FI108139B - Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen peptidin valmistamiseksi - Google Patents
Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen peptidin valmistamiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI108139B FI108139B FI924069A FI924069A FI108139B FI 108139 B FI108139 B FI 108139B FI 924069 A FI924069 A FI 924069A FI 924069 A FI924069 A FI 924069A FI 108139 B FI108139 B FI 108139B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- peptides
- peptide
- val
- gly
- ala
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 314
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 21
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 177
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 45
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 claims abstract description 41
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 claims abstract description 28
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 63
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 61
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 55
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 52
- 108010014186 ras Proteins Proteins 0.000 claims description 49
- 102000016914 ras Proteins Human genes 0.000 claims description 43
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 38
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 19
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 18
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 18
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 claims description 17
- 102100034540 Adenomatous polyposis coli protein Human genes 0.000 claims description 13
- 101000924577 Homo sapiens Adenomatous polyposis coli protein Proteins 0.000 claims description 13
- 108700020978 Proto-Oncogene Proteins 0.000 claims description 12
- 102000052575 Proto-Oncogene Human genes 0.000 claims description 12
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 9
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 claims description 6
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 claims description 6
- 230000005945 translocation Effects 0.000 claims description 5
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 17
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 abstract description 7
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 abstract description 5
- 238000009566 cancer vaccine Methods 0.000 abstract description 5
- 238000011394 anticancer treatment Methods 0.000 abstract 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 86
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 59
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 37
- 230000004044 response Effects 0.000 description 37
- 108010062347 HLA-DQ Antigens Proteins 0.000 description 25
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 25
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 25
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 20
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 19
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 18
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 18
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 17
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 17
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 17
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 16
- 108700042226 ras Genes Proteins 0.000 description 14
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 13
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 11
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 11
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 11
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 10
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 9
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 9
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- AUBMZAMQCOYSIC-MNXVOIDGSA-N Leu-Ile-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O AUBMZAMQCOYSIC-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 8
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 6
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 6
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 6
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 208000033781 Thyroid carcinoma Diseases 0.000 description 5
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 description 5
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical group CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- -1 glycine amino acid Chemical class 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 5
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 5
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 description 5
- 208000013077 thyroid gland carcinoma Diseases 0.000 description 5
- 101150049556 Bcr gene Proteins 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000005907 cancer growth Effects 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 4
- 108010026901 peptide 106 Proteins 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 239000004474 valine Chemical group 0.000 description 4
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- 102100039788 GTPase NRas Human genes 0.000 description 3
- 108010093013 HLA-DR1 Antigen Proteins 0.000 description 3
- 101000744505 Homo sapiens GTPase NRas Proteins 0.000 description 3
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 3
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 210000003810 lymphokine-activated killer cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 3
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 3
- 208000030901 thyroid gland follicular carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 3
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 3
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 2
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 2
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 2
- 208000004463 Follicular Adenocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 101710113436 GTPase KRas Proteins 0.000 description 2
- 101000721661 Homo sapiens Cellular tumor antigen p53 Proteins 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 102000004441 bcr-abl Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010056708 bcr-abl Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 2
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- CSHFHJNMIMPJST-HOTGVXAUSA-N methyl (2s)-2-[[(2s)-2-[[2-[(2-aminoacetyl)amino]acetyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoate Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)OC)CC1=CC=CC=C1 CSHFHJNMIMPJST-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 2
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- ITFICYZHWXDVMU-IPTZIORSSA-N (2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S,3S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-6-amino-2-[[(2S,3S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-amino-4-carboxybutanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]pentanedioic acid Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H]4CCCN4C(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N ITFICYZHWXDVMU-IPTZIORSSA-N 0.000 description 1
- VVQIIIAZJXTLRE-QMMMGPOBSA-N (2s)-2-amino-6-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]hexanoic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)NCCCC[C@H](N)C(O)=O VVQIIIAZJXTLRE-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 13-cis retinol Natural products OCC=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FSHURBQASBLAPO-WDSKDSINSA-N Ala-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N FSHURBQASBLAPO-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 241000024188 Andala Species 0.000 description 1
- 206010003571 Astrocytoma Diseases 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100291031 Caenorhabditis elegans gly-13 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100228200 Caenorhabditis elegans gly-5 gene Proteins 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 1
- 108010010378 HLA-DP Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000015789 HLA-DP Antigens Human genes 0.000 description 1
- LSQHWKPPOFDHHZ-YUMQZZPRSA-N His-Asp-Gly Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)NCC(=O)O)N LSQHWKPPOFDHHZ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 101100005713 Homo sapiens CD4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000686246 Homo sapiens Ras-related protein R-Ras Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- YGDWPQCLFJNMOL-MNXVOIDGSA-N Ile-Leu-Gln Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)N YGDWPQCLFJNMOL-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 1
- 102100026720 Interferon beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical group C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108010028921 Lipopeptides Proteins 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- FXBKQTOGURNXSL-HJGDQZAQSA-N Met-Thr-Glu Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O FXBKQTOGURNXSL-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 102000048850 Neoplasm Genes Human genes 0.000 description 1
- 108700019961 Neoplasm Genes Proteins 0.000 description 1
- RSPISYXLHRIGJD-UHFFFAOYSA-N OOOO Chemical compound OOOO RSPISYXLHRIGJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical group N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- JXWLMUIXUXLIJR-QWRGUYRKSA-N Phe-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 JXWLMUIXUXLIJR-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 101150040459 RAS gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 102100024683 Ras-related protein R-Ras Human genes 0.000 description 1
- 201000000582 Retinoblastoma Diseases 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 239000012317 TBTU Substances 0.000 description 1
- XXROXFHCMVXETG-UWVGGRQHSA-N Val-Gly-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O XXROXFHCMVXETG-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- CLZISMQKJZCZDN-UHFFFAOYSA-N [benzotriazol-1-yloxy(dimethylamino)methylidene]-dimethylazanium Chemical compound C1=CC=C2N(OC(N(C)C)=[N+](C)C)N=NC2=C1 CLZISMQKJZCZDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150063325 ab gene Proteins 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 210000004100 adrenal gland Anatomy 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N all-trans-retinol Natural products OC\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 description 1
- 238000010370 cell cloning Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000002701 cell growth assay Methods 0.000 description 1
- 230000005859 cell recognition Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 1
- 230000000112 colonic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 208000021045 exocrine pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000004077 genetic alteration Effects 0.000 description 1
- 231100000118 genetic alteration Toxicity 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 1
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 description 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- 150000002333 glycines Chemical class 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 108010037248 lantibiotic Pep5 Proteins 0.000 description 1
- SRCAXTIBNLIRHU-JJKPAIEPSA-N lantibiotic pep5 Chemical compound N([C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N\C(=C/C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N\C(=C/C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N\C(=C(/C)S)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)C(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)C(=O)CC SRCAXTIBNLIRHU-JJKPAIEPSA-N 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000003747 lymphoid leukemia Diseases 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical class [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000010807 negative regulation of binding Effects 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 229940045950 pep-20 Drugs 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 108010012581 phenylalanylglutamate Proteins 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 229940021993 prophylactic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 102000027483 retinoid hormone receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091008679 retinoid hormone receptors Proteins 0.000 description 1
- 229960003471 retinol Drugs 0.000 description 1
- 235000020944 retinol Nutrition 0.000 description 1
- 239000011607 retinol Substances 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- YEENEYXBHNNNGV-XEHWZWQGSA-M sodium;3-acetamido-5-[acetyl(methyl)amino]-2,4,6-triiodobenzoate;(2r,3r,4s,5s,6r)-2-[(2r,3s,4s,5r)-3,4-dihydroxy-2,5-bis(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound [Na+].CC(=O)N(C)C1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C([O-])=O)=C1I.O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YEENEYXBHNNNGV-XEHWZWQGSA-M 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- CMJCEVKJYRZMIA-UHFFFAOYSA-M thallium(i) iodide Chemical compound [Tl]I CMJCEVKJYRZMIA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/82—Translation products from oncogenes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4746—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used p53
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/806—Antigenic peptides or proteins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
χ 108139
Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen peptidin valmistamiseksi
Keksinnön yhteenveto ' 5 Tämä keksintö koskee menetelmää T-soluimmuniteetin aikaansaavien, onkogeenin proteiinituotteiden synteettisten peptidien ja niiden fragmenttien valmistamiseksi.
Tekniikan taustaa
Eurooppalaisen patentin 272 321 perusteella tunne-10 taan onkogeenin proteiinituotteen tai sen fragmentin käyttö tuotettaessa onkogeeniproteiinille spesifistä immuno-globuliinia ja sen jälkeen mainitun immunoglobuliinin ja syövän vastaisen aineen välisen konjugaatin muodostus syövän hoitoa varten.
15 Eurooppalaisten patenttien 177 814 ja 175 360 pe rusteella tunnetaan vasta-aineiden tuottaminen onkogeenin proteiinituotteita, kuten ras-onkogeenin p21-proteiinia, vastaan, joka p21-proteiini eroaa ainoastaan yhden kohdassa 12 sijaitsevan aminohapon suhteen normaalista proteii-20 nituotteesta. Näitä vasta-aineita voidaan käyttää diagnostisiin tai terapeuttisiin tarkoituksiin. Immunogeenisten peptidifragmenttien saamiseksi ras-onkogeenin p21-proteii-nista insertoidaan kysteiinitähde kohtien 16 ja 17 väliin, johon voidaan kiinnittää kantajaproteiini.
25 Lisäksi, eurooppalaisen patentin 253 325 perusteel- la tunnetaan onkogeeneihin liittyvät peptidit, jotka sisältävät osan onkogeenin koodittamaa aminohapposekvenssiä, ja mainittuja peptidejä vastaan suunnatut vasta-aineet.
Lisäksi tiedetään, että yksi lähestymistapa immuno-30 logiseen syövän hoitoon on ollut interleukiini-2 -prote-: iinin anto yhdessä spesifisten lymfosyyttien, niin kutsut tujen lymfokiiniaktivoitujen tappajasolujen (LAK-solut) _ «. * 2 108139 tai kasvaimeen tunkeutuvien lymfosyyttien (TIL-solut), kanssa. Edulliset vaikutukset, jotka saatiin aikaan joillain potilailla, joilla oli spesifinen syöpä, eivät ole yleistettävissä. Lisäksi, joidenkin potilaiden saamat si-5 vuvaikutukset ovat melko epämiellyttäviä ja joskus vaka- · via. (Steven A. Rosenberg, Scientific American, toukokuu 1990, Adoptive Immunotherapy for Cancer).
Tiedetään myös, että on tehty yrityksiä sellaisten syöpärokotteiden kehittämiseksi, jotka perustuvat potilaan 10 omasta syövästä peräisin olevien syöpäsolujen tai mainittujen solujen liukenemattomien fragmenttien tai sellaisten solujen, jotka on sekoitettu yhteen muiden epäspesifisten immuunisysteemin stimulaattorien, kuten BCG:n, interferonien tai interleukiinin kanssa, injektoimiseen.
15 D.J. Peace et ai., Fed. Am. Soc. Exp. Biol. (1990) J4 (7), sivu A2013, abstrakti numero 1854, ovat julkaisseet tulokset, joissa immunisoitiin hiiriä ras-onkogeenin p21-proteiinin 5-16 -fragmentilla, jossa glysiini on korvattu arginiinilla kohdassa 12, joka immunisointi johti 20 T-soluresponsseihin. Responssi oli spesifinen immunisoivalle peptidille ja T-solut kykenivät respondoimaan kokonaiselle proteiinille, jossa oli sama Arg-12 -substituutio. Nämä tulokset osoittavat, että ras-peptidit ovat immunogeenisia näissä kokeissa käytetyn hiirikannan . 25 C57BL/6 H-2 -molekyylien yhteydessä ja että tämän hiiri- kannan antigeeniä sisältävät solut kykenevät prosessoimaan ras-onkogeenin p21-proteiinin niin, että muodostuu fragmentteja, jotka ristireagoiyat immunisaatiossa käytetyn synteettisen peptidin kanssa.
30 Havainto, että hiirikanta voidaan immunisoida, ei ’ ole olennainen esillä olevan keksinnön kannalta seuraavis- ta syistä:
Hiirien suhteen on yleinen havainto se, että kannat, joilla on erilaiset H-2 -tyypit, tunnistavat saman 35 proteiinin erilaiset peptidiryhmät (S.S. Zamvil et ai., J.
3 108139
Exp. Med., osa 168 (1988), 1181 - 1186), näin ollen peptidi, joka aiheuttaa immuuniresponssin yhdessä hiirikan-nassa ei ehkä stimuloi toisen läheistä sukua olevan hiiri-kannan T-soluja. Tiedetään myös, että koemalleissa hiir-‘ 5 ten, rottien ja ihmisten T-solut tunnistavat saman prote iinin erilaiset ei-päällekkäiset epitoopit. Selityksen tälle on ajateltu olevan lajien välisissä antigeenin pro-sessointimekanismien ja niiden MHC-molekyylien peptidin sitomiskapasiteetin eroissa.
10 Stefan Jung ja Hermann J. Schleusener, J. Exp.
Med., osa 173, tammikuu 1991, julkaisivat, että ras-onko-geenin p21-proteiinin aminohapot 5-16 sisältävän synteettisen peptidifragmentin, jossa on väliini kohdassa 12 glysiiniaminohapon tilalla, tunnistaa kahdesta terveestä 15 henkilöstä peräisin olevat ihmisen CD4+ T-solut ja että nämä T-solut voidaan kehittää antigeenispesifisiksi T-so-lulinjoiksi, jotka eivät ristireagoi vastaavien peptidien kanssa, jotka ovat peräisin ras-onkogeenin normaaleista p21-proteiineista. Tässä työssä osoitetaan, että ihmisen 20 immuunisysteemi tunnistaa tämän yksittäisen synteettisen peptidifragmentin.
Tämän havainnon asiaankuuluvuus on kuitenkin epäselvä, koska tiedetään, että T-solujen reaktiivisuus synteettisiä peptidejä vastaan voi erota T-solun reaktiivi-. 25 suudesta sitä kokonaista proteiinia vastaan, josta pep tidit ovat peräisin. Selitys tälle ristiriidalle on se, että synteettisen peptidin ekvivalentteja ei muodostu proteiinin proteolyyttisen katkaisun/prosessoinnin aikana in vivo. Näin ollen on erittäin tärkeää, että käytetty pep-30 tidifragmentti aiheuttaa spesifiset T-soluresponssit tai herättää T-muistisoluresponssit todelliselle onkogeenin proteiinifragmentille, joka muodostuu prosessoimalla ja jonka syöpäsolu ja muut antigeeniä omaavat solut sisältävät. Sellaisten peptidien määrittely on välttämätöntä ke- 4 108139 hitettäessä syöpärokotteita ja.syövän hoitoa, jotka perustuvat T-soluimmuniteettiin.
Tekninen tausta
Syövän alkamisen geneettisenä taustana ovat proto-5 onkogeenit ja onkogeenit. Proto-onkogeenit ovat solun normaaleja geenejä, joilla on mahdollisuus tulla onkogeeneik-si. Kaikki onkogeenit koodattavat proteiinia ja toimivat sen välityksellä. Useimmissa tapauksissa niiden on osoitettu olevan signaalin kuljetusreittien osia. Onkogeenit 10 syntyvät luonnossa proto-onkogeeneistä pistemutaatioiden tai translokaatioiden kautta, joka johtaa mutaation sisältävän solun transformoituneeseen tilaan. Syöpä kehittyy monivaiheisen prosessin kautta, johon ottaa osaa useat mutaatiotapahtumat ja onkogeenit.
