FI108991B - Menetelmä ihmisen monoklonaalisen vasta-aineen tuottamiseksi - Google Patents

Description

108991

Menetelmä ihmisen monoklonaalisen vasta-aineen tuottamiseksi 1. Keksinnön ala 5 Tämä keksintö koskee yleisesti immunologian alaa ja erityisesti ihmisen monoklonaalisia vasta-aineita, jotka sitoutuvat RS-virukseen (RSV, respiratory syncytial virus) ja neutralisoivat sitä.

10 2. Kuvaus alan tasosta RSV on tärkein sairautta aiheuttava virus lasten hengitysteissä, ja se on tunnistettu keuhkokuumeen ja bronkioliitin (ilmatiehyttulehdus) yleisimmäksi syyksi. Yksin Yhdysvalloissa on suhteellisen suuri määrä, noin 100 000 - 200 000, 15 sellaisia imeväisikäisiä ja lapsia, joilla on suuri riski kehittää vakava tai kuolemaan johtava RSV-tauti. Riskipopu-laatioon kuuluvat vauvat ja lapset, joilla on bronkopulmo-naalinen dysplasia, synnynnäinen sydäntauti, kystinen fib-roosi, syöpä tai jokin useista eri immuunipuutostaudeista, 20 samoin kuin esimerkiksi aikuiset, joiden immuunivastetta on heikennetty ennen luuytimensiirtoa (McIntosh ja Chanock. 1990. Virology, 2. laitos, toim. Fields ja Knipe. Raven Press Ltd. New York. s. 1045-1072) ”35 Muutamat erilliset todistesuunnat viittaavat siihen, että vasta-aineet antavat puolustuskykyä RSV-infektiota ja sai- • · * · rautta vastaan. Ensiksi, vauvojen infektion vastustuskyky ί * ensimmäisten elinkuukausien aikana, kun vakavan sairauden ·,: : riski on suurimmillaan, on verrannollinen äidin RSV-IgG-vas- : 30 ta-ainepitoisuuteen (Ogilvie et ai. J. Med. Virol. 7:263.

1981). Toiseksi, yhdistetty ihmisen IgG, joka sisältää pal-jon RSV:tä neutraloivia vasta-aineita, tai sopivat hiiren .···. monoklonaaliset vasta-aineet, jotka neutraloivat RS-virusta • t tehokkaasti, voivat suojata pieniä eläimiä keuhkoinfektioil- ' 35 ta, kun niitä annetaan profylaktisesti, ja ne voivat pienen- tää pieneläinten ja koe-eläiminä käytettävien kädellisten . .·. keuhkojen virustiitteriä RSV-infektion huippukohdassa, kun .···, niitä annetaan terapeuttisesti (Walsh et ai. Infection and 2 108991

Immunity. 43:756. 1984, Prince et ai. J. Virol. 55:517.

1985. Prince et al. Virus Research. 3:193. 1985, Prince et ai. J. Virol. 63:1851. 1987, Hemming et al. J. Inf. Dis. 152:1083. 1985). Kolmanneksi, kliininen tutkimus ihmisen 5 yhdistetystä, runsaasti RSV:tä neutraloivia vasta-aineita sisältävästä IgG:stä on antanut alustavia viitteitä siihen, että näillä vasta-aineilla voi olla terapeuttinen vaikutus vauvojen ja pienten lasten vakaviin RSV-sairauksiin (Hemming et al. Antimicrob. Agnts. Chemotherap. 31:1882. 1987). Tämän 10 todistusaineiston nojalla on huomattava tarve kehittää RSV:lle neutraloivia vasta-aineita immuuniprofylaksista ja hoitoa varten, riskiryhmien pikkulasten suojelemiseksi vakavalta sairaudelta ja vakavien alempien hengitysteiden RSV-infektiotapausten hoitamiseksi.

15 Tällä hetkellä ei ole saatavilla mitään RSV-rokotetta. Strategia, jonka profylaktista tehokkuutta parhaillaan arvioidaan, käsittää yhdistetystä plasmasta valmistetun ihmisen IgG:n antamista laskimonsisäisesti määräajoin. Koska globu-20 liinia tarvitaan suuri määrä (1-2 gm/kg), ja koska aine on annettava laskimoon klinikalla tai sairaalassa 2-4 tunnin ajan joka kuukausi syksyn, talven ja varhaiskevään aikana, tämä strategia ei ole kovin käytännöllinen.

· · • * ‘”25 RSV-virionin pinnan tärkeimmät neutralisointiantigeenit ovat

• « I

runsaat (major) glykoproteiinit F (viruksen fuusioituminen) • · · ’ ja G (tarttuminen). Monospesifinen antiseerumi, joka on val- ’ * mistettu immuuniaffiniteettipuhdistettua F- tai G-glykopro- • · : teiinia vastaan, neutralisoi RSV:tä hyvin tehokkaasti (Walsh :.;30 et al. J. Gen. Microbiol. 67:505. 1986). F:n, mutta ei G:n, antiseerumi myös estää RSV-infektoituneiden solujen fuusioi-·;··; tumista infektoitumattomiin naapurisoluihin.

I « · • § On olemassa tarve kehittää ihmisen RSV-vasta-ainevalmistei- 3'5 ta, joilla on parempi spesifinen aktiivisuus kuin yhdiste->11·· ‘ ' tyillä ihmisen plasmavalmisteilla. Yksi potentiaalisesti : tehokas ratkaisu tähän ongelmaan olisi ihmisen monoklonaa- listen RSV-vasta-aineiden käyttö. RSV-spesifinen monoklonaa- 3 108991 linen vasta-aine, toisin kuin polyklonaaliset antiseerumit, sisältää ominaislaatunsa vuoksi suuremman pitoisuuden spesifistä vasta-ainetta. Siksi monoklonaalisen vasta-aineen käyttö pienentäisi profylaksiin tai hoitoon tarvittavan 5 globuliinin määrää monella suuruusluokalla. Tästä seuraa, että tehokas annos monoklonaalista vasta-ainetta voitaisiin antaa lihaksen sisään (intramuscularly, IM), ennemmin kuin laskimon sisään (IV) pitkän ajan kuluessa. Suuressa vaarassa olevien vauvojen profylaksi voitaisiin antaa lihaksen 10 sisään kotona, eikä tarvitsisi antaa vasta-aineita laskimon sisään sairaalassa. Hoitoon tarvittavan globuliinimäärän pienenemisen pitäisi myös mahdollistaa varhaista, lievää alempien hengitysteiden RSV-tautia sairastavien potilaiden hoitaminen antamalla vasta-aineita IM sairaalaan joutumisen 15 estämiseksi. Lisäksi aerosolilääkitys helpottuu siksi, että monoklonaalisten vasta-aineiden spesifinen aktiivisuus on suurempi, mistä seuraa tarvittavan terapeuttisen konsentraa-tion pieneneminen, ja siksi, että sellaiset vasta-aineet ovat entistä tehokkaampia, kun ne viedään suoraan keuhkoi-20 hin. Itse asiassa sumutekäytössä riittävät monoklonaalisten RSV-vasta-aineiden F(ab')2-fragmentit. Käyttökelpoisten vasta-ainevalmisteiden pitäisi myös pystyä neutralisoimaan useita erilaisia eristettyjä RS-viruksia, mukaan luettuna molempien antigeenialaryhmien A ja B RS-virukset. Nämä ala-/25 ryhmät, A ja B, kiertävät populaatiossa samanaikaisesti, eri aikoina vaihtelevassa suhteessa, ja niiden arvioidaan muistuttavan toisiaan 50-%:sesti F-glykoproteiinin suhteen ja • 1 - 5-%:sesti G-glykoproteiinin suhteen (McIntosh ja Cha- ·'- : nock, edellä) .

Muutaman viimeksi kuluneen vuoden aikana RSV-infektion ul-*:·': koisen immuunihoidon teho on parantunut kahden aikaisempien menetelmien muunnoksen ansiosta. Ensiksi hiiren monoklonaa-‘ . listen RSV-F-vasta-aineiden seoksen suuntaamisen tämän gly- 35 koproteiinin tärkeimpiin konservoituneisiin neutralisointi- epitooppeihin osoitettiin olevan tehokas RSV-infektion ul-: koisessa immuuni hoidossa puuvillarotilla (cotton rat) .

Toiseksi, polyklonaalisten RSV-vasta-aineiden antaminen suo- • · » raan keuhkoihin pienipartikkelisena (alle 2 pm) sumutteena 4 108991 keuhkoihin pienipartikkelisena (alle 2 pm) sumutteena oli myös hoidollisesti tehokasta. Monoklonaalisten vasta-aineiden käytön pitäisi pienentää hoitoon tarvittavan IgG:n määrää vähintään kahdella suuruusluokalla. Muissa puuvilla-5 rotilla tehdyissä tutkimuksissa myös parainfluenssavirustyy-pin 3 (PIV3) vasta-aineiden osoitettiin olevan terapeuttisia, kun niitä annettiin suoraan hengitysteihin. Ulkoisen immuunihoidon käyttökelpoisuus ei rajoitu RSV:hen. On odotettavissa, että tämä toimintapa on tehokas myös muille hen-10 gityselimistön taudinaiheuttajaviruksille, joiden patogeeniset vaikutukset myös rajoittuvat alempien hengitysteiden onteloa reunustaviin soluihin.

Keksinnön yhteenveto 15 Tämä keksintö antaa käyttöön menetelmän ihmisen monoklonaa-lisen vasta-aineen tuottamiseksi, joka pystyy neutralisoimaan sekä antigeeniseen alaryhmään A että alaryhmään B kuuluvaa RS-virusta (RSV). Annetaan käyttöön myös ihmisen mono-klonaalista vasta-ainetta koodaava polynukleotidisekvenssi 20 sekä isäntäsolu ja vektori, jotka sisältävät mainitun sekvenssin. Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetuista monoklonaalisista vasta-aineista on erityistä hyötyä RSV-taudin diagnosointireagensseina ja immuunihoidossa.

s 108991 pätevän Fab-fragmentteihin. RSV-taudin hoidossa RSV-vasta-aineiden ulkoisella antamisella suoraan keuhkoihin on yksi suuri etu verrattuna parenteraaliseen antotapaan. Ensin mainittua tietä annetut vasta-aineet ovat noin 80 - 160 5 kertaa tehokkaampia hoidossa, mikä vähentää hoitoon tarvittavien vasta-aineiden määrää noin 80:s - 160:s -osaan. Hoitoon tarvittavaa vasta-ainemäärää voidaan edelleen pienentää käyttämällä ihmisen monoklonaalisia vasta-aineita tai "humanisoituja" hiiren monoklonaalisia vasta-aineita, siten, että 10 hoitoon tarvittava määrä vähenee vielä 25:s - 50:s -osaan. Tämä tarkoittaa, että vasta-aineen kokonaismäärä voidaan pienentää 2000:s - 8000:s -osaan parenteraalisessa hoidossa tarvittavasta, kun monoklonaalisia vasta-aineita annetaan suoraan keuhkoihin RSV-infektion hoitamiseksi. Mahdollisuus 15 käyttää Fab-fragmentteja in vivo hengitysteiden virusinfektioihin tuo kokonaisten vasta-ainemolekyylien käyttöön verrattuna merkittäviä etuja, kuten: 1) parempi tunkeutuvuus kudokseen, 2) Fc:hen liittyvien vaikutusten, kuten tulehduksen, välttäminen ja 3) nopea poistuminen veriplasmasta 20 (clearance).

Fab-fragmenttien terapeuttinen tehokkuus in vivo hengitysteiden virusinfektion hoitamisessa ei ole odotettu vaan yl-lättävä, ottaen huomioon että: 1) Fab:t ovat epäkovalentti-"‘25 siä ja pystyvät tarttumaan vain yhteen kohtaan, joten ne eivät yhdistä (cross link) erillisiä viruspartikkeleja, min- • · · · | kä yleisesti ajatellaan olevan tarpeen virusten neutralisoi- : ’ miseksi, ja 2) Fc-osaa ajatellaan tarvittavan virusten eli- • · · : minoimisessa (viral clearance) laukaisemaan kompleraenttikas- «· · v’30 kadin ja vasta-aineista riippuvan solun solutoksisuuden (antibody dependent cell cytotoxicity, ADCC). Ajatellen sitä *:*·: yllättävää havaintoa, että spesifisesti RSV:hen sitoutuvien

Fab-fragmenttien antamista keuhkoihin voitaisiin käyttää ’ , tehokkaasti RSV-infektion parantamiseen, on nyt mahdollista 35 soveltaa tätä oppia laajasti mihin tahansa virusinfektioon, jossa viruksen kasvu in vivo tapahtuu hengitysteiden onte-: loiden sisäpinnoilla.

I »

»M

i 6 108991

Lyhyt kuvaus piirroksista

Kuvio 1 esittää Lambda Hc2 -ilmentämisvektorin, kuvio 2 esittää Lc2-ilmentämisvektorin/ kuvio 3 esittää pComb-yhdistelmäfagemidivektorin (combina-5 torial phagemid vector) kaavamaisen organisaation, kuvio 4 esittää kloonien 13, 19 ja 11 sekä neljän satunnaisesti valitun muun kloonin painavan ja kevyen ketjun muun-televat domeenit ja kuvio 5a esittää vektorin, jota käytetään kevyiden kappaket-10 jujen ilmentämiseen signaalipeptidiin (s.p.) liittyneinä hCMVrn promootteri-vahvistaja-elementin (hCMV P/E) transkriptio-ohjauksessa. Polyadenylaation tuottaa SV40:n varhainen polyadenylaatiosignaalisekvenssi (poly-A). Plasmidis-I sa on ColEl-replikaation aloituskohta (origin of replicati- 15 on, ori) ja ampisilliiniresistenssigeeni (ampR) E. colissa valikoimista varten. Alapuolella esitetään signaalipeptidiä ja kypsän proteiinin ensimmäistä kolmea N-pään aminohappoa koodaava DNA-linkkerisekvenssi (yksikirjaimisella koodilla). Nuoli osoittaa signaalipeptidin katkaisukohtaa. Kolmas ami-20 nohappo on joko Q tai E, käytetyn linkkerin mukaan. Sacl-kohta on suluissa, koska se tuhoutuu pEL 10 C Q:ssa, ja kuvio 5b esittää pEH.10C:tä, IgGl:n painavan ketjun ilmentämiseen käytettyä vektoria. Domeeni Cgammal:n BstEII-kohta, jota on käytetty kloonatun Fd:n yhdistämiseen pysyvään ,25 osaan, on merkitty. Kevyt ketju -rakenteen piirteiden lisäk-si tässä vektorissa on neomysiiniresistenssigeeni (neoR) , eukaryooteissa valikointia varten.

7 108991 ! kyseisen ihmisen monoklonaalisen vasta-aineen ja ihmisen monoklonaalisten vasta-aineiden, joilla on samankaltainen spesifisyys, käyttämisen RSV-taudin diagnosointiin ja im-muunihoitoon.

5

Termi "RSV-tauti" tarkoittaa mitä tahansa RSV:n suoraan tai epäsuorasti aiheuttamaa tautia sekä sairauksia, jotka altistavat potilaan RSV-infektiolle. Edelliseen kategoriaan kuuluvista sairauksista esimerkkejä ovat keuhkokuume ja bron-10 kioliitti. Jälkimmäiseen kategoriaan kuuluvia tauteja (siis sellaisia, jotka asettavat potilaan vaaraan saada vakava RSV-infektio) ovat kystinen fibroosi, synnynnäiset sydäntaudit, syöpä ja yleisesti mikä tahansa tila, joka aiheuttaa immunosuppressiotilan eli immuunijärjestelmän toiminnan 15 heikkenemisen, kuten elinsiirtopotilailla ja keskosilla.

Yhdeltä kannalta kuvataan yhdistämällä saatuja ihmisen mono-klonaalisia vasta-aineita, jotka reagoivat RSV:n neutrali-sointikohdan kanssa, ja solukantoja, jotka tuottavat sellai-20 siä vasta-aineita. Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettuja monoklonaalisia vasta-aineita tuottavia solukantoja voidaan eristää käyttäen tavanomaisia seulontamenetelmiä, jotka sallivat määrittää halutun vasta-aineen elementäärisen reaktiomallin. Jos siis testattava ihmisen monoklonaalinen •Ml , .2,5 vasta-aine sitoutuu RSV:n antigeenisiin alaryhmiin A ja B ja • · « neutralisoi niitä, testattava ihmisen monoklonaalinen vasta-aine ja keksinnön mukaisten solukantojen tuottama ihmisen / monoklonaalinen vasta-aine ovat ekvivalentit.

» · ·

• I I

I i I · '.‘30 On myös mahdollista määrittää, ilman liikoja kokeita, onko jollakin ihmisen monoklonaalisella vasta-aineella sama spe-sifisyys kuin keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetul-la ihmisen monoklonaalisella vasta-aineella, katsomalla * I * estääkö edellinen jälkimmäistä sitoutumasta RSV:hen. Jos • III· I | 35 testattava ihmisen monoklonaalinen vasta-aine kilpailee kek-*•11« . ’ sinnön mukaisella menetelmällä valmistetun ihmisen monoklo- • J ·’ naalisen vasta-aineen kanssa, mikä näkyy keksinnön mukaisel- la menetelmällä valmistetun ihmisen monoklonaalisen vasta- 8 108991 aineen sitoutumisen vähenemisenä, on todennäköistä, että nämä kaksi monoklonaalista vasta-ainetta sitoutuvat samaan epitooppiin tai lähisukuisiin epitooppeihin. Vielä yksi tapa määrittää, onko jollakin ihmisen monoklonaalisella vasta-5 aineella keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetun ihmisen monoklonaalisen vasta-aineen spesifisyys, on esi-inku-boida keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettua ihmisen monoklonaalista vasta-ainetta RS-viruksen kanssa, jonka kanssa se normaalisti reagoi, ja lisätä sitten testattavaa 10 ihmisen monoklonaalista vasta-ainetta sen määrittämiseksi, onko testattava ihmisen monoklonaalinen vasta-aine estynyt sitoutumasta RSV:hen. Jos testattava ihmisen monoklonaalinen vasta-aine on estynyt, niin sillä on todennäköisesti sama tai toiminnallisesti ekvivalentti epitooppispesifisyys kuin 15 keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetulla monoklonaalisella vasta-aineella. Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettujen ihmisen monoklonaalisten vasta-aineiden seulonta voidaan myös suorittaa käyttämällä RSV:tä ja määrittämällä, neutralisoiko kyseinen monoklonaalinen vasta-aine 20 RSV:tä.

Käyttämällä keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettuja ihmisen monoklonaalisia vasta-aineita on nyt mahdollista | f tuottaa anti-idiotyyppisiä vasta-aineita, joilla voidaan , ,2,5 seuloa ihmisen monoklonaalisia vasta-aineita sen tunnistami-seksi, onko vasta-aineella sama sitoutumisspesifisyys kuin * · keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetulla ihmisen mo-/ noklonaalisella vasta-aineella, ja joita voidaan myös käyt- : tää aktiiviseen immunisaatioon (Herlyn et ai. Science.

