RU2333633C2 - Method of obtaining high crops of zygotic-type cotyledonous blastemals of pine with use of mediums containing disaccharide and glucose (versions) - Google Patents
Method of obtaining high crops of zygotic-type cotyledonous blastemals of pine with use of mediums containing disaccharide and glucose (versions) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2333633C2 RU2333633C2 RU2003109361/13A RU2003109361A RU2333633C2 RU 2333633 C2 RU2333633 C2 RU 2333633C2 RU 2003109361/13 A RU2003109361/13 A RU 2003109361/13A RU 2003109361 A RU2003109361 A RU 2003109361A RU 2333633 C2 RU2333633 C2 RU 2333633C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- medium
- pine
- glucose
- concentration
- embryos
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Description
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИFIELD OF TECHNOLOGY
Настоящее изобретение относится к способам получения зародышей растений в искусственных условиях и дополнительного получения растений из зародышей растений.The present invention relates to methods for producing plant embryos in artificial conditions and the additional production of plants from plant embryos.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND
Спрос на сосны для изготовления продуктов деревообработки продолжает возрастать. Одним предлагаемым решением этой проблемы является определение отдельных деревьев, которые обладают желательными характеристиками, такими как высокая скорость роста, и дают многочисленные, генетически идентичные, клоны взрослых деревьев путем соматического клонирования. Эти клоны могут культивироваться для получения посадок или целых лесов сосен, которые обладают желательными характеристиками.Demand for pine for the manufacture of wood products continues to increase. One suggested solution to this problem is to identify individual trees that have desirable characteristics, such as high growth rates, and produce numerous, genetically identical, clones of adult trees by somatic cloning. These clones can be cultivated to produce plantings or entire forests of pine trees that possess the desired characteristics.
Один способ клонирования сосен использует обработку в искусственных условиях изолированной живой ткани сосны в условиях, которые способствуют образованию зародышей сосны и затем целых растений из обработанной ткани. Изолированная ткань сосны может быть культивирована в присутствии одного или нескольких ауксинов и/или цитокининов для способствования образованию и размножению эмбриогенной ткани, которая затем культивируется в условиях, которые способствуют образованию семядольных зародышей сосны. Затем зародыши могут быть выращены до сосновых деревьев. Примером эмбриогенной ткани сосны являются эмбриональные суспензорные массы (ЭСМ), которые могут формироваться культурой ткани в искусственных условиях из зародышей сосны, вырезанных из семян сосны.One method for cloning pine trees uses artificial processing of isolated living pine tissue under conditions that promote the formation of pine embryos and then whole plants from the treated tissue. Isolated pine tissue can be cultured in the presence of one or more auxins and / or cytokinins to promote the formation and propagation of embryogenic tissue, which is then cultured under conditions that contribute to the formation of cotyledonary pine embryos. Embryos can then be grown to pine trees. An example of embryogenic pine tissue is embryonic suspensor masses (ESMs), which can be formed by tissue culture under artificial conditions from pine embryos cut from pine seeds.
На Фиг.1 показаны эмбриональные суспензорные массы сосны в жидкой культуре. На Фиг.2 показан семядольный зародыш сосны, образовавшийся из ЭСМ (семядоли видны на верху зародыша).Figure 1 shows the embryonic suspension mass of pine in a liquid culture. Figure 2 shows a cotyledonary pine embryo formed from an ESM (cotyledons are visible on top of the embryo).
Существующая проблема, однако, заключается в стимулировании эффективного образования семядольных зародышей сосны, которые способны давать ростки с высокой частотой для получения саженцев сосны. Предпочтительно семядольные зародыши сосны, образовавшиеся в искусственных условиях, морфологически, анатомически и биохимически аналогичны или идентичны зиготным зародышам сосны, образовавшимся в естественных условиях в семенах сосны. В частности, существует потребность в способах получения в искусственных условиях большего числа зиготоподобных семядольных зародышей сосны, чем можно получить, используя известные способы. Предпочтительно частота образования ростков и качество семядольных зародышей сосны, полученных новыми способами, должно быть выше, чем частота образования ростков и качество семядольных зародышей сосны, полученных известными способами.The existing problem, however, is to stimulate the effective formation of cotyledonary pine embryos, which are capable of sprouting with high frequency to produce pine seedlings. Preferably, cotyledonary pine embryos formed under artificial conditions are morphologically, anatomically and biochemically similar or identical to zygotic pine embryos formed under natural conditions in pine seeds. In particular, there is a need for methods for producing in artificial conditions a larger number of zygote-like cotyledonary pine embryos than can be obtained using known methods. Preferably, the frequency of sprout formation and the quality of cotyledonary pine embryos obtained by new methods should be higher than the frequency of sprout formation and the quality of cotyledonary pine embryos obtained by known methods.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE INVENTION
Настоящее изобретение представляет способы получения семядольных зародышей сосны. Способы по настоящему изобретению дают большее количество зиготоподобных семядольных зародышей сосны, чем можно получить известными способами. Кроме того, частота образования ростков и качество семядольных зародышей сосны, полученных способами по настоящему изобретению, выше, чем частота образования ростков и качество семядольных зародышей сосны, полученных известными способами.The present invention provides methods for producing cotyledonary pine embryos. The methods of the present invention produce more zygote-like cotyledonary pine embryos than can be obtained by known methods. In addition, the frequency of sprout formation and the quality of cotyledonary pine embryos obtained by the methods of the present invention is higher than the frequency of sprout formation and the quality of cotyledonary pine embryos obtained by known methods.
Каждый из способов по настоящему изобретению включает в себя этап культивирования эмбриогенной ткани сосны в или на среде, включающей дисахарид и глюкозу для получения семядольных зародышей сосны, и отличается тем, что дисахарид и глюкоза присутствуют в среде в концентрации меньше 3% (т.е. дисахарид присутствует в среде в концентрации меньше 3%, и глюкоза присутствует в среде в концентрации меньше 3%). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения среда включает глюкозу (присутствует в концентрации меньше 3%) и по меньшей мере два дисахарида, и тогда общая концентрация всех дисахаридов в среде меньше 3%. Среды может также содержать один или несколько абсорбирующих составов. Способы по настоящему изобретению могут, кроме того, включать этап получения одного или нескольких сосновых деревьев (например, популяции сосновых деревьев) из семядольных зародышей сосны, полученных в соответствии с настоящим изобретением.Each of the methods of the present invention includes the step of culturing pine embryogenic tissue in or on a medium comprising a disaccharide and glucose to obtain cotyledonary pine embryos, and characterized in that the disaccharide and glucose are present in the medium at a concentration of less than 3% (i.e. disaccharide is present in the medium at a concentration of less than 3%, and glucose is present in the medium at a concentration of less than 3%). In some embodiments of the present invention, the medium comprises glucose (present at a concentration of less than 3%) and at least two disaccharides, and then the total concentration of all disaccharides in the medium is less than 3%. The medium may also contain one or more absorbent compositions. The methods of the present invention may also include the step of obtaining one or more pine trees (for example, a population of pine trees) from cotyledonary pine embryos obtained in accordance with the present invention.
При практическом осуществлении некоторых вариантов настоящего изобретения эмбриогенная ткань последовательно культивируется на или в последовательности из по меньшей мере двух сред, по меньшей мере одна из которых включает дисахарид и глюкозу, каждый из которых присутствует в среде в концентрации меньше 3%. Среда, которая содержит дисахарид и глюкозу, адаптирована для содействия развитию и созреванию семядольных зародышей из эмбриогенной ткани.In the practical implementation of certain embodiments of the present invention, embryogenic tissue is sequentially cultivated on or in a sequence of at least two media, at least one of which includes disaccharide and glucose, each of which is present in the medium at a concentration of less than 3%. A medium that contains disaccharide and glucose is adapted to promote the development and maturation of cotyledonary embryos from embryogenic tissue.
Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения представлены способы получения семядольных зародышей сосны, причем каждый из способов содержит следующие этапы: (а) культивирование эмбриогенной ткани сосны (такой как эмбриональные суспензорные массы) на или в среде для поддержания в жизнеспособном состоянии; и (б) культивирование эмбриогенной ткани сосны, обработанной в соответствии с этапом (а) на среде для развития при концентрации меньше 3%. Среда для развития может по выбору содержать абсорбирующий состав. Способы этого аспекта изобретения могут по выбору включать этап культивирования ткани сосны на или в среде для зарождения для получения эмбриогенной ткани сосны, которая затем культивируется на или в среде для поддержания, упомянутой в этапе (а).Thus, in some embodiments, the present invention provides methods for producing cotyledonary pine embryos, each method comprising the following steps: (a) cultivating embryogenic pine tissue (such as embryonic suspensory masses) on or in a medium to maintain a viable state; and (b) cultivating embryogenic pine tissue treated in accordance with step (a) on a development medium at a concentration of less than 3%. The development medium may optionally contain an absorbent composition. The methods of this aspect of the invention may optionally include the step of cultivating the pine tissue on or in the nucleation medium to obtain embryogenic pine tissue, which is then cultivated on or in the maintenance medium mentioned in step (a).
В еще одном аспекте настоящее изобретение дает семядольные зародыши сосны, полученные в соответствии с одним из способов по настоящему изобретению.In another aspect, the present invention provides cotyledonary pine embryos obtained in accordance with one of the methods of the present invention.
Способы по настоящему изобретению полезны, например, для получения семядольных зародышей сосны, которые могут быть далее охарактеризованы генными или биохимическими средствами и/или могут быть выращены до небольших саженцев сосны, которые могут быть выращены до взрослых сосновых деревьев в случае необходимости. Таким образом, например, способы по настоящему изобретению могут быть использованы для получения клонов индивидуальных сосновых деревьев, которые обладают одной или несколькими желательными характеристиками, такими как быстрый рост или повышенное качество древесины. Например, семядольные зародыши сосны по настоящему изобретению могут быть использованы для получения посадок или лесов сосновых деревьев, обладающих одной или несколькими желательными характеристиками, такими как высокая скорость роста или повышенное качество древесины. Деревья могут быть использованы для получения продукции деревообработки.The methods of the present invention are useful, for example, to obtain cotyledonary pine embryos, which can be further characterized by genetic or biochemical means and / or can be grown to small pine seedlings that can be grown to mature pine trees if necessary. Thus, for example, the methods of the present invention can be used to obtain clones of individual pine trees that have one or more desirable characteristics, such as rapid growth or improved wood quality. For example, the cotyledonary pine embryos of the present invention can be used to obtain plantings or forests of pine trees having one or more desirable characteristics, such as a high growth rate or improved wood quality. Trees can be used to produce wood products.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
На Фиг.1 показаны эмбриональные суспензорные массы сосны в жидкой культуре.Figure 1 shows the embryonic suspension mass of pine in a liquid culture.
На Фиг.2 показан типовой семядольный зародыш сосны, полученный с использованием способов по настоящему изобретению (семядоли видимы на верху зародыша).Figure 2 shows a typical cotyledonary pine embryo obtained using the methods of the present invention (cotyledons are visible on top of the embryo).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНОГО ВАРИАНТА ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯDETAILED DESCRIPTION OF A PREFERRED EMBODIMENT
Если в тексте специально не определено иное, все используемые в нем термины имеют то же значение, которое они имели бы для специалиста в области техники настоящего изобретения.Unless otherwise expressly specified in the text, all terms used in it have the same meaning as they would have for a person skilled in the technical field of the present invention.
Используемый в тексте термин «семядольный зародыш» означает зародыш, который имеет одну или несколько семядолей.As used herein, the term “cotyledonary embryo” means an embryo that has one or more cotyledons.
Термин «дисахарид» относится к углеводам, которые состоят из двух моносахаридных радикалов. Примерами дисахаридов являются мальтоза, сахароза, лактоза, целлобиоза, изомальтоза, гентиобиоза, ламинарабиоза, хитобиоза, ксилобиоза, инулобиоза, маннобиоза, гиалобиурониевая кислота, хондрозин и целлобиурониевая кислота.The term "disaccharide" refers to carbohydrates, which are composed of two monosaccharide radicals. Examples of disaccharides are maltose, sucrose, lactose, cellobiose, isomaltose, gentiobiosis, laminarabiosis, chitobiosis, xylobiosis, inulobiosis, mannobiosis, hyalobiuronic acid, chondrosin, and cellobiurouronic acid.
Используемый в тексте термин «эмбриогенная ткань» относится к любой ткани, полученной из растения семейства Pinacea, которая способна производить один или несколько семядольных зародышей сосны, будучи обработанной в соответствии со способами по настоящему изобретению. Так, термин «эмбриогенная ткань» включает, например, эмбриональные суспензорные массы сосны.As used herein, the term “embryogenic tissue” refers to any tissue obtained from a plant of the Pinacea family that is capable of producing one or more cotyledonary pine embryos when processed in accordance with the methods of the present invention. Thus, the term "embryogenic tissue" includes, for example, embryonic suspensory masses of pine.
Если не указано иное, все значения концентрации, которые выражены в процентах, являются весовыми процентами на единицу объема.Unless otherwise indicated, all concentration values, expressed as a percentage, are weight percent per unit volume.
В одном аспекте настоящее изобретение представляет способы получения семядольных зародышей сосны. Каждый из способов по настоящему изобретению включает этап культивирования эмбриогенной ткани сосны в или на среде, содержащей дисахарид и глюкозу, для получения семядольных зародышей сосны, в которой дисахарид и глюкоза присутствуют каждый в среде в концентрации меньше 3%.In one aspect, the present invention provides methods for producing cotyledonary pine embryos. Each of the methods of the present invention includes the step of culturing pine embryogenic tissue in or on a medium containing a disaccharide and glucose to obtain cotyledonary pine embryos in which the disaccharide and glucose are each present in the medium at a concentration of less than 3%.
В некоторых вариантах осуществления способов по настоящему изобретению по меньшей мере 50% (также по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80% или по меньшей мере 90%) полученных семядольных зародышей сосны являются зиготоподобными (т.е. обладают теми же морфологическими особенностями и физиологическими свойствами, что и зиготные семядольные зародыши сосны на той же стадии развития). Так, в некоторых вариантах осуществления способов по настоящему изобретению от 50% до 100% (также от 60% до 90% или от 70% до 80%) полученных семядольных зародышей сосны являются зиготоподобными.In some embodiments of the methods of the present invention, at least 50% (also at least 60%, at least 70%, at least 80%, or at least 90%) of the obtained cotyledonary pine embryos are zygote-like (i.e. possess the same morphological features and physiological properties as the zygotic cotyledonary pine embryos at the same stage of development). Thus, in some embodiments of the methods of the present invention, from 50% to 100% (also from 60% to 90% or from 70% to 80%) of the obtained cotyledonary pine embryos are zygote-like.
Обычно каждый из семядольных зародышей сосны, полученных в соответствии с настоящим изобретением, обладает одной или несколькими из следующих характеристик: зародыши длиннее (обычно на 0,5-1,0 мм), чем зародыши, которые были обработаны аналогично за тем исключением, что ни глюкоза, ни дисахарид не присутствовали в культурной среде в концентрации меньше 3%; каждый зародыш содержит от восьми до 12 семядолей; и зародыши, обработанные в соответствии с настоящим изобретением, развиваются быстрее, чем зародыши, которые обработаны аналогично за тем исключением, что ни глюкоза, ни дисахарид не присутствовали в культурной среде в концентрации больше 3% (например, в некоторых вариантах осуществления зародыши, подготовленные в соответствии с настоящим изобретением, развиваются в течение 9 недель).Typically, each of the cotyledonary pine embryos obtained in accordance with the present invention has one or more of the following characteristics: the embryos are longer (usually 0.5-1.0 mm) than the embryos that were processed similarly except that neither glucose or disaccharide were not present in the culture medium at a concentration of less than 3%; each embryo contains from eight to 12 cotyledons; and the embryos treated in accordance with the present invention develop faster than the embryos that are processed similarly, with the exception that neither glucose nor disaccharide was present in the culture medium at a concentration of more than 3% (for example, in some embodiments, the embryos prepared in in accordance with the present invention, develop within 9 weeks).