15 Yksinkertaisimmassa muodossaan yhden emäksen subs tituutio proto-onkogeenissä voi aiheuttaa sen, että tuloksena syntynyt geenituote eroaa yhden aminohapon osalta.
Koemalleissa, joissa käytetään hiiren kasvaimia, on osoitettu, että pistemutaatiot solun sisäisissä "omissa" 20 proteiineissa voivat johtaa kasvaimen hyljintäantigeenien syntymiseen, jotka sisältävät peptidejä, jotka eroavat yhden aminohapon suhteen normaalista peptidistä. T-solut, jotka tunnistavat nämä peptidit kasvainsolujen pinnalla olevien pääasiallisten histokompatibiliteettimolekyylien . 25 (MHC) yhteydessä, kykenevät tappamaan kasvainsolut ja näin poistamaan kasvaimen isännästä (Boon, T. et ai., Cell, 1989, osa 58, sivut 293 - 303).
Ihmisen syöpäimmunologian alalla kaksi viimeistä vuosikymmentä ovat nähneet perinpohjaisia yrityksiä aito-30 jen syöpäspesifisten antigeenien karakterisoimiseksi.
Yrityksiä on erityisesti tehty ihmisen kasvainanti-geeneja vastaan olevien vasta-aineiden analysoimiseksi. Alan aiemmat tulokset ehdottivat, että sellaisia vasta-aineita voitaisiin käyttää sekä diagnostisiin että tera-35 peuttisiin tarkoituksiin, esimerkiksi yhdessä syövän vas- 5 108139 täisen aineen kanssa. Yksi ongelma on se, että vasta-aineet kykenevät sitoutumaan ainoastaan sellaisiin kasvain-antigeeneihin, jotka ovat esillä kasvainsolujen pinnalla. Tästä syystä yritykset tuottaa syöpähoito, joka perustuu 5 kehon immuunisysteemiin, ovat olleet vähemmän onnistuneita kuin on odotettu.
Vasta-aineet tunnistavat tyypillisesti vapaan antigeenin sen luonnollisessa konformaatiossa ja voivat mahdollisesti tunnistaa melkein minkä tahansa kohdan, joka on 10 esillä antigeenisessä pinnassa. Päinvastoin kuin B-solujen tuottamat vasta-aineet, T-solut tunnistavat antigeenit ainoastaan MHC-molekyylien yhteydessä, joita nimitetään ihmisellä HLA-molekyyleiksi (ihmisen leukosyyttiantigee-ni), ja ainoastaan sen jälkeen, kun antigeeni on proses-15 soitu sopivasti, joka prosessointi tavallisesti sisältää proteiinin proteolyyttisen fragmentaation, joka johtaa sellaisten peptidien syntymiseen, jotka sopivat MHC-mole-kyylien kuoppaan. Tämä mahdollistaa sen, että T-solu tunnistaa myös sellaiset peptidit, jotka ovat peräisin solun 20 sisäisistä proteiineista. T-solut voivat näin ollen tunnistaa kasvainsolun pinnalla olevien MHC-molekyylien yhteydessä olevat sellaiset poikkeavat peptidit, jotka ovat peräisin mistä tahansa kasvainsolun osasta, ja sen jälkeen aktivoitua niin, että ne eliminoivat poikkeavan peptidin . 25 sisältävän kasvainsolun.
HLA-molekyylejä koodittaa ihmisen kromosomissa 6 oleva HLA-alue. Luokan I molekyylejä koodittavat HLA A, B ja C -alalokukset ja luokan II molekyylejä koodittavat DR, DP ja DQ -alalokukset. Kaikki geenituotteet ovat erittäin 30 polymorfisia. Näin ollen eri yksilöt ekspressoivat erilai-• siä HLA-molekyylejä, jotka eroavat muiden yksilöiden vas taavista. Tämä on perusta vaikeuksille löytää elinsiirroissa sellaiset elinten luovuttajat, joiden HLA-proteii-nit on yhteensopivat. HLA-molekyylien geneettisen variaa-35 tion merkitystä immunologiassa heijastaa niiden rooli im- 6 108139 muuniresponssigeeneinä. Peptidin sitomiskapasiteetin välityksellä tiettyjen HLA-molekyylien läsnä- tai poissaolo määrittää yksilön kapasiteetin respondoida peptidiepitoo-peille. Sen seurauksena HLA-molekyylit määrittävät resis-5 tenssin tai herkkyyden taudille.
T-solut voivat säädellä syövän kehittymistä ja kasvua eri mekanismeilla. Sytotoksiset T-solut, sekä HLA-luokkaan I rajoittuneet CD8+ että HLA-luokkaan II rajoittuneet CD4+ -solut, voivat suoraan tappaa kasvainsolut, 10 jotka sisältävät sopivat kasvainantigeenit. CD4+ auttaja -T-soluja tarvitaan sytotoksisiin T-soluresponsseihin kuin myös vasta-aineresponsseihin ja makrofaagien ja LAK-solujen aiheuttaman tappamisen indusoimiseen.
Vaikka alalla on aiemmin tunnistettu useita onko-15 geenejä ja niiden proteiinituotteita ja eräs äskettäin ilmestynyt tutkimus on osoittanut, että terveen henkilön T-solukokoelma sisältää T-soluja, joilla on spesifisyyttä sellaiselle synteettiselle peptidifragmentille, joka on peräisin ras-onkogeenin yhdestä p21-proteiinituotteesta, 20 mitkään aiemmat tutkimukset eivät ole määritelleet oikeita antigeenejä tai antigeenisiä kohtia, jotka synnyttävät kasvainspesifisen T-soluimmuniteetin.
Näin ollen esillä oleva keksintö perustuu ajatukselle, että toinen mahdollinen lähestymistapa taistella . 25 syöpää vastaan on se, että käytetään kehon omaa immuuni- systeemiä aktivoimalla ja vahvistamalla spesifisten T-so-lujen immuuniresponssia.
Keksinnön määrittely
Nyt on löydetty sellaiset onkogeeniproteiinin syn-30 teettiset peptidit ja peptidifragmentit, jotka saavat aikaan spesifiset T-soluresponssit onkogeenin sisältäviä * syöpäsoluja vastaan.
Tämän keksinnön mukaiselle menetelmälle peptidin valmistamiseksi, jossa peptidissä 35 a) on pistemutaatio tai translokaatio verrattuna sen proto-onkogeenin proteiinin vastaavaan fragmenttiin 7 108139 tai sen kasvaimen suppressorigeenin proteiiniin; ja joka peptidi b) vastaa, sisältäen täydellisesti tai olemalla fragmentti, sellaista prosessoitua onkogeenin proteiini- 5 fragmenttia tai kasvaimen suppressorigeenin fragmenttia, joka on läsnä syöpäsolussa tai muissa antigeeniä sisältävissä soluissa (APC), ja c) on läsnä HLA-peptidi -kompleksina jokaisen yksilön ainakin yhdessä alleelissa; ja 10 d) indusoi spesifiset T-soluvasteet sellaista to dellista onkogeenin proteiinifragmenttia vastaan, jonka solu tuottaa prosessoimalla ja jonka HLA-molekyyli tuo esiin, lukuun ottamatta e) p21-ras-peptidien fragmentteja, jotka vastaavat 15 aminohappojen 5-16 sekvenssiä, jossa on mutaatio 12Val tai 12Arg, on tunnusomaista se, että peptidi valmistetaan synteettisesti tavanomaisilla kiinteäfaasitekniikoilla.
Koska nämä mutaatiot synnyttävät onkogeenien trans-formaatiokapasiteetin, ne ovat avainasemassa syövän kehit-20 tymisessä. Muodostamalla spesifiset T-soluresponssit näitä mutaatioita vastaan, mutaation sisältävien kasvainsolujen kehityksen ja kasvun säätely on mahdollista. Näin ollen ensimmäistä kertaa on mahdollista kehittää profylaktia ja hoito, joka on suunnattu pahanlaatuisissa soluissa olevia 25 spesifisiä geneettisiä muutoksia vastaan.
Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus Tässä kuvataan myös rokotetta, joka ehkäisee sellaisten syöpien muodostumisen, jotka sisältävät tavallisimmin havaitut onkogeenimutaatiot, joka rokote perustuu 30 osittain tai kokonaan sellaisten onkogeeniproteiinien synteettisiin peptideihin tai peptidifragmentteihin, jotka ‘ ' muodostavat T-soluimmuniteetin onkogeenin geenituotetta vastaan.
Kuvataan edelleen syöpähoitoa sellaisille syöville, 35 joissa on mainitut mutaatiot niiden proto-onkogeeneissä, joka hoito perustuu T-soluimmuniteettiin, joka voidaan indusoida potilaissa stimuloimalla heidän T-so- 8 108139 luimmuniteettinsa joko in vitro tai in vivo esillä olevan keksinnön mukaisesti valmistettavilla peptideillä.
Jotta spesifiseen T-soluimmuniteettiin perustuva syöpärokote ja spesifiset syöpähoidot olisivat tehokkaita, 5 täytyy täyttää kolme ehtoa: 1. käytettyjen peptidien täytyy vastata onkogeenin prosessoitua proteiinitragmenttia, niiden täytyy sisältää se täydellisesti ja/tai olla sen aktiivinen fragmentti, joka proteiinifragmentti on läsnä syöpäsolussa tai muissa anti- 10 geeniä sisältävissä soluissa, 2. käytettyjen peptidien täytyy olla sitoutuneena HLA-mo-lekyyliin immunogeenisessa muodossa, ja 3. T-solujen, jotka kykenevät tunnistamaan HLA-peptidi -kompleksin ja respondoimaan sille, täytyy olla läsnä vas- 15 taanottajan verenkierrossa.
On havaittu, että esillä olevan keksinnön mukaisesti valmistettavat peptidit täyttävät kaikki nämä ehdot. Esillä olevan keksinnön mukaisesti valmistettavat peptidit muodostavat spesifiset T-soluimmuuniresponssit in vitro. 20 Määritettiin HLA-molekyylit, jotka kykenevät sitoutumaan kuhunkin peptideistä. Edelleen, todiste siitä, että ras-peptidit sitoutuvat yleisesti HLA-DR ja HLA-DQ -molekyy-leihin, saatiin suorissa sitoutumiskokeissa, joissa käytettiin puhdistettuja HLA-DR ja HLA-DQ -molekyylejä. On 25 havaittu, että tämän keksinnön mukaisesti valmistettavat * synteettiset peptidit tai peptidifragmentit vastaavat onkogeenin prosessoituja proteiinifragmentteja. Tästä on esimerkkinä ras-onkogeenin synteettiset p2-l-peptidif rag-mentit, joissa on mutaatio kohdassa 61. Nämä synteettiset 30 peptidit herättivät spesifiset T-muistisoluresponssit in * vitro. Tämä on selvä osoitus siitä, että syöpäpotilaan T- solut olivat aktivoituneet samojen tai hyvin samanlaisten peptidifragmenttien välityksellä in vivo.
Äskettäin on havaittu, että terveen henkilön T-so-35 lukokoelma sisältää sellaisia T-soluja, joilla on spesifisyys sellaista yksittäistä peptidiä vastaan, joka peptidi ; sisältää mutaation kohdassa 12, ja edelleen tutkittiin, olisiko tämä ilmiö yleinen luonteeltaan. Näin ollen tes- 9 108139 tattiin täydellinen sarja peptidejä, jotka edustivat tunnettuja yleisiä ras-onkogeenin p21-mutaatioita kohdissa 12, 13 ja 61, näiden peptidifragmenttien aktivoimien T-solujen etsimiseksi.
5 Esillä olevassa kuvauksessa ja patenttivaatimuksis sa aminohapot on esitetty joko täydellisillä niinillään tai kolmen kirjaimen lyhenteillä, jotka tunnetaan alalla.
Suoritustavat Tämän keksinnön mukaisesti valmistettavat peptidit 10 ovat synteettisiä peptidejä, jotka vastaavat prosessoitua peptidiä ja/tai sisältävät sen, jota peptidiä on syöpäsoluissa ja muissa antigeeniä sisältävissä soluissa, joka peptidi sisältää mutaation yhdessä tai useammassa kohdassa, jotka vastaavat onkogeenimutaatiota, ja jotka 15 peptidit muodostavat T-soluimmuniteetin onkogeehin prote iinia vastaan. Pistemutaation kohdassa oleva aminohappo voi olla mikä tahansa aminohappo paitsi sellainen aminohappo, joka löytyy proto-onkogeenin koodittamasta normaalista proteiinista, mutta onkogeenin proteiinista 20 löytyvät aminohapot ovat suositeltavia.
Tämän keksinnön mukaisesti valmistettavat peptidit sisältävät edelleen fragmentit, joissa on yksi tai useampi aminohapposubstituutio mutaatio- tai translokaatiokohdan vieressä.
25 Transformoivat ras-geenit ovat onkogeenejä, jotka
• · I
useimmin havaitaan ihmisen syövässä niin, että niiden ko-konaisesiintymistiheyden on arvioitu olevan noin 10 - 20 %. Transformoivat geenit sisältävät mutaation ras-onkogeenin p21-geenituotteen kohdissa 12, 13 ja 61.
30 Tämän keksinnön yhden näkökohdan mukaan synteet- - * tiset peptidit ovat fragmentteja, jotka sisältävät ainakin * · yhden ras-onkogeenin p21-proteiinin kohdista 12, 13 ja 61, jossa on sama aminohapposekvenssi.
Kohdassa 12 oleva aminohappo voi olla mikä tahansa 35 aminohappo paitsi Gly, joka löydetään sellaisesta proteiinituotteesta, jota proto-onkogeeni koodittaa, peptidin muun sekvenssin vastatessa normaalia proto-onkogeeniä. Yksi suositeltava tämän keksinnön mukaisesti valmistettava
1081?O
10 1 ^ s peptidiryhmä sisältää peptidit pll3 - pll9, joiden aminohapposekvenssit on esitetty taulukossa 8, tai niiden fragmentit, jotka synnyttävät T-soluresponssin onkogeenin proteiinituotetta vastaan.
5 Kohdassa 13 oleva aminohappo voi olla mikä tahansa aminohappo paitsi Gly, joka löydetään sellaisesta proteiinituotteesta, jota proto-onkogeeni koodittaa. Yksi suositeltava tämän keksinnön mukaisesti valmistettava peptidiryhmä sisältää peptidit pl20 - pl21, joiden aminohapposek-10 venssit on esitetty taulukossa 8, tai niiden fragmentit, jotka synnyttävät T-soluresponssin onkogeenin proteiinituotetta vastaan.
Kohdassa 61 oleva aminohappo voi olla mikä tahansa aminohappo paitsi Gin, joka löydetään sellaisesta proteii-15 nituotteesta, jota proto-onkogeeni koodittaa. Yksi suositeltava tämän keksinnön mukaisesti valmistettava peptidiryhmä sisältää peptidit, jotka on esitetty taulukossa 9, tai niiden fragmentit, jotka synnyttävät T-soluresponssin onkogeenin proteiinituotetta vastaan.
20 Tämän keksinnön mukaisesti valmistettavat suositel tavat peptidit ovat ras p21-proteiinien peptidejä tai fragmentteja, jotka on valittu aminohapoista 1 - 25 ja joilla on ainakin yksi mutaatio kohdassa 12 ja/tai 13. Normaalin ras p21-proteiinin aminohappojen 1-25 sekvens-25 si, jossa on Gly sekä kohdassa 12 että 13, on esitetty • · taulukossa 6.