\*30 232:100. 1986). Sellaisia anti-idiotyyppisiä vasta-aineita voidaan tuottaa hyvin tunnetuilla hybridoomatekniikoilla (Kohler ja Milstein. Nature. 256:495. 1975). Anti-idiotyyp-pinen vasta-aine on vasta-aine, joka tunnistaa tutkittavan solukannan tuottaman ihmisen monoklonaalisen vasta-aineen

M I M

35 pinnan ainoalaatuisia determinantteja. Nämä determinantit sijaitsevat vasta-aineen hypervaihtelevalla alueella. Juuri ::: tämä alue sitoutuu tiettyyn epitooppiin, ja näin ollen vas- ta-aineen spesifisyys perustuu siihen. Anti-idiotyyppistä •» · 108991 vasta-ainetta voidaan valmistaa immunisoimalla tutkittavalla monoklonaalisella vasta-aineella eläin. Immunisoitu eläin tunnistaa ja vastaa immunisoivan vasta-aineen idiotyyppisiin determinantteihin ja tuottaa vasta-ainetta näille idiotyyp-5 pisille determinanteille. Käyttämällä immunisoidun eläimen anti-idiotyyppisiä vasta-aineita, jotka ovat spesifisiä keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetulle ihmisen mono-klonaaliselle vasta-aineelle, joka on tuotettu kyseisen toisen eläimen immunisoimiseen käytetyssä solukannassa, voi-10 daan nyt tunnistaa muita klooneja, joissa on sama idiotyyppi kuin immunisaatioon käytetyssä hybridooman vasta-aineessa. Kahden solukannan ihmisen monoklonaalisten vasta-aineiden idiotyyppien identtisyys osoittaa, että kyseiset kaksi mono-klonaalista vasta-ainetta ovat samoja siinä mielessä, että 15 ne tunnistavat saman epitooppisen determinantin. Näin ollen, anti-idiotyyppisten vasta-aineiden avulla on mahdollista tunnistaa muita hybridoomia, jotka ilmentävät saman epitoop-pispesifisyyden omaavia monoklonaalisia vasta-aineita.

i 20 On myös mahdollista tuottaa anti-idiotyyppitekniikan avulla jotakin epitooppia matkivia monoklonaalisia vasta-aineita. Esimerkiksi, on odotettavissa, että jotakin ensimmäistä monoklonaalista vasta-ainetta vastaan tehdyllä anti-idio-tyyppisellä vasta-aineella on hypervaihtelevalla alueella » · • «se , ,ί>5 sitoutuva domeeni, joka on ensimmäisen monoklonaalisen vas- i t t ta-aineen sitoman epitoopin "kuva". Siten anti-idiotyyppistä • « . monoklonaalista vasta-ainetta voidaan käyttää immunisaa-

Min / / tioon, koska anti-idiotyyppisen monoklonaalisen vasta-aineen *' sitova domeeni toimii tehokkaasti antigeeninä.

i » · V 30

Termi "vasta-aine" sisältää tämän keksinnön yhteydessä käy-tettynä niin ehjät molekyylit kuin niiden sellaiset fragmen-titkin, kuten Fab ja F(ab')2, jotka pystyvät sitomaan epi- ' . tooppista determinanttia. Tässä keksinnössä edullisempia ?5 ovat Fab-fragmentit. Fab:eillä on lääkintäkäytössä monia etuja F(ab')2:iin ja kokonaisiin immunoglobuliinimolekyylei- : hin verrattuina. Ensinnäkin, koska Fab:eilla on vain yksi antigeeniinsä sitoutumiskohta, immuunikompleksien muodostu-

I « I

10 108991 minen ei ole mahdollista, kun taas näitä komplekseja voi muodostua kahdenarvoisten F(ab')2:ien ja kokonaisten immu-noglobuliinimolekyylien kohdatessa kohdeantigeeninsä. Tällä on merkitystä, koska immuunikompleksien kertyminen kudoksiin 5 voi aiheuttaa vahingollisia tulehdusreaktioita. Toiseksi, koska Fab:eissä ei ole Fc-aluetta, ne eivät pysty laukaisemaan vahingollisia Fc:n aktivoimia tulehdusreaktioita, kuten komplementtikaskadin aloittamista. Kolmanneksi, pienet Fab-j molekyylit pystyvät todennäköisesti tunkeutumaan kudoksiin 10 paljon paremmin kuin suuret kokonaiset vasta-aineet. Neljänneksi, Fab:eitä voidaan tuottaa helposti ja halvalla bakteereissa, esimerkiksi E. colissa, kun taas kokonaisten immuno-globuliini-vasta-ainemolekyylien tuottamiseen hyödyllisinä määrinä tarvitaan nisäkässoluja. Jälkimmäiseen sisältyy im-15 munoglobuliinisekvenssien transfektoiminen nisäkässoluihin siten, että seuraa transformaatio. Näiden sekvenssien monistuminen on sitten saatava aikaan tarkoilla valintaproseduu-reilla ja vakaat transformantit on tunnistettava ja ylläpidettävä. Kokonaiset immunoglobuliinimolekyylit on tuotettava 20 pysyvästi transformoituneilla, runsaasti ilmentävillä so luilla viljelmässä, ongelmineen, jotka liittyvät seerumia sisältävään viljelyalustaan. Tätä vastoin Fabreiden tuotta-I minen E. colissa poistaa nämä vaikeudet ja mahdollistaa ky- seisten vasta-ainefragmenttien tuottamisen suurissa ferment-:.:215 toreissa, jotka eivät ole niin kalliita kuin soluviljelmistä f·: saatavat tuotteet.

i f; Fab:eiden lisäksi myös pieniä vasta-aine-fragmentteja ja • I · · .·:·. epitooppeja sitovia peptideitä, jotka sitovat spesifisesti 30 ainakin yhtä RSV:n epitooppia, mielellään RSV:n glykoprote- . iini F:ssä olevaa, ajatellaan tässä keksinnössä ja voidaan

I

... myös käyttää viruksen neutraloimiseen. Esimerkiksi yksiket- ·;· juisia vasta-aineita voidaan rakentaa USA: laisen Ladnerille et ai. myönnetyn patentin 4 946 778, joka liitetään tähän *:·^5 kokonaisuudessaan viittaamalla, menetelmän mukaan. Yksiket-juiset vasta-aineet sisältävät kevyiden ja raskaiden ketju-;;; jen vaihtelevat alueet joustavan linkkeriosan yhteenliittä- minä. Yksidomeenisena vasta-aineena (single domain antibody) n 108991 tunnettu vasta-ainefragmentti, joka sisältää erillisen yksittäisen VH-domeenin, on vieläkin pienempi. Alalla tunnetaan tekniikoita, joilla saadaan yksidomeenisia vasta-aineita, joilla on ainakin jonkin verran sitoutumispesifisyyttä 5 siitä ehjästä vasta-aineesta, josta ne on johdettu. Esimerkiksi Ward et ai. esittävät artikkelissa "Binding Activities of a Repertoire of Single Immunoglobulin Variable Domains Secreted from Escheria coli", Nature 341:644-646, seulontamenetelmän sellaisen vasta-aineen raskaan ketjun vaihtelevan 10 alueen (VH-yksidomeeninen vasta-aine) saamiseksi, jolla on riittävästi affiniteettia kohde-epitooppiinsa sitoutuakseen siihen eristetyssä muodossa.

Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetut monoklonaali-15 set vasta-aineet sopivat käytettäviksi in vitro esimerkiksi immunotutkimusmenetelmissä, joissa niitä voidaan käyttää nestefaasissa tai sitoutuneina kiinteään kantajaan. Lisäksi näissä immunotutkimusmenetelmissä käytettävät monoklonaaliset vasta-aineet voidaan leimata tunnistettavasti useilla 20 eri tavoilla. Esimerkkejä immunotutkimusmenetelmätyypeistä, joissa voidaan käyttää keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettuja monoklonaalisia vasta-aineita, ovat kompeti-tiiviset ja ei-kompetitiiviset, joko suorat tai epäsuorat immunotutkimusmenetelmät. Esimerkkejä sellaisista immunotut- :.:2:5 kimusmenetelmistä ovat radioimmunotutkimusmenetelmä (RIA) ja » (immunometrinen) sandwich-menetelmä. Antigeenien osoittami-·;·: nen keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettuja monoklo- : naalisia vasta-aineita käyttämällä voidaan suorittaa immuno- tutkimusmenetelmillä, jotka ajetaan eteenpäin, käänteisesti 30 tai simultaanisesti, mukaan luettuina fysiologisten näyttei- ' . den immunohistokemialliset tutkimukset. Alaa taitavat tietä- • » ... vät, tai pystyvät helposti tunnistamaan, muita immunotutki- • · ·;·’ musmenetelmiä ilman liikoja tutkimuksia.

·:·3·5 Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettuja monoklonaa lisia vasta-aineita voidaan sitoa moniin erilaisiin kanta- • · · ;;; jiin ja käyttää RSV:n läsnäolon osoittamiseen. Esimerkkejä '···’ hyvin tunnetuista kantajista ovat mm. lasi, polystyreeni, i f 12 108991 polypropyleeni, polyetyleeni, dekstraani, nailon, amylaasit, j luonnolliset ja muunnetut selluloosat, polyakryyliamidit, agaroosit ja magnetiitti. Kantaja voi olla luonteeltaan joko liukeneva tai liukenematon keksinnön tarkoituksen mukaan.

5 Alaa taitavat tietävät muita sopivia kantajia monoklonaalis-ten vasta-aineiden sitomiseen tai pystyvät löytämään sellaisia rutiinikokeiden avulla.

Alan tavanomaiset taidot omaavat tuntevat monia erilaisia 10 leimoja ja leimaamismenetelmiä. Esimerkkeihin leimoista, joita voidaan käyttää tässä keksinnössä, kuuluu entsyymejä, radioisotooppeja, fluoresoivia yhdisteitä, kolloidimetalle-« ja, kerniluminoivia yhdisteitä ja bioluminoivia yhdisteitä.

Alan tavanomaiset taidot omaavat tietävät muita keksinnön 15 mukaisella menetelmällä valmistettuihin monoklonaalisiin vasta-aineisiin sitoutumaan sopivia leimoja tai pystyvät löytämään niitä rutiinikokeiden avulla. Lisäksi nämä leimat voidaan liittää keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettuihin monoklonaalisiin vasta-aineisiin alan tavanomaiset 20 taidot omaavien tuntemilla standarditekniikoilla.

Keksinnön tarkoituksia varten voidaan osoittaa RSV keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetuilla vasta-aineilla biolo- gisista nesteistä ja kudoksista, joissa on sitä. Voidaan •',•^5 käyttää mitä tahansa näytettä, joka sisältää osoitettavissa :··: olevan määrän RSV:tä. Näyte voi olla nestemäinen, kuten ·;··· virtsa, sylki, selkäydinneste, veri, seerumi tai muu sellai- ; nen, tai kiinteä tai puolikiinteä, kuten kudokset, uloste • · · ♦ tai muu sellainen, tai vaihtoehtoisesti kiinteä kudos, kuten 30 ne, joita käytetään yleisesti histologisessa diagnosoinnis-sa.

i » ·;·’ Toinen leimaustekniikka, josta voidaan saada suurempi herk- :·*: kyys, muodostuu vasta-aineiden yhdistämisestä molekyylipai- ·:··35 noitaan pieniin hapteeneihin. Nämä hapteenit voidaan sitten osoittaa spesifisesti toisen reaktion avulla. On esimerkiksi ;;; tavallista käyttää sellaisia hapteeneja kuten biotiini, joka ’···* reagoi avidiinin kanssa, tai dinitrofenolia, pyridoksaalia i 13 108991 tai fluoreseiiniä, jotka voivat reagoida spesifisten anti- hapteenivasta-aineiden kanssa.

Tässä keksinnössä käytettynä termi "epitooppi" tarkoittaa i 5 mitä tahansa antigeenistä determinanttia tai antigeeniä, johon jonkin vasta-aineen paratooppi sitoutuu. Epitooppiset determinantit koostuvat yleensä molekyylien kemiallisesti aktiivisista pintaryhmistä, kuten aminohappo- tai sokerisi-vuketjuista, ja niillä on yleensä spesifisiä kolmiulotteisia 10 rakennepiirteitä sekä spesifisiä varauspiirteitä.

Keksinnön mukaisessa tutkimusmenetelmässä käytettävät materiaalit sopivat ihanteellisesti pakkauksen (kit) valmistamiseen. Sellainen pakkaus voi sisältää pohjan (a carrier 15 means), joka on jaettu lokeroihin, joissa pysyy vakaasti yksi tai useampi astia, kuten koeputki, putki tai muu sellainen, joista astioista jokainen sisältää yhden erillisistä menetelmässä käytettävistä osatekijöistä. Esimerkiksi yhdessä astioista voi olla keksinnön mukaisella menetelmällä 20 valmistettua ihmisen monoklonaalista vasta-ainetta, joka on leimattu tai voidaan leimata osoitettavasti. Pakkauksessa voi myös olla astioita, joissa on puskuria tai puskureita ja/tai astia, jossa on osoitusväline (reporter), esimerkiksi biotiiniin sitoutuva proteiini, kuten avidiini tai strepta-;,:^5 vidiini, sitoutuneena osoitusmolekyyliin (reporter molecu-le), kuten entsyymileimaan tai fluoresoivaan leimaan.

14 108991

Annettavan tunnistettavasti leimatun ihmisen monoklonaalisen vasta-aineen konsentraation pitäisi olla riittävä, jotta RSVrhen sitoutuminen on erotettavissa taustasta. Lisäksi on 5 toivottavaa, että tunnistettavasti leimattu monoklonaalinen vasta-aine poistuu nopeasti verenkiertojärjestelmästä, jotta saadaan paras mahdollinen kohde/tausta-signaalisuhde.

Yleensä tunnistettavasti leimatun ihmisen monoklonaalisen 10 vasta-aineen annos in vivo -diagnoosia varten vaihtelee sellaisten tekijöiden mukaan, kuin yksilön ikä, sukupuoli ja sairauden aste. Ihmisen monoklonaalisen vasta-aineen annos voi vaihdella välillä noin 0,01 mg/m - noin 500 mg/m , mie- 2 2 2 lellään 0,1 mg/m - noin 200 mg/m , mieluiten noin 0,1 mg/m 2 15 - noin 10 mg/m . Nämä annokset voivat vaihdella esimerkiksi sen mukaan, annetaanko useita injektioita, kudoksen mukaan ja muiden alaa taitavien tuntemien tekijöiden mukaan.

Diagnostisessa kuvantamisessa in vivo käytettävissä oleva 20 tutkimusväline on tärkeä tietyn radioisotoopin valitsemiseen vaikuttava tekijä. Valitun radioisotoopin hajoamistyypin on oltava määrätyllä tutkimusvälinetyypillä havaittavissa. Vielä toinen tärkeä tekijä valittaessa radioisotooppia in vivo -diagnostiikkaan on, että radioisotoopin puoliintumisajan on : :£:5 oltava riittävän pitkä, että se on vielä havaittavissa het-* · · ;··· kellä, jolloin suurin määrä on siirtynyt kohteeseen, mutta riittävän lyhyt, jotta isännälle vahingollinen säteily on ; .·. mahdollisimman vähäistä. Ihanteellista on, että in vivo - ‘il/ kuvantamiseen käytettävä radioisotooppi ei emittoisi partik- • t · 30 kelejä, mutta tuottaisi suuren määrän fotoneja väliltä 140 -250 keV, jotka voidaan helposti havaita tavanomaisilla gam-makameroilla.

·;··· In vivo -diagnoosia varten voidaan immunoglobuliiniin sitoa ...3:5 radioisotooppeja joko suoraan tai epäsuorasti, käyttäen vä-·_ littävää toiminnallista ryhmää. Välittävät toiminnalliset

• » I

’L* ryhmät, joita usein käytetään sitomaan metalli-ioneina ole- via radioisotooppej a immunoglobuliineihin, ovat bifunktio- 15 108991 naalisia kelatoivia agentteja, kuten dietyyleenitriamiini-pentaetikkahappo (DTPA) ja etyleenidiamiinitetraetikkahappo (EDTA) ja niiden kaltaiset molekyylit. Tyypillisiä esimerkkejä metalli-ioneista, joita voidaan sitoa keksinnön mukai- 111 9 7 5 siin monoklonaalisiin vasta-aineisiin, ovat In, Ru, 67„ 6 8 7 2 8 9 . 2 0 1 ml

Ga, Ga, As, Zr ja Tl.

Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetut monoklonaaliset vasta-aineet voidaan leimata myös paramagneettisella 10 isotoopilla in vivo -diagnoositarkoituksiin, kuten magneet-tiresonanssi- (MRI) tai elektronispinresonanssikuvaukseen (ESR). Yleensä voidaan käyttää mitä tahansa tavanomaista visualisoivaa diagnostista kuvausmenetelmää. Kamerakuvauk-seen käytetään yleensä gammasäteitä ja positroneja emittoi-15 via radioisotooppeja ja MRI:hin paramagneettisia isotooppeja. Tällaisissa tekniikoissa erityisen käyttökelpoisiin alkuaineisiin kuuluvat Gd, Mn, Dy, Cr ]a Fe.

Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettuja ihmisen 20 monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää in vitro ja in vivo RSV-taudin hoidon seurantaan. Siten olisi esimerkiksi mahdollista määrittää mittaamalla RSV:n infektoimien solujen lukumäärän kasvamista tai pienenemistä tai kehossa tai kehon eri nesteissä olevan RSV:n*>konsentraation muutoksia, onko \:2?5 tietty RSV-taudin parantamiseen tarkoitettu hoito tehokas.

« · · * • ·

Ihmisen monoklonaalisia vasta-aineita voidaan myös käyttää . RSV-taudin immunoterapiaan. Termi "immunoterapeuttinen" tai • · · "I.* "immunoterapia" tässä käytettynä keksinnön mukaisella mene- » · · '·* ' telmällä monoklonaalisten vasta-aineiden yhteydessä tarkoit- 30 taa sekä profylaktisesti että hoitona annettavaa. Siten monoklonaalisia vasta-aineita voidaan antaa suuressa vaaras-’t,,: sa oleville potilaille RSV-taudin todennäköisyyden ja/tai vakavuuden vähentämiseksi tai potilaille, joilla voidaan jo >>ti; todeta aktiivinen RSV-infektio.

.35 Tässä keksinnössä se yllättävä löytö, että RSV:tä in vitro * » · neutralisoivia Fab-fragmentteja voidaan käyttää terapeutti- 16 108991 sesti RSV-infektion hoitamiseen in vivo, viittaa siihen, j että vastaavaa lähestymistapaa voidaan käyttää muihin keuhkoihin liittyviin virusinfektioihin. Siten keksintö käsittää laajemmassa mielessä virusta neutralisoivien Fab-fragment-5 tien käyttämisen sellaisen in vivo viruksen aiheuttaman infektion hoitoon, jossa viruksen kasvu on rajoittunut isännän | hengitystieonteloiden pinnoille. Sellaisiin viruksiin kuulu- | vat influenssavirus, parainfluenssavirus, rinovirus ja ko- ronavirus samoin kuin RSV, kuten tässä olevissa esimerkeissä 10 esitetään.

Muille keuhkoviruksille spesifisten Fab-fragmenttien tunnistaminen voidaan suorittaa rutiininomaisilla, alalla hyvin tunnetuilla neutralisaatioon perustuvilla tutkimus-15 menetelmillä tarvitsematta turvautua liikoihin kokeisiin.

Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettujen monoklonaa-listen vasta-aineiden antamiseen sopivien annoksien vaihteluvälit ovat sellaiset, jotka riittävät tuottamaan halutun 20 vaikutuksen, jossa RSV-taudin oireet paranevat tai infektion todennäköisyys pienenee. Annostus ei saisi olla niin suuri, että se aiheuttaa haitallisia sivuvaikutuksia, kuten hyper-viskositeettisyndroomia, keuhkojen turvotusta, sydämen toi-minnan vajausta tai sen kaltaista. Yleisesti annos vaihtelee !t|25 iän, kunnon, sukupuolen ja potilaan taudin laadun mukaan, ja :'·· sen voi määrittää alaa taitava henkilö. Minkä tahansa komp- ·;··· likaation sattuessa kyseinen lääkäri voi säätää annostusta, j .·. Annostus voi vaihdella noin 0,01:stä mg:sta/kg noin 300taan mg:aan/kg, mielellään noin 0,l:stä mg:stä/kg noin 200taan • I · ’30 mgiaan/kg, mieluiten noin 0,2ista mgistä/kg noin 20:een . mgtaan/kg yhtenä tai useampana annoksena päivittäin yhden * * * * · tai useamman päivän ajan. Edullisesti vasta-ainetta annetaan • · ··* 2tn, 5tn tai useamman peräkkäisen päivän aikana, jotta väl- ·;·’! tettäisiin viruksen alkaminen lisääntyä uudelleen.

...35 *. Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettuja monoklonaa- lisiä vasta-aineita voidaan antaa parenteraalisesti inji-soimalla tai infusoimalla vähitellen ajan kuluessa. Keksin- i i7 108991 non mukaisella menetelmällä valmistettuja ihmisen monoklo-naalisia vasta-aineita voidaan antaa laskimon sisään, vatsa-kalvonontelon sisään, lihaksen sisään, ihon alle, ontelon sisään tai ihon läpi. Hoitona käytettäessä edullinen tapa 5 keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettujen ihmisen monoklonaalisten vasta-aineiden antamiseen on keuhkosumute. Alaa taitavat tuntevat hyvin tekniikat, joilla voi valmistaa keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettua vasta-ainetta sisältäviä aerosolikuljetussysteemejä. Yleensä sellaisissa 10 systeemeissä tulisi käyttää komponentteja, jotka eivät merkitsevästi huononna vasta-aineen biologisia ominaisuuksia, kuten paratoopin sitomiskykyä (katso esim. Sciarra ja Cutie. Aerosols. Remington Pharmaceutical Sciences. 18. laitos. 1990. s. 1694-1712, liitetään viittaamalla). Alaa taitavat 15 pystyvät helposti määrittämään eri parametrit ja olosuhteet vasta-aineaerosolien tuottamiseen tarvitsematta turvautua liikoihin tutkimuksiin.

Parenteraalisesti annettaviksi tarkoitettuihin valmisteisiin 20 kuuluvat steriilit vesiliuokset tai muut liuokset, suspensiot ja emulsiot. Esimerkkejä liuottimista, jotka eivät ole vesipohjaisia, ovat propyleeniglykoli, polyetyleeniglykoli, kasvisöljyt, kuten oliiviöljy ja orgaaniset esterit, joita voi injisoida, kuten etyylioleaatti. Vesipohjaisiin kanta-:.;2;5 jiin kuuluvat vesi, alkoholi/vesiliuokset, emulsiot tai sus-pensiot, mukaan luettuna suolaliuokset ja puskuroidut ai-*;··: neet. Parenteraalisiin kantajiin sisältyvät natriumkloridi- ; liuos, Ringerin dekstroosi, dekstroosi- ja natriumkloridi, I I I · ! maitohappo-Ringer ja rasvaöljyt. Suonensisäisiin kantajiin i ti· 30 kuuluvat neste- ja ravintotäydentäjät, elektrolyyttitäyden-. täjät (kuten Ringerin dekstroosiin perustuvat) ja muut sel- ... laiset. Mukana voi myös olla säilytysaineita ja muita lisä- • · ·;·’ aineita, kuten esimerkiksi mikrobeja estäviä aineita, an- ·;· ; tioksidantteja, kelatoivia aineita, reagoimattomia kaasuja ·;*·2[5 ja muuta sellaista.

i ie 108991

Lisäksi esitetään menetelmä sellaisen lääkkeen tai farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseksi, joka sisältää keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettuja ihmisen mono-klonaalisia vasta-aineita, kun lääkettä käytetään RSV-taudin 5 immunoterapiaan.