Способы по настоящему изобретению могут быть использованы для получения семядольных зародышей любого члена семейства Pinacea, таких как члены рода Pinus, таких как сосна Лоблолли (Pinus taedd).The methods of the present invention can be used to obtain cotyledonary embryos of any member of the Pinacea family, such as members of the Pinus genus, such as Loblolly pine (Pinus taedd).
Примером эмбриогенной ткани, применимой при практическом осуществлении настоящего изобретения, являются эмбриональные суспензорные массы (ЭСМ). ЭСМ могут быть приготовлены из предсемядольных зародышей, удаленных из семян сосны. Семена обычно поверхностно стерилизуются до удаления предсемядольных зародышей, которые затем культивируются на или в среде, которая допускает образование ЭСМ, которые включают зародыши на ранней стадии в процессе размножения путем образования почек и деления. Среда может, по желанию, содержать гормоны, которые стимулируют размножение зародышей на ранней стадии. Примерами гормонов, которые могут быть включены в среду, являются ауксины (например, 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-D)) и цитокинины (например, 6-бензиламинопурин (БАП)). Ауксины могут использоваться, например, в концентрации от 1 мг/л до 200 мг/л. Цитокинины могут использоваться, например, в концентрации от 0,1 мг/л до 10 мг/л. Примером среды, применимой для культивирования предсемядольных зародышей сосны для инициирования формирования ЭСМ, является среда BM1, указанная в Примере 1.An example of embryogenic tissue applicable in the practice of the present invention is embryonic suspension mass (ESM). ESMs can be prepared from pre-cotyledonary embryos removed from pine seeds. Seeds are usually superficially sterilized to remove pre-cotyledonary embryos, which are then cultured on or in an environment that allows for the formation of ESMs, which include the embryos at an early stage in the process of propagation by the formation of buds and division. The medium may optionally contain hormones that stimulate the reproduction of the embryos at an early stage. Examples of hormones that may be included in the medium are auxins (e.g., 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D)) and cytokinins (e.g., 6-benzylaminopurine (BAP)). Auxins can be used, for example, in a concentration of from 1 mg / L to 200 mg / L. Cytokinins can be used, for example, in a concentration of from 0.1 mg / L to 10 mg / L. An example of a medium applicable for the cultivation of pre-cotyledonary pine embryos to initiate the formation of an ESM is BM 1 , as described in Example 1.
Каждый из способов по настоящему изобретению включает этап культивирования эмбриогенной ткани сосны в или на среде, содержащей дисахарид и глюкозу, для получения семядольных зародышей сосны, в которой дисахарид и глюкоза присутствуют каждый в концентрации меньше 3% (или меньше 2,9%, или меньше 2,8%, или меньше 2,7%, или меньше 2,6%). В некоторых вариантах осуществления способов по настоящему изобретению дисахарид и глюкоза присутствуют в среде в концентрации от 1 до 2,5% каждый. В некоторых вариантах осуществления способов по настоящему изобретению дисахарид и глюкоза присутствуют в среде в концентрации от 2 до 2,5% каждый. В некоторых вариантах осуществления способов по настоящему изобретению дисахарид присутствует в среде в концентрации 2,5%, и глюкоза присутствует в среде в концентрации 1%. В некоторых вариантах осуществления способов по настоящему изобретению среда содержит глюкозу и по меньшей мере два дисахарида, в таком случае концентрация глюкозы в среде меньше 3%, и общая концентрация всех дисахаридов в среде от 1% до 2,5%. В некоторых вариантах осуществления способов по настоящему изобретению среда содержит глюкозу и по меньшей мере два дисахарида; в этом случае глюкоза присутствует в среде в концентрации меньше 3%, а общая концентрация всех дисахаридов в среде от 2% до 2,5%.Each of the methods of the present invention includes the step of cultivating pine embryogenic tissue in or on a medium containing a disaccharide and glucose to obtain cotyledonary pine embryos in which the disaccharide and glucose are each present in a concentration of less than 3% (or less than 2.9%, or less 2.8%, or less than 2.7%, or less than 2.6%). In some embodiments of the methods of the present invention, the disaccharide and glucose are present in the medium at a concentration of from 1 to 2.5% each. In some embodiments of the methods of the present invention, the disaccharide and glucose are present in the medium at a concentration of from 2 to 2.5% each. In some embodiments of the methods of the present invention, the disaccharide is present in the medium at a concentration of 2.5%, and glucose is present in the medium at a concentration of 1%. In some embodiments of the methods of the present invention, the medium contains glucose and at least two disaccharides, in which case the concentration of glucose in the medium is less than 3%, and the total concentration of all disaccharides in the medium is from 1% to 2.5%. In some embodiments of the methods of the present invention, the medium comprises glucose and at least two disaccharides; in this case, glucose is present in the medium at a concentration of less than 3%, and the total concentration of all disaccharides in the medium is from 2% to 2.5%.
В некоторых вариантах осуществления способов по настоящему изобретению эмбриогенная ткань сосны культивируется в или на среде, содержащей дисахарид и глюкозу, каждый в концентрации меньше 3%, в течение периода от шести недель до 12 недель, или от восьми недель до 12 недель, или от девяти недель до 11 недель. В некоторых вариантах осуществления способов по настоящему изобретению эмбриогенная ткань сосны культивируется в или на среде, содержащей дисахарид и глюкозу, каждый в концентрации меньше 3%, при температуре от 20°С до 24°С или от 21°С до 24°С.In some embodiments of the methods of the present invention, embryogenic pine tissue is cultured in or on a medium containing disaccharide and glucose, each at a concentration of less than 3%, for a period of from six weeks to 12 weeks, or from eight weeks to 12 weeks, or from nine weeks to 11 weeks. In some embodiments of the methods of the present invention, pine embryogenic tissue is cultured in or on a medium containing disaccharide and glucose, each at a concentration of less than 3%, at a temperature of from 20 ° C to 24 ° C or from 21 ° C to 24 ° C.
Среда, которая содержит дисахарид и глюкозу, также может содержать питательные вещества (например, соли), которые поддерживают существование инкубированной растительной ткани, и один или несколько агентов для регулирования осмолярности среды в желаемом диапазоне. Например, осмолярность среды может составлять от 250 ммоль/кг до 450 ммоль/кг или от 250 ммоль/кг до 350 ммоль/кг. Водородный показатель среды также может регулироваться до желаемого значения. Например рН среды может составлять от 4,5 до 6,5 или от 5,0 до 6,0.A medium that contains a disaccharide and glucose may also contain nutrients (e.g., salts) that support the existence of incubated plant tissue, and one or more agents for controlling the osmolarity of the medium in the desired range. For example, the osmolarity of the medium can range from 250 mmol / kg to 450 mmol / kg or from 250 mmol / kg to 350 mmol / kg. The pH of the medium can also be adjusted to the desired value. For example, the pH of the medium may be from 4.5 to 6.5, or from 5.0 to 6.0.
Среда, содержащая дисахарид и глюкозу, может быть жидкой средой или твердой средой. При использовании жидкой среды эмбриогенная ткань обычно помещается на абсорбирующую подложку (например, фильтровальную бумагу), которая пропитана жидкой средой. При использовании твердой среды эмбриогенная ткань может быть помещена на поверхность среды и может частично проникать в поверхность твердой среды. Так, твердые среды включают среды, которые отверждены частично и позволяют эмбриогенной ткани значительно проникать в материал среды, и полностью отвержденные среды, которые не позволяют эмбриогенной ткани проникать в материал отвержденной среды. Жидкие среды могут быть полностью или частично отверждены путем добавления соответствующего количества огеливающего агента, такого как агар-агар или гелрит.The medium containing the disaccharide and glucose may be a liquid medium or a solid medium. When using a liquid medium, embryogenic tissue is usually placed on an absorbent substrate (for example, filter paper), which is impregnated with a liquid medium. When using a solid medium, embryogenic tissue can be placed on the surface of the medium and can partially penetrate the surface of the solid medium. Thus, solid media include media that are partially cured and allow embryogenic tissue to significantly penetrate into the material of the medium, and fully cured media that do not allow embryogenic tissue to penetrate into the material of the cured medium. Liquid media can be fully or partially cured by adding an appropriate amount of a gelling agent, such as agar agar or gelrite.
