrat efter en viss tidsperiod eller genom justering av mediumkompositionen till en högre koncentration och/eller modiﬁering av utstrykningsdensiteten för särskilda cellinjer med basis på deras tillväxthastighet. i Såsom visas i Tabell 8 resulterade utstrykningsmetoden med hjälp av. spridning enligt föreliggande uppﬁnning i 120% utbyte av groddar jämfört med utstrykningsmetoden med droppning, vilket tyder på en mycket stor förbättring vad gäller odlingsproduktivitet jämfört med både embryobildning och -groning med basis på per behållarenhet och ytarea. Denna observerade förbättring i embryoutbyte möjliggör uppskalning utan någon begränsning av storleken av utstrykningsytan jämfört med den tidigare droppningsmetoden med odling i petriskålar. Sådan uppskalning ökar mängden bildade embryon per utstryk- 10 15 20 25 30 531 225 27 ningsenhet och reducerar enhetskostnaden genom reduktion av den erforder- liga omfattningen av hantering. Även om detta exempel beskriver användning av cambrobehållare som utstrykningsbehållare, kan utstrykningsbehållaren för utvecklingssteget efter utstrykning vara vilken lämplig utstrykningsyta som helst, såsom vilken behåll- artyp som helst, tex kommersiellt tillgängliga livsmedelsberedningsbehållare som är värrnestabila och har ett fungerande lock.The combined results recorded for the four genotypes tested are provided below in Table 10 15 531 228 26 Table 8 Parameter Control: Spreading by p-value spreading by spreading (6 ml SCV dripping (6 ml diluted in 18 ml) SCV in drops of 0.5 ml x 12) Total embryo yield per 2167 3692 0.0708 containers Average embryo 180.6 307.6 yield per ml SCV Germination of catech ﬁ 1 17.2 20.9 0.4261 Germs per ml SCV 40 88.9 0.1768 Average root length 32.1 23.7 0.1481 mm) The values shown in Table 8 above indicate a statistically significant (a p-threshold value of 0.10) 70% increase in embryonic yield without any obvious loss in germination rate, also if there is a certain indication of difference in root length. Without adhering to any theory, the observed difference in 'root size' may be due to nutritional factors associated with the larger growth. The nutritional factors can be influenced either by transferring the plated embryos to a fresh growth substrate after a certain period of time or by adjusting the medium composition to a higher concentration and / or modifying the plating density for specific cell lines based on their growth rate. i As shown in Table 8, the smear method resulted in using. spread according to the present invention in 120% yield of sprouts compared to the smear method with dripping, which indicates a very large improvement in terms of culture productivity compared to both embryo formation and germination based on per container unit and surface area. This observed improvement in embryo exchange allows scaling up without any limitation on the size of the smear area compared to the previous dripping method with cultivation in petri dishes. Such scaling up increases the amount of embryos formed per smear unit and reduces the unit cost by reducing the required amount of handling. Although this example describes the use of cambro containers as spreading containers, the spreading container for the post-ironing development step can be any suitable spreading surface, such as any type of container, eg commercially available food preparation containers which are heat stable and have a working lid.

Förfarandet för spridning genom sammanﬂytning i vätska har också med framgång utförts genom användning av en utstrykningsstomme anbring- ad över ett flertal icke-porösa sterila ytor förutom halvfasta medier, såsom ett sterilt plastlock eller ett silikonark eller en gummimatta placerad i ett kärl med förmåga att bevara vätska, följt av kontakt mellan de utstrukna embryona och utvecklingsmedium.The method of spreading by liquid surface has also been successfully performed by using a smear frame applied over a plurality of non-porous sterile surfaces in addition to semi-solid media, such as a sterile plastic lid or a silicone sheet or a rubber mat placed in a vessel capable of preserving fluid, followed by contact between the streaked embryos and developmental medium.

Förfarandet för spridning genom sammanﬂytning i vätska har med framgång också använts genom först utstrykning av en mängd av sterilt ut- spädningsmedium som är tillräcklig för nedsänkning av en utstrykningsyta inbegripande ett poröst material anbringat över ett fast (icke-poröst) substrat.The liquid dispersion method has also been successfully used by first plating an amount of sterile dilution medium sufficient to immerse a plating surface including a porous material applied over a solid (non-porous) substrate.