Muut tämän keksinnön suositeltavat peptidit ovat ras p21-proteiinien peptidejä tai fragmentteja, jotka on valittu aminohapoista 45 - 72, erikoisesti 51 - 67, ja 30 joilla on ainakin yksi mutaatio kohdassa 61. Normaalin ras p21-proteiinin aminohappojen 45 - 72 sekvenssi, jossa on • *
Gin kohdassa 61, on esitetty taulukossa 6.
Muut esillä olevan keksinnön mukaisesti valmistettavat peptidit ovat p53-proteiinin peptidifragmentteja, 35 joissa on mutaatiot ainakin kohdassa 273, jossa voi sijaita mikä tahansa muu aminohappo paitsi Arg.
21 1Q8139
Edelleen muita esillä olevan keksinnön mukaisesti valmistettavia peptidejä ovat bcr-abl -fuusioproteiinien p210 ja pl90 peptidifragmentit, joissa bcr-geenin eksoni 3 ja abi-geenin eksoni 2 ovat yhdistyneet, tai fuusioprote-5 iini p210, jossa bcr-geenin eksoni 2 ja abi-geenin eksoni 2 ovat yhdistyneet.
Muut peptidit ovat bcr-abl -fuusioproteiinin peptidi fragmentteja, joissa bcr-geenin eksoni c3 ja abi-geenin eksoni 2 ovat yhdistyneet.
10 Tämän ryhmän suositeltavat peptidit sisältävät seu- raavat fragmentit tai niiden osat:
Ile-Pro-Leu-Thr-Ile-Asn-Lys-Glu-Glu-Ala-Leu-Gln-Arg-Pro-
Val-Ala-Ser-Asp-Phe-Glu
Ala-Thr-Gly-Phe-Lys-Gln-Ser-Ser-Lys-Ala-Leu-Gln-Arg-Pro-15 Val-Ala-Ser-Asp-Phe-Glu
Ala-Phe-Asp-Val-Lys-Ala-Leu-Gln-Arg-Pro-Val-Ala-Ser-Asp-
Phe-Glu
Edelleen muita suositeltavia peptidejä ovat ret-fuusioproteiinin fragmentit, jotka sisältävät seuraavan 20 sekvenssin tai sen osia:
Leu-Arg-Lys-Ala-Ser-Val-Thr-Ile-Glu-Asp-Pro-Lys-Trp-Glu-Phe
Edelleen muita suositeltavia peptidejä ovat EGF-reseptorin fuusioproteiinin fragmentit, jotka sisältävät 25 seuraavan sekvenssin tai sen osia:
Ser-Arg-Ala-Leu-Glu-Glu-Lys-Lys-Gly-Asn?-Tyr-Val-Val-Thr-
Asp-His-Gly
Edelleen muita suositeltavia peptidejä ovat reti-nolireseptorin fuusioproteiinin fragmentit, jotka sisäl-30 tävät seuraavan sekvenssin tai sen osia:
Leu-Ser-Ser-Cys-Ile-Thr-Gln-Gly-Lys-Ala-Ile-Glu-Thr-Gln- • ·
Ser-Ser-Ser-Ser-Glu-Glu
Esillä oleva keksintö sisältää edelleen menetelmän suurempien fragmenttien valmistamiseksi, jotka fragmentit 35 sisältävät muutamia aminohapposubstituutioita joko N- tai C-päässä, ja on havaittu, että että sellaiset peptidit 12 108139 voivat muodostaa T-soluklooneja, joilla on sopiva spesifisyys .
Esillä olevan keksinnön mukaisesti valmistetut peptidit tai fragmentit voivat olla symmetrisiä tai epäasym-5 metrisiä sen kohdan ympärillä, jossa mutaatio löytyy onko-geenin proteiineissa.
Edelleen on ajateltu, että peptidit voidaan antaa yhdessä joko samaan aikaan tai erikseen sellaisten yhdisteiden, kuten sytokiinien, nimittäin interleukiini-2 -pro-10 teiinin tai sen kaltaisten kanssa immuuniresponssin voimistamiseksi, kuten alalla tunnetaan.
Keksintö sisältää, mutta ei ole rajoitettu, menetelmän spesifisten peptidien ja minkä tahansa synteettisten peptidien, jotka sisältävät tai menevät päällekkäin 15 näiden sekvenssien kanssa, tai niiden variaatioiden sisältäen peptidit, joissa on aminohapposubstituutiot, jotka säilyttävät mainitun aktiivisuuden tai parantavat sitä, valmistamiseksi.
Esillä olevan keksinnön mukaisesti valmistettavia 20 peptidejä voidaan käyttää rokotteessa tai terapeuttisena kokoonpanona joko yksinään tai yhdessä muiden materiaalien kanssa, kuten esimerkiksi lipopeptidikonjugaatin muodossa, jonka alalla tiedetään voivan indusoida korkea-affiniteet-tisia sytotoksisia T-lymfosyyttejä (K. Deres, Nature, 342 25 (marraskuu 1989)).
Voi olla käyttökelpoista sisällyttää esillä olevan keksinnön mukaisesti valmistettavat peptidit tai peptidi-fragmentit rokotteeseen, joka perustuu joko synteettiseen peptidiin tai rekombinanttifragmenttiin.
30 Esillä olevan keksinnön mukaisesti valmistettavat peptidit ovat erikoisen käyttökelpoisia käytettäväksi ro- kotteessa, joka kykenee turvallisesti muodostamaan jomman kumman tyyppisen immuniteetin: (1) peptidit tuotetaan synteettisesti ja eivät sen vuoksi 35 sisällä transformoivia syöpägeenejä tai muita kohtia tai • · 13 108139 materiaaleja, jotka voivat aiheuttaa vahingollisia vaikutuksia, (2) peptidejä voidaan käyttää yksinään indusoimaan solu-immuniteetti, 5 (3) peptidit voidaan suunnata tietyn tyyppistä T-solures- ponssia varten ilman, että saadaan aikaan muiden ei-toivottujen responssien aiheuttamia sivuvaikutuksia.
Esillä olevan keksinnön mukaisesti valmistettavat peptidit tai fragmentit voidaan sisällyttää farmaseutti-10 siin kokoonpanoihin tai rokotteisiin yhdessä tavallisten alalla tunnettujen lisäaineiden, laimentimien, stabiloiji-en tai sellaisten kanssa.
Tässä kuvattu farmaseuttinen kokoonpano tai rokote voi sisältää peptidit tai fragmentit yksinään tai yhdessä 15 ainakin yhden farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan tai laimentimen kanssa.
Lisäksi rokotekokoonpano voi sisältää valikoiman peptidejä, joissa on tavallisimmat onkogeeniproteiineista löytyvät mutaatiot.
20 Lisäksi rokotekokoonpano voi sisältää peptidin, joka on valittu yhtä syöpää varten, joka rokote voidaan antaa henkilöille, jotka kuuluvat ryhmään, jolla on korkea riski saada tämä syöpä.
Esillä olevan keksinnön mukaisesti valmistettavat 25 peptidit ja peptidifragmentit voidaan tuottaa tavanomaisilla menetelmillä, jotka alalla tunnetaan, ja tämä on selvennetty alla kuvatussa synteesikuvauksessa.
Kuten yllä on mainittu, tässä kuvattua syöpäroko-tetta voidaan antaa henkilöille, jotka kuuluvat ryhmään, 30 jolla on korkea riski saada yksi määritelty syöpä, johon • liittyy yksi tai useita onkogeenejä. Esimerkkejä ihmisen • · kasvaimista löydetyistä onkogeeneistä on esitetty taulukossa 5.
Tässä kuvattua syöpärokotetta voidaan edelleen an-35 taa väestölle yleisesti esimerkiksi sellaisten peptidien •« • 14 108139 seoksena, jotka muodostavat T-soluimmuniteetin yleisiä eri syöpämuotoja vastaan.
Tässä kuvattua syöpähoitoa voidaan antaa sekä in vivo että in vitro, jossa hoidossa päämääränä on synnyttää 5 spesifiset T-solulinjat tai kloonit sen onkogeenin, joka on vastuussa potilasta vaivaavasta syöpätyypistä, geeni-tuotetta vastaan.
Biologiset kokeet
Kuvioiden kuvaus 10 Kuvio 1 kuvaa menetelmän, jolla synnytettiin ras p21-peptidin spesifiset T-soluresponssit normaaleissa luovuttajissa in vitro ja sellaisten solujen kloonauksen. Perifeerisen veren mononukleaariset solut (PBMC) eristettiin defibrinoidusta verestä sentrifugoimalla 15 Lymphoprep'illä (Nycomed, Oslo, Norja). Pestyt PBMC-solut suspendoitiin uudelleen RPMI1640-alustaan (Gibco, Paisley, Skotlanti), johon oli lisätty 100 kansainvälistä yksikköä penisilliiniä per ml, streptomysiiniä (100 μg/ml) ja 15 % autologista seerumia ja osoitetut määrät synteettisiä pep-20 tidejä, ja inkuboitiin inkubaattorissa 5 % C02:n läsnäollessa 37 °C:ssa. Käytettyjen peptidien rakenteet on esitetty taulukossa 1. Kaikki peptidit, joissa oli mutaatio kohdassa 12 ja 13, sisälsivät lisäksi alaniinin tai valii-nin C-päässä.
25 T-solukloonausta varten T-solublastit ympättiin • «
Terasaki-levyille niin, että määrä oli 1-10 blastia per kuoppa, samaan peptidiä sisältävään alustaan kuin yllä. Kukin kuoppa sisälsi 25 000 säteilytettyä (2000 R) autologista PBMC-solua syöttösoluina ja niihin lisättiin ihmi-30 sen IL-2 -rekombinanttiproteiinia (Amersham, Englanti) niin, että lopullinen konsentraatio oli 20 yksikköä/ml, • · kokonaistilavuuden ollessa 20 μΐ. T-solujen kasvua arvioitiin mikroskooppisesti vuorokausina 5 - 6 ja ne siirrettiin 96-kuoppaisille levyille (Costar, Cambridge, MA, 35 USA). Kukin kuoppa sisälsi 100 000 tuoretta, säteilytettyä >· · 15 108139 autologista PBMC-solua syöttösoluina kuin myös yllä olevan tapaan peptidit ja IL-2 -proteiinin, kokonaistilavuuden ollessa 120 μΐ. Kasvavat kloonit laajennettiin edelleen 24-kuoppaisille levyille 3-5 vuorokautta sen jälkeen, 5 kun ne oli siirretty 96-kuoppaisille levyille, samaan tapaan kuin yllä on kuvattu, ja ne stimuloitiin uudestaan viikoittain tuoreilla säteilytetyillä syöttösoluilla, peptideillä ja IL-2 -proteiinilla. Kloonien lisälaajennus suoritettiin alustassa, joka sisälsi ainoastaan IL-2 -10 proteiinia ja lopuksi alustassa, joka ei sisältänyt peptidejä tai IL-2 -proteiinia.
Kuvio 2 ja kuviot 2a - 2e esittävät T-solukloonien I, B, E ja F spesifisyyden T-solukasvukokeissa. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena 96-kuoppaisilla levyil-15 lä niin, että alkuperäisessä peptidi seoksessa oli läsnä viisi peptidiä stimuloivina antigeeneinä. Kuopat sisälsivät 50 000 säteilytettyä (8000 R) autologista EBV-viruk-sella transformoitua B-solua antigeeniä sisältävinä soluina (APC).
20 Viljelmiä inkuboitiin 2 vuorokautta 37 °C:ssa inku- baattorissa 5 % C02:n läsnäollessa, ja leimattiin yli yön 1 pCiillä 3H-tymidiiniä (Amersham, Englanti) per kuoppa ennen keräystä lasikuitufilttreille automaattisella solu-kerääjällä (Scatron, Lierbyen, Norja). Tymidiinin inkorpo-25 raatio DNA:hän kvantitoitiin tuikenestelaskijalla käyttäen • · LKB 1205 Betaplate Liquid Scintillation -laskijaa. Tulokset on annettu kolmen rinnakkaisen viljelmän keskiarvona. Kontrollit sisälsivät T-solukloonit viljeltyinä yksinään tai APC:n kanssa ilman peptidejä. Paneelien mittakaava on 30 piirretty positiivisen responssin voimakkuuden mukaisesti.
Kuviot 3a - 3d esittävät tulokset klooneilla I, B, • · E ja F tehdyistä blokeerauskokeista, joissa käytettiin monoklonaalisia vasta-aineita L243, joka on spesifinen HLA-DR -molekyylille, ja FN81.1.1, joka on spesifinen 35 HLA-DQ -molekyylille. Kasvukokeet tehtiin, kuten on ku- ·· ie 1 Q 8 1 3 9 vattu kuviossa 2 paitsi, että APC-soluja esi-inkuboitiin 30 minuuttia 37 °C:ssa osoitetun monoklonaalisen vasta-aineen konsentraation läsnäollessa ennen T-solujen ja peptidien lisäystä inkubaatioseokseen. Tulokset on esitetty, 5 kuten on kuvattu kuviossa 2.
Kuvio 4 esittää peptidi-inhibitiokokeet käyttäen kloonia I indikaattoriresponssisoluna. Olosuhteet olivat, kuten on kuvattu kuviossa 2 paitsi, että stimuloivaa peptidiä (peptidi 42) käytettiin 10 pmolaarisena konsentraa-10 tiona ja inhibitorisia peptidejä käytettiin 250 pmolaa-risena konsentraationa. APC-soluja esi-inkuboitiin 30 minuuttia 37 °C:ssa inhibitoristen peptidien kanssa ennen stimulatoristen peptidien ja T-solujen lisäystä. Tulokset on esitetty, kuten kuviossa 2. (Huomaa: peptidi 42 tuntuu 15 inhiboivan kloonia I 250 pmolaarisena konsentraationa. Tämä näkyy myös tämän kloonin annosresponssikäyrästä peptidin 42 kanssa (tulosta ei esitetty)).
Kuvio 5 esittää samanlaiset tulokset kuin kuvio 4, tällä kertaa on kloonin E inhibitioresponssi peptidillä 43 20 näytetty. Olosuhteet ovat muuten samat kuin on kuvattu kuviossa 4.
Kuvio 6 esittää kloonin E responssin peptidin 43 lyhennetyille muodoille. Peptidit lyhennettiin N- ja C-päistä, kuten on esitetty taulukossa 2. Kokeen olosuhteet 25 olivat, kuten on kuvattu kuviossa 2. Kunkin peptidin kon- » * sentraatio .oli 10 pmolaarinen ja respondoivien T-solujen ja APC-solujen määrä oli 50 000.
Kuvio 7 esittää peptidi-inhibitiokokeet käyttäen kloonia E indikaattoriresponssisoluna ja käyttäen peptidin 30 43 samoja lyhennettyjä muotoja. Stimulatorista peptidiä (peptidi 43) käytettiin 5 pmolaarisena konsentraationa ja * · inhibitorisia peptidejä 250 pmolaarisena konsentraationa. Olosuhteet olivat muuten samat kuin on kuvattu kuviossa 4. Huomaa: peptidit 65 ja 81 ovat ei-stimulatorisia 10 pmo- * · · 17 108139 laarisena konsentraationa (kuvio 6), mutta ne ovat stimu-latorisia 250 pmolaarisena konsentraationa.