Было определено, что включение абсорбирующего состава в среду, которая содержит дисахарид и глюкозу, далее способствует получению высокого урожая семядольных зародышей сосны, имеющих повышенную частоту прорастания и улучшенное качество. Абсорбирующим составом может быть любой состав, который не токсичен к эмбриогенной ткани в концентрациях, используемых при практическом осуществлении методов по настоящему изобретению, и который способен абсорбировать гормоны роста и токсические соединения, продуцируемые растительными клетками во время развития зародышей и присутствующие в среде. Так, абсорбированный гормон более не способен способствовать росту эмбриогенной ткани в или на среде, и абсорбированные токсины не могут неблагоприятно влиять на растительные клетки. В этом контексте термин "абсорбирующий" охватывает любое химическое или физическое взаимодействие между абсорбирующим составом и одним или несколькими гормонами роста и/или токсинами в среде, так что гормоны роста и/или токсины становятся связанными абсорбирующим составом.It was determined that the inclusion of an absorbent composition in a medium that contains a disaccharide and glucose further contributes to a high yield of cotyledonary pine embryos having an increased germination rate and improved quality. The absorbent composition may be any composition that is not toxic to embryogenic tissue at the concentrations used in the practice of the methods of the present invention, and which is capable of absorbing growth hormones and toxic compounds produced by plant cells during embryonic development and present in the medium. Thus, the absorbed hormone is no longer able to promote the growth of embryogenic tissue in or on the medium, and the absorbed toxins cannot adversely affect plant cells. In this context, the term “absorbent” encompasses any chemical or physical interaction between the absorbent composition and one or more growth hormones and / or toxins in the medium, such that growth hormones and / or toxins become bound by the absorbent composition.
Так, в некоторых вариантах осуществления способов по настоящему изобретению эмбриогенная ткань инкубируется в или на среде, которая содержит гормоны роста, такие как ауксины и/или цитокинины, для содействия размножению эмбриогенной ткани. Когда получен достаточный объем эмбриогенной ткани, она может быть затем перенесена на среду, которая не содержит гормонов роста, но содержит дисахарид и глюкозу, а также, по выбору, один или несколько абсорбирующих составов. Абсорбирующий состав или составы связывают гормоны роста, присутствующие в среде, так что скорость размножения эмбриогенной ткани снижается, или размножение полностью останавливается, и дисахарид и глюкоза инициируют получение семядольных зародышей сосны из эмбриогенной ткани.Thus, in some embodiments of the methods of the present invention, embryogenic tissue is incubated in or on a medium that contains growth hormones, such as auxins and / or cytokinins, to facilitate the propagation of embryogenic tissue. When a sufficient volume of embryogenic tissue has been obtained, it can then be transferred to a medium that does not contain growth hormones but contains disaccharide and glucose, as well as, optionally, one or more absorbent formulations. The absorbent composition or compositions bind the growth hormones present in the medium, so that the rate of reproduction of embryogenic tissue is reduced, or the reproduction is completely stopped, and the disaccharide and glucose initiate the production of cotyledonary pine embryos from embryogenic tissue.
Не ограничительные примеры применимых абсорбирующих составов включают активированный уголь, растворимый поли-N-винилпирролидон, нерастворимый поли-N-винилпирролидон, активированный оксид алюминия и силикагель. Абсорбирующий раствор может присутствовать в количестве, например, от 0,01 г/л до 5 г/л. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения абсорбирующий состав присутствует в количестве от 0,05 г/л до 1 г/л. В тех вариантах осуществления способов по настоящему изобретению, в которых в среде присутствуют несколько абсорбирующих составов (например, по меньшей мере два абсорбирующих состава), вышеуказанные диапазоны концентраций относятся к общему содержанию абсорбирующих составов в среде.Non-limiting examples of suitable absorbent compositions include activated carbon, soluble poly-N-vinylpyrrolidone, insoluble poly-N-vinylpyrrolidone, activated alumina, and silica gel. The absorbent solution may be present in an amount of, for example, from 0.01 g / L to 5 g / L. In some embodiments, implementation of the present invention, the absorbent composition is present in an amount of from 0.05 g / l to 1 g / l. In those embodiments of the methods of the present invention in which several absorbent compositions are present in the medium (for example, at least two absorbent compositions), the above concentration ranges refer to the total content of the absorbent compositions in the medium.
При практическом осуществлении некоторых вариантов настоящего изобретения эмбриогенная ткань последовательно культивируется на или в последовательности из по меньшей мере двух сред, по меньшей мере одна из которых содержит дисахарид и глюкозу, которые каждый присутствуют в среде в концентрации меньше 3%. Среда, которая содержит дисахарид и глюкозу, адаптирована для способствования развитию и созреванию семядольных зародышей из эмбриогенной ткани, такой как эмбриогенная ткань, в которую были добавлены один или несколько гормонов роста. Семядольные зародыши сосны имеют повышенную частоту прорастания и улучшенное качество.In the practical implementation of certain embodiments of the present invention, embryogenic tissue is sequentially cultivated on or in a sequence of at least two media, at least one of which contains a disaccharide and glucose, which are each present in the medium at a concentration of less than 3%. A medium that contains disaccharide and glucose is adapted to promote the development and maturation of cotyledonary embryos from embryogenic tissue, such as embryogenic tissue, into which one or more growth hormones have been added. Pine cotyledonary embryos have an increased germination rate and improved quality.
Например, при практическом осуществлении некоторых вариантов способов по настоящему изобретению эмбриогенная ткань сосны (такая как ЭСМ) культивируется на или в среде для поддержания жизнедеятельности, которая адаптирована для содействия делению клеток и росту эмбриогенной ткани. Среда для поддержания жизнедеятельности может быть твердой средой, или жидкой средой, которая может перемешиваться для содействия росту и размножению содержащейся в ней эмбриогенной ткани. Среда для поддержания жизнедеятельности может содержать питательные вещества, которые поддерживают жизнедеятельность эмбриогенной ткани, и может содержать гормоны, такие как один или несколько ауксинов (например, 2,4-D) и/или цитокинины (например, кинетин, БАП), которые способствуют делению клеток и росту эмбриогенной ткани. Если используется ауксин, его концентрация в среде для поддержания жизнедеятельности может составлять, например, от 0,1 мг/л до 10 мг/л (или от 0,1 мг/л до 5 мг/л). Если в среде присутствуют несколько ауксинов, вышеуказанные диапазоны концентрации относятся к общему содержанию ауксинов в среде. Если используется цитокинин, его концентрация в среде для поддержания жизнедеятельности может составлять, например, от 0,1 мг/л до 2 мг/л (или от 0,1 мг/л до 1 мг/л). Если в среде присутствуют несколько цитокининов, вышеуказанные диапазоны концентрации относятся к общему содержанию цитокининов в среде.For example, in the practical implementation of certain variants of the methods of the present invention, embryogenic pine tissue (such as ESM) is cultured on or in a life support medium that is adapted to promote cell division and embryogenic tissue growth. The life support medium may be a solid medium, or a liquid medium that can be mixed to facilitate the growth and reproduction of the embryogenic tissue contained therein. The life support medium may contain nutrients that support embryogenic tissue and may contain hormones such as one or more auxins (e.g. 2,4-D) and / or cytokinins (e.g. kinetin, BAP) that promote fission cells and embryogenic tissue growth. If auxin is used, its concentration in the life support medium may be, for example, from 0.1 mg / L to 10 mg / L (or from 0.1 mg / L to 5 mg / L). If several auxins are present in the medium, the above concentration ranges relate to the total auxins in the medium. If cytokinin is used, its concentration in the environment for maintenance of vital activity may be, for example, from 0.1 mg / L to 2 mg / L (or from 0.1 mg / L to 1 mg / L). If several cytokinins are present in the medium, the above concentration ranges relate to the total cytokinin content in the medium.