Yksi keksinnön edullinen toteutus koskee ihmisen monoklonaa-lisia vasta-aineita, joiden raskaiden ketjujen CDR3:een sisältyvät polypeptidit APIAPPYFDH (SEQ ID NRO 1), HLPDYWNL-10 DYTRFFYYMDV (SEQ ID NRO 2) tai näiden peptidien konservatiiviset muunnokset. Tähän keksintöön sisältyy myös tiettyjä aminohapposekvenssejä, jotka sitovat RSV:n glykoproteiini F:n epitooppisia sekvenssejä ja neutralisoivat RSV:n siihen sitouduttuaan. Termi "konservatiivinen muunnos" tarkoittaa 15 tässä käytettynä aminohappotähteen korvaamista toisella, biologisesti samankaltaisella tähteellä. Esimerkkeihin konservatiivisista muunnoksista sisältyvät yhden hydrofobisen tähteen, kuten isoleusiinin, valiinin, leusiinin tai metio-niinin korvaaminen toisella tai polaarisen tähteen korvaami-20 nen toisella, kuten arginiinin korvaaminen lysiinillä, glutamaatin aspartaattihapolla, glutamiinin asparagiinilla tai muu sellainen. Termi "konservatiivinen muunnos" sisältää myös substituoidun aminohapon käyttämisen substituoimattoman alkuperäisen (parent) aminohapon paikalla, edellyttäen, että :,ji?5 vasta-aineet, joissa on substituoitu polypeptidi, myös neut- :·'! ralisoivat RSV:tä. Analogisesti, toinen keksinnön edullinen •:· · toteutus koskee polynukleotideja, jotka koodaavat yllämai- : nittua raskaan ketjun polypeptidiä ja polynukleotidisek- venssejä, jotka ovat komplementaarisia näille polynukleoti- • I · 30 disekvensseille. Komplementaarisiin polynukleotidisekvens- . seihin kuuluvat ne sekvenssit, jotka hybridisoituvat keksin- i · i t t ,,, non mukaisiin polynukleotidisekvensseihin tiukasti kontrol- • » ·;** loiduissa hybridisaatio-olosuhteissa.

:"35 108991 19 Tämän keksinnön mukainen edullinen vektori on yhdistelmä-DNA-molekyyli (rDNA), joka sisältää nukleotidisekvenssin, joka koodaa ja pystyy ilmentämään fuusiopolypeptidiä, joka sisältää, suunnassa aminopäästä karboksipäähän, 1) prokary-5 oottisen erityssignaalidomeenin, 2) heterologisen polypepti-din ja 3) rihmamaisen faagin kalvoon ankkuroitumisdomeenin. Vektori sisältää DNA:n ilmentymistä kontrolloivia sekvenssejä fuusiopolypeptidin ilmentämistä varten, edullisesti pro-karyoottisia kontrollisekvenssejä.

10

Rihmamainen faagikalvoankkuri on edullisesti cpIII- tai cpVIII -vaippaproteiinin (coat protein) domeeni, joka kykenee assosioitumaan rihmamaisen faagipartikkelin matriksiin, littäen siten fuusiopolypeptidin faagin pintaan.

15

Erityssignaali on proteiinin johtopeptididomeeni, joka suuntaa proteiinin gram-negatiivisten bakteerien periplasmaatti-seen kalvoon. Yksi edullinen erityssignaali on pelB-eritys-signaali. Erwinia carotovan kahden pelB-geenituotemuunnoksen 20 erityssignaalidomeenin ennustetut aminohapposekvenssit kuvataan artikkelissa Lei et ai. (Nature. 331:543-546. 1988).

;· PelB-proteiinin johtosekvenssiä on aiemmin käytetty fuusio- ; proteiinien erityssignaalina (Better et ai. Science.

240:1041-1043. 1988, Sastry et ai. Proc. Natl. Acad. Sei.

25 USA. 86:5728-5732. 1989 ja Mullinax et ai. Proc. Natl. Acad.

. . Sei. USA. 87:8095-8099. 1990). Muiden tässä keksinnössä käyttökelpoisten E. colin erityssignaalipolypeptididomeenien i : : .

• aminohappotähdesekvenssejä löytyy teoksesta toim. Oliver, In Neidhard, F. C. Escherichia coli and Salmonella Typhimurium.

: 30 American Society for Microbiology. Washington D.C. 1:56-69.

: 1987.

’·’·· Edullisia kalvoankkureita vektorille voidaan saada rihmamai- * * sista faageista M13, fl, fd ja vastaavista rihmamaisista 35 faageista. Edullisia kalvoankkuriproteiineja löytyy geeni III:n ja geeni VIII:n koodaamista vaippaproteiineista. Rihmamaisen faagin vaippaproteiinin kalvoankkuridomeeni on osa 108991 20 vaippaproteiinin C-pään aluetta ja sisältää hydrofobisten aminohappotähteiden alueen, joka läpäisee lipidikaksoisker-roskalvon, ja varauksellisten aminohappotähteiden alueen, joka on tavallisesti kalvon soluliman puoleisella pinnalla 5 ja jatkuu poispäin kalvosta. Faagi flrssä geeni VIII:n vaippaproteiinin kalvon läpäisevä alue sisältää tähteet Trp-26 -Lys-40, ja sytoplasmaattinen alue sisältää 11 karboksyter-minaalista tähdettä 41 - 52 (Ohkawa et ai. J. Biol. Chem. 256:9951-9958. 1981). Esimerkkikalvoankkuri voisi koostua 10 cpVIII:n tähteistä 26 - 40. Siten edullisen kalvoankkurido-meenin sekvenssi saadaan rihmamaisen faagin M13 geenin VIII vaippaproteiinista (jota merkitään myös cpVIII tai CP 8). Geenin VIII vaippaproteiini on läsnä kypsässä faagipartikke-lissa suurimmalla osalla faagipartikkelin pinnasta, tyypil-15 lisesti noin 2500 - 3000 vaippaproteiinikopiona.

Lisäksi saadaan toisen edullisen kalvoankkuridomeenin aminohappotähdesekvenssi rihmamaisen faagin M13 geenin III vaippaproteiinista (merkitään myös cpIII). Geenin III vaip-20 paproteiini on läsnä kypsän faagin pinnalla faagipartikkelin toisessa päässä, tyypillisesti 4-6 vaippaproteiinikopiona. Yksityiskohtaiset kuvaukset rihmamaisten faagipartikkelien *'. rakenteesta, vaippaproteiineista ja partikkelien yhteenliit- * tymisestä on katsauksissa Rached et ai. (Microbiol. Rev.

25 50:401-427. 1986 ja Model et ai. teoksessa The Bacteriopha- : ges. Osa 2. toim. R. Calendar. Plenum Publishing Co. s. 375- ».·"· 456. 1988).

108991 21

Jotta saataisiin korkeita geenin ilmentymistasoja E. colis-sa, on tarpeen käyttää paitsi voimakkaita promoottereja suurten mRNA-määrien tuottamiseksi, myös ribosomin sitoutumiskohtia sen varmistamiseksi, että mRNA translatoituu te-5 hokkaasti. E. colissa ribosomin sitoutumiskohta sisältää aloituskodonin (AUG) ja 3 - 9 nukleotidia pitkän sekvenssin, joka sijaitsee 3-11 nukleotidia ylävirtaan aloituskodonis-ta (Shine et ai. Nature 254:34. 1975). Sekvenssi, AGGAGGU, jota kutsutaan Shine-Dalgarno-sekvenssiksi (SD-sekvenssi), 10 on komplementaarinen E. colin 16S rRNA:n 3'-päälle. Ribosomin sitoutumiseen mRNArhan ja mRNA:n 3'-pään sekvenssiin voivat vaikuttaa muutamat tekijät: i) SD-sekvenssin ja 16S-rNA:n 3'-pään välisen komplementaa- 15 risuuden aste ii) SD-sekvenssin ja AUG:n välimatka ja mahdollisesti niiden välissä olevan DNA:n sekvenssi (Roberts et ai. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 76:760. 1979a, Roberts et ai. Proc. Natl.

20 Acad. Sei. USA. 76:5596. 1979b, Guarente et ai. Science 209:1428. 1980 ja Guarente et ai. Cell 20:543. 1980). Opti-( _ mointi saadaan aikaan mittaamalla geenien ekspressiotaso plasmideissa, joissa tätä väliä on systemaattisesti muutet- » ♦ « i tu. Erilaisten mRNA:iden vertailu osoittaa, että on tilas- 25 tollisesti suosittuja sekvenssejä asemasta -20 asemaan +13 : (kun AUG:n A on asemassa 0) (Gold et ai. Annu. Rev. Micro- '.· · biol. 35:365. 1981). Johtosekvenssien on osoitettu vaikutta van translaatioon varsin huomattavasti (Roberts et ai. 1979 : a, b, edellä) .

30 , *, iii) AUG:ta seuraava nukleotidisekvenssi, joka vaikuttaa ri- ’ bosomin sitoutumiseen (Taniguchi et ai. J. Mol. Biol.

118:533. 1978).

* * I

« · 35 3 ' -kontrollisekvenssit määrittävät ainakin yhden lopetusko- donin (stop-kodonin) lukukehyksessä ja toimivasti liitettynä heterologiseen fuusiopolypeptidiin.

108991 22

Edullisissa toteutuksissa käytettävä vektori sisältää proka-ryoottisen replikaation aloituskohdan eli replikonin aloituskohdan, i.e. DNA-sekvenssin, joka pystyy ohjaamaan autonomista replikoitumista ja yhdistelmä-DNA-molekyylin yllä-5 pitämistä prokaryoottisessa, sillä transformoidussa isän- täsolussa, esimerkiksi bakteerisolussa, kromosomin ulkopuolella. Sellaisia replikaation aloituskohtia tunnetaan alalla hyvin. Edullisia replikaation aloituskohtia ovat ne, jotka ovat tehokkaita isäntäorganismissa. Yksi edullinen isän-10 täsolu on E. coli. Vektorin käyttöön E. colissa edullinen replikaation aloituskohta on ColEl, joka on pBR322:ssa ja useissa muissa erilaisissa yleisissä plasmideissa. Edullinen on myös pACYC:issä ja sen johdannaisissa oleva pl5A:n replikaation aloituskohta pl5A. ColEl- ja pl5A-replikoneja on 15 käytetty runsaasti molekyylibiologiassa, ne ovat saatavilla useissa erilaisissa plasmideissa, ja niitä ovat kuvanneet ainakin Sambrook et ai. Molecular Coning: a Laboratory Manual. 2. laitos. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989).

20 ColEl- ja pl5A -replikonit ovat erityisen edullisia tässä keksinnössä käytettäviksi, koska niillä kummallakin on kyky ’ ohjata plasmidin replikoitumista E. colissa, kun toinen rep- * · likoni on läsnä toisessa plasmidissa samassa E. coli -solus-* sa. Toisin sanoen, ColEl ja pl5A ovat replikoneja, jotka 25 eivät häiritse toisiaan ja sallivat kahden plasmidin ylläpi-: don samassa isännässä (katso esim. Sambrook et ai., edellä, : sivut 1.3 - 1.4). Tämä piirre on erityisen tärkeä tässä kek sinnössä, koska yksittäisen isäntäsolun, joka sallii faagin : replikoitumisen, on tuettava kahden erillisen vektorin it- ;'j'; 30 senäistä ja samanaikaista replikoitumista, nimittäin hete- , rologisen fuusiopolypeptidin ilmentämisvektorin ja heterodi- : meerisen reseptorin (tässä tapauksessa monoklonaalisen, RSVrtä sitovan ja neutraloivan) ilmentämisvektorin.

3 5 Lisäksi niihin toteutuksiin, joihin sisältyy prokaryoottire-plikoni, sisältyy myös geeni, jonka ilmentyminen tuo sillä transformoidulle isäntäbakteerille valikoitumisedun, kuten 23 1 0 8 9 91 lääkeresistenssin. Tyypillisiä bakteerilääkeresistenssi-geenejä ovat ne, jotka antavat resistenssin ampisilliinille, tetrasykliinille, neomysiini/kanamysiinille tai kolamfeniko-lille. Vektorit sisältävät tyypillisesti myös sopivia rest-5 riktiokohtia translatoituvien DNA-sekvenssien insertoimi- seen. Esimerkkivektoreita ovat plasmidit pUC8, pUC9, pBR322 ja pBR329, saatavissa Biorad Laboratoriesilta (Richmond, Kalifornia) ja pPL ja pKK223, saatavissa Pharmacialta (Pis-cataway, New Jersey).

10

Vektori heterodimeerisen reseptorin, esimerkiksi keksinnön mukaisen monoklonaalisen vasta-aineen, ilmentämiseen rihma-maisen faagipartikkelin pinnalla on yhdistelmä-DNA-molekyyli (rDNA), joka on sopeutettu translatoituvien ensimmäisen ja 15 toisen DNA-sekvenssin vastaanottamiseen ja ilmentämiseen ensimmäisen ja toisen reseptoripolypeptidin muodossa, niin, että toinen reseptoripolypeptideistä on yhdistetty rihmamai-sen faagin vaippaproteiinin kalvoankkuriin. Se tarkoittaa, että ainakin toinen reseptoripolypeptideistä on fuusiopoly-20 peptidi, joka sisältää rihmamaisen faagin kalvoankkuridomee-nin ja prokaryoottisen erityssignaalidomeenin.

» * » t * DNA:n ilmentämisvektori heterodimeerisen reseptorin ilmentämiseen tarjoaa järjestelmän kyseisten kahden translatoituvan 25 DNA-sekvenssin kloonaukseen (insertoimiseen) kahteen erilli- :.: : seen vektorissa olevaan kasettiin kahden erillisen kistronin » * * 1 .·’ : muodostamiseksi, jotta voidaan ilmentää heterodimeerisen reseptorin ensimmäistä ja toista polypeptidiä tai polypep-: tidien ligandia sitovia osia, jotka muodostavat heterodimee- 3 0 risen reseptorin. DNA:n ilmentämisvektoria kahden kistronin , *, ilmentämiseen kutsutaan kaksikistroniseksi ilmentämisvekto- riksi.

! ' :

Vektori sisältää yhden kasetin, johon sisältyy ylävirran ja • 35 alavirran translatoituvia DNA-sekvenssejä toimivasti liitet tyinä sellaisen nukleotidisekvenssin avulla, joka on muokattu (adapted) insertti-DNA:n liittämiseen suunnatusti. Ylä- 24 108991 virran translatoituva sekvenssi koodaa tässä määriteltyä erityssignaalia. Alavirran translatoituva sekvenssi koodaa tässä määriteltyä rihmamaisen faagin kalvoankkuria. Kasettiin sisältyy edullisesti DNA:n ilmentämistä kontrolloivia 5 sekvenssejä sen reseptoripolypeptidin ilmentämiseksi, jota valmistuu, kun insertoitava, translatoituva DNA-sekvenssi (insertti-DNA) on insertoitu suunnatusti kasettiin suunnattuun ligaatioon muokatun nukleotidisekvenssin välityksellä. Rihmamaisen faagin kalvoankkuri on edullisesti cpIII- tai 10 cpVIII -vaippaproteiinin domeeni, joka pystyy sitoutumaan rihmamaisen faagipartikkelin matriksiin kiinnittäen siten fuusiopolypeptidin faagin pintaan.

Reseptoria ilmentävä vektori sisältää myös toisen kasetin 15 toisen reseptoripolypeptidin ilmentämiseen. Tämä toinen kasetti sisältää toisen translatoituvan DNA-sekvenssin, joka koodaa tässä määriteltyä erityssignaalia, 3'-päästään toimivasti liitettynä suunnattuun liittämiseen muokatun nukleotidisekvenssin välityksellä vektorin alavirran DNA-sekvens-20 siin, joka tyypillisesti määrittää ainakin yhden lopetusko-donin kasetin lukukehyksessä. Toinen translatoituva DNA-sek-. venssi on toimivasti liitettynä 5'-päästään 5'-elementit muodostaviin DNA:n ilmentämistä kontrolloiviin sekvenssei- i » t | . hin. Toinen kasetti pystyy, kun siihen insertoidaan transla- 25 toituva DNA-sekvenssi (insertti-DNA), ilmentämään toista :·; : fuusiopolypeptidiä, johon sisältyy erityssignaalin reseptori : sekä insertti-DNA:n koodaama polypeptidi.

’ Ylävirran translatoituva DNA-sekvenssi koodaa prokaryoottis- 30 ta edellä kuvattua erityssignaalia. Ylävirran translatoituva , DNA-sekvenssi, joka koodaa pelB:n erityssignaalia, on edul- * i * linen DNA-sekvenssi reseptorin ilmentämisvektoriin sisälly-!·;·· tettäväksi. Alavirran translatoituva DNA-sekvenssi koodaa aiemmin kuvatun kaltaista rihmamaisen faagin kalvoankkuria.

3 5 Siten alavirran translatoituva DNA-sekvenssi koodaa aminohappotähdesekvenssiä, joka vastaa joko rihmamaisen faa- 108991 25 gin geeni III:n tai geeni VIII:n vaippapolypeptidiä ja mielellään on sen kanssa identtinen.

Kasetti tämän keksinnön mukaisessa DNA:n ilmentämisvektoris-5 sa on vektorin alue, joka muodostaa, kun siihen insertoidaan translatoituva DNA-sekvenssi (insertti-DNA), nukleotidisek-venssin, joka sopivassa isännässä kykenee ilmentämään resep-toripolypeptidiä. Ilmentämiskykyistä nukleotidisekvenssiä kutsutaan kistroniksi. Siten kasetti sisältää DNA:n ilmentä-10 mistä kontrolloivia elementtejä toimivasti liitettyinä ylävirran ja alavirran translatoituviin DNA-sekvensseihin. Kistroni muodostuu, kun translatoituva DNA-sekvenssi insertoidaan suunnatusti (liitetään suunnatusti) ylävirran ja alavirran sekvenssien väliin siihen tarkoitukseen muokatun 15 nukleotidisekvenssin välityksellä. Saatavat kolme transla- toituvaa DNA-sekvenssiä, nimittäin ylävirran -, insertoitu -ja alavirran sekvenssi, ovat kaikki toimivasti liitettyinä samassa lukukehyksessä.

20 Siten DNA:n ilmentämisvektori heterodimeeristen reseptorien ilmentämiseen tarjoaa käyttöön järjestelmän translatoituvien DNA-sekvenssien kloonaamiseen vektorin kasettiosiin hetero-: dimeerisen reseptorin ensimmäistä ja toista reseptoripoly- peptidiä, kuten monoklonaalisen vasta-aineen raskasta ja 2 5 kevyttä ketjua, ilmentämään pystyvien kistronien tuottami- I · ; seksi. Ilmentämisvektori, käytetäänpä sitä sitten ilmentä- * t « mään heterologista fuusiopolypeptidiä tai heterodimeeristä i : : ' reseptoria, tunnetaan siitä, että se pystyy ilmentämään ra- kennegeenituotetta yhteensopivassa isännässä.

!.: i 30 V : Tässä käytettynä termi "vektori" tarkoittaa nukleiinihappo- ; molekyyliä, joka pystyy siirtämään toista nukleiinihappomo- ···, lekyylia, johon se on toimivasti liitetty, eri geneettisten '·’ ympäristöjen välillä. Edullisia vektoreita ovat ne, jotka 3 5 pystyvät replikoitumaan autonomisesti ja ilmentämään DNA-‘segmenttien, joihin ne on toimivasti liitetty, rakenne- 26 1 0 8 9 91 geenituotteita. Siksi on edullista, että vektoreissa on edellä kuvatut replikonit ja valikoitavat markkerit.

Tässä käytettynä, DNA-sekvenssien eli segmenttien yhteydes-5 sä, sanonta "toimivasti liitetty" tarkoittaa, että sekvenssit eli segmentit on liitetty kovalenttisesti, edullisesti tavanomaisilla fosfodiesterisidoksilla, yhteen DNA-juos-teeseen, joko yksi- tai kaksijuosteisessa muodossa. Vektorin, johon tämän keksinnön mukainen transkriptioyksikkö eli 10 kasetti liitetään toimivasti, valinta riippuu suoraan, kuten alalla hyvin tiedetään, toivotuista toiminnallisista ominaisuuksista, esimerkiksi vektorin replikoitumisesta ja proteiinin ilmentämisestä sekä isäntäsolusta, joka aiotaan transformoida. Nämä ovat yhdistelmä-DNA-molekyylien rakenta-15 misalaan sisältyviä rajoituksia.

Suunnattuun liittämiseen muokattu nukleotidisekvenssi eli polylinkkeri on DNA:n ilmentämisvektorin alue, joka 1) liittää ylävirran ja alavirran translatoituvat DNA-sekvenssit 20 toimivasti replikoitumista ja kuljettamista varten ja 2) tarjoaa kohdan tai tavan liittää DNA-sekvenssi suunnatusta ··· vektoriin. Tyypillisesti suuntaava polylinkkeri on nukleoti- disekvenssi, joka määrittää kahta tai useampia restriktioen-donukleaasin tunnistuskohtaa eli restriktiokohtaa. Restrik-25 tioentsyymillä kstkaistaessa nämä kaksi kohtaa tuottavat : kohesiiviset päät, joihin translatoituva DNA-sekvenssi voi- ΓΓ: daan liittää DNA:n ilmentämisvektorissa. Edullisesti nämä t kaksi restriktiokohtaa tarjoavat restriktioentsyymeillä kat-; ,·, kaistaessa kohesiiviset päät, jotka eivät ole komplementaa- t · » '.V 30 riset, ja siten sallivat translatoituvan DNA-sekvenssin suunnatun insertoimisen kasettiin. Yhdessä toteutuksessa · välineen suunnattuun liittämiseen tarjoavat ylävirran trans- i : latoituvassa DNA-sekvenssissä, alavirran translatoituvassa ·' * DNA-sekvenssissä tai molemmissa olevat nukleotidit. Toisessa t · t ' J 35 toteutuksessa suunnattuun liittämiseen muokattuun nukleoti-disekvenssiin sisältyy nukleotidisekvenssi, joka määrittää useita suunnattuja kloonaustapoja. Kun suunnattuun liittä- 27 108991 miseen muokattuun nukleotidisekvenssiin sisältyy useita restriktiokohtia, sitä sanotaan moninkertaiseksi kloonaus-| kohdaksi.

5 Yhdessä edullisessa toteutuksessa laaditaan helposti käsi teltävä DNA-ilmentämisvektori: rihmamainen faagipartikkeli, joka sisältää tämän keksinnön opetusten mukaisen genomin. Tässä toteutuksessa DNA-ilmentämisvektori sisältää myös nuk-leotidisekvenssin, joka määrittää rihmamaisen faagin repli-10 kaation aloituskohtaa siten, että vektori, kun se saa asiaankuuluvan geneettisen täydennyksen, pystyy replikoitumaan, kuten rihmamainen faagi, yksijuosteisessa replikoituvassa muodossa, ja voi pakkautua rihmamaisen faagin partikkeleiksi. Tämä piirre tuo DNA-ilmentämisvektorille kyvyn pakkautua 15 faagipartikkeleiksi, jotta partikkelit voidaan sitten erot taa yhdessä sisältämiensä vektorien kanssa muista partikkeleista, jotka muodostavat faagipartikkelipopulaation.