Kuvio 8 esittää kloonin F responssin peptidin 45 lyhennetyille muodoille. Peptidien rakenne on esitetty 5 taulukossa 2. Kokeen olosuhteet olivat täsmälleen samat kuin on kuvattu kuviossa 6.
Kuvio 9 esittää tulokset PBMC-stimulaatiosta potilaalla, jolla oli follikulaarinen kilpirauhasen karsinoo-ma, ras p21-proteiinista peräisin olevien peptidien koko 10 paneelilla. PBMC-soluja, 100 000 solua per kuoppa, inku-boitiin 96-kuoppaisilla levyillä niin, että läsnä oli 100 pg/ml kutakin peptidiä, ilman (ensimmäinen pylväs) ihmisen IL-2 -rekombinanttiproteiinia tai (toinen pylväs) niin, että sitä oli läsnä 1 yksikkö/ml. 3H-tymidiiniä 15 (1 pCi) lisättiin vuorokautena 6 ja viljelmät kerättiin ja prosessoitiin vuorokautena 7, kuten on kuvattu kuviossa 2. Tulokset on esitetty kolmen rinnakkaisen keskiarvoina. Kontrollina olivat PBMC-solut viljeltyinä yksinään tai IL-2 -rekombinanttiproteiinin läsnäollessa.
20 Kuvio 10 esittää samasta luovuttajasta kuin kuvios sa 9 peräisin olevien PBMC-solujen responssin peptidille 23, kun läsnä oli IL-2 -proteiinia tai ilman sitä. Olosuhteet olivat, kuten kuviossa 9 paitsi, että käytettiin so-lumäärää 200 000 solua per kuoppa ja kahta eri peptidian-25 nosta.
• φ (
Kuvio 11 esittää kuvioissa 9 ja 10 kuvatusta potilaasta peräisin olevan sekundaarisen T-soluviljelmän responssin viidelle peptidille, jotka edustavat normaalin ja mutatoidun ras p21-proteiinien kohdan 61 ympärillä olevia 30 aminohapposekvenssejä. Olosuhteet olivat, kuten on kuvat tu kuviossa 2 paitsi, että käytettiin 25 000 respondoivaa • · solua ja APC-solua ja peptidin konsentraatio oli 200 pg/ml.
Kuvio 12 esittää T-solukloonien 10, 14, 15 ja 23 35 reaktiivisuuden peptidille 23. Kokeen olosuhteet olivat, 108139 18 kuten on kuvattu kuviossa 2 paitsi, että APC-soluina käytettiin 50 000 säteilytettyä allogeenista HLA-DQ -molekyylin suhteen identtistä PBMC-solua ja peptidin konsentraa-tio oli 50 μg/ml.
5 Kuvio 13 esittää kloonilla 14 tehtyjen blokeeraus- kokeiden tulokset käytettäessä monoklonaalista vasta-ainetta FN81.1.1, joka on spesifinen HLA-DQ -molekyylille. Olosuhteet olivat, kuten on kuvattu kuvioissa 2 ja 3.
Kuvio 14 esittää kloonin 15 responssin peptidin 23 10 lyhennetyille muodoille. Peptidit lyhennettiin N- ja C-päistä, kuten on esitetty taulukossa 7. Tämän kokeen olosuhteet olivat, kuten on kuvattu kuviossa 2 paitsi, että kutakin peptidiä käytettiin 20, 50 ja 100 /unolaarisena loppukonsentraationa. Respondoivien solujen ja APC-solujen 15 määrä oli 50 000 solua.
Kuvio 15 esittää kloonin 14 responssin uudelle synteettisten peptidien ryhmälle, joka sisältää saman mutaation kohdassa 61 kuin peptidi 23. Nämä uudet peptidit sisältävät ras-sekvenssin sekvenssit 51 - 67, 52 - 67, 53 -20 67, 51 - 65, 52 - 65 ja 53 - 65, katso taulukko 6. Näiden peptidien sekvenssit on esitetty taulukossa 7. Olosuhteet olivat, kuten on kuvattu kuviossa 14.
Kuvio 16 esittää kloonin F annosresponssikäyrät peptidille 45 ja peptideille 88 - 91. Peptidien rakenteet 25 on esitetty taulukossa 2. Peptidin konsentraatio oli, kuten on esitetty kuviossa ja kokeen olosuhteet olivat muutoin samanlaiset kuin on esitetty kuviossa 6.
Kuvio 17 esittää kloonin B responssin peptidin 43 lyhennetyille muodoille ja kloonin I responssin peptidin 30 42 lyhennetyille muodoille. Peptidit lyhennettiin N- ja C- päistä, kuten on esitetty taulukossa 2. Kullakin peptidil- • i lä käytettiin kolmea erilaista annosta lopullisten kon-sentraatioiden ollessa 20, 50 ja 100 /xmolaarisia. Respondoivien solujen ja APC-solujen määrä oli 50 000 solua. 35 Kokeen olosuhteet olivat, kuten on kuvattu kuviossa 2.
• · « 19 7 08 7 39
Kuviot 18a - 18d esittävät tulokset kokeista, joissa kloonit B, I, E ja F stimuloitiin pitkien peptidien paneelilla. Kullakin peptidillä käytettiin kolmea eri annosta loppukonsentraatioiden ollessa 20, 50 ja 100 pmolaa-5 risia. Vertailun vuoksi kloonit stimuloitiin peptideillä 42, 43, 44 ja 45, joita käytettiin kloonien muodostamiseen. Respondoivien solujen ja APC-solujen määrä oli 50 000 solua. Olosuhteet olivat muutoin samat kuin on kuvattu kuviossa 2.
10 Kuvio 19 esittää kahden T-solukloonin, KB 15 ja KB
23, jotka ovat peräisin terveeltä luovuttajalta, joka oli stimuloitu pitkien peptidien (p-112, p-113, p-114, p-115 ja p-116) seoksella, responssin. Viljelyolosuhteet olivat oleelliset sellaiset, jotka on kuvattu kuviossa 1.
15 Kuvio 20 esittää tulokset IFN-Γ käsiteltyjen pak susuolen karsinoomasolujen HT29 (ATCC, Rockville, MD) kas-vuinhibitiokokeista käyttäen kloonia 14 vaikuttajasoluina. Mikrotiitterilevyn kuoppaan ympättyjen kohdesolujen määrä oli 20 000 ja soluja käsiteltiin 500 yksiköllä ihmisen 20 IFN-rekombinanttiproteiinia/ml (Amersham, UK) 3 vuorokautta ennen säteilytettyjen (2000 radia) vaikuttajasolujen lisäystä, kuten kuviossa on esitetty. Peptidillä käsiteltyjä soluja viljeltiin viimeiset 24 tuntia peptidin 106 läsnäollessa sen loppukonsentraation ollessa 10 pg/ml.
25 Vaikuttajasolujen lisäyksen jälkeen viljelmät leimattiin ··' 3 yli yön 1 pCi:llä H-tymidiiniä per kuoppa ennen keräystä, kuten on kuvattu kuviossa 2. Spesifinen kasvuinhibitio laskettiin sellaisten kontrolliviljelmien, joihin ei oltu lisätty peptidiä, inkorporaatiotuloksista.
30 Ras-spesifisten T-solujen induktio primaarisella in vitro immunisaatiolla • · "
Tutkimme ensiksi, sisältäisikö normaalien terveiden henkilöiden T-solukokoelma T-soluja, jotka kykenevät tunnistamaan sellaisten peptidien ryhmän ja respondoimaan 35 niiden kanssa, jotka peptidit sisältävät aminohapposek- ·· >08129 20 ° venssit, jotka ovat peräisin mutatoituneesta ras p21-pro-teiinista.
Terveiden luovuttajien perifeerisen veren mononuk-leaarisia soluja stimuloitiin in vitro esillä olevan kek-5 sinnön mukaisesti valmistettavien synteettisten ras p21-peptidien seoksilla, kuten on kuvattu kuviossa 1.
Joidenkin näiden kokeiden tulokset on esitetty taulukossa 3. Mitään primaarista responssia peptidiseoksia vastaan ei voitu havaita. Samanlaiset kokeet, joissa käy-10 tettiin 15 terveen luovuttajan ryhmää, jotka oli stimuloitu yksittäisillä peptideillä, osoitti myöskin täydellisen primaariresponssien puutteen näitä peptidejä vastaan (tuloksia ei esitetty). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että normaalissa väestössä respondoivien solujen yleisyys 15 on hyvin alhainen. Kuitenkin, kun in vitro viljelmiä stimuloitiin toistuvasti peptideillä ja tuoreilla säteilyte-tyillä antigeeniä sisältävillä soluilla, voitiin havaita vahva responssi vastaavia peptidejä vastaan (taulukko 3).
Nämä tulokset osoittavat selvästi, että sopivan in 20 vitro immunisaation jälkeen sellaisilla peptideillä, jotka sisältävät mutatoituneista onkogeeneista peräisin olevat aminohapposekvenssit, voidaan saada aikaan spesifiset T-soluresponssit. Näin ollen olemme myös osoittaneet, että T-soluja, joilla on spesifisyys ras p21-proteiinista pe-25 räisin oleviin peptideihin, on läsnä normaalissa T-solu-kokoelmassa ja tällä luovuttajalla on sellaiset HLA-mole-kyylit, jotka kykenevät sitomaan sellaisia peptidejä.
Seuraavaksi halusimme tutkia sellaisten T-solujen hienospesifisyyttä, jotka solut kykenevät tunnistamaan ras 30 p21-peptidit, ja määritellä ne HLA-molekyylit, jotka ovat vastuussa näiden peptidien sitomisesta ja tuovat ne esiin • · respondoivia T-soluja varten. Tätä tarkoitusta varten kloonasimme aktivoidut T-solut, jotka olivat läsnä viljelmässä, joka respondoi seokselle, joka sisälsi peptidit 35 P-42 - P-46. Kloonausmenetelmä on kuvattu kuviossa 1. Tu- ·· i 108139 21 x lokset kloonauskokeista on yhteenvedetty taulukossa 4. Klooneista, jotka osoittivat spesifisyyttä yksittäiselle peptidille, neljä valittiin lisätutkimuksia varten.
Klooni I sisälsi spesifisyyden ainoastaan pep-5 tidille 42, joka sisältää lysiiniaminohapon kohdassa 12. Lysiinin substituoiminen monilla muilla aminohapoilla ehkäisi responssin täydellisesti (kuvio 2a).
Responssi peptidiä 42 vastaan voitiin täydellisesti blokeerata HLA-DR -molekyyliä vastaan olevalla monoklonaa-10 lisella esimerkkivasta-aineella L243, mutta ei monoklonaa-lisilla vasta-aineilla, jotka ovat HLA-DQ -molekyyliä ja HLA-DP -molekyyliä vastaan, joka osoittaa, että peptidi 42 sitoutuu HLA-DR -molekyyliin tällä tietyllä luovuttajalla (kuvio 3a).
15 Klooni B sisälsi spesifisyyden ainoastaan pep tidille 44, joka sisältää arginiiniaminohapon kohdassa 12. Mitään muita peptidejä ei tunnistettu (kuvio 2b).
Kuten klooni I, klooni B oli myös HLA-DR -molekyylin rajoittama, minkä osoitti blokeerauskokeet monoklo-20 naalisella vasta-aineella (kuvio 3b).
Klooni E sisälsi spesifisyyden ainoastaan peptidille 44, joka sisältää väliiniaminohapon kohdassa 13. Mitään muita peptidejä ei tunnistettu (kuvio 2c).
Päinvastoin kuin kloonit, jotka tunnistivat pep-25 tidin 42 ja peptidin 44, tätä kloonia ei blokeerannut mo- I · « noklonaaliset anti-HLA-DR -vasta-aineet, mutta sen sijaan sen blokeerasi monoklonaalinen vasta-aine, joka tunnistaa HLA-DQ -molekyylin (kuvio 3c). Anti-HLA-DP -vasta-aineella ei ollut mitään vaikutusta. Nämä tulokset osoittavat, että 30 peptidi 43 sitoutuu HLA-DQ -molekyyliin tällä tietyllä luovuttajalla.
« · «
Klooni F osoitti erilaisen reaktiivisuuskuvion. Klooni F antoi erittäin vahvat responssit peptidiä 45 vastaan, joka sisältää alaniinin kohdassa 12, joka oli läsnä 35 alkuperäisessä peptidiseoksessa. Se ei reagoinut muiden ·· 22 1 081 39 seoksessa olevien peptidien kanssa (kuvio 2d), mutta reagoi vaihtelevalla tasolla muiden peptidien kanssa (kuvio 2e). Tämän kloonin reaktiivisuus tuntui olevan kriittisesti riippuvainen siitä, että sillä on glysiiniaminohappo 5 kohdassa 13, koska tämän glysiinin substituoiminen aspara-giinihapolla tai valiinilla ehkäisi responssin täydellisesti. Kohdassa 12 olevan glysiinin substituoiminen emäksisellä lysiini- tai arginiiniaminohapolla johti mataliin responsseihin tai ei johtanut mihinkään responssiin osoit-10 taen, että sellaiset substituutiot häiritsevät T-solure-septorin sitoutumiskohtaa. Kuten kloonilla E, tämä klooni oli myös HLA-DQ -molekyylin rajoittama, jonka osoitti blo-keeraus monoklonaalisilla vasta-aineilla (kuvio 3d). Yksi mielenkiintoinen havainto on se, että kaksi peptidiä, 15 joissa on emäksiset aminohapot kohdassa 12 ja jotka eivät onnistuneet stimuloimaan HLA-DQ -molekyylin rajoittamaa kloonia F, molemmat kykenevät sitoutumaan HLA-DR -molekyyliin ja molemmat tunnistetaan resiprookkisesti kloonien I ja B toimesta.
20 Peptidin HLA-DR ja HLA-DQ -molekyyleihin sitoutu misen kartoittamiseksi testasimme ei-stimulatoristen ras p21-peptidien kyvyn inhiboida peptidin 42 sitoutumista HLA-DR -molekyyliin käyttäen kloonin I stimulaatiota indi-kaattorisysteeminä, ja kyvyn inhiboida peptidin 43 sitou-.· 25 tumista HLA-DQ -molekyyliin käyttäen kloonin E stimulaa tiota indikaattorisysteeminä.
Peptidin 42 sitoutumista HLA-DR -molekyyliin inhiboi vahvasti 25-kertainen peptidien 39, 40, 41, 43, 44 ja 45 ylimäärä (kuvio 4). Muut peptidit inhiboivat ainoastaan 30 marginaalisesti sitoutumista. Huomionarvoisesti yksikään ** peptideistä, joissa oli aminohappo 61, ei pystynyt merkit tävästi inhiboimaan sitoutumista HLA-DR -molekyyliin ja sen jälkeistä kloonin I aktivaatiota. Päinvastaisesta, kaikki peptidit inhiboivat peptidin 45 sitoutumista HLA-35 DQ -molekyyliin ja sen jälkeistä kloonin E aktivaatiota 23 1 081 39 (kuvio 5). Näin ollen kaikki peptidit, joissa oli ras p21-proteiinista peräisin olevat aminohapposekvenssit, kykenivät sitoutumaan HLA-DQ -molekyyliin sisältäen peptidit, jotka sisälsivät ei-mutatoidun 6-19 -sekvenssin (Gly 5 kohdassa 12 ja 13) ja ei-mutatoidun 54 - 69 -sekvenssin (Gin kohdassa 61). Näin ollen on mahdollista, että kaikki nämä peptidit voivat olla immunogeenisiä HLA-DQ -molekyylin yhteydessä ja että useat peptideistä sen lisäksi voivat olla immunogeenisiä HLA-DR -molekyylin yhteydessä, 10 kuten on jo esitetty peptideille 42 ja 44 ja peptidille, joka sisältää Vai kohdassa 12 (Jung ja Schluesener, 1991).