Обычно желательно, хотя и не обязательно, включать в среду для поддержания жизнедеятельности мальтозу в качестве единственного или главного источника сахара. Мальтоза может присутствовать в концентрации от 0,5 мг/л до 6 мг/л или от 1 мг/л до 3 мг/л.It is usually desirable, although not necessary, to include maltose as the sole or main source of sugar in the environment to maintain vital activity. Maltose may be present in a concentration of from 0.5 mg / L to 6 mg / L or from 1 mg / L to 3 mg / L.
Осмолярность среды для поддержания жизнедеятельности может регулироваться до значения, которое находится в желаемом диапазоне, например от 100 ммоль/кг до 250 ммоль/кг или от 100 ммоль/кг до 200 ммоль/кг. Водородный показатель среды для поддержания жизнедеятельности может также регулироваться до значения в желаемом диапазоне, например от 4,5 до 6,5 или от 5,0 до 6,0. Эмбриогенная ткань обычно инкубируется в или на среде для поддержания жизнедеятельности при температуре в интервале от 20°С до 24°С или от 21°С до 24°С. Примером подходящей среды для поддержания жизнедеятельности является среда ВМ2 в Примере 1.The osmolarity of the environment to maintain life can be adjusted to a value that is in the desired range, for example from 100 mmol / kg to 250 mmol / kg or from 100 mmol / kg to 200 mmol / kg. The hydrogen indicator of the environment for maintaining life can also be adjusted to a value in the desired range, for example from 4.5 to 6.5 or from 5.0 to 6.0. Embryogenic tissue is usually incubated in or on the medium to maintain vital activity at a temperature in the range from 20 ° C to 24 ° C or from 21 ° C to 24 ° C. An example of a suitable environment for life support is the environment of VM 2 in Example 1.
Эмбриогенная ткань инкубируется в или на среде для поддержания жизнедеятельности до тех пор, пока эмбриогенная ткань не размножится до желаемого объема (определяемого, например, по массе культивированной эмбриогенной ткани). Эмбриогенная ткань затем может быть перенесена на среду для развития, адаптированную для содействия развитию высококачественных семядольных зародышей сосны. Средой для развития обычно является твердая среда, хотя она может быть и жидкой средой.Embryogenic tissue is incubated in or on the medium to maintain vital activity until the embryogenic tissue multiplies to the desired volume (determined, for example, by the weight of cultured embryogenic tissue). Embryogenic tissue can then be transferred onto developmental media adapted to promote the development of high-quality cotyledonary pine embryos. The development medium is usually a solid medium, although it may also be a liquid medium.
Среда для развития содержит дисахарид и глюкозу, которые каждый присутствует в концентрации меньше 3% (или меньше 2,9%, или меньше 2,8%, или меньше 2,7%, или меньше 2,6%). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения дисахарид и глюкоза присутствуют каждый в среде для развития в концентрации от 1% до 2,5%. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения дисахарид и глюкоза присутствуют каждый в среде для развития в концентрации от 2% до 2,5%.The development medium contains disaccharide and glucose, each of which is present in a concentration of less than 3% (or less than 2.9%, or less than 2.8%, or less than 2.7%, or less than 2.6%). In some embodiments, the disaccharide and glucose are each present in a developmental medium at a concentration of 1% to 2.5%. In some embodiments, the disaccharide and glucose are each present in a developmental medium at a concentration of from 2% to 2.5%.
Среда для развития может содержать питательные вещества (например, соли), которые поддерживают жизнедеятельность эмбриогенной ткани. Подходящие среды для развития обычно не содержат гормонов роста, таких как ауксины и цитокинины, но могут содержать гормон - абсцизовую кислоту. При использовании абсцизовой кислоты в среде для развития она обычно применяется в концентрации в диапазоне от 1 мг/л до 200 мг/л, например от 1 мг/л до 100 мг/л. Осмолярность среды для развития может регулироваться до значения, которое находится в желаемом диапазоне, например от 250 ммоль/кг до 450 ммоль/кг или от 250 ммоль/кг до 350 ммоль/кг. Водородный показатель среды для развития также может регулироваться в желаемом диапазоне, например от 4,5 до 6,5 или от 5,0 до 6,0. Эмбриогенная ткань обычно инкубируется в или на среде для развития при температуре в интервале от 20°С до 24°С или от 21°С до 24°С. Примером подходящей среды для развития является среда ВМ3 в Примере 1.A growth medium may contain nutrients (e.g. salts) that support the vital functions of embryogenic tissue. Suitable growth media usually do not contain growth hormones, such as auxins and cytokinins, but may contain the hormone abscisic acid. When abscisic acid is used in a developmental medium, it is usually applied in a concentration in the range from 1 mg / L to 200 mg / L, for example from 1 mg / L to 100 mg / L. The osmolarity of the developmental medium can be adjusted to a value that is in the desired range, for example, from 250 mmol / kg to 450 mmol / kg or from 250 mmol / kg to 350 mmol / kg. The hydrogen index of the development environment can also be adjusted in the desired range, for example from 4.5 to 6.5 or from 5.0 to 6.0. Embryogenic tissue is usually incubated in or on a developmental medium at a temperature in the range from 20 ° C to 24 ° C or from 21 ° C to 24 ° C. An example of a suitable medium for development is the environment of VM 3 in Example 1.
В некоторых вариантах осуществления способов по настоящему изобретению эмбриогенная ткань инкубируется в или на среде для развития в течение периода от шести недель до 12 недель или от шести недель до девяти недель.In some embodiments of the methods of the present invention, embryogenic tissue is incubated in or on a developmental medium for a period of six weeks to 12 weeks or six weeks to nine weeks.
Так, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предлагает способы для получения семядольных зародышей сосны, причем каждый из способов включает этапы: (а) культивирования эмбриогенной ткани сосны (такой как эмбриональные суспензорные массы) на или в среде для поддержания жизнедеятельности; и (б) культивирования эмбриогенной ткани сосны, обработанной в соответствии с этапом (а), на или в среде для развития, содержащей дисахарид и глюкозу для образования семядольных зародышей сосны, где дисахарид и глюкоза присутствуют каждый в среде для развития в концентрации меньше 3%. Среда для развития может, по выбору, содержать абсорбирующий состав. Способы по данному аспекту настоящего изобретения могут, по выбору, включать этап культивирования ткани сосны в или на среде для инициирования для получения эмбриогенной ткани сосны, которая затем культивируется в или на среде для поддержания жизнедеятельности, как указано в этапе (а).Thus, in some embodiments, the present invention provides methods for producing cotyledonary pine embryos, each method comprising the steps of: (a) cultivating embryogenic pine tissue (such as embryonic suspensory masses) on or in a life support medium; and (b) cultivating the embryogenic pine tissue treated in accordance with step (a) on or in a development medium containing a disaccharide and glucose to form cotyledonary pine embryos, where the disaccharide and glucose are each present in the development medium in a concentration of less than 3% . The development medium may optionally contain an absorbent composition. The methods of this aspect of the present invention may optionally include the step of cultivating the pine tissue in or on the initiation medium to obtain embryogenic pine tissue, which is then cultivated in or on the vital support medium as indicated in step (a).
В других вариантах осуществления настоящее изобретение предлагает способы для получения семядольных зародышей сосны, причем каждый из способов включает этапы: (а) культивирования эмбриогенной ткани сосны (такой как эмбриональные суспензорные массы сосны) на твердой среде для поддержания жизнедеятельности; (б) культивирования эмбриогенной ткани сосны, обработанной в соответствии с этапом (а) в жидкой среде для поддержания жизнедеятельности; и (в) культивирования эмбриогенной ткани сосны, обработанной в соответствии с этапом (б), на твердой среде для развития, содержащей дисахарид и глюкозу, для образования семядольных зародышей сосны, в которой дисахарид и глюкоза присутствуют каждый в среде для развития в концентрации меньше 3%. Среда для развития может, по выбору, содержать абсорбирующий состав. Способы по данному аспекту настоящего изобретения могут, по выбору, включать этап культивирования ткани сосны в среде для инициирования для получения эмбриогенной ткани сосны, которая затем культивируется на среде для поддержания жизнедеятельности, как указано в этапе (а).In other embodiments, the present invention provides methods for producing cotyledonary pine embryos, each method comprising the steps of: (a) cultivating embryogenic pine tissue (such as pine embryonic suspensory masses) on a solid medium to support vital functions; (b) cultivating the embryogenic pine tissue treated in accordance with step (a) in a liquid medium to maintain life; and (c) cultivating the embryogenic pine tissue treated in accordance with step (b) on a solid development medium containing disaccharide and glucose to form cotyledonary pine embryos in which disaccharide and glucose are each present in the development medium in a concentration of less than 3 % The development medium may optionally contain an absorbent composition. The methods of this aspect of the present invention may optionally include the step of cultivating the pine tissue in the initiation medium to obtain embryogenic pine tissue, which is then cultured on the environment to support vital functions, as indicated in step (a).