Den önskade SCV sätts därefter till utspädningsmediet och blandas varsamt med en pipett. De ﬂytande oellema sprids därefter med eventuell hjälp av en plpett och/eller varsam skakning av den .första utstrykningsytan. Utstryknings- stommen tas därefter upp och placeras över ett andra tlllväxtsubstrat inbe- gripande utvecklingsmedium och inkuberas såsom beskrivits ovan.The desired SCV is then added to the dilution medium and gently mixed with a pipette. The surface oils are then spread, if necessary by means of a pallet and / or gentle shaking of the first smearing surface. The smear frame is then picked up and placed over a second growth substrate including development medium and incubated as described above.

Slutligen har förfarandet för spridning genom sammanﬂytning också med framgång använts för åstadkommande av embryon från olika genotyper av sydstatsgultall genom användning av alikvoter av från 1 ml upp till 12 ml SCV utstrukna på en hel utstrykningsstomme (17,8 x 10,2 cm (7 x 4 tum)) placerad på ett halvfast utvecklingsmedium. . Även om den föredragna utföringsformen av uppfinningen har belysts och beskrivits, inses det att olika förändringar kan göras därav utan att man frångår innebörden av skyddsomfånget för föreliggande uppfinning.Finally, the spreading method has also been successfully used to produce embryos from different genotypes of southern yellow pine by using aliquots of from 1 ml up to 12 ml SCV spread on a whole smear frame (17.8 x 10.2 cm (7 x 4 inches)) placed on a semi-solid development medium. . Although the preferred embodiment of the invention has been elucidated and described, it will be appreciated that various changes may be made therefrom without departing from the scope of the scope of the present invention.

Claims

10 15 20 25 30 531 226 28 PATENT REQUIREMENTS

A method of making heart-shaped somatic coniferous embryos, the method comprising: a) distributing by smearing with låg a low-density surface tal a number of pre-cardiac embryos on a porous material horizontally applied over a non-porous surface in a volume of sterile diluent sufficient to immerse at least the surface of the porous material, thereby spreading the pre-cardiac embryos uniformly, b) removing the sterile diluent from the porous material, thereby uniformly dispersing the pre-cardiac embryos on the porous material, and c) contact between the pre-cardiac embryos captured on the porous material and a development medium for a period of time sufficient to produce cardiac somatic conifer embryos. _

The method of claim 1, wherein the plurality of pre-cardiac embryos are distributed in the sterile dilution medium of step (a) having a density of less than 0.1 g cell wet weight per 6.5 cm 2 (square inch) of porous material.

The method of claim 1, wherein the plurality of pre-cardiac embryos are distributed in the sterile dilution medium of step (a) having a density of less than 0.05 g cell weight per 6.5 cm 2 (square inch) of porous material. v

The method of claim 1, wherein the plurality of pre-cardiac embryos are distributed in the sterile dilution medium of step (a) having a density of from 0.1 g to 0.001 g of unweighted liquid per 6.5 cm 2 (square inch) of porous material. . g

The method of claim 1, wherein the porous material comprises pores having an average pore diameter in the range of from 5 μm to 1200 μm.

The method of claim 1, wherein the porous material is non-absorbent. 10 15 20 25 30 531 225 29

A method according to claim 5, wherein the porous material is a wire mesh fabric.

The method of claim 1, wherein the porous material is attached to a support frame including handles. in

The method of claim 8, wherein the sterile dilution medium is removed from the porous material of step (b) by vertically lifting the support frame from the non-porous substrate.

The method of claim 1, wherein the sterile diluent is removed from the porous material of step (b) by reducing the sterile diluent to a level below the surface of the porous material.

11.. The method of claim 1, wherein the developing medium according to step (c) is a liquid medium.

The method of claim 1, wherein the developing medium according to step (c) is a solid medium.

A method of making heart-shaped somatic coniferous embryos, comprising; (a) culturing somatic conifers or an induction medium to obtain embryogenic ores; (b) culturing the embryogenic cells produced in step (a) in a surface maintenance medium for the production of pre-cardiac somatic coniferous embryos; in E (c) distributing by smearing with ﬂ a low density surface area ett a number of the pre-cardiac embryos prepared in step (b) on a porous material which is horizontally applied over a non-porous surface in a volume of sterile dilution medium which is sufficient to immerse at least the surface of the porous material, whereby the pre-cardiac embryos spread uniformly; (d) removing the sterile dilution medium from the porous material, thereby trapping the uniformly dispersed pre-cardiac embryos on the porous material; and (e) contacting the pre-cardiac embryos captured on the porous material with a development medium for a period of time sufficient to produce cardiac somatic conifer embryos.