Sen tutkimiseksi, mitkä aminohapot ovat tärkeitä HLA-DQ -molekyylin rajoittamisen T-solukloonien E ja F peptidin tunnistukselle, syntetisoimme lyhennetyt muodot 15 peptideistä 43 ja 45, kuten on esitetty taulukossa 2. Peptidit lyhennettiin sekä N- että C-päästä. Ensimmäinen tärkeä kysymys oli, oliko näiden peptidien C-päähän tehdyllä aminohappojen Ala ja Leu yhteisiisäyksellä tärkeä rooli in vitro immunisaatiossa. Kuvioiden 6 ja 8 tulokset osoit-20 tavat, että nämä kaksi lisäaminohappoa ottivat marginaalisesti osaa kloonin E tunnistamaan kohtaan eivätkä olleet tärkeitä kloonin F peptidin tunnistukselle. Peptidi 79, josta puuttuu nämä kaksi aminohappoa, oli yhtä tehokas stimuloimaan kloonia F. Peptidit 64, 79 ja 80 stimuloivat 25 kloonia E konsentraationa 10 μΐ. Peptidit 65 ja 81 tulivat • * stimulatorisiksi konsentraationa 250 μΐ. Peptidit 66, 67, 68, 82 ja 83 inhiboivat tässä konsentraatiossa (kuvio 7) ja kykenevät näin ollen sitoutumaan HLA-DQ -molekyyliin. Peptidit 69, 70, 74, 75 ja 76 stimuloivat kloonia 30 F 10 μ1:η konsentraatioina.
Kuvioiden 6-8 yhdistetyt tulokset osoittavat, ' * « että useat peptidit, jotka sisältävät alaniinin kohdassa 12 tai valiinin kohdassa 13 ja jotka ovat pituudeltaan vaihtelevia, voidaan tunnistaa kloonien E ja F toimesta. 35 Silmiin pistävä symmetria tuloksissa kloonien E ja F koh- ·» < 108139 24 dalla osoittaa, että aminohapot Vai kohdassa 8 ja Ser kohdassa 17 ovat ehdottoman tärkeitä näiden T-solukloonien stimuloimiseksi. Peptidin, joka stimuloi kloonia E, ennustettu minimisekvenssi on sen vuoksi Val-Val-Gly-Ala-Gly-5 Val-Val-Gly-Lys-Ser ja kloonille F sekvenssi on Val-Val-Gly-Ala-Ala-Gly-Val-Gly-Lys-Ser. Ennustettu minimipeptidi 8-17, 12 - Ala (peptidi 88) syntetisoitiin ja sen kykyä stimuloida kloonia F verrattiin peptidiin 45 ja useihin muihin peptideihin, kuten on kuvattu kuviossa 16. Peptidin 10 88 annosresponssikäyrä vahvistaa sen stimulatorisen kyvyn, mutta osoittaa, että se on paljon vähemmän vahvempi kuin peptidi, jota käytettiin tämän kloonin synnyttämiseen. Lyhyemmät peptidit sitoutuvat edelleen HLA-DQ -molekyyliin, mutta niistä on hävinnyt sellaiset aminohapot, jotka 15 ovat kriittisiä näiden T-solukloonien tunnistamiselle. Ennakoimme, että myös nämä peptidit käytettyinä T-solujen stimuloimiseen in vitro voivat muodostaa ryhmän uusia T-soluklooneja, joilla on hiukan erilaiset spesifiteetit.
Sen tutkimiseksi, ovatko samat aminohapot, jotka 20 tunnistettiin tärkeiksi HLA-DQ -molekyylin rajoittamien T-solukloonien peptidin tunnistuksessa, tärkeitä myös HLA-DR -molekyylin rajoittamien kloonien B ja I tunnistuksessa, syntetisoimme peptidien 42 ja 44 lyhennetyt muodot, kuten on esitetty taulukossa 2. Peptidit lyhennettiin sekä . 25 C- että N-päistä. Kuvion 17 tulokset vahvistavat sen, että
Ala ja Leu kaksoisaminohapot eivät olleet tärkeitä näiden T-solukloonien tunnistukselle. Molemmille klooneille Lys kohdassa 16 on ehdottoman tärkeä, koska tämän aminohapon poistaminen ehkäisi peptidiresponssin. Nämä kaksi kloonia 30 eroavat toisistaan niin, että niillä on erilainen tarve valiinin suhteen kohdassa 7 tämän aminohapon ollessa tärkeä kloonin B stimulaatiolle samalla, kun sen läsnäolo tuntuu vaikuttavan negatiivisesti kloonin I responssiin. Kuvion 17 tulosten perusteella minimipeptidit kloonien B
108139 25 ja I stimuloimiseksi ovat Val-Val-Val-Gly-Ala-Arg-Gly-Val-Gly-Lys ja Val-Val-Gly-Ala-Lys-Gly-Val-Gly-Lys.
Peptidiprosessoinnin selvittämiseksi syntetisoimme ras p21-peptidit, jotka sisälsivät tähteet 1-25. Oletet-5 tavasti nämä peptidit mahdollistavat luonnollisesti esiintyvien peptidien muodostuksen, kun ne on annettu APC-soluille. Tämän koesarjan tulokset on esitetty kuviossa 18. Kaikki kloonit kykenivät respondoimaan 1-25 -peptideille edellyttäen, että kohdissa 12 ja 13 oli läsnä oikea amino-10 happosubstituutio. Vertasimme responssia niiden peptidien vastaavaan, joita käytettiin primaarisessa stimulaatiossa, pitkät peptidit olivat tehokkaampia stimuloitaessa klooneja B ja F. Kloonit E ja I osoittivat päinvastaisen reak-tiivisuuskuvion. Nämä tulokset voivat osoittaa, että pit-15 kien peptidien prosessointi voi muodostaa peptidejä, jotka eroavat kloonien muodostukseen käytetyistä peptideistä.
Yhteenvetona tuloksista, jotka saatiin ainoastaan neljällä T-solukloonillamme: 1. T-solukloonit F ja E voivat tunnistaa peptidit 45, 41, 20 40, 39 (ja 37) ja peptidin 43, vastaavassa järjestyksessä.
Kloonit I ja B tunnistavat peptidit 42 ja 44, vastaavassa järjestyksessä, näin ollen yksittäisen luovuttajan normaalissa kokoelmassa läsnäolevista esiaste-T-soluista peräisin olevien T-solukloonien rajoitettu ryhmä voi tunnistaa : 25 kahta lukuunottamatta kaikki yleisimmät p21 Gly-12 ja Gly- 13 -ras-mutaatiot.
2. Peptidit voivat sitoutua sekä HLA-DR että HLA-DQ -mole-kyyleihin, koska peptidit tunnistetaan HLA-DR -molekyylin rajoittamalla (kloonit I ja B) ja HLA-DQ -molekyylin ra- 30 joittamalla (kloonit E ja F) tavalla.
3. Käyttämällä lyhennettyjä peptidejä olemme määritelleet mahdolliset minimisekvenssit, jotka tarvitaan HLA-DQ ja HLA-DR -molekyylien rajoittamien T-soluklooniemme stimulaatioon. Kaikki kloonit tarvitsevat ydinsekvenssin läsnä- 35 olon, joka sekvenssi sisältää kohdat 8 - 16 ja eroaa ai- 26 1 08 1 39 noastaan vähän tämän sekvenssin ympärillä olevien aminohappojen suhteen.
4. Sekä HLA-DQ» että HLA-DR -molekyylien rajoittamat kloonit voivat respondoida eri pituisille peptideille, jotka 5 ovat pituudeltaan ydinsekvenssistä aina 26 aminohapon pituisiin sekvensseihin asti.
5. T-solukloonimme ovat antaneet meille myös tärkeätä tietoa niistä peptideistä, joille ei ole olemassa reaktiivisia klooneja. Näin ollen blokeerauskokeet, joissa käy- 10 tettiin 25 - 50 -kertaista ylimäärää peptidejä ja klooneja E, F ja I respondoivina indikaattorisoluina, olemme osoittaneet kuvion 5 mukaisesti, että kaikki tämän kokeen synteettiset peptidit sisältäen peptidit, jotka sisältävät ras-mutaation aminohappokohdalla 61, kykenevät sitoutumaan 15 HLA-DQ -molekyyliin ja että useat peptideistä kykenevät sitoutumaan HLA-DR -molekyyliin.
Kun olimme saaneet aikaan responssit terveissä luovuttajissa primaarisella in vitro immunisaatiolla lyhyillä peptideillä (peptidit 42, 43, 44, 45) ja havainneet, että 20 T-solukloonit, jotka saatiin aikaan stimuloitaessa näillä peptideillä, kykenivät respondoimaan pidempien peptidien kanssa, jotka luultavasti vaativat prosessointia, tutkimme, voisivatko pitkät peptidit myös synnyttää T-solu-responsseja primaarisen stimulaation jälkeen. Näitä kokei-25 ta varten valitsimme normaalit luovuttajat, joilla oli sellaiset HLA-molekyylit, joiden ei aiemmin tiedetty sitovan ras-peptidejä. Näiden kokeiden tulokset on esitetty kuviossa 19. Peptidit 114 ja 115 kykenivät stimuloimaan spesifiset T-soluresponssit ja T-solukloonit, jotka tun-30 nistivat nämä peptidit, voitiin muodostaa massaviljel- mistä. Näin ollen peptidit, jotka sisältävät sekvenssin 1 - 25 ja myös aminohapposubstituutiot kohdassa 12, ovat myös immunogeenisiä. Tuloksemme osoittavat myös, että ras-peptidin responsiivisyys ei ole rajoittunut yhteen ainoaan 35 HLA-haplotyyppiin.
27 1 081 39
Ras-peptidin HLA-molekyyl±in sitoutumisen yleisen luonteen tutkimiseksi kehitimme sitoutumistestin peptidin sitoutumisen mittaamiseksi puhdistettuihin HLA-DR ja HLA-DQ -molekyyleihin. Ras-peptidien sitoutumisen vertai-5 lemiseksi standardiin, joka oli korkea-affiniteettinen sitova peptidi, tutkimme ensin radioaktiivisesti leimatun influenssaviruksen matriksipeptidin sitoutumisen inhibi-tiota puhdistettuihin HLA-DR1 -molekyyleihin. Taulukossa 11 esitetyt tulokset osoittavat, että kaikki testatut pep-10 tidit kykenivät sitoutumaan HLA-DR1 -molekyyleihin. Ras-peptidien sitoutumisen voimakkuus mitattuna kykynä inhiboida indikaattoripeptidin sitoutumista oli samanlainen kuin influenssaviruksen matriksipeptidin vastaava. Nämä tulokset vahvistavat T-solustimulaatioon käytettyjen pep-15 tidien sitoutumiskyvyn ja osoittavat myös, että ei-stimu-latoriset peptidit voivat sitoutua HLA-DR -molekyyleihin. Lisäksi, nämä tulokset ovat laajentaneet tietouttamme niin, että tiedetään niiden HLA-DR -molekyylien, jotka kykenevät sitomaan ras-peptidejä, sisältävän myös HLA-DR1 20 -molekyylin. Havainnot peptidin sitoutumisesta puhdistettuihin HLA-DQ -molekyyleihin vahvistavat solututkimuk-siamme ja esittävät ensimmäisen esimerkin peptidien suorasta sitoutumisesta puhdistettuhin HLA-DQ -molekyyleihin.
Tähän mennessä saadut havainnot osoittavat, että 25 ras-proteiinista peräisin olevien peptidien sitoutuminen voi olla yleinen ilmiö heijastaen ehkä HLA/T-solusysteemin tärkeätä valvontaroolia sellaisten solujen eliminoimisessa, jotka solut sisältävät mahdollisesti vahingollisia ras-mutaatioita.
30 On huomautettava, että T-soluresponssimme saatiin ilman ulkopuolisen IL-2 -proteiinin lisäystä soluviljel-miin, ja näin ollen ne riippuvat synteettisille peptideillemme luonnostaan kuuluvasta kyvystä indusoida spesifiset kasvuresponssit luovuttajan T-soluissa. Tämä tarjoaa suu-35 ren edun verrattuna viime aikaisiin menetelmiin, jotka 28 108139 perustuvat IL-2 -proteiinin suurien määrien käyttöön, jolla indusoidaan in vitro syöpäpotilaiden solujen kasvua, jotka solut ovat peräisin joko perifeerisestä verestä (LAK-solut) tai kasvaimeen työntyvistä lymfosyyteistä 5 (TIL-solut). Tämä epäspesifinen T-solujen (ja NK-solujen) aktivaatiotapa on vastuussa vakavista sivuvaikutuksista, joita havaitaan potilailla, joille on annettu hoitoa LAK-tai TIL-soluvalmisteilla.
Se uusi havainto, että normaalin yksilön T-soluko-10 koelma sisältää sellaisia T-soluja, jotka kykenevät spesifisesti tunnistamaan peptidit, jotka sisältävät useita ihmisen syövistä yleisesti löydetyistä ras-onkogeenin mutaatioista, on tärkeä syöpähoidon ja profylaktisella rokotuksella tapahtuvan syövän ehkäisyn kannalta. Lisäksi on 15 myös tärkeää, että kaikki ras-onkogeenin synteettiset peptidit kykenevät sitoutumaan HLA-geenituotteisiin, kuten peptidin blokeerauskokeet osoittivat.
Keskeisen tärkeää on alla esitetty havainto, että potilaan, jolla on kilpirauhasen follikulaarinen karsinoo-20 ma, perifeerinen veri sisältää lymfosyyttejä, jotka kykenevät muodostamaan klassisen muistiresponssin sellaista ras p21-proteiinin synteettistä peptidiä vastaan, joka peptidi edustaa yhtä yleisimmin tässä syöpätyypissä löydetyistä ras-mutaatioista. Sellaista responssia ei voida . ' 25 odottaa tapahtuvan, ellei potilaan T-solut ole altistuneet aiemmin samalle tai hyvin samanlaiselle peptidifragmen-tille in vivo. Sellaisen altistuksen voidaan helposti kuvitella tapahtuvan, jos potilaan syöpäsolu sisältää tämän aminohapon 61 spesifisen mutaation.
30 Ras-peptidin spesifisten T-muistisolujen osoittaminen syöpäpotilaissa:
Synteettiset peptidit, joita käytettiin ras-pepti-dispesifisten T-solujen indusoimiseksi primaarisella in vitro immunisaatiolla, rakennettiin ilman, että tarkoin 35 tunnettiin luonnollisesti esiintyvien ras-peptidien koos- • 29 1 081 39 turmista, jotka ras-peptidit muodostuvat, kun mutatoitunut-ta ras-geenituotetta prosessoidaan in vivo proteolyyttis-ten entsyymien toimesta.
Vaikka olemme osoittaneet, että kukin klooni osoit-5 taa spesifisyyttä yksittäisiä peptidejä vastaan, jotka peptidit edustavat erilaista ras-mutaatiota ollen muuten identtisiä, joka osoittaa, että aminohapot, jotka edustavat mutaatiomuotoja, muodostavat tärkeän osan siitä kohdasta, jonka T-solut tunnistavat ja että kukin klooni voi 10 tunnistaa useita eri pituisia peptidejä, jotka ovat peräisin samasta mutatoidusta tuotteesta, jää yksi keskeinen asia ratkaistavaksi. Jotta olisivat toiminnallisesti kyvykkäitä in vivo (nimittäin profylaktisissa ja terapeuttisissa tarkoituksissa), T-solut/kloonit, jotka on muodos-15 tettu stimuloiden spesifisesti synteettisillä peptideillä, täytyy spesifisyydessään mennä päällekkäin niiden peptidien kanssa, jotka ovat peräisin syöpäsoluista.