Семядольные зародыши сосны, полученные с использованием способов по настоящему изобретению, могут, по выбору, развиваться до образования саженцев сосны, которые могут быть выращены до сосновых деревьев, по желанию. Семядольные зародыши сосны могут проращиваться на твердой среде для прорастания, такой как среда BM5 в Примере 1. Проросшие саженцы могут быть перенесены в почву для последующего роста. Например, проросшие саженцы могут быть помещены в почву в теплице и расти там до переноса в открытый грунт. Обычно семядольные зародыши сосны освещаются для стимулирования роста. Обычно все этапы способов по настоящему изобретению, за исключением прорастания, проводятся в темноте.Pine cotyledonary nuclei obtained using the methods of the present invention can optionally develop to form pine seedlings that can be grown to pine trees, if desired. Pine cotyledonary embryos can be germinated on a solid germination medium, such as BM 5 medium in Example 1. Sprouted seedlings can be transferred to the soil for subsequent growth. For example, sprouted seedlings can be placed in the soil in a greenhouse and grow there before being transferred to open ground. Typically, cotyledonary pine embryos are illuminated to stimulate growth. Typically, all steps of the methods of the present invention, with the exception of germination, are carried out in the dark.
Способы по настоящему изобретению могут использоваться, например, для получения клонов индивидуальных сосновых деревьев, которые обладают одной или несколькими желательными характеристиками, такими как быстрая скорость роста. Так, в одном аспекте настоящее изобретение предлагает способы для получения генетически идентичных семядольных зародышей сосны. Способы по данному аспекту настоящего изобретения включают этап культивирования генетически идентичной эмбриогенной ткани сосны в или на среде, содержащей дисахарид и глюкозу, для получения генетически идентичных семядольных зародышей сосны, в которой дисахарид и глюкоза присутствуют каждый в концентрации меньше 3%.The methods of the present invention can be used, for example, to obtain clones of individual pine trees that have one or more desirable characteristics, such as a fast growth rate. Thus, in one aspect, the present invention provides methods for producing genetically identical cotyledonary pine embryos. The methods of this aspect of the present invention include the step of culturing genetically identical pine embryogenic tissue in or on a medium containing a disaccharide and glucose to obtain genetically identical cotyledonary pine embryos, in which the disaccharide and glucose are each present in a concentration of less than 3%.
В еще одном аспекте настоящее изобретение предлагает популяции зиготоподобных семядольных зародышей сосны. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения по меньшей мере 50% (или по меньшей мере 60%, или по меньшей мере 70%, или по меньшей мере 80% или по меньшей мере 90%) семядольных зародышей сосны в популяции семядольных зародышей сосны являются зиготоподобными. Так, в некоторых вариантах данного аспекта настоящего изобретения от 50 до 100% (или от 60 до 80%, или от 70 до 80%) семядольных зародышей сосны являются зиготоподобными. Способы по настоящему изобретению могут использоваться для получения популяций зиготоподобных семядольных зародышей сосны по настоящему изобретению. Так, в одном аспекте настоящее изобретение предлагает популяции семядольных зародышей сосны, подготовленных по одному из способов по настоящему изобретению.In yet another aspect, the present invention provides populations of zygote-like cotyledonary pine embryos. In some embodiments of the present invention, at least 50% (or at least 60%, or at least 70%, or at least 80%, or at least 90%) of the cotyledonary pine embryos in the pine cotyledonary seed population are zygote-like. Thus, in some embodiments of this aspect of the present invention, from 50 to 100% (or from 60 to 80%, or from 70 to 80%) of the cotyledonary pine embryos are zygote-like. The methods of the present invention can be used to obtain populations of zygote-like cotyledonary pine embryos of the present invention. Thus, in one aspect, the present invention provides populations of cotyledonary pine embryos prepared according to one of the methods of the present invention.
Следующие примеры просто иллюстрируют рассмотренный выше наилучший способ практического осуществления настоящего изобретения, но не должны истолковываться как ограничивающие настоящее изобретение.The following examples merely illustrate the best practice described above for practicing the present invention, but should not be construed as limiting the present invention.
Пример 1Example 1
Данный Пример представляет показательный способ по настоящему изобретению для получения популяции сосны Лоблолли (Pinus taeda) семядольных зародышей и прорастания зародышей.This Example provides an exemplary method of the present invention for producing a Loblolly pine (Pinus taeda) population of cotyledonary embryos and germination of the embryos.
Женские гаметофиты, содержащие зиготные зародыши, удаляются из семян через 4-5 недель после оплодотворения. Шелуха семян удаляется, но зародыши не вырезаются из окружающего их гаметофита, вырезается только центральная часть семяпочки. Конусы хранятся при температуре 4°С до использования. Сразу же после удаления недоразвившихся зародышей семена стерилизуются после начальной промывки и обработки моющим средством в 15%-ном растворе Н2О2 в течение 10 минут. Экспланты тщательно промываются в стерильной дистиллированной воде после каждого этапа обработки.Female gametophytes containing zygotic embryos are removed from the seeds 4-5 weeks after fertilization. The husk of the seeds is removed, but the embryos are not cut out from the gametophyte surrounding them, only the central part of the ovule is cut out. Cones are stored at 4 ° C until use. Immediately after removal of the underdeveloped embryos, the seeds are sterilized after the initial washing and detergent treatment in a 15% solution of H 2 O 2 for 10 minutes. Explants are thoroughly washed in sterile distilled water after each processing step.
В Таблице 1 приведены составы типичных сред, применяемых для эмбриогенеза сосны Лоблолли.Table 1 shows the compositions of typical media used for embryogenesis of Loblolly pine.
Стадия I - Инициирование: Стерильные гаметофиты с цельными зародышами помещаются на твердую культурную среду ВМ1 и выдерживаются при температуре 22-25°С в течение 3-5 недель в полной темноте. Продолжительность выдержки зависит от культивируемого генотипа. В конце этого периода образуется белая слизистая масса вместе с первоначальными эксплантами. Анализ под микроскопом обычно выявляет в этой массе многочисленные зародыши на начальной стадии. Они обычно характеризуются наличием длинного тонкостенного суспензора с небольшой головкой, имеющей плотную цитоплазму и крупные ядра.Stage I - Initiation: Sterile gametophytes with whole embryos are placed on a solid culture medium VM 1 and kept at a temperature of 22-25 ° C for 3-5 weeks in complete darkness. The duration of exposure depends on the cultivated genotype. At the end of this period, a white mucous mass forms along with the original explants. Microscopic analysis usually reveals numerous nuclei in this mass at the initial stage. They are usually characterized by the presence of a long thin-walled suspension with a small head having a dense cytoplasm and large nuclei.
Осмолярность среды для инициирования в некоторых случаях может достигать 170 ммоль/кг. Обычно она составляет около 160 ммоль/кг или даже ниже (150 ммоль/кг).In some cases, the osmolarity of the initiation medium can reach 170 mmol / kg. Usually it is about 160 mmol / kg or even lower (150 mmol / kg).