Rihmamaisen faagin replikaation aloituskohta on, kuten hyvin 20 tiedetään, faagigenomin alue, joka määrittää replikaation initiaatiokohdan, terminaatiokohdan ja replikaation tuotta-man replikoituvan muodon pakkaamisen (katso esim. Rasched et >' ai. Microbiol. Rev. 50:401-427. 1986 ja Horiuchi, J. Mol.

'"l Biol. 188:215-223. 1986).

25 ·,· · Tämän keksinnön käyttöön edullinen rihmamaisen faagin repli- iT: kaation aloituskohta on M13-, fl- tai fd-faagin replikaation aloituskohta (Short et ai. Nucl. Acids Res. 16:7583-7600.

; ,*, 1988) . Edullisia DNA:n ilmentämisvektoreita ovat kaksikist- 1 * » 30 roniset ilmentämisvektorit pCOMB8, pCKAB8, pCOMB2-8, pC0MB3, pCKAB3, pCOMB2-3 ja pCOMB2-3'.

' ' i

Kun keksintö nyt on täysin kuvattu, alan tavanomaiset taidot , ; omaavalle on selvää, että useita erilaisia muutoksia ja , 35 muunnoksia voidaan tehdä poikkeamatta keksinnön hengestä tai laajuudesta.

28 108991

Esimerkki 1

Kaksikistronisen ilmentämisvektorin rakentaminen heterodi-meerisen reseptorin tuottamiseen faaaipartikkelien pinnalle Jotta saataisiin vektorijärjestelmiä suoraan seulottavissa 5 olevien Fab-vasta-ainefragmenttien tuottamiseksi suurina määrinä on aikaisemmin rakennettu ilmentymiskirjastoja bakteriofagi Lambdaan, kuten on kuvattu artikkelissa Huse et ai. Science 246:1275-1281. 1989). Nämä järjestelmät eivät kuitenkaan sisältäneet suunniteltuja piirteitä, jotka mah-10 dollistaisivat ilmennetyn Fab:n suuntaamisen rihmamaisen faagipartikkelin pintaan, kuten kuvaavat Barbas et ai. (Proc Natl. Acad. Sei. USA. 33:7978-7982. 1991).

Pääkriteeri vektorijärjestelmän valinnassa oli tarve tuottaa 15 suurin välittömästi seulottavissa oleva määrä Fab-fragment-teja. Bakteriofagi Lambda valittiin lähtökohdaksi ilmentämisvektorin kehittämiseen kolmesta syystä. Ensiksikin, faa-gi-DNA:n pakkaaminen in vitro oli tehokkain tapa viedä DNA uudelleen isäntäsoluihin. Toiseksi, oli mahdollista osoittaa 20 proteiinin ilmentyminen yksittäisten faagiplakkien tasolla. Lopuksi, faagikirjastojen seulontaan liittyi tyypillisesti _ vähemmän epäspesifisen sitoutumisen aiheuttamia vaikeuksia.

: Vaihtoehto, plasmidi-kloonausvektorit, ovat edullisia vain < t ;>> kloonien analysoimisessa sitten kun ne on tunnistettu. Tätä , 25 etua ei kadotettu nykyisessä järjestelmässä, koska käytet- ; ,·, tiin kaksikistronista ilmentämisvektoria, kuten pCombVIII:- * » 1 aa, mikä salli raskasta ketjua, kevyttä ketjua tai Fab:tä i : : ilmentävän insertin sisältävän plasmidin irtileikkaamisen.

1 · ’· > 30 a. Kaksikistronisen ilmentämisvektori pCOMB:in rakentaminen V : (i) Lambda Zap™ II:n valmistamistaminen

Lambda Zap™ II on alkuperäisen Lambda Zapin (ATCC #40 298) .···, johdannainen, jossa ovat jäljellä kaikki alkuperäisen Lambda

Zapin tunnusmerkit, mukaan lukien 6 ainoalaatuista kloonaus-

* I

'. 35 kohtaa, fuusioproteiinin ilmentäminen ja kyky irroittaa sek- : venssi nopeasti fagemidimuodossa (Bluescript SK-), mutta jossa ei ole SAM 100 -mutaatiota, mikä sallii monien ei-sup- 29 1 0 8 9 91 F-kantojen (Non-Sup F strains) kasvun, mukaan lukien XL1-Blue. Lambda Zap™ II rakennettiin, kuten on kuvattu artikkelissa Short et ai. (Nuc. Acids Res. 16:7583-7600. 1988), korvaamalla lambda-S-geeni, joka sisältyy 4254:n emäsparin 5 (ep) DNA-fragmenttiin, joka on valmistettu pilkkomalla lambda Zap restriktioentsyymillä Neo I. Tämä 4254:n ep:n DNA-fragmentti korvattiin Lambda gtlO:stä (ATCC #40 179) eristetyllä, Lambda-S-geenin sisältävällä 4254:n ep:n DNA-fragmentilla sen jälkeen, kun vektori oli pilkottu restriktioent-10 syymillä Neo I. Lambda gtlO:stä eristetty 4254:n ep:n DNA-fragmentti liitettiin alkuperäiseen lambda Zap -vektoriin käyttäen T4-DNA-ligaasia ja standardinenettelyjä, kuten teoksessa Current Protocols in Molecular Biology, toim. Au-subel et al. John Wiley and Sons. New York. 1987 kuvatut, 15 Lambda Zap™ II:n muodostamiseksi.

(ii) Lambda Hc2: n valmistaminen

Monien erilaisten VH:ta koodaavien DNA-homologien ilmentämiseksi E. coli -isäntäsolussa rakennettiin vektori, joka ni-20 mitettiin Lambda Hc2:ksi. Vektori tarjosi seuraavaa: kyvyn sijoittaa VH:ta koodaavat DNA-homologit oikeaan lukukehyk- » seen, Shinen et ai. (Nature 254:34. 1975) kuvaaman mukaisen ribosomin sitoutumiskohdan, ilmentyvän proteiinin periplas- : matilaan ohjaavan johtosekvenssin, jota kutsutaan pelB-eri- i 25 tyssignaaliksi, polynukleotidisekvenssin, joka koodasi tun-: nettua epitooppia (epitooppimerkki, epitope tag) sekä po- Γ; lynukleotidin, joka koodasi spacer-proteiinia VH:ta koodaa- * van DNA-homologin ja epitooppimerkkiä koodaavan polynukle-otidin väliin. Lambda Hc2:n ovat aiemmin kuvanneet Huse et » * 30 ai. (Science 246:1274-1281. 1989).

),· j Lambda Hc2:n valmistamiseksi rakennettiin synteettinen, ’ j kaikki edellä luetellut piirteet sisältävä DNA-sekvenssi ’ . laatimalla yksijuosteisia 20-40 emäksen polynukleotidisek- t % 35 venssejä, jotka hybridisoituisivat toisiinsa ja muodostaisi- c I < » vat kaksijuosteisen synteettisen DNA-sekvenssin. Yksittäiset 108991 30 yksijuosteiset polynukleotidisekvenssit esitetään taulukossa 1.

Polynukleotidit N2, N3, N9-4, Nil, N10-5, N6, N7 ja N8 (tau-5 lukko 1) kinasoitiin lisäämällä 1 μΐ kutakin polynukleotidia (0,1 μg/μl) ja 20 yksikköä T4-polynukleotidikinaasia liuokseen, joka sisälsi 70 mM Tris-HCl:a, pH 7,6, 10 mM MgCl2:ta, 5 mM ditiotreitolia (DTT), 10 mM beta-merkaptoetanolia, 500 mikrogrammaa/ml ^g/ml) naudan seerumialbumiinia (BSA). Li-10 uosta pidettiin 30 minuuttia 37 °C:ssa ja reaktio pysäytettiin pitämällä liuosta 10 minuuttia 65 °C:ssa. Kahta pääpo-lynukleotidia (end nucleotides), 20 mg polynukleotidia Nl ja polynukleotidia N12, lisättiin edelliseen kinasointireak-tioliukseen yhdessä 1/10 tilavuuden kanssa sellaista liuos-15 ta, joka sisälsi 20,0 mM Tris-HCl:a, pH 7,4, 2,0 mM MgCl2:a ja 50,0 mM NaCl:a. Tämä liuos lämmitettiin 70 °C:seen 5 minuutiksi ja sen annettiin jäähtyä huoneenlämpötilaan, noin 25 °C:seen, 1,5 tunnin ajan 500 ml:n vesidekantterissa. Tässä ajassa kaikki 10 polynukleotidia emäspariutuivat muo-20 dostaen kaksijuosteisen synteettisen DNA-insertin. Yksittäiset polynukleotidit yhdistettiin toisiinsa kovalenttisesti synteettisen DNA-insertin stabiloimiseksi lisäämällä 40 μΐ ::: edellä kuvattua reaktiota liuokseen, joka sisälsi 50 mM

:··;· Tris-HCl:a, pH 7,5, 7 mM MgCl2:ta, 1 mM DTT:tä, 1 mM

25 adenosiinitrifosfaattia (ATP) ja 10 yksikköä T4-DNA-ligaa-: .·. siä. Tätä liuosta pidettiin 37 °C:ssa 30 minuuttia, ja sit- ten T4-DNA-ligaasi inaktivoitiin pitämällä liuosta 65 °C:ssa 10 minuuttia. Pääpolynukleotidit kinasoitiin sekoittamalla 52 μΐ edellä kuvattua reaktiota, 4 μΐ liuosta, joka sisältää : 30 10 mM ATP:tä ja 5 yksikköä T4-polynukleotidikinaasia. Tätä ' liuosta pidettiin 37 °C:ssa 30 minuuttia, ja sitten T4-po- • lynukleotidikinaasi inaktivoitiin pitämällä liuosta 10 mi- nuuttia 65 °C:ssa.

35 31 108991

Taulukko 1 N1) 5’ GGCCGCAAATTCTATTTCAAGGAGACAGTCAT 3’ (SEQ ID 3) N2) 5’ AATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATT 3’ (SEQ. I.D. 4) N3) 5’ GTTATTACTCGCTGCCCAACCAGCCATGGCCC 3’ (SEQ. I.D. 5) N6) 5’ CAGTTTCACCTGGGCCATGGCTGGTTGGG 3’ (SEQ. I.D. 6) N7) 5’CAGCGAGTAATAACAATCCAGCGGCTGCCGTAGGCAATAG3’ (SEQ. I.D. 7) N8) 5’ GTATTTCATTATGACTGTCTCCTTGAAATAGAATTTGC 3’ (SEQ. I.D. 8) N9*4) 5’ AGGTGAAACTGCTCGAGATTTCTAGACTAGTTACCCGTAC 3’ (SEQ. I.D. 9) N10-5) 5’ CGGAACGTCGTACGGGTAACTAGTCTAGAAATCTCGAG 3' (SEQ. I.D. 10) N11) 5’ GACGTTCCGGACTACGGTTCTTAATAGAATTCG 3’ (SEQ. I.D. 11) N12) 5’ TCGACGAATTCTATTAAGAACCGTAGTC 3’ (SEQ. I.D. 12) 32 1 0 8 9 91

Valmis synteettinen DNA-insertti ligatoitiin suoraan esimerkissä la(i) kuvattuun Lambda Zap™ II -vektoriin, joka oli aiemmin pilkottu restriktioentsyymeillä Not I ja Xho I. Li-gaatioseos pakattiin käyttäen Stratageneltä, La Jolla, Kali-5 tornia, saatavaa Gigapack II Gold -pakkaamisuutettä valmistajan ohjeiden mukaan. Pakattu ligaatioseos maljättiin XL1-Blue-soluille (Stratagene). Yksittäisiä lambda-plakkeja ir-roitettiin ja insertit leikattiin irti valmistajan (Stratagene) toimittaman in vivo -irtileikkausmenettelyn Lambda 10 Zap™ II:lie mukaan. Tämä in vivo -irtileikkausmenettely siirsi kloonatun insertin Lambda Hc2-vektorista fagemidivek-toriin, jotta sitä olisi mahdollista käsitellä ja sekvensoi-da helposti. Edellä kuvattujen kloonausvaiheiden onnistuminen vahvistettiin sekvensoimalla insertti Sangerin dideoksi-15 menetelmällä, jonka ovat kuvanneet Sanger et alia (Proc.

Natl. Acad. Sei. USA. 74:5463-5467. 1977), ja käyttäen valmistajan ohjeita AMV Reverse Transcriptase 35S-ATP -sekven-sointipakkauksessa (Stratagene). Saatu Lambda Hc2 -ilmentä-misvektori on esitetty kuviossa 1.

20 (iii) Lambda Lc2:n valmistaminen (U' Useiden erilaisten VL:ää koodaavien DNA-homologien ilmentä- : miseksi E. coli -isäntäsolussa rakennettiin Lambda Lc2:ksi II» nimetty vektori, jolla on kyky sijoittaa VL:ää koodaavat 2 5 DNA-homologit oikeaan lukukehykseen, edellyttäen, että on « · : Shinen et ai. (Nature 254:34. 1975) kuvaama ribosomin sitou- tumiskohta ja edellyttäen, että on pelB-geenin johtosekvens-‘ si-erityssignaali, jota Lei et ai. (J. Bac. 169:4379. 1987) ja Better et ai. (Science 240:1041. 1988) ovat aikaisemmin Ui : 30 käyttäneet menestyksekkäästi Fab-segmenttien erittämiseksi v : E. colissa, ja edellyttäen myös, että on polynykleotidi, :joka sisältää restriktioendonukleaasikohdan kloonausta var-···, ten. Lambda Lc2:n ovat aiemmin kuvanneet Huse et ai. (Scien- ce 246:1275-1281. 1989).

35 *”· Synteettinen, kaikki edellä kuvatut piirteet sisältävä DNA- sekvenssi rakennettiin laatimalla yksijuosteisia, 20 - 60 33 1 0 8 9 91 emäksen polynukleotidisekvenssejä, jotka hybridisoituisivat toisiinsa ja muodostaisivat kaksijuosteisen synteettisen DNA:n. Kunkin yksittäisen yksijuosteisen polynukleotidiseg-mentin (01 - 08) sekvenssit kaksijuosteisen synteettisen 5 DNA-sekvenssin sisällä esitetään taulukossa 2.

Taulukossa 2 esitetyt polynukleotidit kinasoitiin lisäämällä 1 μΐ (0,1 jug/μΙ) kutakin polynukleotidia ja 20 yksikköä T4-polynukleotidikinaasia liuokseen, joka sisälsi 70 mM Tris-10 HCl, pH 7,6, 10 mM MgCl, 5 mM DTT, 10 mM betamerkap- toetanolia, 500 mg/ml BSA:ta. Liuosta pidettiin 37 °C:ssa 30 minuuttia ja reaktio pysäytettiin pitämällä liuosta 65 °C:ssa 10 minuuttia. 20 ng kumpaakin pääpolynukleotidia (end polynucleotides), 01 ja 08, lisättiin edelliseen ki-15 nasointireaktioliuokseen yhdessä 1/10 tilavuutta sellaista liuosta kanssa, joka sisälsi 20,0 mM Tris-HCl:a, pH 7,4, 2,0 mM MgClra ja 15,0 mM natriumkloridia (NaCl). Tämä liuos lämmitettiin 70 “Öiseen 5 minuutiksi ja sen annettiin jäähtyä huoneenlämpötilaan, noin 25 “Crseen, 1,5 tunnin ajan 500 20 ml:n vesidekantterissa. Tässä ajassa kaikki 8 polynukleotidia emäspariutuivat muodostaen kaksijuosteisen synteettisen DNA-insertin, joka esitetään kuviossa 3. Yksittäiset po-: lynukleotidit yhdistettiin toisiinsa kovalenttisesti syn- . : teettisen DNA-insertin stabiloimiseksi lisäämällä 40 μΐ

25 edellä kuvattua reaktiota liuokseen, joka sisälsi 50 mM ·. Tris-HCl:a, pH 7,5, 7 mM MgCl:a, 1 mM DTTitä, 1 mM

’!!.* adenosiinitrifosfaattia (ATP) ja 10 yksikköä T4-DNA-ligaa- sia. Tätä liuosta pidettiin 37 °C:ssa 30 minuuttia, ja sitten T4-DNA-ligaasi inaktivoitiin pitämällä liuosta 65 °C:ssa '· 30 10 minuuttia. Pääpolynukleotidit (end polynucleotides) ki- :.: · nasoitiin sekoittamalla 52 μΐ edellä kuvattua reaktiota, 4 : .·. μΐ liuosta, joka sisältää 10 mM ATPitä ja 5 yksikköä T4-po- ,··*. lynukleotidikinaasia. Tätä liuosta pidettiin 37 °C:ssa 30 minuuttia, ja sitten T4-polynukleotidikinaasi inaktivoitiin *.'·*. 35 pitämällä liuosta 10 minuuttia 65 °C:ssa.

34 1 0 8 9 91

Taulukko 2 1. 5’ TGAATTCTAAACTAGTCGCCAAGGAGACAGTCAT 3’ (SEQ. I.D. 13) 5 2. 5’ AATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATT 3' (SEQ. I.D. 14) 3. 5’ GTTATTACTCGCTGCCCAACCAGCCATGGCC 3' (SEQ. I.D. 15) 4. 5’ GAGCTCGTCAGTTCTAGAGTTAAGCGGCCG 3’ 10 (SEQ. I.D. 16) 5. 5’ CT ATTTCATT ATG ACT GT CT CCTT G G CGACTAGTTTAG AATT C AAG CT 3' (SEQ. I.D. 17) 6. 5’ CAGCGAGTAATAACAATCCAGCGGCTGCCGTAGGCAATAG 3’ (SEQ. I.D. 18) 15 7. 5’ TGACGAGCTCGGCCATGGCTGGTTGGG 3’ (SEQ. I.D. 19) . 8. 5' TCGACGGCCGCTTAACTCTAGAAC 3’ ' ; (SEQ. I.D. 20) 108991 35

Valmis synteettinen DNA-insertti ligatoitiin suoraan Lambda Zap™ II -vektoriin, joka on kuvattu esimerkissä 1(a)(i) ja joka oli aiemmin pilkottu restriktioentsyymeillä Sac I ja Xho I. Ligaatioseos pakattiin käyttäen Gigapack II Gold -5 pakkaamisuutetta (Stratagene) valmistajan ohjeiden mukaan.

Pakattu ligaatioseos maljattiin XLl-Blue-soluihin (Stratagene) . Yksittäisiä lambda-plakkeja irroitettiin ja insertit leikattiin irti valmistajan (Stratagene) toimittaman in vivo \ -irtileikkausmenettelyn Lambda Zap™ II:lie mukaan. Tämä in 10 vivo -irtileikkausmenettely siirsi kloonatun insertin Lambda Lc2 -vektorista plasmidifagemidivektoriin, jotta sitä olisi mahdollista käsitellä ja sekvensoida helposti. Edellä kuvattujen kloonausvaiheiden onnistuminen vahvistettiin sekven-soimalla insertti käyttäen valmistajan ohjeita AMV Reverse 15 Transcriptase 35S-dATP -sekvensointikitissä (Stratagene). Saatu Lc2-vektori on esitetty kaaviokuvana kuviossa 2.

Edullinen tässä keksinnössä käytettävä vektori, joka on nimetty Lambda Lc3:ksi, on edellä valmistetun Lambda Lc2:n 20 johdannainen. Lambda Lc2 sisältää Spe I -restriktiokohdan (ACTAGT), joka sijaitsee 3' EcoRI-restriktiokohdasta ja 5' . Shine-Dalgarno -ribosomin sitoutumiskohdasta. Myös Lambda

» · * I

Hc2:ssa on Spel-restriktiokohta, kuten on esitetty kuviossa I > · 1. pCombiksi nimetty yhdistelmävektori rakennettiin yhdis-, 25 tämällä osia Lambda Hc2:sta ja Lc2:sta esimerkissä la(iv) jäljempänä kuvatulla tavalla. Saatu pComb-yhdistelmävektori '*·! : sisälsi kaksi Spel-restriktiokohtaa, yksi Lambda Hc2:sta ja * t f V : yksi Lambda Lc2:sta, joiden välissä on EcoRI-kohta. Kahden

Spel-restriktiokohdan läsnäolosta huolimatta, DNA-homologit, ! : : 30 joissa oli Spel- ja EcoRI -kohesiiviset päät, ligatoituivat ‘: onnistuneesti suunnatusti aikaisemmin Spelillä ja EcoRI:llä pilkottuun pComb-ilmentämisvektoriin. Se, että EcoRI-rest-riktiokohta oli Lc2-vektorista olevan 3' Spel-kohdan lähel-1 *y’ lä, esti 3' Spel -kohdan täydellisen pilkkoutumisen. Siten 3 5 pCombin pilkkomisesta Spelrllä ja EcoRI :llä ei seurannut ;·· kahden Spel-kohdan välissä sijaitsevan EcoRI-kohdan poista minen.

36

S

108991

Toisen Spel-restriktiokohdan läsnäolo voi olla epätoivottavaa liitettäessä pComb-vektoriin, joka pilkotaan vain Spe I:llä, koska näiden kahden kohdan välinen alue eliminoituisi. Siksi valmistetaan Lambda Lc2 -johdannainen, jossa ei 5 ole toista eli 3' Spel-kohtaa, joka nimetään Lambda Lc3:ksi, pilkkomalla ensin Lambda Lc2 Spel:llä linearisoidun vektorin muodostamiseksi. Päät täytetään, jotta muodostuu tylpät päät, jotka liitetään yhteen, jotta saadaan Lambda Lc3, josta puuttuu yksi Spel-kohta. Lambda Lc3 on edullinen vektori 10 käytettäväksi yhdistelmävektorin rakentamiseen jäljempänä kuvatulla tavalla.