Niinpä testasimme PBMC-solut useista syöpäpotilaista, joilla oli sellaisia kasvaimia, joista oli julkaistu 20 korkeita ras-mutaation esiintymistiheyksiä, jotta olisimme löytäneet todisteita aiemmasta ras-proteiinista peräisin olevien peptidien tunnistuksesta (nimittäin T-muistisolu-responssit). Useista potilaista, jotka osoittivat todisteita aiemmasta T-solustimulaatiosta, yksi valittiin lisä- . . 25 tutkimuksia varten. Kuviossa 9 esitetyt tulokset osoit- • · tavat, että potilas, jolla oli follikulaarinen kilpirauhasen karsinooma, kykeni respondoimaan peptidiä 23 vastaan. Responssi muuttui synergistisesti lisättäessä ihmisen IL-2 -rekombinanttiproteiinia. Responssi vahvistettiin toi-30 sessa kokeessa (kuvio 10), jossa käytettiin korkeampaa solumäärää ja korkeampaa konsentraatiota peptidiä 23. Kun
• I
oli kulunut viikko stimulaatiosta peptidillä 23, viljelmä stimuloitiin uudelleen tällä kertaa viidellä erilaisella peptidillä, jotka olivat peräisin ras-proteiinista amino-35 happokohdan 61 ympäriltä. Ainoastaan peptidi 23 kykeni 30 1 08 1 3 9 stimuloimaan solut uudelleen osoittaen spesifisyyden olevan ainoastaan tätä peptidiä vastaan (kuvio 11). Potilaiden T-solukloonit muodostettiin kloonaamalla massaviljel-mästä uuden stimulaation jälkeen vuorokautena 3 käyttäen 5 menetelmää, joka on kuvattu kuviossa 1. Saatiin useita satoja T-soluklooneja ja neljän kloonin tulokset on esitetty kuviossa 12. Kloonit 10, 14, 15 ja 23 respondoivat kaikki voimakkaasti peptidille 23. Kloonit ovat HLA-DQ -molekyylin rajoittamia (inhibitio monoklonaalisella vasta-10 aineella FN81.1.1, kuvio 13 ja tulokset, joita ei esitetty), joka havaittiin peptidiblokeerauskokeista peptidillä 23 käyttäen HLA-DQ -molekyylin rajoittamaa kloonia E (kuvio 7). Peptidin 23 kyky saada aikaan voimakas T-solures-ponssi syöpäpotilaalla klassisessa T-muistisolutestissä 15 ehdottaa vahvasti, että T-solut ovat kohdanneet identtisen tai hyvin samanlaisen peptidin in vivo.
Tämän lisätutkimiseksi syntetisoimme ryhmän peptidin 23 lyhennettyjä muotoja ja testasimme niiden kykyä stimuloida kloonia 15. Kuviossa 14 esitetyt tulokset 20 osoittavat, että N-pään aminohapot Asp kohdassa 54 ja Ile kohdassa 55 ovat kriittisiä kloonin 15 tunnistukselle. Asp 54 aminohapon poistaminen alentaa vahvasti responssia ja Ile 55 aminohapon poistaminen ehkäisee responssin täydellisesti. Kuten kuviossa 14 on esitetty, klooni 15 ei ollut • t; 25 herkkä C-pään aminohappojen Asp 69, Arg 68, Met 67 ja Ala 66, poistamiselle. Ser 65 aminohapon poistaminen alensi vahvasti responssia. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että prosessoitu ras p21-peptidi, joka alunperin stimuloi nämä T-solut in vivo, on voinut sisältää lisäaminohappoja 30 ras-proteiinin N-päästä. Sen mukaisesti syntetisoimme uudet peptidit, joista puuttui useita C-pään aminohapois-ta, joiden ei havaittu ottavan osaa T-solun tunnistukseen, mutta jotka sisälsivät uudet aminohapot Leu 53, Leu 52 ja Cys 51, jotka olivat peräisin luonnollisesta ras p21-sek-35 venssistä. Tulokset, jotka osoittavat kloonin 14 stimulaa- 108139 31 tion tällä peptidiryhmällä, on esitetty kuviossa 15. Optimaalinen stimulaatio havaittiin peptidillä 106, joka sisältää sekvenssin 51 - 67. Havainto, että jopa vahvempi responssi saadaan aikaan peptidillä, jossa on sekvenssi, 5 joka eroaa merkittävästi peptidistä, jota käytettiin kloonin syntymiseen käytettyjen T-solujen in vitro stimulaatioon osoittaa vahvasti, että peptidi 106 edustaa enemmän sellaista peptidiä, joka syntyy syöpäsolun prosessoinnilla ja joka alunperin muodosti immuuniresponsein, kuin peptidi 10 23.
On huomattavaa, että potilaan syöpätyyppi on ainoa sellainen, jossa kohdassa 61 tapahtuneiden ras-mutaatioi-den on julkaistu tapahtuvan korkealla esiintymistiheydellä.
15 Näin ollen on osoitettu, että mutatoidun ras-pro- teiinin prosessointi in vivo täytyy johtaa peptideihin, jotka ovat hyvin samanlaisia tai jopa identtisiä tämän keksinnön mukaisesti valmistettaville synteettisille peptideille. Synteettisten peptidien käyttö jo olemassa ole-20 van syöpäpotilaiden T-soluresponssin tehostamiseksi in vitro on näin ollen hyvin mahdollista. Sellaisia in vitro laajennettuja ras-spesifisiä T-solupopulaatioita voidaan käyttää ras-mutaatioita sisältävien kasvainsolujen poistamiseen potilaasta parannetulla LAK/TIL-solumenetelmällä.
. 25 Käyttäen käytettävissä olevia syöpäpotilaan onko- geenispesifisiä T-soluja halusimme seuraavaksi tutkia sellaisten solujen mahdollista roolia syöpäsolujen kasvun säätelemiseksi in vitro. Sen mukaisesti testasimme Leu 61 -spesifisen T-solukloonin 14 vaikutuksen ihmisen paksusuo-30 lenkarsinoomasolulinjan HT29 kasvuun in vitro. Tämä solu- linja voidaan indusoida ekspressoimaan samoja HLA-DQ -mo-* lekyylejä solun pinnalle kuin joita löydetään syöpäpoti laasta sen jälkeen, kun on altistettu IFN-Γ -rekombinant-tiproteiinille. Kuvion 20 tulokset osoittavat, että IFN-Γ 35 -proteiinilla käsiteltyjen syöpäsolujen, joita oli 32 '087 39 esi-inkuboitu onkogeenisen pep.tidin 106 kanssa, kasvu inhiboitu! voimakkaasti sellaisen T-solukloonin läsnäollessa, joka klooni tunnistaa tämän peptidin HLA-DQ -molekyylin yhteydessä. Inhibitio riippui viljelmään lisättyjen 5 solujen määrästä ja käytetystä peptidikonsentraatiosta. Kontrollisyöpäsoluihin, joita käsiteltiin ainoastaan IFN-Γ -proteiinilla, tämän kloonin läsnäololla ei ollut mitään vaikutusta. Toiminnalliset tutkimukset osoittavat edelleen keksinnön mukaisten peptidien käyttökelpoisuuden syövän 10 hoitamiseksi.
Synteesit
Peptidit syntetisoitiin käyttäen jatkuvavirtauk-sista kiinteän faasin peptidisynteesiä (Biolynx 4170 -syntetisaattori, Pharmacia, LKB). Käytettiin N-a-Fmoc -amino-15 happoja sopivilla sivuketjusuojauksilla (Ser(tBu), Thr(tBu), Lys(Boc), His(Trt), Arg(Pmc), Cys(Trt), Asp(0-tBu), Glu(O-tBu)). Fmoc-aminohapot aktivoitiin TBTU:lla ennen koplausta. Fmoc:in selektiiviseen poistamiseen kunkin koplauksen jälkeen käytettiin DMF:ssä olevaa 20 % pi-20 peridiiniä. Resiinin irrotus ja sivuketjusuojauksen lopullinen poistaminen suoritettiin 95 % TFAilla (vesipohjainen). Peptidit puhdistettiin ja analysoitiin käänteisfaa-si-HPLC:lla (C18)(Shimadzu LC8A). Aminohappoanalyysi suoritettiin käyttäen PICO-Tag -menetelmää (Waters Millipore, : 25 Inc.).
Seuraavat peptidit ja peptidifragmentit syntetisoitiin tällä menetelmällä: AI) Seuraavan sekvenssin sisältävät ras-peptidit, joissa on pistemutaatiot kohdissa 12 tai 13: 30 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
Leu-Val-Val-Val-Gly-Ala-Gly-Val-Val-Gly-Lys-Ser-Ala-Leu »
Muut syntetisoidut peptidit, joilla oli normaalin ras-peptidin 1-25 -sekvenssi, mutta joilla oli mutaatiot kohdassa 12 tai 13, esitetään taulukossa 8.
33 108129 A2) Seuraavan sekvenssin sisältävät ras-peptidit, joissa on pistemutaatiot kohdassa 12 tai 13 ja lisäaminohapot yhdessä päässä, jotka lisäaminohapot eivät sisälly ras-proteiinien normaaleihin sekvensseihin: 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
Leu-Val-Val-Val-Gly-Ala-Gly-Gly-Val-Gly-Lys-Ser-Ala-Leu-Ala-Leu
Leu-Val-Val-Val-Gly-Ala-Asp-Gly-Val-Gly-Lys-Ser-Ala-Leu-Ala-Leu
Leu-Val-Val-Val-Gly-Ala-Val-Gly-Val-Gly-Lys-Ser-Ala-Leu-Ala-Leu
Leu-Val-Val-Val-Gly-Ala-Cys-Gly-Val-Gly-Lys-Ser-Ala-Leu-Ala-Leu
Leu-Val-Val-Val-Gly-Ala-Ser-Gly-Val-Gly-Lys-Ser-Ala-Leu-Ala-Leu
Leu-Val-Val-Val-Gly-Ala-I»ys-Gly-Val-Gly-Lys-Ser-Ala-Leu-Ala-Leu
Leu-Val-Val-Val-Gly-Ala-Arg-Gly-Val-Gly-Lys-Ser-Ala-Leu-Ala-Leu
Leu-Val-Val-Val-Gly-Ala-Ala-Gly-Val-Gly-Lys-Ser-Ala-Leu-Ala-Leu
Leu-Val-Val-Val-Gly-Ala-Gly-Val-Val-Gly-Lys-Ser-Ala-Leu-Ala-Leu .c Leu-Val-Val-Val-Gly-Ala-Gly-Asp-Val-Gly-Lys-Ser-Ala-Leu-Ala-Leu lo A3) Seuraavan sekvenssin sisältävät ras-peptidit, joissa 20 on pistemutaatiot kohdassa 12 tai 13 ja joiden N- tai C-päät on lyhennetty: 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Val-Val-Val-Gly-Ala-Ala-Gly-Val-Gly-Lys-Ser-Ala . . 25 Val-Val-Gly-Ala-Ala-Gly-Val-Gly-Lys-Ser-Ala
Val-Val-Val-Gly-Ala-Ala-Gly-Val-Gly-Lys-Ser Val-Val-Gly-Ala-Ala-Gly-Val-Gly-Lys-Ser Leu-Val-Val-Val-Gly-Ala-Ala-Gly-Val-Gly-Lys-Ser-Ala Leu-Val-Val-Val-Gly-Ala-Ala-Gly-Val-Gly-Lys-Ser Leu-Val-Val-Val-Gly-Ala-Ala-Gly-Val-Gly-Lys 30 Leu-Val-Val-Val-Gly-Ala-Ala-Gly-Val-Gly
Val-Val-Val-Gly-Ala-Ala-Gly-Val-Gly-Lys-Ser-Ala-Leu-Ala-Leu
Val-Val-Gly-Ala-Ala-Gly-Val-Gly-Lys-Ser-Ala-Leu-Ala-Leu
Val-Gly-Ala-Ala-Gly-Val-Gly-Lys-Ser-Ala-Leu-Ala-Leu
Gly-Ala-Ala-Gly-Val-Gly-Lys-Ser-Ala-Leu-Ala-Leu 35 108139 34
Ala-Ala-Gly-Val-Gly-Lys-Ser-Ala-Leu-Ala-Leu
Leu-Val-Val-Val-Gly-Ala-Gly-Val-Val-Gly-Lys-Ser-Ala Leu-Val-Val-Val-Gly-Ala-Gly-Val-Val-Gly-Lys-Ser Leu-Val-Val-Val-Gly-Ala-Gly-Val-Val-Gly-Lys 5 Leu-Val-Val-Val-Gly-Ala-Gly-Val-Val-Gly
Val-Val-Val-Gly-Ala-Gly-Val-Val-Gly-Lys-Ser-Ala-Leu-Ala-Leu Val-Val-Gly-Ala-Gly-Val-Val-Gly-Lys-Ser-Ala-Leu-Ala-Leu Val-Gly-Ala-Gly-Val-Val-Gly-Lys-Ser-Ala-Leu-Ala-Leu Ala-Gly-Val-Val-Gly-Lys-Ser-Ala-Leu-Ala-Leu 10 B) Ras-peptidit, joissa on mutaatio kohdassa 61: 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69
Asp-Ile-Leu-Asp-Thr-Ala-Gly-Leu-Glu-Glu-Tyr-Ser-Ala-Met-Arg-Asp Asp-Ile-Leu-Asp-Thr-Ala-Gly-Arg-Glu-Glu-Tyr-Ser-Ala-Met-Arg-Asp 15 Asp-Ile-Leu-Asp-Thr-Ala-Gly-Lys-Glu-Glu-Tyr-Ser-Ala-Met-Arg-Asp
Asp-Ile-Leu-Asp-Thr-Ala-Gly-His-Glu-Glu-Tyr-Ser-Ala-Met-Arg-Asp 20 C) Abl-bcr -fuusiogeenin peptidi:
Ile-Pro-Leu-Thr-Ile-Asn-Lys-Glu-Glu-Ala-Leu-Gln-
Arg-Pro-Val-Ala-Ser-Asp-Phe-Glu .. 25 Ala-Thr-Gly-Phe-Lys-Gln-Ser-Ser-Lys-Ala-Leu-Gln-
Arg-Pro-Val-Ala-Ser-Asp-Phe-Glu D) Egf-reseptoripeptidi ja retinoidireseptoripeptidi: 30
Ser-Arg-Ala-Leu-Glu-Glu-Lys-Lys-Gly-Asn-Tyr-Val-
Val-Thr-Asp-His-Gly
Leu-Ser-Ser-Cys-Ile-Thr-Gln-Gly-Lys-Ala-Ile-Glu-
Thr-Gln-Ser-Ser-Ser-Ser-Glu-Glu 35 '08139
—<1111111 II Q| I I I I
3 ! ! 1 ! ! ! ! ! ! <11!! ^ j ! ! i1 I ! ! ! o* 1 1 1 1 -p ill II < I ' ' ' a
Tilli II I I I I I I
3.111 II ·*-* I I t I <0 5111.111 '1 52!!! 2 ij I I I I I I I ! ! ¥ •P π3 I I I I I I I 11 2 Z?
•H . , I I I I I I II ·—I lilt H
•3 ill II <1111 9
Tl I I I I i i 1 I II I I I I I I
O, }_| I I t I iti il HI'·· CU <V) , I I I f I t II 0)111 Ä ft $ I , 1 I I I II to I I 1 I ft
' I I I I I I I I II I I I I I I
w I 1 I I I i i || sL ! ΐ ΐ I «π 3 ! ! ! ! ! ! ! ! 31111 3 S >.i!iiiii » 3 ! j ! ! ,2 rH I I I I I I I II n 4-1 rn i i I -1 ι i * 11 Uiiil γ Φ T llllll II I I I ' ' ' .2 Λ I I . I . I I II =>'11' g +! ίο ι ι ι ι ι ι ι 1 ι -11111 j
4-) >1111111 II Olli I T
0) I I I I I I I I II I I I I I I
Ä >,1111111 Ha c D> W 3 w £
C H I I I I I I I « W i i· "t1 2 i U
>, OIIIIIII >< ϋ < j J ι γ tn IIIIIIII.II ι ι ι ι ι '
,, >,£Xhwv4WO>(0 >ii >11'· jS
S, HWlö>,a)>iMH HI ^ ' <
jj 0<>UWt-3<< a I o t I I I T
<u Till I 1 I I '1 I I I ' ' λ γ miiii'ii ii <o ' ' ' 1 2 ,—1 tllllll II rH I I I I rj
2 <1111111 II ..<1111 "I
.. IIIIII'I^'I ill'll P CL
C 4-) >, I I I I I I I 0 ' 1 -H P 1 ! ! ! ° w o o ·—I I I I I I I I -Η ι I 4J.CIIII +4,,.