Стадия II - Поддержание жизнедеятельности и размножение:Stage II - Life Support and Reproduction:
Зародыши на ранней стадии, удаленные из масс, образованных на стадии инициирования, сначала помещаются на загущенную среду для поддержания жизнедеятельности и размножения. Она отличается от среды для инициирования тем, что гормоны роста (ауксины и цитокинины) снижаются по меньшей мере на порядок. Осмолярность этой среды обычно выше, чем среды для инициирования, и составляет 180 ммоль/кг или больше в результате увеличения концентрации мио-инозитола до 0,5 объемных процентов. Температура и световой период по-прежнему равны 22-25°С при полной темноте. Зародыши культивируются в течение 12-14 дней на твердой среде ВМ2 до переноса в жидкую среду для дальнейшего субкультивирования. Эта жидкая среда имеет аналогичный состав, но без огеливающего агента. Зародыши в конце стадии поддержания жизнеспособности на твердой среде обычно сходны по внешнему виду с зародышами стадии I. После 5-6 недель субкультур на жидкой среде для поддержания жизнеспособности образуются развитые зародыши на ранней стадии. Они характеризуются мягкими эмбриональными головками, обычно имеют свыше 100 индивидуальных клеток и многочисленные суспензоры.Embryos at an early stage, removed from the masses formed at the initiation stage, are first placed on a thickened medium to support vital activity and reproduction. It differs from the initiation medium in that growth hormones (auxins and cytokinins) are reduced by at least an order of magnitude. The osmolarity of this medium is usually higher than the initiation medium and amounts to 180 mmol / kg or more as a result of an increase in the concentration of myo-inositol to 0.5 volume percent. The temperature and light period are still equal to 22-25 ° C in complete darkness. The embryos are cultured for 12-14 days on a solid medium VM 2 before being transferred to a liquid medium for further subculture. This liquid medium has a similar composition, but without gelling agent. Embryos at the end of the stage of maintaining viability on a solid medium are usually similar in appearance to the nuclei of stage I. After 5-6 weeks of subcultures on a liquid medium, developed embryos are formed at an early stage to maintain viability. They are characterized by soft embryonic heads, usually have over 100 individual cells and numerous suspensors.
Осмотический потенциал сред для поддержания жизнеспособности для Pinus taeda обычно составляет примерно 180-400 ммоль/кг. В большинстве случаев осмотический потенциал сред для поддержания жизнедеятельности примерно в 1,5 раза выше, чем у сред для инициирования или размножения.The osmotic potential of viability media for Pinus taeda is usually about 180-400 mmol / kg. In most cases, the osmotic potential of media for maintaining vital activity is approximately 1.5 times higher than that of media for initiation or reproduction.
Стадия III - Развитие зародыша: Развившиеся зародыши на ранней стадии их культуры Стадии II переносятся на подложку из фильтровальной бумаги, помещенной на подкладку, пропитанную жидкой средой для развития. Эта среда или совсем не имеет гормонов роста, или они присутствуют только в очень небольших количествах, и эта среда имеет такой же пониженный уровень осмотических агентов как и на Стадиях I и II. Присутствуют глюкоза и мальтоза. Может быть добавлена абсцизовая кислота для ускорения дальнейшего развития. Также может быть добавлен абсорбирующий состав (такой как активированный уголь, растворимые и нерастворимые формы поли-N-винилпирролидона, активированный оксид алюминия и силикагель) в концентрации примерно 0,1-5 г/л или примерно 0,25-2,5 г/л.Stage III - Development of the embryo: Developed embryos at an early stage of their culture Stage II is transferred to a substrate of filter paper placed on a lining impregnated with a liquid medium for development. This medium either does not have growth hormones at all, or they are present only in very small quantities, and this medium has the same reduced level of osmotic agents as in Stage I and II. Glucose and maltose are present. Abscisic acid may be added to accelerate further development. An absorbent composition (such as activated carbon, soluble and insoluble forms of poly-N-vinylpyrrolidone, activated alumina and silica gel) can also be added at a concentration of about 0.1-5 g / l or about 0.25-2.5 g / l
Осмотический потенциал этой среды может быть значительно поднят по сравнению со средой для поддержания жизнедеятельности. Например, осмолярность может достигать 350 ммоль/кг или даже больше. Развитие предпочтительно проводится в полной темноте при температуре 22-25°С до развития удлиненных семядольных зародышей. Время развития обычно составляет несколько недель, обычно от 6 до 9 недель.The osmotic potential of this medium can be significantly increased in comparison with the medium for supporting vital functions. For example, osmolarity can reach 350 mmol / kg or even more. The development is preferably carried out in complete darkness at a temperature of 22-25 ° C until the development of elongated cotyledonary embryos. The development time is usually several weeks, usually from 6 to 9 weeks.
Затем зародыши инкубируются при 4-10°С в течение 3-4 недель в среде, которая не содержит PEG или АБА (например, среда ВМ7).Then the embryos are incubated at 4-10 ° C for 3-4 weeks in a medium that does not contain PEG or ABA (for example, BM7 medium).
Стадия IV - Сушка: Зародыши, все еще находящиеся на подложке из фильтровальной бумаги, поднимаются с подкладки и помещаются в закрытый контейнер на насыщенный раствор K2SO4 или воду, при относительной влажности 97% на период около трех недель.Stage IV - Drying: Embryos still on the filter paper substrate are lifted from the lining and placed in a closed container on a saturated solution of K 2 SO 4 or water, at a relative humidity of 97% for a period of about three weeks.
Стадия V - Прорастание: Высушенные семядольные зародыши со Стадии IV регидратируются путем помещения их на той же подложке из фильтровальной бумаги примерно на 24 часа на подкладку, насыщенную жидкой средой для прорастания. Затем зародыши индивидуально размещаются на твердой среде ВМ5 для прорастания. Это основная питательная среда без гормонов роста, которая была модифицирована путем снижения содержания сахарозы, мио-инозитола и органического азота. Зародыши инкубируются на среде ВМ5 в течение примерно 6-8 недель при температуре 23-25°С и световым периодом 16 часов света - 8 часов темноты до тех пор, пока получившиеся проростки не будут иметь хорошо развитый корешок и гипокотиль и зеленую семядольную структуру и эпикотиль. По желанию, семядольные зародыши могут быть превращены в искусственные семена.Stage V - Germination: The dried cotyledonary embryos from Stage IV are rehydrated by placing them on the same filter paper substrate for about 24 hours on a lining saturated with a germination medium. Then the embryos are individually placed on a solid medium VM 5 for germination. This is the main growth medium without growth hormones, which has been modified by reducing the content of sucrose, myo-inositol and organic nitrogen. The embryos are incubated on VM 5 medium for about 6-8 weeks at a temperature of 23-25 ° C and a light period of 16 hours of light - 8 hours of darkness until the resulting seedlings have a well-developed root and hypocotyl and a green cotyledon structure and epicotyl. If desired, cotyledonary embryos can be turned into artificial seeds.
Из-за пониженной концентрации углеводов осмотический потенциал среды для прорастания далее снижается ниже уровня среды для развития. Обычно он ниже примерно 150 ммоль/кг (или примерно 100 ммоль/кг).Due to the low concentration of carbohydrates, the osmotic potential of the medium for germination further decreases below the level of the medium for development. It is usually below about 150 mmol / kg (or about 100 mmol / kg).
Стадия VI - Преобразование: Проростки со Стадии V удаляются из среды для прорастания и помещаются в грунт, состоящий из равных частей торфа и мелкого перлита.Stage VI - Conversion: The seedlings from Stage V are removed from the germination medium and placed in soil consisting of equal parts of peat and fine perlite.
Пример 2Example 2
Этот пример демонстрирует воздействие среды для развития, которая содержит 2,5% мальтозы и 1% глюкозы, на развитие и прорастание культивируемых на ней соматических зародышей сосны Лоблолли.This example demonstrates the effect of a developmental medium, which contains 2.5% maltose and 1% glucose, on the development and germination of the somatic embryos of the Loblolli pine cultivated on it.