(iv) pCombin valmistaminen

Fagemidit leikattiin irti ilmentämisvektoreista Lambda Hc2 15 tai Lambda Lc2 edellä kuvatulla in vivo -irtileikkausmenet-telyllä. Kaksoisjuosteista DNA:ta valmistettiin fagemidia sisältävistä soluista Holmesin et ai. (Anal. Biochem.

114:193. 1981) kuvaamien menetelmien mukaan. In vivo -irti-leikkauksesta saadut fagemidit sisälsivät samat nukleoti-20 disekvenssit vasta-ainefragmenttien kloonaukseen ja ekspres- sioon, kuin kantavektorit, ja niitä nimitetään fagemideiksi Hc2 ja Lc2, vastaten Lambda Hc2:ta ja Lc2:ta, tässä järjestyksessä .

tt; 25 Fagemidi Hc2:n ja fagemidi Lc2:n osia yhdistämällä tuotetun . . yhdistelmäfagemidivektori pComb:in rakentamiseksi pilkottiin i ; : fagemidi Hc2 ensin Sacl:llä LacZ-promootterin 5'-puolella · * *’ ‘ sijaitsevan restriktiokohdan poistamiseksi. Linearisoidun fagemidin päät tylpistettiin sitten T4-polymeraasilla ja ;,· 3 0 yhdistettiin, jolloin saatiin Hc2-fagemidi, josta puuttui : · : Sacl-kohta. Muunnettu Hc2-fagemidi ja Lc2-fagemidi pilkot- ; ’·, tiin sitten erikseen Scal:llä ja EcoRI:llä, mistä saatiin

Hc2-fragmentti, jossa on 5' - 3' -suunnassa Seal-, Notl-, t » * · *; XhoI-, Spel- ja EcoRI -restriktiokohdat, ja Lc2-fragmentti, · 35 jossa on 5' - 3' -suunnassa EcoRI-, Sacl, Xbal- ja Sacl - ;·: restriktiokohdat. Linearisoidut fagemidit liitettiin sitten yhteen vastaavista kohesiivisista päistään pCombiin, rengas- 37 1 0 8 9 91 maiseksi tehdyn fagemidin, jossa ovat peräkkäin NotI-, XhoI, Spel-, EcoRI-, Sacl-, Xbal-, Apal- ja Seal -restriktiokoh-dat. Ligatoitu fagemidivektori insertoitiin sitten sopivaan isäntäbakteeriin ja transformantit valikoitiin ampisilliini-5 antibiootilla.

Valikoidut ampisilliiniresistentit transformantit seulottiin kahden Notl-kohdan suhteen. Saatu ampisilliiniresistentti yhdistelmäfagemidivektori nimettiin pComb:iksi, jonka kaava-10 mainen rakenne esitetään kuviossa 3. Saatu yhdistelmävekto-ri, pComb, koostui DNA-molekyylistä, jossa on kaksi kasettia kahden fuusioproteiinin ilmentämiseksi, ja jossa on seuraa-vien, toimivasti liitettyjen elementtien nukleotidisekvens-sit, lueteltu 5' - 3' -suunnassa: ensimmäinen kasetti, joka 15 koostuu indusoitavasta LacZ-promootterista ylävirtaan LacZ- geenistä, Notl-restriktiokohta, ribosomin sitoutumiskohta, pelB-johtosekvenssi, spacer, 5'-Xho- ja 3'-Spel -restrik-tiokohtien rajoittama kloonausalue, dekapeptidimerkki, jota seuraavat ilmentämisen kontrolli -lopetussekvenssit, EcoRI-20 restriktiokohta, joka sijaitsee toisen, ilmentämistä ohjaa vasta ribosomin sitoutumiskohdasta muodostuvan kasetin 5'-... puolella, pelB-johtosekvenssi, spacer-alue, 5' Sac I ja 3'

Xba I -restriktiokohtien rajaama kloonausalue, jota seuraa- t t * vat ilmentämistä kontrolloivat lopetussekvenssit ja toinen 25 Not I -restriktiokohta.

·'· Edullinen, pComb3:ksi nimitetty yhdistelmävektori rakenne- * · ·’’ taan yhdistämällä osia fagemidista Hc2 ja fagemidista Lc3, kuten edellä on kuvattu pCombin valmistamista. Saatava yh-;,· > 30 distelmävektori, pComb3, koostuu DNA-molekyylistä, jossa on : kaksi pCombin kasettien kanssa identtistä kasettia kahden . fuusioproteiinin ilmentämiseksi muuten samoin kuin pCombis- sa, paitsi että toisen kasetin toinen Spel-restriokohta on i : poistettu.

:\i 35 38 108991 b. Vektoreiden pCoinbVIII ia pComblll rakentaminen sellaisten fuusioproteiinien ilmentämistä varten, joissa on bakteriofagin vaippaoroteiinin kalvoankkuri

Monien endonukleaasirestriktiokloonauskohtiensa ansiosta 5 edellä valmistettu fagemidi-ilmentämisvektori pComb on käyttökelpoinen kloonausväline modifioimiseen tämän keksinnön mukaisen ilmentämisvektorin valmistamiseksi. Sitä tarkoitusta varten pComb pilkotaan EcoRI:11a ja Spel:llä, mitä seuraa fosfataasikäsittely linearisoidun pCombin valmistamiseksi.

10 i) pCombVIII;n valmistaminen PCR-tuote, jossa on rihmamaisen bakteriofagin vaippaproteii-ni VIII:n (cpVIII) kalvoankkuridomeenin määrittävä nukleoti-disekvenssi ja kohesiiviset Spel- ja EcoRI -päät, sekoitet-15 tiin linearisoituun pComb:iin ligaatioseoksen muodostamiseksi. CpVIII-kalvoankkuria koodaava PCR-fragmentti liitettiin suunnatusti pComb-fagemidi-ilmentämisvektoriin vastaaviin kohesiivisiin päihin, jolloin muodostui pComb VIII (jota merkitään myös pComb8). pCombVIII sisältää pelB-erityssig-20 naalin toiminnallisesti liitettynä cpVIII-kalvoankkuriin.

Tässä keksinnössä käytettäväksi edullinen fagemidiekspres-siovektori, jota merkitään joko pComb2-VIII tai pComb2-8, valmistettiin yllä kuvatulla tavalla liittämällä suunnatusti 25 cpVIII-kalvoankkuria koodaava PCR-fragmentti pComb2-fagemi- ' di-ilmentämisvektoriin Spel- ja EcoRI -kohesiivisten päiden : : välityksellä. pComb2-8:ssa oli vain yksi Spel-restriktiokoh- t » : : ta.

; 30 (ii) pComblllrn valmistaminen

Erillinen fagemidi-ilmentämisvektori rakennettiin käyttäen bakteriofagi cpIII:n kalvoankkuridomeenia koodaavia sek-; venssejä. Valmistettiin PCR-tuote, joka määrittää cpIII-kal- 1,..: voankkuria ja sisältää LacZ-promootterialueen sekvenssin 3' 35 kalvoankkurista kevyen ketjun ilmentämiseksi, sekä Spel- ja EcoRI -kohesiiviset päät. CpIII:sta johdettu PCR-tuote liitettiin sitten linearisoituun pComb2-vektoriin, jossa on 108991 39 vain yksi Spel-kohta, vektori pComb2-3:n (merkitään myös pComb2-III) muodostamiseksi.

Tässä keksinnössä käytettäväksi edullisempi fagemidi-ilmen-5 tämisvektori, jossa on lisäksi muita restriktioentsyymi- kloonauskohtia, jota merkitään pComblll' tai PComb2-3', valmistettiin, kuten edellä on kuvattu pComb2-3:n kohdalla, mutta lisäten 51:n emäsparin fragmentin pBluescriptistä, jonka ovat kuvanneet Short et ai. (Nuc. Acids Res. 16:7583-10 7600. 1988) ja joka on kaupallisesti saatavilla Stratagenes- tä. pComb2-3':n valmistamiseksi pComb2-3 pilkottiin ensin XhoI- ja Spel -restriktioentsyymeillä linearisoidun pComb2-3:n muodostamiseksi. Vektori pBluescript pilkottiin samoilla entsyymeillä vapauttaen 51:n emäsparin emäsparin fragmentin, 15 joka sisälsi restriktioentsyymikohdat S1I, Accl, Hindi, Clal, Hindlll, EcoRV, PstI, Smal ja BamHI. 51 emäsparin fragmentti liitettiin linearisoituun pComb2-3-vektoriin ko-hesiivisten XhoI- ja Spel -päiden välityksellä pComb2-3':n muodostamiseksi.

20

Esimerkki2 :* RSV-spesifisten monoklonaalisten vasta-aineiden eristäminen ,; Lvmfosyvtti-RNA:n valmistaminen ia kirjaston rakentaminen 25 RNA:n valmistaminen HIV-l-seropositiivisen henkilön luuyti-men lymfosyyteistä ja IgGl-kappa-kirjaston rakentaminen faa- l · gin pinnalle pComb3-järjestelmällä suoritettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu (Burton et ai. Proc. Natl. Acad. Sei. i 30 USA 88:10134. 1991).

f t I »Il : , ·, Kmaston seulominen (panning) antigeeniä sitovan faagin ‘'.* valitsemiseksi, liukoisten Fab:eiden valmistaminen ia Fab- ; supernatanttien ELISA-seulonta 35 Burtonin et ai., edellä, kuvaama HIV-l-seropositiivisen luo-”*" vuttajan seerumin ELISA-analyysi osoitti noin 1:3000 RSV-FG- glykoproteiinitiitteriä. Siksi sama kirjasto seulottiin ELI- 40 1 0 8 9 91 SA-kuopissa olevaa yhdistelmä-FG-glykoproteiinia (1 baku-loviruksessa ilmennettyä FG-fuusioglykoproteiinia/kuoppa) vastaan. Kirjaston seulominen suoritettiin kuvatulla tavalla (Barbas et ai. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 33:7978. 1991).

5 Neljän seulontakierroksen jälkeen eluoitunut faagi oli amp-lifikoitunut noin 500-kertaisesti, mikä viittasi spesifisten antigeeniä sitovien kloonien yleistymiseen. Eluoituneella faagilla infektoitiin E. coli XLl-Blue-soluja. Liukoisia Fab:eitä tehtiin soluista preparoimalla soluista DNA:ta ja 10 leikkaamalla faagin vaippaproteiinigeeni III:n fragmentti irti Nhel/Spel:llä ja ligatoimalla sitten uudelleen. Uudelleen rakennetulla fagemidilla transformoitiin XLl-Blue-soluja liukoisia Fab-fragmentteja erittävien kloonien tuottamiseksi. Fab-supernatantteja valmistettiin sonikoimalla pelle-15 toituneita soluja Burtonin (edellä) kuvaamalla tavalla. Lyhyesti, klooneja kasvatettiin 10 ml:ssa SB-kasvatuslientä (super broth: 30 g tryptonia, 20 g hiivauutetta, 10 g MOPS/1, pH 7), joka sisälsi 50 /ng/ml karbenisilliiniä ja 10 mM MgCl2 37 °C:ssa, kunnes saatiin optinen tiheys 0,2 aal-20 lonpituudella 600 (OD600) . Isopropyyli-(beta)-D-tiogalakto-pyranosidia (IPTG), 1 mM, lisättiin ja kasvatettiin viljel-* mää yön yli 37 °C:ssa. Solut pelletoitiin sentrifugoimalla , 4000 rpm 15 minuuttia Beckmanin JA10-roottorilla 4 °C:ssa.

I t ·

Solut lietettiin uudelleen 3 ml:aan PBS:ää, joka sisälsi 0,2 t > 25 mM fenyylimetyylisylfonyylifluoridia, ja hajotettiin soni- i < , , koimalla jäillä (2-4 minuuttia). Solujäänteet pelletoitiin sentrifugoimalla 14 000 rpm JA-20-roottorilla 4 °C:ssa mi- * * •1 * nuuttien ajan. Supernatantti käytettiin sellaisenaan ELISA- analyysiin. Vaihtoehtona sonikoinnille, Fab-supernatantteja ;;; 30 valmistettiin jäädytys-sulatus-hajottamismenettelyllä. Kas- : Γ: vatusolosuhteet olivat samanlaiset kuin edellä on kuvattu ,sonikoinnille, mutta kun IPTG:tä oli lisätty, soluja kasva-tettiin 25 °C - 39 °C:ssa yön yli. Solut lietettiin uudel- t » ;· leen 1 ml:aan PBS:ää mikrofuugiputkeen, jäädytettiin kuival- 35 la jäällä ja sulatettiin sitten 37 °C:isessa vesihauteessa.

i Jäädytys-sulatus-proseduuri toistettiin 3 kertaa ja superna tantti kerättiin, kun oli sentrifugoitu mikrofuugissa 10 4i 108991 minuuttia. Supernatantti käytettiin sellaisenaan ELISA-ana-lyysiin ja varastoitiin -20 °C:ssa.

Fab-supernatanttien ELISA-seulonta oli kuvatun mukainen 5 (Barbas et ai. Methods: A Comparison to Methods in Enzymol. toim. Lerner, R. ja Burton,· D. 2:119. 1991). ELISA-kuoppiin tehtiin kerros 0,1 jug:lla joko FG-fuusioglykoproteiinia tai puhdistettua F-glykoproteiinia. Kasvatettiin 30 kloonia, ja Fab-fragmentteja sisältävät supernatantit seulottiin ELISA-10 menetelmällä FG:n kanssa reagoinnin suhteen. 28 kloonin supernatantit reagoivat selvästi. Kaikki nämä positiiviset kloonit reagoivat myös F-glykoproteiinin kanssa.

Viruksen neutralisointi -mittaus 15 Neutralisointiaktiivisuus mitattiin komplementilla vahviste tulla plakkireduktiolla (complement-enhanced plaque reduction) (Coates et ai. J. Epid. 83:299. 1966), käyttäen HEp-2-soluviljelmiä ja prototyyppialaryhmä A- (kanta A2) ja alaryhmä B (kanta 18537) -viruksia sekä useista eri lähteistä 20 eristettyjä alaryhmien A ja B viruksia. Neutraloivan vasta-aineen tiitteriksi laskettiin suurin Fab-laimennos, joka > vähensi plakkien määrää 60 %:illa.

: 28 positiivista supernatanttia seulottiin kykynsä suhteen 25 neutraloida alaryhmän A RSV:tä plakkimenetelmässä. Kloonien 13 ja 19 Fab-supernatantit neutraloivat tätä virusta hyvin i tehokkaasti ja suuri Fab-pitoisuus neutraloi viruksen täy- » dellisesti (taulukko 3). Kolme eri supernatanttivalmistetta kustakin kloonista neutralisoi RSVrtä toistettavalla taval-’ J ; 30 la, tehokkuudella 0,9 - 2,8 nM, eli 0,04 - 0,14 μg/ml Fabrtä • ; ! vähensi RSV-plakkien määrää 60 %:lla. Muilla supernatanteil- , la oli jonkin verran heikkoa kykyä neutraloida virusta, mut- I i i ta tämä oli jossain määrin vaihtelevaa. Johdomukaisin neut- i * *{’* ralointi näiden kloonien joukosta havaittiin kloonilla 11.

3 5 Tämä klooni ei neutraloinut RSV:tä täydellisesti ja sen ;<! neutralointitehokkuus oli noin 10 kertaa pienempi kuin kloo nien 13 ja 19 (taulukko 3).

42 108991

Fab-fraamenttien puhdistus

Yhden litran viljelmiin SB-lientä, joka sisälsi 50 /Lig/ml karbenisilliiniä ja 20 mM MgCl2:ta, ympättiin sopivia klooneja ja indusoitiin 7 tuntia myöhemmin 2 mMrlla IPTGrtä ja 5 kasvatettiin yön yli 30 °C:ssa. Solupelletit sonikoitiin ja supernatantti tiivistettiin 50 ml:aan. Suodatetut superna-tantit vietiin 25 ml:n proteiini-G-anti-Fab-pylvääseen, pestiin 12 ml puskurilla 3 ml/min ja eluoitiin sitruunahapolla, pH 2,3. Sitten neutraloidut fraktiot tiivistettiin ja siir-10 rettiin 50 mM:seen MES:ään, pH 6,0, ja vietiin 2 ml:n Mono-S-pylvääseen 1 ml/min. 0 - 500 mM NaCl-gradientti ajettiin nopeudella 1 ml/min, ja Fab eluoitui aluella 200 - 250 mM NaCl. Tiivistämisen jälkeen Fab:t olivat positiivisia tit-rattaessa ELISA:11a FG:tä vastaan, ja tuottivat yhden juovan ' 15 50 kD:ssä 10 - 15 % SDS-PAGE:11a. Konsentraatio määritettiin absorbanssimittauksella 280 nm:ssä käyttäen ekstinktioker-rointa (1 mg/ml) 1,35.

Kloonien 11, 13 ja 19 E, coli -lysaateista affiniteettikro-20 matografiällä puhdistetut ja tiivistetyt Fab:t neutralisoi vat RSV:tä myös suhteellisen tehokkaasti, samoin, mutta jonkin verran vähemmän, kuin mitä havaittiin raakalysaateilla. Kloonien 11 ja 19 osoittaman neutralointiaktiivisuuden spe-sifiys saatiin havainnosta, että puhdistetut, tiivistetyt . 25 Fab:t eivät neutraloi parainfluenssatyypin 3 virusta (tau lukko 3). Lisäksi HIV-1 gpl20:lle spesifinen, puhdistettu ja • tiivistetty Fab-valmiste (ELISA-tiitteri 1:1500) ei neutra loinut RSV:tä (taulukko 3).

• * 43 1 0 8 9 91 e

OS

+*

M

Λ >

CO

• mm s •5 i 4> cd *- ιλ ,-n O t/i ^

Ct 4) O' jg B S | r a l| s| h n. H S H ® t" ^ ~ £X ·> £ A Z A Z Λ Λ ^ 11 :« jZ jg

E

e -s « ^ o £» α fc ^ o I « > ° ^ « <u e vo O vo r s δ °~ o m '? > °, ^ Λ O £ CO - (N ©„ TT oi » £ «, VO*- Pi o o o o Λ -* Λ ►> GÄ S ?. ^ o S > e +3 a 55 :S « ^ ί «Λ C M Ox .2. e -S s® 5 no

·“» -r" >-> u< θ'- \θ O o'- -.o sP

S 3¾¾ O ^ "T O ^ ^ S 3 -g U o 00 ro OOv oo g on o- e σνσ\ »o oo o > o • mm

S 3 « '«f TT

.2 s b <n ^ •C te e ί—* • · B3 ελ 4> . „ i/’f o 2 e Λ 00 t" : : « e o ^ o'

2 r 6 · - VO

Ή 3 A ~S) vo Ό VO (N VO

g 3¾¾ ^ ^ ^ ^ .o oo" 3 C CntlnOVO r-ι o 00 (N 00 3 * 03 ”: s te " 4>

Ό -M

• · · m .te .-a vs --¾ ;,; : fe -¾ -s -a w CC M TO ^ TO ^ g s Μ«ί3«3^Μ3ί33ϋ* =3 e -g 3 -g 3 3 -s s 3 * « -s s n 2 5 "ö Ss 3 "Ö e 3 "o tö^S S *o g S | 8 &·§ 8 &·§ 8 £*§ &·§ :;: 5 H £ WJctWi-JD.Wi-la.h-la,^ TZ 'τΛ » « * § ζΛ ; ; ; C es . o .- 5> s I ^ ϋ : : : g Ö * * £ .1 e 2 2 B λ !...: «|§ .. (2 I e s § s $ :·’’·· s § a 3 s * -7 §

-3| § A S > >J

H * S £ c£t f* ΚΓ 44 1 0 8 9 91

Esimerkki 3

Fab;n neutralointiaktiivisuus erilaisia RSV-isolaatteia vastaan

Kloonin 19 neutralointiaktiivisuuden laajuus tutkittiin tes-5 taamalla se lisäksi vielä 9:ää alaryhmän A virusisolaattia sekä 9:ää alaryhmän B virusisolaattia vastaan. Nämä virukset oli kerätty eri maantieteellisltä alueilta 31 vuoden aikana. Virusten neutralointi suoritettiin esimerkissä 2 kuvatulla tavalla. Puhdistettu Fab 19 -valmiste neutraloi kutakin 10 näistä isolaateista tehokkaasti (taulukko 4). Lisätutkimukset osoittivat, että myös klooni llrllä näyttää olevan laaja reaktiivisuus, koska se neutraloi alaryhmän B RSV-prototyyp-piä yhtä tehokkaasti kuin alaryhmän A prototyyppiä, ja se neutraloi laajasti alaryhmien A ja B viruksia.

i : 45 108991 I m :<c < x: \ w > m W Q)

P \Q ' :(0 O

(G CO :<Ö .. 4-> -H

H \ W p- s w a s ' s •H .,-j d) v. CTl ίΰ

c 3 , S « C S

Φ _ — p] O >i n -H

ö d 7= c P) p g o 4-J

•H φ to - . ΙΛ CSJ to p d 7¾ o p · φ i; h ¢)

C -H W a-H O O - W P -n -> > W

(O «H 3 ^ -P -' - o C/3 P C S -H

•H 3 · H H ^ :(0 iH

UI W W 3 - « Η'·Γ~> „ ~ H

(0 Φ -H d T3 ' - «f * V£)0 . O :<0 •H Qi > O φ Γ- Γ" -CO \ O :(Ö m o > tn m -h ρ - - o - ^ \ tn ir \ ;<c •H -HI-rHOH O rf-t-ω _>(X4-> (C C 4J Λ ^ - \ m κθ LI in w h ·. X <a X - ~ «j m -P n m >1 j -H e OI ie h (0 (N 'VO -H Ή ni

I P (0 H -H i—I — -- O — ,_| —I " ^ \ "H

Φ (0 P (0 P O H O (0 \ (Tl Ο > -P

4-> -h d > - ^cmes-P

ro tn d -h ro e - - n - .μ o \ -h pro O O P Φ m no -in ^ p o ^ - g -H > O H p Φ - - O - 3 O' ^ .Λ O ·Η

Φ H (0 -H tn O H O <C G (£> ro O O

tn to λ< P > i - -h \ "pi+j 3 ·ι- I P h o\° - - no ^ ,C -H P- \

Φ X! 3 <0 oh - ^ tn tn p, h- P

tn p ro Φ P o - - o - «jO-P _J r- ro

34-) t, d O O H VO \ S O ^ C

3 ro un 5 rH \ £ i tn te νο-Ρίν.>Φ

Hi—I CO 1—I ·—> ^ >0 o ό - e H tn I *4* O ,-t \ VO - e -H -H (0 (0 CO O \ H O ^ m (0

• Ptn ,* g o en tn<\ m ^ *H

: 3 -H3H H -H \ O' '\d top tora h ro o ^ n- -h ’, ·Η χ \ i O ^ M 01

(0 > (0 P) i-H O in P

>1 -rl tn no (0 \ in m -rl -h co m o . P d ή > ·· Opi en (Ti ρ P O p, \ i rH p 1 i—! rH e/} Φ 4-) 'v d Ή (oio -h ·η o & 2; o te

P -H p p ^ < d P G

. · P > (0 P (O-Hecn^ 3P (o (Og to - £ e o p ··· Φ rH rH (0 Λ \ r- tn *h ·

d 3 o rH i—i o en ceo(0 m -G

·,·· 3 tn oh p \ S .2 w · , o -h tn e φ(η -to ho· , . h ι·ηφ tn^-.zjstnr^ ; ; ; (Q > \ n * m tn

.·.· d W

>rr -H -H K I O C \ -H ° ω i : d(0 -h p o o o s OOP p e =ro tn-P^ | \ >i X 0 3 Og e tT> co Λ Di P - ptrH< p φ x: ,H co ω h tn e ·.: 3 x ro tji> p -h h 3οφο

Hid p -Hp (nxj'x .d^-r-itn

;·; 3 XJ :(0 tn P (0 (G « W j \ P H

(0(0 1(0 Φ CH S(0-H<>:(0 3

EnlPg Eh <(0< CQ «S3 «s -Hl s 46 1 0 8 9 91

Esimerkki 4 RSV-spesifisten monoklonaalisten vasta-ainekloonien nukle-iinihapposekvenssianalyysien vertailu

Kaksoisjuosteinen DNA nukleiinihapposekvensoitiin käyttäen 5 Sequenase 1.0:aa (USB) ja sopivia alukkeita, jotka hybri-disoituvat C-gaxnma-I-domeenin sekvenssiin (SEQGb: 5'-GTCGTTGACCAGGCAGCCCAG-3') tai C-kappa-domeenin sekvenssiin (SEQKb: 5'-ATAGAAGTTGTTCAGCAGGCA-3'). Vaihtoehtoisessa sekvensoinnissa käytettiin yksijuosteista DNA:ta ja T3-aluketta 10 (5'-ATTAACCCTCACTAAAG-3', Sambrook et ai. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. laitos. Cold Spring Harbor Press.