-. · 2 ‘Jj u I ι I I I ' ' ti 1 I Ό Η ι ι ι ι m ι . Tl t< I I I I I I I ι 2 I 1 Π3 I I I I I (Ö ' idSniiiii.ijSii -ΰαιιιι p g <04-)f0lllllll3ll gwilll 3¾
Hg>iiiiiiiBii ι < I I I I IT
§?iiiiiiii|ii ' I I I ' ο- -H H I I I I I I I II 3 1 ι ι ι H ,2.
4JC4(13IIIIIIIHII H <D I I I I ,n Γ) (0rH>IIIIIIIHII U3JIIII 7 g > λ ; ι ; ί ι ι >1 ί i eli : :: g g* +4 H fö I I I I I I I-—Il I H H I I I I j
H u > I I I I ι ι ι O I I OHI I I I T
> I I I I I I I I II lllll A, C-HZJIIIIIIIHII H a I I I I CMQ)
2 (M a I I I I I I I fM I I fM w I I I I q T
<H OiJlllllllCyil Oj <1111 e O d) S p ** O ιΉ * *· ** ** ** ** "* ** *" *" * Π\ A 0 Γ^οοσ\θτΗΓΜ^ιη n κο γν o rH r-> ^ ^ Σ3 W rn m rn ^ ^ e ^ c\i cm po 04 oj , g ^ aaaaaaaa aa aaaaa ^ 108139 36 -μ
•H
Ή
Tj > 3 3 3 3 3 -t-1 ο) φ α) ο) <υ ο)
%> -J J J Ο J J
S I ιιιιι 7* ra ra ra ra ra 3
. r~~i' r—( r—l y—A r—\ rH
" < < < < < < νί I 1 1 1 1 1 Λ .3 3 33333 m © © 0) <U Q) 0) 0)
(W k-«>J t-3 tj »J »J
2 11 I I I I I
fö <0 fö CJr3/3f0f3 [ \ T~^ r-ί rH *—i »H r—i >, < < < <<< <<
jj III I I I I I
m U U U U U M/rt
g aidlQJQJ Q)Q)CJ(1)Q) *3 *V
fi to to to to to to to to to [J
S I I I I I I I I I II
>ί >1 >t >1 >Λ ^^^^^0)0)0)0) 3 73 71 f ^ ^ ^^^J^totocoto i ' 1 I I i I I ! I i 1 I , ^ ^ ^ ^>1 ^ Σ>Ί ΞΗ Σ>Ί W U) {/) ti)
>1 *“' *3 1 I »3 1—( f—i r—i t—{ *—t r—i r-( S~ ·>. K
+J OOOUOOOOOOO^IiJlJJ
© <111)1111111111 +j * * ’—· ’—< ’—I ’—1 '—< ,—t ·—< ·—1 <—I >-< >~i 3»-^ rararararararararararar-ii-ir-Hr-i :[Ö >>>>>>>>>>>0000 X 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
. -3 —It—|r—I
•ra *3iH.—li—|,-Ii-(i-(r-l<-i«3i—110<βΐβ(0 55 ooooooooooo>>>> 55 1 1 1 1 1 1. 1 1 1 1 1 1 . 1 1 1
3 raiSflrararanJQrjrörai^^i^iN
^-1.3.-1,-1,-1.-1.-1.-1.-11-11-131-11-113
t <<<<<<<<<<<OOOO
ω I 1 I I 1 1 I 1 Ί 1 I I 1 I I
Jj rarar3ro<0f3i3r3i3förararararÖ ra *f:'f:<<<<<<<<<'f,f'f<'ic +j ''iiiiiiiiiJ·'·
w y—Λ t—4 f—-I ,—f _j _j _j _j _j J.--1 r' rH r-H
W CJOOOOOOOOO Y ^ ra <<<1111111 ΛΛΛΛ • rarararararararara μ 'iiiiiiii ΛΛΛΛ -H id <0 ra ra > > > > t > > ξ > > > > >
. 1 ί ί ί ί ί .- ί ί Λ JL
C ·—< ·—< ,—< ,—t ,—I —t ,* -rt 3 ra ra ra . ra ra ra ra ►> ·< ra <<11111 ora 3333-33 [? ra ra 0 q) Q) q)
. *_J « I
rai 0
3 53 Ln-c-inor'Cooo^rMncocnorH
S 3 η^Λ!νΓ'Γ'':,Γ'^Γ'Γ''0β)0'θ' ra.aaao.aac.acL.aa.aaa 37 1 08 1 39 3 3 3 0 3 3 3 0 O t-3 O) Q) ¢)
^ I ,3 »-3 ,-J
1 ΙΟΙ I I
5 2 2 2 2 2 3333 < < i < < < ,32,35
1 3 i § 2, J, 2, I ΐ I I
2 2 2^222 2 2 2 2 T f f .rä f f 2 ? f f f 222 2 < 2 2 2 Λ 10 3333
ίίί fsL'ff'f'3* < >J «J J rJ
•li I M I I I I 1 I 1 I 1
t-l J-ι U !-i UOSjUS-i^i j_| j_, ί_! ItJlOrtJiH
<UO00 Ot/iOOOO OOO 2222 0 w to to witoioww www < < < <
1 I I I I M I I I I III I I I I
to to to tn to to >, to in tntotntntntntn'i-HMMVH
rj ,_) J J __ *-3 I JJ>-3>-3iJ,J,_!,-3iJWWWW
I I I I I I >, I I 1 I I I I I I I I I I
>1 >, >,>,>,>i>i>i>,tn in w in
♦“H »—( »H »—{ r-S rH iH U r—( r—< r—-( rH rH rH pH rH rH pH
ΟϋΟϋϋϋΟ I OUOUI?OUOOh3»4^v4
I I 1 l I I I «—( I I I I I t » I I I 1 I I
•-H »-HrHrH»—l*—(rH Γ3 Ή r—( (i-Hi-HrHrHi-Hi—I >i >1 >1 >1
Φίϋίΰί3ΐ3:3Γ3>(3ί3 r3rtJ<Ö<0fl3<ÖfQrHrHrHr-H
>>>>>>> 1 >> >>>>>>>oooo t llllll—til ,1111111111
*H »—I *—I r—t *-t ·—l ·—I r3 rH rH
ro ns ra ns ro ra a > ra ra -3r?,-<rdr^'_,rH3'J,,JI,s'0 >>>>>>> 1 >>>9999999999
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I
u oooouuouo 07^^7999999 1 * 1 * 1 * 1 1 1 1 ill'' 2 22222 2· 2222*"***" " m m ( ll llfllt. 1 1 .......
iririririririririr ^ 2222222222 „ 2222222222 9 VV??????? • § r^^-L_L.ii_L_L.LJ_. 1 rHrHrHrHr-Hr—(
• P rH»-HrHrH^HrHf-(pHpH (OiOiÖrtiiOiTJrHpHrHrH
24 iOiOfljrtfadflfOfO >>>>>>OUUO
•P >>>>>>>>> I I I t I 1 I I 1 1
(Ö * t I 1 I I I I | «—( i-H »H rH rH f—( rH rH rH rH
•i—1 ·—· —1 ·—* ·— *—r ·—1 ·—* —1 rararararararararara rararar. rararara >>>>>>>>>> 1 >>>?>>>> I I I I I I I I 1 1
I I I I I I I J r—I rH H H r—H rH rH rH rH rH
*HrHrHrH-rHr^rH <0<ΟΛ(0<ΟΠ)Π3ΐΟΐΟίβ rarararararara >>>>>>>>>> >>>>>,>> 1 1 1 I I 1 1 1 O lllllll 3 3 3 3 3 3 ^ Ή M 333333 oooooora ra yt 00)0) 0)0)0 ij J ,J J J ,J > > 3 j j j o j j
iH
H 0,Η<Ν)ηΗ·ιΠΗ·ΙΛνΟι^ . £ rracorHrvn-rt.TOr-e^-iTrTr^.rrintninin
"j Jf.OOtOSOtOOOvO.HrHfH.H.-ir-lr-I.HrH.H
H ^ααα^α^ααιχΟτΟτααοτΟτααο,Οτο, 38 108139 3 3 ω <ΰ ι ι (Ο ti
fH rH
< <
I I
3 3 Φ Ο) α ^
I I
s >ι ti m
rH γΗ »H rH
ο ο < <
I I II
rH rH rH rH P| V-| ti ti ti ti Φ 0) > > > > w w
I I I I I I
>1 >1 >1 >1 w tn rH fH ι-H rH i>-< 0 O O O »3 »3
1 I I I I I
tr en tn tn >i N
M U >1 >, rH rH
«C C J J O O
I I I I I I
ti ti ti ti rH rH
rH rH rH rH ti ti <;<<;<>> ι ι ι ι ι ι >i >, >1 >1 >1 >i
rH f—I rH rH rH rH
0 O O U O O
1 I I I I I
ι—ι rH rH rH tn tn ti ti ti ti >h >i > > > > ,3 »3
3 I I I I I I
3 f—I rH f—I rH ti <0
Λί li li li It) rl H
-p >>>>«<
Iti I I I I I I
’I 1 ι—I rH f—I Ή ί>ι rH
ti ti ti fl f-H rH
ι > > > > a o
I I I I I
CM 3 3 3 3 -I
; Λ a) o) o) a) ti o pj j ^ p) > A< 3
^ f" CO σι O rH (M
3 Γ" r-* t" oo co oo
ti H rl rl rl rl rH
^ a a a, a a Of 39 1 08 1 39
Taulukko 3
Primaariresponssi Responssi kolmannen stimulaation jälkeen peptidiseoksella 111
5 CPM CPM
PBMC 9798,8 3666,1 PBMC + IL-2 14060,7 29768,4 PBMC + pepti- diseos III 9027,7 21706,9 10 PBMC + pepti- diseos III 14365,0 44909,8 PBMC: 100 000 solua per kuoppa IL-2: 1 yksikkö/ml lopullista laimennosta 15 Peptidiseos III: 20 pg kutakin viidestä peptidistä 42, 43, 44, 45, 46.
Taulukko 4 20 Kloonien spesifisyys 16 kloonia 45 kloonista osoitti spesifisyyttä peptidiseok-selle tai yksittäiselle peptidille.
Peptidi 42 2/45
Peptidi 43 9/45 25 Peptidi 44 1/45
Peptidi 45 1/45
Peptidi 46 0/45
Peptidiseos 3/45 4 40 1 081 39
Taulukko 5
Esimerkkejä ihmisen kasvaimista löydetyistä onkogeeneistä ja kasvaimen suppressorigeeneistä.
Proto-onkogeeni Kasvain (kasvaimet) Mutaatio 5 _ abi krooninen myelogeeninen translokaatio leukemia gip munasarjan ja lisämunu- pistemutaatiot nuaisen karsinooma 10 gsp aivolisäkkeen adrenooma; pistemutaatiot kilpirauhasen karsinooma H-ras paksusuolen, keuhkojen pistemutaatiot ja haiman karsinooma; melanooma 15 K-ras akuutti myelogeeninen ja pistemutaatiot lymfoblastinen leukemia; kilpirauhasen karsinooma; melanooma N-ras virtsa- ja sukupuolielin- pistemutaatiot 20 ten ja kilpirauhasen karsi nooma ; melanooma ret kilpirauhasen karsinooma uudelleen j ärj estyminen trk kilpirauhasen karsinooma uudelleen .. 25 järjestyminen • ·
Kasvaimen suppressorigeenit rbl retinoblastooma; osteo- pistemutaatio 30 sarkooma; rinnan, virtsa rakon ja keuhkojen karsi- * nooma p53 astrosytooma; rinnan, pak- pistemutaatio susuolen ja keuhkojen kar-35 sinooma; osteosarkooma 41 108139
Taulukko 6 H-, K- ja N-ras p21-proteiinien aminohappojen 1-26 sekvenssi: 5 Met-Thr-Glu-Tyr-Lys-Leu-Val-Val-Val-Gly-Ala-Gly-Gly-Val-
Gly-Lys-Ser-Ala-Leu-Thr-Ile-Gln-Leu-Ile-Gln-Asn H-, K- ja N-ras p21-proteiinien aminohappojen 45-72 10 sekvenssi:
Val-Ile-Asp-Gly-Glu-Thr-Cys-Leu-Leu-Asp-Ile-Leu-Asp-Thr-
Als-Gly-Gln-Glu-Glu-Tyr-Ser-Ala-Met-Arg-Asp-Gln-Tyr-Met 15 R-ras p21-proteiinien aminohappojen 53 - 67 sekvenssi: Leu-Asp-Ile-Leu-Asp-Thr-Ala-Gly-Gln-Glu-Glu-Phe-Gly-
Ala-Met 20 > » 42 losing
Li, CL, I I I t
> M I I ' I
V f fill! 3 1 O'1 I I I I CT> H £5 C) I t 1 I m u n <1111 <
I Y I I I I I I
3 1 -P I I -Pilli -P -p "p 0)11 0)1111 0) 0 οΤί ειι ειιιι s s
p Y Y III tilli II
-H 3 1 (Oil (OIIII (01(0
T3 m jj, ·“I I t «—11111 ,—( I H
-HJt <11 <1111 <l<
p 7 7 III I I I I I III
a s, ί M I I M I I Mill! M I I M
0 ,7 Q)iiQ)ii q)iiii oiiia)
CL13 Mi CO I I CO I I CO I I I I W I I M
1 I Y I I I I I I I I I I I I I I I
H (0 L M I I M I I Milli M I I I M
(N H Jp >1 I I >1 I I >,1111 > ι ι ι > a < 3 HIIHII Hllll E-< I · I e-·
I 7 I I I I I I I I I I I I I I I I
ω M u CJ I I C3 I I ., 3 I I I I Silli (Ox; 2 ,—I I I »—I I I "Jr? f—1 till >—f ι ι ι i
Μ Η £ OIIOII ÄOIIII OIIII
I I I I I I I I »IIIII I I I I I
•p a o, siisii 'siiii siiii >ί V) -HI I -H I I r-l I I I I Hllll -p < % OIIOII 7301111 Ollll a) I , ι ι ι ι ι ι <ιιιιι iiiii C s S SIISII SIIII silll ö a) m q)iiq)ii £701111 qjiiii 2 PJ /3 PJIIJII .¾ PJ I 1 I I Plllll
-C I I llllll V IIIII IIIII
>h 0 0) > I I >, I I '>,1111 >1111 1 ι—I .—ι H I 1 -—I I I H <—I till -H till , h u_i oiioii Pr1 oiiii oiiii
P I 7 llllll V IIIII IIIII
>1 a Q, (011(011 1(0111(0 (OIIII
-P m m -HI I -H I I R -—I I I I -H Hllll 2 < < <ll<ll 73<lll< <1111
P I I llllll γιιιι IIIII
S s Ml I M I I 1 M I I M Milli •2 ο) ο) x: ι ι x: ι ι s x: ι ι x xiiiii PI P] HIIHII rij E—« 1 I Eh Hllll
I I llllll Y I I I IIIII
·£ 3 s a ι ι a ι ι 1, a ι a a ι ι ι t 2 Q) q) miirnii tn ι in ωιιιι 2 PI pi <ii<ii m3<i< <iiii
71 I llllll Y I I IIIII
2 a a siisii Iss siiii 7: U) W 0)110)11 li 0) 0) qjiiii “ < < PI I I PI I I 3 P P *-3 I I I 1
2 I I llllll 71 IIIII
p3s 0)110)11 «, 0 0)1111 r-< 2 0) -—I I I -—) I I r* -—t -—) till Π PI J ΗΙΙΗΙΙ H Hllll
p'l llllll 7 IIIII
£ 2 s-patiati a, aaaaa.