Были испытаны три генотипа сосны Лоблолли: Генотип А, Генотип В и Генотип С. Эмбриональные суспензорные массы (ЭСМ) каждого генотипа выращивались в колбе, содержащей 1 л среды ВМ2. Каждая колба с ЭСМ отстаивалась в течение 15 мин, среды перемешивалась, и отстоявшиеся клетки переносились в новый сосуд. Равный объем среды ВМ6 добавлялся к клеткам, которым затем давали отстаиваться в течение 10 мин. Половина среды ВМ6 удалялась, и аликвотные пробы по 1,5 мл отстоявшихся клеток (соотношение клетки с ВМ6 1:0,5) переносились непосредственно на среды ВМ3 (содержит глюкозу и мальтозу) и ВМ4 (содержит мальтозу, но не содержит глюкозу) для развития, а также на среды ВМ2, ВМ5, ВМ6 и ВМ7.Three Loblolli pine genotypes were tested: Genotype A, Genotype B and Genotype C. The embryonic suspensor masses (ESM) of each genotype were grown in a flask containing 1 liter of BM2 medium. Each ESM flask was left to stand for 15 minutes, the medium was mixed, and the settled cells were transferred to a new vessel. An equal volume of BM6 medium was added to the cells, which were then allowed to stand for 10 minutes. Half of BM6 medium was removed, and aliquots of 1.5 ml of settled cells (cell ratio with BM6 1: 0.5) were transferred directly to BM3 (contains glucose and maltose) and BM4 (contains maltose, but does not contain glucose) for development , as well as on the media VM2, VM5, VM6 and VM7.
После инкубирования в течение 4 недель на этих средах для развития наблюдалось, что среда ВМ3 обеспечивала более быстрое развитие, чем среда ВМ4. Другие среды не показали различий по сравнению с контрольной средой. После инкубирования в течение 12 недель на средах для развития зародыши, культивируемые на среде ВМ3, были намного больше, длиннее и более напоминали зиготных зародышей, чем зародыши, культивируемые на среде ВМ4. Зародыши, культивируемые на среде ВМ3, начали развивать семядоли после восьми недель. Зародыши, культивируемые на среде ВМ3, имели 8-10 семядолей (генотип А дал несколько зародышей, имевших 14-16 семядолей) по сравнению с 4-6 семядолями на зародышах, культивируемых на среде ВМ4. Так, культивирование зародышей на среде для развития, содержащей мальтозу и глюкозу (среда ВМ3), дало более крупные зародыши улучшенного качества с большим количеством семядолей и видимых сводов, чем другие среды. В Таблице 2 показано количество зиготоподобных зародышей сосны Лоблолли, полученных на средах ВМ4 и ВМ3.After incubation for 4 weeks on these developmental media, it was observed that the BM3 medium provided faster development than the BM4 medium. Other media showed no differences compared to the control medium. After incubation for 12 weeks on development media, the embryos cultured on BM3 medium were much larger, longer and more like zygotic embryos than embryos cultured on BM4 medium. Embryos cultured on BM3 medium began to develop cotyledons after eight weeks. The embryos cultured on BM3 medium had 8-10 cotyledons (genotype A gave several embryos having 14-16 cotyledons) compared to 4-6 cotyledons on embryos cultured on BM4 medium. Thus, the cultivation of embryos on a developmental medium containing maltose and glucose (BM3 medium) gave larger nuclei of improved quality with a large number of cotyledons and visible arches than other media. Table 2 shows the number of zygote-like embryos of Loblolly pine obtained on BM4 and BM3 media.
Зиготоподобные зародыши были выбраны из плоских чашек со средами ВМ3 и ВМ4 и перенесены в чашку Петри, содержащую фильтровальную бумагу на подложке, пропитанной средой ВМ7. Чашки Петри герметизировались парафином и хранились в холодном месте. После 4 недель куски фильтровальной бумаги с зародышами переносились на ячеистые мостики в коробках Magenta, которые содержали примерно 100 мл воды. После 3 недель сушки в коробках куски фильтровальной бумаги с зародышами переносились в чашки Петри, содержащие подложку, пропитанную жидкой средой ВМ5. После 24 часов зародыши переносились на твердую среду ВМ5 в коробки для прорастания. Коробки были оставлены в темноте на одну неделю и затем перенесены в светлое помещение.Zygote-like nuclei were selected from flat plates with BM3 and BM4 media and transferred to a Petri dish containing filter paper on a substrate impregnated with BM7 medium. Petri dishes were sealed with paraffin and stored in a cold place. After 4 weeks, the pieces of filter paper with the buds were transferred to the mesh bridges in Magenta boxes, which contained approximately 100 ml of water. After 3 weeks of drying in boxes, pieces of filter paper with embryos were transferred to Petri dishes containing a substrate impregnated with liquid BM5 medium. After 24 hours, the embryos were transferred onto solid BM5 medium in germination boxes. The boxes were left in the dark for one week and then moved to a bright room.
Зародыши, полученные на ВМ3, имели частоту прорастания, которая почти вдвое превышала частоту прорастания зародышей на ВМ4. Более того, качество проростков, полученных на среде ВМ3, было лучше качества проростков, полученных на среде ВМ4. Например, для Генотипов А и В биполярные проростки на среде ВМ3 имели прямые и толстые гипокотили при энергичном росте эпикотилей. Напротив, биполярные проростки, полученные на среде ВМ4, имели искривленные, относительно тонкие гипокотили.The embryos obtained on BM3 had a germination rate that was almost twice the germination rate on VM4. Moreover, the quality of seedlings obtained on a BM3 medium was better than the quality of seedlings obtained on a BM4 medium. For example, for Genotypes A and B, bipolar seedlings on BM3 medium had straight and thick hypocotyls with vigorous growth of epicotyls. On the contrary, bipolar seedlings obtained on BM4 medium had curved, relatively thin hypocotyls.
Хотя предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения был продемонстрирован и изложен, будет понятно, что в него могут быть внесены различные изменения без отхода от идеи и объема настоящего изобретения.Although a preferred embodiment of the present invention has been demonstrated and set forth, it will be understood that various changes may be made therein without departing from the spirit and scope of the present invention.
Claims (26)
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US37127902P | 2002-04-09 | 2002-04-09 | |
| US60/371,279 | 2002-04-09 | ||
| US60/380,747 | 2002-05-14 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2003109361A RU2003109361A (en) | 2004-10-27 |
| RU2333633C2 true RU2333633C2 (en) | 2008-09-20 |
Family
ID=32594991
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2003109361/13A RU2333633C2 (en) | 2002-04-09 | 2003-04-03 | Method of obtaining high crops of zygotic-type cotyledonous blastemals of pine with use of mediums containing disaccharide and glucose (versions) |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2333633C2 (en) |
| ZA (1) | ZA200302462B (en) |
-
2003
- 2003-03-28 ZA ZA200302462A patent/ZA200302462B/en unknown
- 2003-04-03 RU RU2003109361/13A patent/RU2333633C2/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ZA200302462B (en) | 2003-10-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7785884B2 (en) | Low density spreading methods for conifer somatic embryogenesis | |
| US7452722B2 (en) | Methods for developing conifer somatic embryos | |
| EP2332405B1 (en) | Media comprising gellan gum and methods for promoting maturation of conifer somatic embryos | |
| CA2423393C (en) | Methods for producing high yields of zygotic-like cotyledonary pine embryos utilizing media that include a disaccharide and glucose | |
| US7732205B2 (en) | Development and stratification of pine somatic embryos using a liquid system | |
| US7888099B2 (en) | Methods for producing a synchronized population of conifer somatic embryos | |
| RU2333633C2 (en) | Method of obtaining high crops of zygotic-type cotyledonous blastemals of pine with use of mediums containing disaccharide and glucose (versions) | |
| US20090087909A1 (en) | Use of Trehalose in Conifer Somatic Embryogenesis to Increase Germination Vigor | |
| AU2003203636B2 (en) | Methods for producing cotyledonary pine embryos utilizing a gibberellin | |
| AU2003231584B2 (en) | Methods for producing conifer somatic embryos | |
| AU2004202738B2 (en) | Use of abscisic acid in somatic embryogenesis of pine trees | |
| US20040237130A1 (en) | Embryogenic culture initiation of douglas-fir by maltose | |
| McKellar | Micropropagation and in vitro studies of Pinus patula Scheide et Deppe. | |
| NZ533575A (en) | Use of abscisic acid in somatic embryogenesis of pine trees |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20180404 |