New York. 1989) tai aluketta, joka hybridisoituu C-kappa-j domeenissa olevaan sekvenssiin (KEF: 5'-GAATTCTAAACTAGC- TAGTTCG-3').

15

Minkä tahansa samankaltaisuuksien paljastamiseksi kloonien välillä sekvensoitiin kloonit 13 ja 19 (kloonit, jotka neutraloivat tehokkaasti), klooni 11 ja 4 muuta kloonia (sattumanvaraisesti valittuja). Kuten kuviosta 5 näkyy, kloonit 13 20 ja 19 olivat identtiset sekä raskaiden että kevyiden ketjujen vaihtelevien domeenien osalta, ja ne erosivat selvästi , ‘ muista 5:stä kloonista. Siitä huolimatta klooni 19 ja klooni : 11 eivät osoittaneet mitään merkkejä positiivisesta yhteis- : vaikutuksesta, kun näitä kahta Fab:tä testattiin seoksena, : 25 jonka pitoisuudet oli säädetty siten, että kummankin osate kijän neutralointiaktiviteetti olisi yhtä suuri. Klooni 11:n ja sattumanvaraisesti valittujen kloonien raskaat ketjut olivat kaikki identtisiä, ja 4 tämän ryhmän kevyistä ketjuista olivat myös identtisiä. Yksi oli erilainen. Tämä si-: 30 tovien sekvenssien hyvin rajallinen muuntelevuus on vasta- *·’ ‘ kohtainen HIV-1 gpl20:een sitoutuvien, samasta kirjastosta • tunnistettujen kloonien osalta havaitun huomattavan muunte- levuuden kanssa, vaikka luovuttajan seerumin tiitterit gpl20:tä ja FG:tä vastaan olivat samankaltaiset. Esimerkik-'· ”· 35 si, gpl20:een sitoutuvien Fab:eiden joukosta tunnistettiin somaattisia raskaiden ja kevyiden ketjujen muunnoksia, kun taas tässä tapauksessa näin ei ollut. Tämä saattaa heijastaa 47 108991 sitä, että HIV-l-gpl20:n tapauksessa antigeenistimulaatio on kroonista eikä satunnaista, kuten RSV:n kohdalla.

Kiloailu-ELISA:t 5 Ilmeiset sitoutumisaffiniteetit arvioitiin vapaan FG-glyko-proteiinin ja ELISA-kuopissa olevan FG-kerroksen välisestä kilpailusta Fab-fragmenttien suhteen, kuten kuvattu (Zebedee et ai. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:3175. 1992).

10 Fab-fragmenttien ja hiiren (murine) monoklonaalisten anti-F-vasta-aineiden välinen kilpailu FG-kerroksesta määritettiin olennaisilta osin, kuten on kuvattu (Persson et ai. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:2432. 1991). Näillä kokeilla pyrittiin tunnistamaan RSV:n F:n antigeeninen kohta, jota vastaan 15 Fab:t suuntautuivat. ELISA-kuoppiin tehtiin kalvo RSV:n FG-antigeenista 0,1 jug/ml 4 °C:ssa yön yli. Kuopat suljettiin ja niitä inkuboitiin Fab-supernatanttien kanssa 4 x maksimaalisessa sitoutuvassa määrässä (OD490 = 2,5, määritetty epäsuoralla ELISA:11a) 1 tunnin ajan 37 °C:ssa ja inkuboi-20 tiin sitten hiiren vesivatsanesteessä yhdestä neljästä RSV F -spesifisiä monoklonaalisia vasta-aineita tuottavasta hybri-:· doomasolukannasta (1142, 1153, 1112 tai 1243, Beeler et ai.

J. Virol. 63:2941. 1989) tunnin ajan 37 °C:ssa konsentraa-tiossa, jonka OD490 = 2,5. Kuopat pestiin ja kehitettiin HRP-25 konjugoidulla anti-hiiri-F(ab' )2:lla. Estoprosentti laskettiin kaavalla 100 - ([koe-OD/verrokki-OD (ilman kilpailijaa alussa)] x 100]. Käänteistutkimusta varten inkuboitiin ne- ♦ * ' * linkertainen ylimäärä hiiren vasta-ainetta FG:llä päällyste tyillä levyillä 4-kertaisena ylimääränä ja ihmis-Fab:tä li-: 30 sättiin antamaan optinen tiheys 2,5, ja määritettiin vuohen v : anti-ihmis-Fab:llä.

’’’·’ Kloonien 11, 13 ja 19 Fab:itä tutkittiin edelleen inhibitio- ^ * . · · o _ Λ ELISA:11a, joka antoi tulokseksi suuruusluokkaa 10 M olevat 35 ilmeiset sitoutumisaf f initeetit. Fab ll:n ja 13:n ja hiiren monoklonaalisten vasta-aineiden kykyä kilpailla FG:n kohdista tutkittiin mös kilpailu-ELISA:11a. Tähän tarkoitukseen 48 108991 käytetyt hiiren monoklonaaliset vasta-aineet määrittävät kolmea F-glykoproteiinin kohtaa, jotka näyttävät olevan tär-! keitä neutraloinnissa. Kuten taulukossa 5 esitetään, vasta- aine B-kohdalle kilpailee Fab 11:n kanssa, mutta hiiren vas-5 ta-aineet kilpailevat Fab 13:n kanssa hyvin vähän tai eivät ollenkaan. Tämä jälkimmäinen tulos voi viitata af-finiteettieroihin, vaikka hyvin vähän tai ei ollenkaan kilpailua havaittiin, kun joko Fab 13:a tai hiiren mAb:tä käytettiin ylimäärä. Vaihtoehtoisia selityksiä ovat, että ihmi-10 sen neutraloiva vasta-ainevaste voidaan tehdä, osittain, eri antigeenikohtia vastaan kuin hiiren tunnistamia, tai että tulos voi heijastaa Fab-fragmenttien pienempää kokoa, koska kyseiset kolme kohtaa määritettiin käyttäen kokonaisia vasta-aineita.

i : » · · 49 108991

Taulukko 5

Ihmisen Fab:n FG-antiqeeniin sitoutumisen esto hiiren mono-klonaalisilla vasta-aineilla

Estoprosentti 5 Hiiren mAB Antiaeenikohta Fab 11 Fab 13 1142 A 0,5 15,5 1153 A 0,0 19,3 1112 B 74,5 0,0 10 1243 C 0,0 13,9 Näiden Fab:eiden neutraloiva aktiivisuus oli sama kuin vähän aikaa sitten kuvatun hiiren humanisoidun RSV F -monoklonaa-15 lisen vasta-aineen (Tempest et ai. Bio/Technology 9:266.

1991), joka oli hyvin aktiivinen sekä soluviljelmässä (0,4 μg/ml riitti vähentämään virusplakkeja 50:llä %:lla) että hiirissä (5 mg/kg riitti pienentämään keuhkovirustiitteriä 105:llä infektion huipulla). Nämä monovalentit tämän keksin-20 nön mukaiset Fab:t, joista puuttui täyspitkän divalentin

IgG-molekyylin Fc-efektorisegmentti, olivat ekvivalentteja neutralisointitoiminnan suhteen.

: Esimerkki 5 w: 25 Ihmisen vhdistelmä-vasta-aineiden valmistaminen

Yhdistelmäfaagikirjasto-lähestymistapa immunoglobuliinijou- 1 ♦ * ‘j**t kon kloonaukseen (immunoglobulin repertoire cloning) on vas- * · tikään mahdollistanut spesifisiin antigeeneihin suurella affiniteetilla sitoutuvia ihmisen immunoglobuliini-Gl-Fab:- * » ;· : 30 itä koodaavien geenifragmenttien eristämisen (Barbas et ai., ' edellä) . On mahdollista rakentaa jäljempänä kuvatulla taval- •la kokonaisia ihmisen anti-RSV-vasta-aineita koodaavia gee-nejä perustuen yhteen näistä geenifragmenteista ja ilmentää _· t kyseisiä konstrukteja tehokkaasti ko-transfektoimalla eril- I * · '· ’’· 35 lisiä raskaan ja kevyen ketjun vektoreita hamsterin (Chinese : ’· hamster) munasarjasolukantaan (CHO), joka ilmentää konstitu- tiivisesti viruksen transaktivoijaproteiinia. Tämä järjes- 50 1 0 8 9 91 telinä on yleisesti käyttökelpoinen joukkokloonauksella saa-ujen yhdistelmävasta-aineiden nopea analyysimenetelmä.

| Kannat, olasmidit ia DNA:n käsittelyt 5 Kaikissa kloonauskokeissa käytettiin E. coli -kantaa XL-1 blue (F) proAB, lacl9ZDM15, TnlO(tet1)(Stratagene). Vektorit pEE6hCMVneo, pEE6hCMVBglII, johdannainen pEE6hCMV:stä, ja pElOOl ovat Celltech Ltd:Itä, Slough, Yhdistyneet Kuningaskunnat .

10 DNA:ta käsiteltiin standarditekniikoiden mukaan (Sambrook et ai., edellä), oligonukleotidit syntetoitiin b-syanoetyyli-fosforiamidiittikemian avulla Applied Biosystemsin DNA-syn-tetoijassa 380A ja puhdistettiin denaturoivalla PAGE:11a.

15 Restriktioentsyymit ovat New England Biolabsilta. Kaikki konstruktit todennettiin DNA-sekvensoinnilla Sangerin (edellä) mukaan.

Soluvilielv ia DNA-transfektio 20 CHO L761h -soluja kasvatetaan DMEM:issä, 10 % FCS:ää, 1 x NEAA (non-essential amino acids, ei-välttämättömiä aminohappoja, GIBCO-BRL) ja 2 mM glutamiinia. DNA:n transfektointi ; tehdään, kuten aikaisemmin on kuvattu (Stephens et ai. Nucl.

: Acids Res. 17:7110. 1989). Vakaiden transfektanttien vali- 25 koimiseksi lisätään G418:aa (Geneticin, GIBCO-BRL) 1 mg/ml.

, . Solut kloonataan rajoittavalla laimennoksella 96:n kuopan mikrotitrauslevyillä.

Proteiinien radioaktiivinen leimaus ia immuunisakkautus ;,· : 30 Yhdessä kuopassa 24:n kuopan mikrotitrauslevyllä korvataan V ! transfektoitujen CHO-solujen kasvatusalusta 24 tunnin kulut- ; ,·. tua transfektiosta 1 ml:11a DMEM:ää (metioniinitonta) , 10 % FCS:ää, 1 x NEAA:ta, 2 mM glutamiinia, 10 mM Na-butyraattia ja 4,62 MBq Trans-S35-leimaa (ICN Flow). Inkuboinnin kestet-*,’·· 35 tyä 3 vuorokautta 37 °C:ssa, viljelmän supernatantti kerä- *!“: tään sentrifugoimalla 14000 g:llä 5 minuuttia ja varastoi daan se -20 °C:ssa jatkotutkimuksiin asti. Tunikamysiiniä 51 108991 lisätään tarvittaessa 10 mg/ml:n lopulliseen konsentraati-oon.

IgGl:n immuunisakkautusta varten sekoitetaan 200 ml superna-5 tanttia kahden tunnin ajan esiturvotettuun proteiini A

-Sepharoseen (Pharmacia), minkä jälkeen sentrifugoidaan 15 sekuntia 7000 g:ssä ja pestään hajotuspuskurilla (10 mM Tris pH 7,4, 1 mM EDTA, 1 % Nonidet P-40)/0,5 M NaCl. Vielä kahden pesun jälkeen hajotuspuskurissa/0, 1 % SDS ja 10 mM Tris 10 pH 7,4/0,1 % Nonidet P-40, palloset uutetaan keittämällä pelkistävässä tai pelkistämättömässä SDS-PAGE-näytepuskuris-sa ja supernatantti 5 minuutin 14000 g:ssä sentrifugoinnista analysoidaan SDS-PAGE:lla 10 % geelissä. Ajon jälkeen geeliä liotetaan 30 minuuttia 1 M Na-salisylaatissa, kuivataan 80 15 °C:ssa kahden tunnin ajan tyhjiökuivaajassa ja altistetaan autoradiografiafilmille -70 °C:ssa.

ELISA:t RSV-vasta-ainetta tuottavat kloonit osoitetaan käyttäen ELI-20 SA 96 -mikrotitrauslevyä, jossa on 50 μ1:η kerros (0,1 mg) ! RSV-FG:tä PBS:ssä. Sitoutunut vasta-aine osoitettiin anti- ihmis-kappa-kevytketju - peroksidaasikonjugaatilla (Sigma, . nro A7164). Vasta-aineiden ja Fabteiden sitoutu- ; misaffiniteetit arvioidaan kilpailu-ELISA:11a.

. 25 CHO-soluviljelmäsupernatanttien vasta-ainemäärät arvioidaan ’ kilpailu-ELISA:11a mikrotitrauslevyillä, joilla on proteiini

A -kalvot. Standardikäyrä tehdään sekoittamalla kyllästävä vakiomäärä alkaliinifosfataasilla leimattua ihmisen IgGl-; 30 kappaa (valmistettu käsikirjan Harlow ja Lane: Antibodies: A

: : : Laboratory Manual, CSH Laboratory, CSH, New York 1988 mu- . kaan) vaihteleviin määriin ihmisen IgGl-kappaa (Sigma, I > ‘Y,.‘ 13889) ja mittaamalla proteiini A:han sitoutunut immunoglo- » · I « buliini-alkaalinen fosfataasi -konjugaatti PBStllä pesun * \ !_'·> 3 5 jälkeen.

* » » » »

Vasta-aineen puhdistaminen ia N-pään sekvensointi 52 108991

Vasta-aineet affiniteettipuhdistetaan syanogeenibromidi-ak-tivoitua Sepharosea (Sigma) käyttäen valmistetussa Sepharose RSV-FG -pylväässä. Pallosiin adsorboituneet vasta-aineet vapautetaan keittämällä pelkistävässä näytepuskurissa, ja ras-5 kaat ja kevyet ketjut erotetaan SDS-PAGE:11a. Sekvensoimi- seksi proteiinit blotataan Immobilon-kalvolle käyttäen 10 mM CAPS/10 % MeOHra blottauspuskurina. Raskaat ja kevyet ketjut osoitetaan PonceauS-värjäyksellä ja sekvensoidaan Edmanin degradaatiolla.

10

Ilmentämiskonstruktien laatiminen

Perusajatus on tuottaa eri vektorit raskaiden ja kevyiden ketjujen ilmentämiseen CHO-soluissa. Lähtökohdiksi valitaan kaksi johdannaista pEE6:sta (Whittle et ai. Protein Enginee-15 ring. 1:499. 1987), jossa transkriptiota ohjaa ihmisen syto-megaloviruksen (hCMV) promootteri/vahvistaja-elementti. Kokonaisena vasta-aineena ilmennettäväksi valittava Fab on se, joka sitoo RSVrtä suurella affiniteetilla, esimerkiksi klooni 19. Kahden immunoglobuliinin ilmentämiseksi erittymään 20 CHO-soluista kevyttä ketjua (LC) ja raskaan ketjun (HC) Fd-fragmenttia koodaavien DNA:iden tulee olla yhdistetty sopi-viin signaalipeptideihin, jotka immunoglobuliineilla ovat varsin monenlaisia. DNA-sekvenssistä näkyy selvästi, mihin i alaryhmiin kloonin 19 Fd ja LC kuuluvat, ja siksi valitaan , 25 signaalipeptidit näistä geeniperheistä. Sitten syntetoidaan m · > HC-signaalipeptidiä koodaavia oligonukleotideja kyseisten

• I

: · DNA-sekvenssien mukaan klooneissa VH-26 (Matthysens et ai.

i i ' ' teoksessa toim. Steinberg, C. ja Lefkovits, I. The Immune

System. New York. S. Karger. 132. 1981) ja oligonukleotidit ; : | 30 LC-signaalipeptidiä varten laaditaan klooni EVJKll:n johto- : Γ: peptidin mukaan (Stavezner et ai. Nucl. Acids Res. 13:3495.

, \ 1985). E. colin ilmentämisvektorin ja PCR-alukkeiden raken- i i * teen takia ihmisen immunuglobuliinien ensimmäisiä kolmea ‘ (LC) ja viittä (Fd) aminohappoa (aa) ei alun perin kloonat- ! : 35 tu. Siksi ne sisällytettiin signaalipeptidejä koodaaviin linkkereihin VH-26- ja EVJK11 -frameworkl-sekvenssien (FRI) mukaan. Raskaan ketjun vektorin osalta on mahdollista säi- 53 108991 lyttää 5'XhoI -kloonauskohta, mutta kevytketjurakenteessa Sacl-kohdan säilyttäminen tuo kypsän proteiinin asemaan 3 glutamaatin luonnossa esiintyvän glutamiinin tilalle. Lisäksi se luo hyvin epätavallisen negatiivisten varausten keräy-5 tymän N-päähän yhdessä ennestään asemassa +1 olevan glutamaatin kanssa. Siksi tehdään kaksi erilaista kevytketjura-kennetta, joista yksi koodaa glutamaattia ja toinen alkuperäistä glutamiinia asemaan +3, mikä tuhoaa kloonauksessa käytetyn Sacl-kohdan. Puuttuvan Fc-osan lisäämiseksi Fd:hen 10 irroitetaan vastaava DNA-fragmentti plasmidista pElOOl, jossa on genomisen Ig gamma 1 -kloonin alaklooni (Takahashi et ai. Cell 29:671. 1982). Fd:n ja Fc:n yhdistämiseen käytettiin ainoalaatuista BstEII-kohtaa gamma 1 -domeenia koodaa-vassa DNA:ssa. Tehokkaan translaation aloituksen mahdollis-15 tamiseksi käytettyjen kahden signaalipeptidin luonnolliset Kozak-sekvenssit sisällytettiin linkkerien 5'-päiden rakenteeseen. Täydellinen HC-rakenne kloonataan nisäkkään ilmen-tämisvektori pEE6HCMVneo:on (Whittle et ai. edellä), jotta saadaan hCMV-promootteri/vahvistaja-elementti transkription 20 aloitukseen, SV40-polyadenylaatiosignaali ja neomysiini- resistenssigeeni, jotta vakaiden transfektanttien valikoiminen mahdollistuu (kuvio 5). LC-rakenteet, joita oli kaksi, kloonattiin kumpikin erikseen vektori pEE6hCMVBgIII:een i . (Stephens et ai. edellä), joka tarjoaa samat transkription- , 25 säätelysignaalit, muttei mitään antibiottiresistenssigeeniä eukaryoottisoluissa valikointiin (kuvio 5). Runsas pelkkien > ‘ raskaiden Ig-ketjujen ilmentyminen tappaa nisäkässoluja.

Siksi valikointi raskaan ketjun vektorin suhteen valikoi myös samanaikaisen kevyen ketjun synteesin suhteen.

li 30 • Tilapäinen ilmentäminen CHO-L761h-soluissa , V, Se, että on kehitetty CHO-solukanta CHO L761h (Cockett et l i » ’ ai. Nucl Acids Res. 19:319. 1991), joka ilmentää konstitu- t tiivisesti adenovirus E1A:n mutanttigeeniä, joka transakti-! \i 35 voi hCMV-promootteria, mahdollistaa riittävän runsaan ilmen- >:"· tymisen, jotta voidaan tutkia tilapäisesti transfektoitunei- ta soluja.

54 108991

Radioaktiivisesti leimattujen proteiinien proteinA-Sepharo-se-immuunisakkautuksen tilapäisesti LC- ja HC -ilmentämis-vektoreilla transfektoitujen CHO L761h -solujen vilje-lysupernatantista pitäisi tuoda esiin noin 150 kD:n juova, 5 kuten odotetaan ihmisen IgGlrltä pelkistämättömissä SDS-PA-GE-olosuhteissa.

Pelkistävissä olosuhteissa nämä juovat jakautuvat kahdeksi proteiiniksi, noin 50 ja 25 kD, jotka ovat Ig:n raskaiden ja 10 kevyiden ketjujen odotetut molekyylipainot. Kappaketju, jossa on kaksi glutamaattia N-päässä, liikkuu leveänä juovana niin, että suurin osa kulkee sen kappaketjun jäljessä, jonka N-pää sisältää luonnollisen glutamiinin.

15 IgGl:n vaikutusten esiin saamiseksi on tärkeää, että CH2- domeeni on oikein N-glykosyloitu. Raskaan ketjun glykosyloi-tuneisuuden tutkimiseksi tehdään rinnakkaiset transfektiot, joita sitten viljellään tunikamysiiniä sisältävässä ja si-sältämättömässää kasvatusalustassa. Vastaavien immuunisak-20 kautusten pitäisi osoittaa, että CHO-solut ovat N-gly-kosyloineet raskaan ketjun.

i * »

Pysyvästi transfektoitujen CHO-soluien IqGl/19-eritvs Tällä järjestelmällä tuotettavissa olevan vasta-ainesaannon 25 tutkimiseksi valikoidaan vakaat transfektantit lisäämällä G418:aa ja laimentamalla soluja sen jälkeen rajoittavasti.

» »

Klooneista tutkitaan, mitkä solukannat tuottavat osoitettavissa olevia määriä anti-RSV-vasta-ainetta. Näistä tuottavimpia klooneja kasvatetaan edelleen tuottavuuden lisätutki-: 30 muksia varten. Vasta-aineiden eritystason tulisi olla noin V : 200 - 300 ng/ml 24 tunnin aikana 2 - 105 solusta.

• · » ’II.’ Eritettyjen vasta-aineiden tutkiminen » ·

Vasta-aineet puhdistetaan RSV-affiniteettikromatografiällä 35 viljelysupernatanteista ja 5 ensimmäistä N-pään aminohappoa määritetään Edmanin degradaatiolla. Kaikkien vasta-aineket-jujen suhteen pitäisi pystyä osoittamaan, että signaalipep- 55 1 0 8 9 91 tidaasi toimii johdonmukaisesti ja oikein, ja että saadut sekvenssit ovat täsmälleen odotettujen mukaisia. Kahden vasta-aineen ilmeiset RS-virukseen sitoutumisaffiniteetit arvioidaan kilpailu-ELlSA-testeillä, mikä mahdollistaa vertailun 5 alkuperäisen Fab:n affiniteettiin. Vasta-aineiden tulisi sitoa RSV:tä noin 108M-1:n ilmeisellä affiniteetilla, mikä on tyypillistä suuren affiniteetin omaavalle vasta-aineelle.

Esimerkki 6 10 RSV-infektion parantaminen in vivo ihmisen Fab-monoklonaali-sella vasta-aineella

Kolmen Fab:n terapeuttinen teho testattiin RSV:llä infek-toiduissa hiirissä. RSV-Fab:t valmistettiin edellä kuvatulla tavalla. Testattaessa plakkireduktioneutralisointitekniikal-15 la HEp-2-soluviljelmissä RSV-Fab 19:n virusta neutralisoiva aktiivisuus osoittautui suureksi (tiitteri 1552 pitoisuudella 258 μg/ml), kun taas toisella RSV-Fab:llä, 126:11a, ei näyttänyt olevan neutralisoivaa aktiivisuutta soluviljelmässä. Kolmas, ihmisen immuunipuutosviruksen (HIV) kuoriglyko-20 proteiinia vastaan suuntautuva ihmisen monoklonaalinen Fab, jota tutkittiin verrokkina, ei osoittanut RSV:tä neutra-lisoivaa aktiivisuutta soluviljelmässä. Riippumattomassa tutkimusssarjassa osoitettiin RSV-Fab 19:11a olevan myös •I hyvin suuri fuusioitumista estävä (FI) aktiivisuus. Fab-19- 25 Fab:n FI-tiitteri oli noin kolmannes sen neutraloiva vasta-aine -tiitteristä.

Käytettiin 15:n - 32:n viikon ikäisiä Balb/c-naarashiiriä, painoltaan keskimäärin 25 g. Hiiriin ympättiin nenän kautta ;·’· : 30 ίο6,3 plakkia muodostavaa yksikköä (pfu) kannan A2 RS-virusta • · » V * 100 ^l:ssa kudosviljelyalustaa. Ymppäys suoritettiin, kun » :hiiret oli anestesoitu metoksifluraanilla. Näissä olosuh-·»» ,**·, teissä nenään ympätyt aineet kulkeutuvat suoraan keuhkoihin.

Kumpaankin tutkittavaan ryhmään otettiin kuusi hiirtä. Kol-*. *'. 35 men päivän kuluttua viruksen ymppäyksestä tiputettiin nenään 100 μΐ Fab-suspensiota metoksifluraaninukutuksessa. Neljän päivän kuluttua viruksen ymppäämisestä hiiret uhrattiin ja „β 108991 56 niiden keuhkot otettiin talteen (Murphy et ai. Vaccine 8:497 - 502. 1990. ja Prince et ai. Am. J. Path. 93:771 - 792. 1978). Keuhkohomogenaateista titrattiin RSV plakkitutkimus-menetelmällä HEp-2-soluissa, joita pidettiin puolijähmeän 5 kasvatusalustakerroksen alla 37 °C:ssa 5 %:sessa C02-inku- boijassa (Prince et ai. 1978). Plakit osoitettiin immuunipe-roksidaasileimausmenetelmällä (Murphy et ai. 1990).

57 108991

Taulukko 6

Nenän sisään annetun ihmisen monoklonaalisen RSV-Fab 19:n vaikutus RSV-infektioon

Fab, jota Fab-annos virustiitteri, .... keuhkoissa Däivänä 4 annettiin --- päivänä 3 1mg/ruumiinpainoko RSV-alarvhmä A* Influenssa** RSV 19 0,516 2/+/- 0,33 6,4+/-0,25 0,258 4,2 +/- 0,47 n.d.

0,129 4,8 +/- 0,23 n.d.

0,032 5,5 +/- 0,09 n.d.

0,008 6,0 +/- 0,06 n.d.

0,002 6,0 +/- 0,06 n.d.

RSV 126 0,548 5,6 +/- 0,11 6,5+/-0,29 0,274 5,9 +/- 0,12 n.d.

0,137 5,9 +/- 0,10 n.d.

0,034 6,0 +/- 0,08 n.d.

0,009 6,2 +/- 0,09 n.d.

0,002 5,9 +/- 0,06 n.d i ’ HIV DL 21, kontrolli 0,600 5,9 +/-0,04 n.d.

: 0,300 5,9 + /- 0,14 n.d.

ί Ei TO.. .... n.a 6,1+/-0,14 6.8+/-0.08 ti mitään

Eläimiin ympättiin 106 pfu nenän sisään päivänä o. Tiitte-laskettiin log10 pfu/g kudosta (kuuden eläimen keskiarvo +/keskivirhe) .

: Eläimiin ympättiin 106 TCID5g influenssa A/Udorn nenän sisään päivänä 0. Tiitterit laskettiin logio TC^Dso/9 kudosta (4:n eläimen keskiarvo +/-keskivirhe) .

n.d = ei määritetty n,a = ei analysoitu 58 108991

Kuten taulukosta 6 näkyy, RSV-Fab 19, jolla edellä oli voimakas neutraloiva aktiivisuus soluviljelmässä, oli tehokas myös RSV-määrän pienentämisessä Balb/c-hiirten keuhkoista niiden RSV-infektion lakivaiheessa. Jo 3,2 μg FAb 19:ää oli 5 terapeuttisesti aktiivinen määrä hiirissä. Näin oli tapauksessa, jossa hiirille annettiin 129 μg Fab 19:ää ruumiinpai-nokiloa kohden. Hiirillä, joille annettiin 12,9 μg (eli 516 μg ruumiinpainokiloa kohden) Fabrtä, oli tehokkaampi hoitotulos: RSV-tiitteri keuhkoissa oli pienentynyt 5000-osaan.

10 Sitä vastoin, RSV-Fab 126 ja HIV-FAb DL 21, jotka eivät osoittaneet RSV:n neutralointiaktiivisuutta soluviljelmässä, eivät myöskään pienentäneet RSV-tiitteriä infektoitujen hiirten keuhkoissa. Sitä paitsi RSV-Fab 19:llä ei ollut hoi-tovaikutusta hiirissä, jotka oli infektoitu influenssaviruk-15 sella A/Udorn/1972, mikä oli lisätodiste tämän Fab:n hoito-vaikutuksen spesifisyydestä RSV-infektiota vastaan in vivo (taulukko 6).

Seuraavaksi tutkittiin Fab 19:n RSV-infektion vastaisen hoi-20 tovaikutuksen kestoa mittaamalla hiirten keuhkoissa olevan RSV:n määrä eri aikoina sen jälkeen, kun nenään oli tiputet-';· tu Fab:tä (taulukko 7) .

59 108991

Taulukko 7 RSV-infektoituien Balb/c-hiirten hoidon teho, kun annettiin yksi annos Fab I9:ää nenään

Viruksen saanto keuhkoista (log10pfu/g kudosta

Hoidossa käytetty vasta-aine päivänä—3 päivä 4 päivä 6 päivä 8 päiva 10 RSV Fab 19 <1,7 4,8+/-0,18 <1,7 <1,7 HIV Fab 5.6+/-0,12 4,9+/-0,14 <1,7 <1,7 -seerumi*· 4.8 +/- 0,10 4,3+/-0,21 <1/ <'·7 ei mitään 5,8 +/-0,07 5,1 +/- 0,09 <1,7 <1,7 25 ug mainittua Fab:tä tai ihmisen RSV-immuuniseerumia laimennoksena 1:4 annettiin nenän sisään 100 ui tilavuudessa ,j kevyessä metoksifluraanianestesiassa.

**JE-C-seerumi oli ihmisen polyklonaalinen immuuniseerumi, jonka RSV:tä neutralisoivien vasta-aineiden tiitteri oli 1:1782 mitattuna plakkireduktiolla kanta A2:ta vastaan.

» I t 60 108991 60

Vahvistettiin, että Fab 19:llä on kyky aiheuttaa keuhkojen virusmäärän merkitsevä pieneneminen 24 tunnin kuluttua hoidosta. Tärkeää on, että klooni 19:n hoitoteho oli suurempi kuin ihmisen polyklonaalisen JEC-seerumin, jolla oli vastaa-5 van tasoinen neutralointiaktiivisuus. Kahden päivän kuluttua havaittiin kuitenkin virustiitterin kohonneen uudestaan.

Siten hoidettujen hiirten keuhkovirustiitteri kolmantena päivänä hoidosta (joka oli kuudes päivä infektoinnin jälkeen) ei eronnut merkitsevästi verrokkiryhmien, nimittäin 10 hiirten, joille oli annettu HIV-Fab:tä ja hiirten, jotka eivät saaneet mitään hoitoa, tiitteristä.

Nämä havainnot viittasivat siihen, että menestyksekäs hoito Fab:llä saattaisi edellyttää lääkkeen antamista toistuvasti 15 viruksen lisääntymisen hillitsemiseksi, kunnes parantuminen on tapahtunut. Tämän toimintatavan toteutettavuutta tarkasteltiin tutkimuksessa, josta on yhteenveto taulukossa 8.

% * » » i I · * · I · I * ( »

I * I

liv t i » i I * I «

I ' I

i I I

»III» I « 61 108991 o O <o Os O .-.

$ ~ ^ n

to O O O O O

0 :ee -4. -4. >4. 4. -4.

a > + + + + + g -:g CS en <D es vo^ Λ rt-” m” (N rt-” rt” 01 e3

Oi 21 01 .2 rt eS -H o ^ es^ «-^ rt vo o' o' o" o" .2 :eö -4. -4. .O -4. ~4 O > + + ^ + + rt en oo^ ^ vo^ vo^ -5 Ph rt-" m" V vo” vo” £>

O S

•ä C/5 S ^

rt 'S

<» —h vn vo ω .S, C ^ 'l to «? 2o vo o o o 2 ΐ 1 5 i i . i |

Λ -5 -;g o Tr ό ό o S

« > pin τί“ es” e d o” 2 •s 3

5 S

— C/3 Ä Jv> 5« λ

M O

is s | tJ rt- o o e § 2 hP . . hP *3-

S ‘:J3 '—I Ό Ό Ό >Or O

B &H en e e e VO o § * 1 .S ^ 8 | -2.:2 -§ *, e +-Γ £ 3 g g ts

>> .O S O D

! £ :rt S rt e -: εΛ o, ro ro h at :¾ rt -0-.3 . w :§ O vr, vn ö d2 »C rt o ^ ^ ^ :rt to -rt :., «j piHXJeneneneni ÖeS'-2 : : o § § «3 :.* -s ^ Säi? > < -s t3 | ω ö '1 S 2 lii £ e -S ·§ s §3-3 : : «3 o Uh £ :-2 S -g ‘ ‘ ®“ .·§ rtl >> '3 '*·>, 4) ^ .52 ffi Uni Pii = = W W £ ’ '· s rt rt > !. ; " 5 |.S .

6 -g « £ jg* *··’ * ^ :2 'rt '53 S ö

8 >2 Jj] S rt rt -.-H

• "S rt rt ^ 4-. 43 <U

. .: -¾ fe £p go 2 s m • ; s j o s 5 2 11 4'·: «2 o $ > > -q HP5 Dt es m rt o rt .o o rt 62 108991

Yksi hiiriryhmä sai RSV-Fab 19:ää ainoastaan kolmantena päivänä infektoinnista, toista ryhmää hoidettiin kolmantena ja neljäntenä infektoinnin jälkeisenä päivänä, kun taas jäljelle jäävä hiiriryhmä sai Fabrtä kolmantena, neljäntenä ja 5 viidentenä infektion jälkeisenä päivänä. Kuten aikaisemmissa kokeissa, yksittäinen Fab 19 -tippojen antaminen vähensi hiirten keuhkojen RSV:tä 2500-osaan, mutta tiitteri kasvoi jälleen suuremmaksi 24 tunnin kuluttua. Siitä huolimatta virustiitteri oli sillä hetkellä sadasosa verrokkihiirten 10 tiitteristä. Seuraavien kahden päivän aikana keuhkovirus-tiitteri ei koskaan ollut lähelläkään sitä korkeaa tasoa, jolla se oli RSV:n lisääntymisen lakipisteessä, eli 106,5 pfu päivänä 4 infektoinnin jälkeen. Kuudentena ja seitsemäntenä infektoinnin jälkeisenä päivänä keuhkovirusmäärä pysyi in-15 fektion katoamisvaiheelle tyypillisellä tasolla, nimittäin ΙΟ4'2 - 104'3 pfutssa, mikä vastaa hoitamattoman ryhmän seitsemännen infektionjälkeisen päivän tiitteriä (taulukko 8) . 1

Kahtena tai kolmena peräkkäisenä päivänä hoitaminen pienensi keuhkovirustiitteriä jopa enemmän (taulukko 8). Jälkimmäisen ryhmän hiirten keuhkoista ei voitu osoittaa virusta päivän : kuluttua hoidon lopettamisesta, kun taas päivää myöhemmin : havaittiin virusmäärän kasvaneen uudestaan hyvin vähän. Tämä ; 25 tapahtuma ei ehkä ole merkittävä, koska virusta voitiin osoittaa vain 2 hiiren keuhkoissa 4:stä testatusta, ja löydetty virusmäärä oli edelleen merkitsevästi pienempi kuin verrokkiryhmällä (taulukko 8). Nämä havainnot viittaavat siihen, että RSV-Fab:t, kuten Fav 19, olisivat tehokkaita i : 30 alempien hengitysteiden vakavan RSV-taudin hoitoon sellai- V ! silla vauvoilla ja pikkulapsilla, joilla riski on suuri, : ,·. sekä kaikenikäisillä yksilöillä, joilla, liittyen esimerkik- si suppressiohoitoon elinsiirron yhteydessä, perinnölliseen tautiin tai HIV-infektioon on vajaa immuunipuolustus. Lisäk-j \''i 35 si nämä havainnot viittaavat siihen, että Fab:iden, kuten ’ Fab 19:n, antaminen suoraan hengitysteihin olisi tehokasta myös vakavan RSV-taudin ennaltaehkäisyyn suuren riskin omaa- 63 108991 villa yksilöillä, jotka ovat altistuneet infektiolle ollessaan sairaalassa tai käydessään poliklinikalla.

Nämä havainnot, jotka osoittivat, että vasta-aineen Fab-5 fragmentit olivat terapeuttisesti aktiivisia in vivo, eivät olleet lainkaan odotettavissa, koska alalla ei ollut aikaisemmin opetettu tai ehdotettu näitä tuloksia. Todellakaan, tämän keksinnön tekijöiden parhaan tiedon mukaan vasta-aine-Fab:iden hoitovaikutusta in vivo ei ole raportoitu aikaisem-10 min. Itse asiassa on olemassa lukuisia teoreettisia näkökohtia, joiden valossa vasta-aine-Fab:iden hoitovaikutus in vivo oli varsin epätodennäköinen. Fab:t ovat yhdenarvoisia ja voivat siis kiinnittyä vain yhteen kohtaan, josta syystä ne eivät pysty yhdistämään (cross link) erillisten viruspar-15 tikkelien antigeenisiä kohtia. Tämän tosiseikan takia monet tutkijat ovat ajatelleet, että yhdistäminen kahdenarvoisilla vasta-ainemolekyyleillä tai F(ab1)2rksilla on edellytys virusten neutraloimiselle. Fab:iden voitaisiin myös uskoa olevan tehottomia siksi, että Fabristä puuttuu immunoglobu-20 liinimolekyylin Fc-osuus, joka saa aikaan monet vasta-aineiden laukaisevista toiminnoista, kuten komplementtikaskadin ja vasta-aineista riippuvan solusytotoksisuuden (ADCC) akti-·· voitumisen. Kaikesta huolimatta RSV-Fab 19 vähentää RSV:n infektoimissa keuhkoissa olevien virusten määrää hyvin ak-25 tiivisesti, ja saattaa siksi olla lähtömerkkinä uudelle ai-kakaudelle limakalvovirusinfektioiden immunoterapiassa, esimerkiksi niin RSV:n kuin muidenkin hengitysteiden viruspato-geenien, esimerkiksi influenssavirusten, parainfluenssavi- ’’’ ‘ rusten, rinovirusten ja koronavirusten, joiden kasvu in vivo 30 rajoittuu hengitysteiden ontelonpuoleiselle pinnalle.

·'. ‘ ' Materiaalitalletukset : .·, Seuraavat solukannat on talletettu ennen 16.9.1992 American

Type Culture Collectioniin, 1301 Parklawn Drive, Rockville, 35 Maryland, USA (ATCC) : i » < * · ‘: Solukanta ATCC:n talletusnumero M 108991 ! Klooni 11 ATCC 69071 I Klooni 19 ATCC 69072 Tämä talletus tehtiin patentointitarkoitukseen tehtyjen mik-5 robitalletusten kansainvälistä tunnustamista koskevan Buda-bestin sopimuksen (Budapest Treaty) ja siihen liittyvien säännösten määräysten mukaisesti. Tämä takaa elävän viljelmän säilyttämisen 30 vuotta talletuspäivämäärästä. ATCC pitää organismia saatavilla Budapestin sopimuksen määräysten 10 mukaisesti, mikä takaa viljelmän jälkeläisten pysyvän ja rajoittamattoman saatavuuden yleisölle, kun kyseinen USA:n patentti on myönnetty, tai kun USA:lainen tai mikä tahansa vierasmaalainen patenttihakemus tulee julkiseksi, kumpi tahansa tapahtuu ensin, ja varmistaa, että jälkeläiset ovat 15 saatavilla sille, jolla on tähän oikeus USA:n patentti- ja tavaramerkkikomissionäärin (U.S. Commissioner of Patents and Trademarks) määrittelyn mukaan 35 USC §122:n ja komissionää-rin tähän liittyvien säännösten mukaan (mukaan luettuna 37 CFR §1.14, viitaten erityisesti kohtaan 886 OG 638).

20 Tämän hakemuksen allekirjoittaja on suostunut siihen, että jos talletettu viljelmä kuolee, häviää tai tuhoutuu viljel-täessä sopivissa olosuhteissa, se korvataan ilmoituksen perusteella viipymättä elävällä saman kannan viljelmällä. Tal-25 letetun kannan saatavuutta ei pidä tulkita luvaksi käyttää keksintöä vastoin minkä tahansa hallituksen patenttilakiensa mukaan myöntämiä oikeuksia.

‘ Edeltävän kirjallisen selvityksen katsotaan olevan riittävä, 30 jotta alaa taitava henkilö pystyy käyttämään keksintöä. Tä-· · · män keksinnön aluetta ei tule rajoittaa koskemaan talletet- tuja solukantoja, sillä talletettu toteutus on tarkoitettu . yksittäiseksi havainnollistukseksi yhdestä keksinnön puoles- ta, ja mikä tahansa toiminnaltaan vastaava solukanta kuuluu | f *·;·* 3 5 keksinnön alueeseen. Materiaalitalletus ei tarkoita, että myönnettäisiin tämän kirjallisen kuvauksen olevan riittämä-;··; tön mahdollistamaan minkä tahansa keksinnön puolen harjoit- 65 108991 tamisen, paras tapa mukaan luettuna, eikä sen pidä tulkita rajoittavan patenttivaatimusten kattavuutta sen edustamaan spesifiseen havainnollistavaan esimerkkiin. Itse asiassa, tässä esitettyjen ja kuvailtujen lisäksi monet keksinnön 5 muunnokset käyvät alaa taitaville ilmeisiksi edeltävästä kuvauksesta, ja kuuluvat mukana olevien patenttivaatimusten alueeseen.

Yhteenveto sekvensseistä 10 Sekvenssi ID nro 1 on RSV:tä neutraloivan ihmisen mono- klonaalisen vasta-aineen raskaan ketjun aminohapposekvenssi,

Sekvenssi ID nro 2 on RSVrtä neutraloivan ihmisen mono-klonaalisen vasta-aineen raskaan ketjun aminohapposekvenssi, 15

Sekvenssi ID nro 3 on polynukleotidisekvenssi vasta-aineen raskas ketju -molekyylin tuottamiseen,

Sekvenssi ID nro 4 on polynukleotidisekvenssi vasta-aineen 20 raskas ketju -molekyylin tuottamiseen,

Sekvenssi ID nro 5 on polynukleotidisekvenssi vasta-aineen :· raskas ketju -molekyylin tuottamiseen, 25 Sekvenssi ID nro 6 on polynukleotidisekvenssi vasta-aineen raskas ketju -molekyylin tuottamiseen,

Sekvenssi ID nro 7 on polynukleotidisekvenssi vasta-aineen ’’ * raskas ketju -molekyylin tuottamiseen, 30 i,: : Sekvenssi ID nro 8 on polynukleotidisekvenssi vasta-aineen V : raskas ketju -molekyylin tuottamiseen, ,···. Sekvenssi ID nro 9 on polynukleotidisekvenssi vasta-aineen 35 raskas ketju -molekyylin tuottamiseen,

1 I

66 108991

Sekvenssi ID nro 10 on polynukleotidisekvenssi vasta-aineen raskas ketju -molekyylin tuottamiseen, i

Sekvenssi ID nro 11 on polynukleotidisekvenssi vasta-aineen 5 raskas ketju -molekyylin tuottamiseen,

Sekvenssi ID nro 12 on polynukleotidisekvenssi vasta-aineen raskas ketju -molekyylin tuottamiseen, 10 Sekvenssi ID nro 13 on polynukleotidisekvenssi vasta-aineen kevyt ketju -molekyylin tuottamiseen,

Sekvenssi ID nro 14 on polynukleotidisekvenssi vasta-aineen kevyt ketju -molekyylin tuottamiseen, 15

Sekvenssi ID nro 15 on polynukleotidisekvenssi vasta-aineen kevyt ketju -molekyylin tuottamiseen,

Sekvenssi ID nro 16 on polynukleotidisekvenssi vasta-aineen 20 kevyt ketju -molekyylin tuottamiseen,

Sekvenssi ID nro 17 on polynukleotidisekvenssi vasta-aineen kevyt ketju -molekyylin tuottamiseen, 25 Sekvenssi ID nro 18 on polynukleotidisekvenssi vasta-aineen , kevyt ketju -molekyylin tuottamiseen, :: Sekvenssi ID nro 19 on polynukleotidisekvenssi vasta-aineen ‘ kevyt ketju -molekyylin tuottamiseen, 30 j :: Sekvenssi ID nro 20 on polynukleotidisekvenssi vasta-aineen kevyt ketju -molekyylin tuottamiseen,

Sekvenssi ID nro 21 on aminohapposekvenssi kloonien rsv 6H, t * 35 11H, 21H, 22H ja 23H raskaiden ja kevyiden ketjujen vaihte- levien domeenien tuottamiseen (kuvio 4) , 67 108991

Sekvenssi ID nro 22 on aminohapposekvenssi kloonien rsv 13H ja 19H raskaiden ja kevyiden ketjujen vaihtelevien domeenien tuottamiseen (kuvio 4), 5 Sekvenssi ID nro 23 on aminohapposekvenssi kloonien rsv 6L, 11L, 2IL ja 22L raskaiden ja kevyiden ketjujen vaihtelevien domeenien tuottamiseen (kuvio 4),

Sekvenssi ID nro 24 on aminohapposekvenssi kloonin rsv 23L 10 raskaiden ja kevyiden ketjujen vaihtelevien domeenien tuottamiseen (kuvio 4),

Sekvenssi ID nro 25 on aminohapposekvenssi kloonien rsv 13L ja 19L raskaiden ja kevyiden ketjujen vaihtelevien domeenien 15 tuottamiseen (kuvio 4),

Sekvenssi ID nro 26 on kevyiden ketjujen linkkerin nukleoti-disekvenssi (ja johdettu aminohapposekvenssi) (kuvio 5, ylempi), 20

Sekvenssi ID nro 27 on sekvenssin ID nro 26 kevyiden ketjujen linkkerin johdettu aminohapposekvenssi (kuvio 5),

Sekvenssi ID nro 28 on raskaiden ketjujen linkkerin nukle-25 otidisekvenssi (ja johdettu aminohapposekvenssi) (kuvio 5, . alempi) ja '· ’· Sekvenssi ID nro 29 on sekvenssin ID nro 28 raskaiden ketju- ‘’ jen linkkerin johdettu aminohapposekvenssi (kuvio 5).

* I »

» I

* t 1 · 108991

SEKVENSSILISTAUS

(1) YLEISET TIEDOT: (i) HAKIJA:

Burton, Dennis R.

Barbas, III, Carlos F.

Chanock, Robert M.

Murphy, Brian R.

Crowe, Jr., James E.

(ii) KEKSINNÖN NIMITYS: Ihmisen monoklonaalisia, neutralisoivia vasta-aineita RS-virukselle (iii) SEKVENSSIEN LUKUMÄÄRÄ: 29 (iv) KIRJEENVAIHTO-OSOITE: (A) VASTAANOTTAJA: Spensley Horn Jubas & Lubitz (B) KATU: 1880 Century Park East, Suite 500 (C) KAUPUNKI: Los Angeles (D) OSAVALTIO: Kalifornia

(E) MAA: USA

(F) POSTINUMERO: 90067 (v) KONEKOODIMUOTO: (A) VÄLINETYYPPI: Levyke (B) TIETOKONE: IBM PC -yhteensopiva

i i (C) KÄYTTÖJÄRJESTELMÄ: PC-DOS/MS-DOS

,· : (D) OHJELMISTO: Patentin julkaisulupa #1.0, versio #1.25 (vi) TIEDOT NYKYISESTÄ HAKEMUKSESTA: (A) HAKEMUSNUMERO: PCT/ : (B) JÄTTÖPÄIVÄ: SYYSKUU-16-1993 (C) LUOKITUS: (viii) ASIAMIEHEN TIEDOT: 69 108991 (A) NIMI: Wetherell, Jr., Ph.D., John R.

(B) REKISTERINUMERO: 31 678 (C) VIITE/LUETTELONUMERO: FD-2791 (ix) TIETOLIIKENNEYHTEYSTIEDOT: (A) PUHELIN: +619 455 5100 (B) TELEFAKSI: +619 455 5110 (2) SEKVENSSIN ID NO:1 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 10 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: peptidi (B) SIJAINTI: väli 1..10 (Xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:l: ;· Ala Pro Ile Ala Pro Pro Tyr Phe Asp His ·. 1 5 10 (2) SEKVENSSIN ID NO: 2 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 19 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen : (D) TOPOLOGIA: lineaarinen ;j'.’ (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (ix) OMINAISPIIRRE: ’l'' (A) NIMI/SELITYS: peptidi :,''i (B) SIJAINTI: 1..19 70 1 0 8 9 91 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:2:

His Leu Pro Asp Tyr Trp Asn Leu Asp Tyr Thr Arg Phe Phe Tyr 15 10 15

Tyr Met Asp Val

(2) SEKVENSSIN ID NO:3 TIEDOT

(i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 32 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (ix) OMINAISPIIRRE:

(A) NIMI/SELITYS: CDS

(B) ASEMA: 1..32 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:3: GGCCGCAAAT TCTATTTCAA GGAGACAGTC AT 32 (2) SEKVENSSIN ID NO:4 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 36 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo . (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • ♦ v : (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: CDS , ·, (B) ASEMA: 1. . 36 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:4: AATGAAATAC CTATTGCCTA CGGCAGCCGC TGGATT 36 71 108991

(2) SEKVENSSIN ID NO:5 TIEDOT

(i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 32 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (ix) OMINAISPIIRRE:

(A) NIMI/SELITYS: CDS

(B) ASEMA: 1..32 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:5: GTTATTACTC GCTGCCCAAC CAGCCATGGC CC 32 (2) SEKVENSSIN ID NO:6 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 29 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) l (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: CDS ·· (B) ASEMA: 1..29 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:6: :T: CAGTTTCACC TGGGCCATGG CTGGTTGGG 29

(2) SEKVENSSIN ID NO: 7 TIEDOT

(i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 40 emäsparia :·· (B) TYYPPI: nukleiinihappo 72 108991 (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (ix) OMINAISPIIRRE:

(A) NIMI/SELITYS: CDS

(B) ASEMA: 1..40 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:7: CAGCGAGTAA TAACAATCCA GCGGCTGCCG TAGGCAATAG 40 (2) SEKVENSSIN ID NO:8 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 38 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (ΪΧ) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: CDS \ (B) ASEMA: 1..38 ! (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:8: • · · GTATTTCATT ATGACTGTCT CCTTGAAATA GAATTTGC 38 » «

/ ·' (2) SEKVENSSIN ID NO: 9 TIEDOT

(i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: ; (A) PITUUS: 40 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo . \ (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen .··.: (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) 73 1 0 8 9 91 (ix) OMINAISPIIRRE:

(A) NIMI/SELITYS: CDS

(B) ASEMA: 1..40 (ΧΪ) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:9: AGGTGAAACT GCTCGAGATT TCTAGACTAG TTACCCGTAC 40 (2) SEKVENSSIN ID NO:10 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 38 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (ix) OMINAISPIIRRE:

(A) NIMI/SELITYS: CDS

(B) ASEMA: 1..38 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:10: CGGAACGTCG TACGGGTAAC TAGTCTAGAA ATCTCGAG 38 » (2) SEKVENSSIN ID NO: 11 TIEDOT 1 (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 33 emäsparia : : (B) TYYPPI: nukleiinihappo i » : : (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen I t T: (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (ix) OMINAISPIIRRE:

' ·;·* (A) NIMI/SELITYS: CDS

(B) ASEMA: 1..33 74 108991 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:11: GACGTTCCGG ACTACGGTTC TTAATAGAAT TCG 33 (2) SEKVENSSIN ID NO:12 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 28 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (ix) OMINAISPIIRRE:

(A) NIMI/SELITYS: CDS

(B) ASEMA: 1..28 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:12: TCGACGAATT CTATTAAGAA CCGTAGTC 28

(2) SEKVENSSIN ID NO:13 TIEDOT

(i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 34 emäsparia ·· (B) TYYPPI: nukleiinihappo ,·. (C) JUOSTEISUUS: yksi juosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen » .* (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) • * · » 1 ’’ (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: CDS I.:’; (B) ASEMA: 1..34 ; (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 13: TGAATTCTAA ACTAGTCGCC AAGGAGACAG TCAT 34 (2) SEKVENSSIN ID NO: 14 TIEDOT: : *; (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: „ 108991 75 (A) PITUUS: 36 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (ix) OMINAISPIIRRE:

(A) NIMI/SELITYS: CDS

(B) ASEMA: 1..36 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:14: AATGAAATAC CTATTGCCTA CGGCAGCCGC TGGATT 36

(2) SEKVENSSIN ID NO:15 TIEDOT

(i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 31 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) i (ix) OMINAISPIIRRE: i

(A) NIMI/SELITYS: CDS

(B) ASEMA: 1..31 • · I f (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:15: GTTATTACTC GCTGCCCAAC CAGCCATGGC C 31 i * (2) SEKVENSSIN ID NO: 16 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: 1 I » /'.* (A) PITUUS: 30 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksi juosteinen ' "i (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 76 108991 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (ix) OMINAISPIIRRE:

(A) NIMI/SELITYS: CDS

(B) ASEMA: 1..30 (XX) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:16: GAGCTCGTCA GTTCTAGAGT TAAGCGGCCG 30

(2) SEKVENSSIN ID NO:17 TIEDOT

(i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 48 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (ΪΧ) OMINAISPIIRRE:

(A) NIMI/SELITYS: CDS

(B) ASEMA: 1..48 !· (Xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:17: , CTATTTCATT ATGACTGTCT CCTTGGCGAC TAGTTTAGAA TTCAAGCT 48 1 · (2) SEKVENSSIN ID NO: 18 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: ; ‘ (A) PITUUS: 40 emäsparia » i (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen i i (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) i t T (ix) OMINAISPIIRRE:

:.'i (A) NIMI/SELITYS: CDS

‘ “i (B) ASEMA: 1..40 77 108991 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:18: CAGCGAGTAA TAACAATCCA GCGGCTGCCG TAGGCAATAG 40

(2) SEKVENSSIN ID NO:19 TIEDOT

(i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 27 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (ix) OMINAISPIIRRE:

(A) NIMI/SELITYS: CDS

(B) ASEMA: 1..27 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:19: TGACGAGCTC GGCCATGGCT GGTTGGG 27 (2) SEKVENSSIN ID NO:20 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 24 emäsparia ·/ (B) TYYPPI: nukleiinihappo ··: (C) JUOSTEISUUS: yksi juosteinen ··· (D) TOPOLOGIA: lineaarinen •\ (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: CDS V 1 (B) ASEMA: 1..24 .···. (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 20: ,· . TCGACGGCCG CTTAACTCTA GAAC 24 (2) SEKVENSSIN ID NO: 21 TIEDOT: 78 108991 (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: \ (A) PITUUS: 129 aminohappoa | (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (vii) VÄLITÖN LÄHDE: (B) KLOONI: rsv 6H, 11H, 21H, 22H ja 23H (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: peptidi (B) ASEMA: 1..129 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:21:

Gin Vai Lys Leu Leu Glu Gin Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly 15 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Vai Ser Gly Vai Thr Phe Ser Ala 20 25 30

Tyr Ala Het Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 : Vai Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Asp Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser 50 55 60

Vai Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu 65 70 75 80 : : Tyr Leu Gin Het Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr 85 90 95 : : : Cys Ala Ser His Leu Pro Asp Tyr Trp Asn Leu Asp Tyr Thr Arg Phe ‘ 100 105 110 : .·, Phe Tyr Tyr Het Asp Vai Trp Gly Lys Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser ·;;/ 115 120 125 . Ser

(2) SEKVENSSIN ID NO: 22 TIEDOT

(i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: 108991 79 (A) PITUUS: 120 emäsparia (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (vii) VÄLITÖN LÄHDE:

(B) KLOONI: rsv 13H ja 19H

(ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: peptidi (B) ASEMA: 1..120 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:22:

Gin Vai Lys Leu Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Arg Leu Ala 1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr Thr Leu Ser Gly 20 25 30 ;· Tyr Thr Met His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ! 35- 40 45 **: Vai Ser Ser Ile Thr Gly Gly Ser Asn Phe Ile Asn Tyr Ser Asp Ser 50 55 60

Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu ’•;V 65 70 75 80

Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Thr Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr : 85 90 95 : : Cys Ala Thr Ala Pro Ile Ala Pro Pro Tyr Phe Asp His Trp Gly Gin 100 105 110 >··, Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser ·;·’ 115 120 • » · 80 108991 (2) SEKVENSSIN ID NO:23 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN .OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 109 aminohappoa I (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (vii) VÄLITÖN LÄHDE: (B) KLOONI: rsv 6L, 11L, 21L ja 22L (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: peptidi (B) ASEMA: 1..109 (Xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:23:

Met Ala Glu Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Thr Gin Ser Ile Ser Ser Asn 20 25 30 ^ Ala Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu : : 35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Ala Thr Asp Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu : 65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asp Ile Ser Pro : 85 90 95

Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg : 100 105 i ’ :

(2) SEKVENSSIN ID NO:24 TIEDOT

(i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: 81 108991 (A) PITUUS: 109 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (vii) VÄLITÖN LÄHDE:

(B) KLOONI: rsv 23L

(ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: peptidi (B) ASEMA: 1..109 (Xl) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:24:

Ket Ala Glu Leu Thr Gin Ser Pro Vai Thr Leu Ser Vai Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Vai Ala Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gin Asn Ile Asn Asp Asn 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly ·· 50 ' 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Arg Leu Glu Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Gly Ser Pro Tyr i 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 (2) SEKVENSSIN ID NO:25 TIEDOT: I : 108991 82 I (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 108 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (vii) VÄLITÖN LÄHDE: (B) KLOONI: rsv 13L ja 19 L (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: peptidi (B) ASEMA: 1..108 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:25:

Met Ala Glu Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 1 5 10 15

Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Thr Gin Ser Vai Ser Asn Phe 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Glu Ala Pro Thr Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr-Asp Ala Ser Thr Ser Gin Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Met Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro : : 65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Met Tyr Tyr Cys Gin Ala Ser Ile Asn Thr Pro Leu ; 85 90 95

Phe Gly Glu Gly Thr Arg Ile Asp Met Arg Arg Thr 100 105 i 83 108991

(2) SEKVENSSIN ID NO:26 TIEDOT

(i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 86 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (ix) OMINAISPIIRRE:

(A) NIMI/SELITYS: CDS

(B) ASEMA: 15..86 (C) MUUT TIEDOT: /huomautus "Kun nukleotidi 81 = C, aminohappo 23 = glutamiini (Gin). Kun nukleotidi 81 = G, aminohappo 23 = glutamaatti (Glu)" (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:26: AAGCTTAGGG AACC ATG GAA ACC CCA GCG CAG CTT CTC TTC CTC CTG CTA 50

Met Glu Thr Pro Ala Gin Leu Leu Phe Leu Leu Leu 1 5 10 CTC TGG CTC CCA GAT ACC ACC GGA GAA ATT CAG CTC 86

Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Glu Ile Gin Leu ; 15 20 | (2) SEKVENSSIN ID NO:27 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: : (A) PITUUS: 24 aminohappoa , · (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:27:

Met Glu Thr Pro Ala Gin Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 15 10 15

Asp Thr Thr Gly Glu Ile Gin Leu 20 i”’: 84 108991

(2) SEKVENSSIN ID NO:28 TIEDOT

(i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 89 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (ix) OMINAISPIIRRE:

(A) NIMI/SELITYS: CDS

(B) ASEMA: 15..89 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:28: AAGCTTAACT CACC ATG GAG TTT GGG CTG AGC TGG CTT TTT OTT GTG GCT 50

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Vai Ala 15 10 ATT TTA AAA GGT GTC CAG TCT GAG GTG GAG CTG CTC GAG 89

Ile Leu ly s Gly Vai Gin Ser Glu Vai Glu Leu Leu Gltf 15 20 25 (2) SEKVENSSIN ID NO:29 TIEDOT: ’ (1) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 25 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen | * ♦ : (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini j :': (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:29: i i Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Vai Ala Ile Leu Lys Gly 15 10 15

Vai Gin Ser Glu Vai Glu Leu Leu Glu 20 25 i :

Claims (11)

1. 85 108991
2. 1. Menetelmä ihmisen monoklonaalisen vasta-aineen tuottamiseksi, joka vasta-aine pystyy neutralisoimaan sekä antigeeniseen alaryhmään A että alaryhmään B kuuluvaa RS-virusta 5 (RSV), tunnettu siitä, että viljellään hybridoomasolulinjaa ATCC 69071 olosuhteissa, jotka sallivat vasta-aineen tuoton.
3. 2. Menetelmä ihmisen monoklonaalisen vasta-aineen tuottamiseksi, joka vasta-aine pystyy neutralisoimaan sekä anti- 10 geeniseen alaryhmään A että alaryhmään B kuuluvaa RS-virusta (RSV), tunnettu siitä, että viljellään hybridoomasolulinjaa ATCC 69072 olosuhteissa, jotka sallivat vasta-aineen tuoton.
4. 3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnet-15 tu siitä, että vasta-aine sitoutuu glykoproteiini F:ssä olevaan epitooppiin.
5. 4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vasta-aine on Fab-fragmentti. 20
6. 5. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu sii-tä, että siinä raskas ketju käsittää CDR3-polypeptidisek-venssin, joka on valittu sekvensseistä ‘ 25 APIAPPYFDH (SEQ ID 1) ja HLPDYWNLDYTRFFYYMDV (SEQ ID 2) : koostuvasta ryhmästä. ;·: 30 6. Ihmisen monoklonaalista vasta-ainetta koodaava polynuk- leotidisekvenssi, tunnettu siitä, että polynukleotidi sisäl-.· , tää sekvenssin, joka koodaa immunoglobuliinin raskaan ketjun CDR3-polypeptidisekvenssiä, joka on valittu ryhmästä: APIAPPYFDH (SEQ ID 1) ja 35 HLPDYWNLDYTRFFYYMDV (SEQ ID 2) . • i 86 1 0 8 9 91
7. 7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen polynukleotidisekvenssi, tunnettu siitä, että polynukleotidi on DNA:ta.
8. 8. Isäntäsolu, tunnettu siitä, että se sisältää patentti- 5 vaatimuksen 6 mukaisen polynukleotidisekvenssin.
9. 9. Biologisesti toimiva vektori, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 6 mukaisen polynukleotidisekvenssin. 10
10. 10. Vektori, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 6 mukaisen polynukleotidisekvenssin.
11. 11. Isäntäsolu, tunnettu siitä, että se sisältää patentti- 15 vaatimuksen 10 mukaisen vektorin.