ω 2 0 0 in 1 1 in 1 1 ω tn tn in w in to Y PI £ < ι ι < ι ι a- <<<<< X 1 , I I llllll 7 ί?·Ρϋ)(0 SISSIS 3 0)10)0)10) 0)
O V S O < P I JP I P PI
U '.....I I
P M(0mM SS SS 0)
•H 0)0 00 H
: >eh<hwppip)pih
II I I I
3 3 M 0 0 a H n m > > w r- u ω O O < c 0 0 W ·(—! « s Ή PI 0 ^ ** ............ ·· *......... ..........
O 0 “"* O M CD C7N O H CO ^ LT O MO O C H (M n < ι pi 00 oooohh co cTicrvCNcr-cri σ,οοοο r 1 Eh Eh ' -—! -—( h h *—) *—t H <h -—1 »—j , ^ a a a a a a a a a aa a a aaaaa, 43 1081S9
Taulukko 8 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 P 112: Met-Thr-Glu-Tyr-Lys-Leu-Val-Val-Val-Gly-Ala- 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 5 Gly-Gly-Val-Gly-Lys-Ser-Ala-Leu-Thr-Ile-Gln- 23 24 25
Leu-Ile-Gln 123456789 10 11 P 113: Met-Thr-Glu-Tyr-Lys-Leu-Val-Val-Val-Gly-Ala- 10 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
Val-Gly-Val-Gly-Lys-Ser-Ala-Leu-Thr-Ile-Gln- 23 24 25
Leu-Ile-Gln 15 123456789 10 11 P 114: Met-Thr-Glu-Tyr-Lys-Leu-Val-Val-Val-Gly-Ala- 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
Lys-Gly-Val-Gly-Lys-Ser-Ala-Leu-Thr-Ile-Gln- 23 24 25
Leu-Ile-Gln 20 123456789 10 11 P 115: Met-Thr-Glu-Tyr-Lys-Leu-Val-Val-Val-Gly-Ala- 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
Arg-Gly-Val-Gly-Lys-Ser-Ala-Leu-Thr-Ile-Gln- 23 24 25 25 Leu—He—Gin • 123456789 10 11 P 116: Met-Thr-Glu-Tyr-Lys-Leu-Val-Val-Val-Gly-Ala- 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
Ala-Gly-Val-Gly-Lys-Ser-Ala-Leu-Thr-Ile-Gln- 30 23 24 25
Leu-Ile-Gln
• I
123456789 10 11 P 117: Met-Thr-Glu-Tyr-Lys-Leu-Val-Val-Val-Gly-Ala- 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 35 Ser-Gly-Val-Gly-Lys-Ser-Ala-Leu-Thr-Ile-Gln- 23 24 25
Leu-Ile-Gln 44 7 °8 7 39
Taulukko 8 - jatkuu 1 2 3 4 5 6 7 ' 8 9 10 11 5 P 118: Met-Thr-Glu-Tyr-Lys-Leu-Val-Val-Val-Gly-Ala- 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
Cys-Gly-Val-Gly-Lys-Ser-Ala-Leu-Thr-Ile-Gln- 23 24 25
Leu-Ile-Gln 10 123456789 10 11 P 119: Met-Thr-Glu-Tyr-Lys-Leu-Val-Val-Val-Gly-Ala- 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
Asp-Gly-Val-Gly-Lys-Ser-Ala-Leu-Thr-Ile-Gln- 23 24 25
Leu-Ile-Gln 15 123456789 10 11 P 120: Met-Thr-Glu-Tyr-Lys-Leu-Val-Val-Val-Gly-Ala- 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
Gly-Val-Val-Gly-Lys-Ser-Ala-Leu-Thr-Ile-Gln- 23 24 25 20 Leu-Ile-Gln 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 P 121: Met-Thr-Glu-Tyr-Lys-Leu-Val-Val-Val-Gly-Ala- 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
Gly-Asp-Val-Gly-Lys-Ser-Ala-Leu-Thr-Ile-Gln-25 23 24 25
Leu-Ile-Gln * 45
Taulukko 9 ^ ^ 8 1 3 9 P158 Val-Ile-Asp-Gly-Glu-Thr-Cy's-Leu-Leu-Asp-Ile- 5 Leu-Asp-Thr-Ala-Gly-Leu-Glu-Glu-Tyr-Ser-Ala-
Met-Arg-Asp-Gln-Tyr-Met P166 Val-Ile-Asp-Gly-Glu-Thr-Cys-Leu-Leu-Asp-Ile-
Leu-Asp-Thr-Ala-Gly-Arg-Glu-Glu-Tyr-Ser-Ala-Met-Arg-Asp-Gln-Tyr-Met 10 pl68 Val-lle-Asp-Gly-Glu-Thr-Cys-Leu-Leu-Asp-Ile-
Leu-Asp-Thr-Ala-Gly-Lys-Glu-Glu-Tyr-Ser-Ala-Met-Arg-Asp-Gln-Tyr-Met 15 pl67 Val-Ile-Asp-Gly-Glu-Thr-Cys-Leu-Leu-Asp-Ile-
Leu-Asp-Thr-Ala-Gly-His-Glu-Glu-Tyr-Ser-Ala-Met-Arg**Asp-Gln-Tyr-Met 20
Taulukko 10
Klooni Peptidispesifisyys Responssin blokeeraa 25 B P-115 Monoklonaalinen anti- HLA-DR -vasta-aine KB16 P-115 Monoklonaalinen anti- HLA-DQ -vasta-aine 30 KBll P-115 Monoklonaalinen anti- HLA-DP -vasta-aine 46 1 081 39
Taulukko 11
Peptidien sitoutuminen affiniteettipuhdistettuihin HLA-molekyyleihin
Peptidit Sekvenssit Tulokset 5 DQw6 DR1 IC50(/XM) IC50(mM) P112 MTEYKLVVVGAGGVGKSALTIQLIQ 6,02 1,21 P113 V------------- 8,97 0,78 P114 K------------- 2,53 0,55 PH5 R------------- 2,78 0,24 P116 A------------- 2,68 0,44 10 P117 -----------S------------- 1,91 <0,11 P118 C------------- 10 1,75 P119 D------------- 3,03 1,10 P120 GV—---------- 7,31 0,74 P121 D------------ 2,74 0,31 P88 WGAAGVGKS 8,97 15 P89 V---------- 10 P90 ----------A 9,98 P91 ------------ 1,29 P45 L------------LAL 0,9 0 P104 Y------------ <0,33 0,78 20 P34 S GPLKAEIAQLE Y »10 0,15 • 25 Peptidien sitoutuminen affiniteetipuhdistettuihin HLA-molekyyleihin testattiin niiden kyvyn suhteen inhiboida radioaktiivisesti leimatun indikaattoripeptidin sitoutumista. Kun testattiin peptidien sitoutumista DQw6-molekyyliin, käytettiin indikaattoripeptidinä jodeerattua 30 P104-peptidiä, kun taas testattaessa peptidien sitoutumis-. ta DR1-molekyyliin, indikaattoripeptidinä käytettiin jo deerattua P34-peptidiä (peräisin influenssaviruksen mat-riksiproteiinin aminohapoista 17 - 29). Taulukossa on esitetty indikaattoripeptidin sitoutumisen 50 % inhibitiokon-35 sentraatio (IC50). Alhainen IC50 tarkoittaa hyvää sitoutu-
Claims (5)
- 47 108139
- 1. Menetelmä peptidin valmistamiseksi, jossa peptidissä 5 a) on pistemutaatio tai translokaatio verrattuna sen proto-onkogeenin proteiinin vastaavaan fragmenttiin tai sen kasvaimen suppressorigeenin proteiiniin; ja joka peptidi b) vastaa, sisältäen täydellisesti tai olemalla 10 fragmentti, sellaista prosessoitua onkogeenin proteiini- fragmenttia tai kasvaimen suppressorigeenin fragmenttia, joka on läsnä syöpäsolussa tai muissa antigeeniä sisältävissä soluissa (APC), ja c) on läsnä HLA-peptidi -kompleksina jokaisen yk-15 silön ainakin yhdessä alleelissa; ja d) indusoi spesifiset T-soluvasteet sellaista todellista onkogeenin proteiinifragmenttia vastaan, jonka solu tuottaa prosessoimalla ja jonka HLA-molekyyli tuo esiin, lukuun ottamatta 20 e) p21-ras-peptidien fragmentteja, jotka vastaavat aminohappojen 5-16 sekvenssiä, jossa on mutaatio 12Val tai 12Arg, , tunnettu siitä, että peptidi valmistetaan synteettisesti tavanomaisilla kiinteäfaasitekniikoilla .
- 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n n e t t u siitä, että valmistetaan aminohapposekvenssi, joka on sama kuin luonnollisen p21-ras-proteiinin aminohapposekvenssin vastaava fragmentti paitsi, että kohdassa 12 tai 13 oleva Gly-tahde ja/tai kohdassa 61 oleva Gin on 30 korvattu millä tahansa muulla aminohapolla.
- 3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, t u n n e t t u siitä, että valmistetaan peptidi, joka valitaan ryhmästä, joka sisältää A:n, B:n ja C:n: 1°8139 A) taulukossa 8 esitetyt peptidit pll3 - pll9 tai niiden fragmentit; B) taulukossa 8 esitetyt peptidit pl20 - pl21 tai niiden fragmentit;
- 5 C) taulukossa 9 esitetyt peptidit pl58, pl66, pl68 ja pl67 tai niiden fragmentit. 108139
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB919103974A GB9103974D0 (en) | 1991-02-26 | 1991-02-26 | Therapeutically useful peptides or peptide fragments |
| GB9103974 | 1991-02-26 | ||
| PCT/NO1992/000032 WO1992014756A1 (en) | 1991-02-26 | 1992-02-21 | Therapeutically useful peptides and peptides fragments |
| NO9200032 | 1992-02-21 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI924069A FI924069A (fi) | 1992-09-11 |
| FI924069A0 FI924069A0 (fi) | 1992-09-11 |
| FI108139B true FI108139B (fi) | 2001-11-30 |
Family
ID=10690575
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI924069A FI108139B (fi) | 1991-02-26 | 1992-09-11 | Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen peptidin valmistamiseksi |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5961978A (fi) |
| EP (1) | EP0529023B1 (fi) |
| AT (1) | ATE181337T1 (fi) |
| AU (1) | AU660452B2 (fi) |
| CA (1) | CA2077537C (fi) |
| DE (1) | DE69229428T2 (fi) |
| DK (1) | DK0529023T3 (fi) |
| ES (1) | ES2134797T3 (fi) |
| FI (1) | FI108139B (fi) |
| GB (2) | GB9103974D0 (fi) |
| GR (1) | GR3031234T3 (fi) |
| HK (1) | HK1011370A1 (fi) |
| NO (1) | NO923953L (fi) |
| WO (1) | WO1992014756A1 (fi) |
Families Citing this family (40)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07501711A (ja) * | 1992-09-30 | 1995-02-23 | ドイチェス クレブスフォーシュングスツェントラム スチフトゥング デス エフェントリヒェン レヒツ | ｐ５３特異的抗体の検出法 |
| CA2158281A1 (en) * | 1993-03-15 | 1994-09-29 | Jay A. Berzofsky | Peptide coated dendritic cells as immunogens |
| AT399656B (de) * | 1993-03-19 | 1995-06-26 | Boehringer Ingelheim Int | Verfahren zur herstellung von krebsvakzinen |
| GB9422814D0 (en) * | 1994-11-11 | 1995-01-04 | Medinnova Sf | Chemical method |
| US6156316A (en) * | 1995-05-08 | 2000-12-05 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Oncogene fusion protein peptide vaccines |
| US6365151B1 (en) | 1996-01-19 | 2002-04-02 | Philadelphia Health And Educational Corporation | Cellular immunogens comprising cognate proto-oxogenes |
| DE69714033T2 (de) | 1996-04-19 | 2003-02-13 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary National Institute Of Health | Mutierte ras peptide zur zeugung von cd8+ zytitoxischen t lymphoizyten |
| US7709002B1 (en) * | 1996-04-19 | 2010-05-04 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Mutated ras peptides for generation of CD8+Cytotoxic T lymphocytes |
| US6069229A (en) * | 1997-03-07 | 2000-05-30 | Schering Corporation | Mammalian proteinases; oxidoreductases; related reagents |
| GB2328689A (en) * | 1997-08-27 | 1999-03-03 | Norsk Hydro As | Peptides based on the p21 ras proto-oncogene protein for the treatment of cancer |
| NO314086B1 (no) | 1998-05-08 | 2003-01-27 | Gemvax As | Peptider og farmasöytiske sammensetninger inneholdende disse, nukleinsyresekvenser som koder for slike peptider, plasmider og virusvektoreromfattende slike DNA-sekvenser samt anvendelse av disse for fremstilling avfarmasöytiske preparater til |
| NO315238B1 (no) | 1998-05-08 | 2003-08-04 | Gemvax As | Peptider som stammer fra leserammeforskyvingsmutasjoner i TBF<beta>II- eller BAX-genet, og farmasöytiske sammensetninger inneholdende disse,nukleinsyresekvenser som koder for slike peptider, plasmider og virusvektoreromfattende slikenukleinsy |
| US7030211B1 (en) | 1998-07-08 | 2006-04-18 | Gemvax As | Antigenic peptides derived from telomerase |
| NO309798B1 (no) * | 1999-04-30 | 2001-04-02 | Targovax As | Peptidblanding, samt farmasoytisk sammensetning og kreftvaksine som innbefatter peptidblandingen |
| US7700359B2 (en) * | 2000-06-02 | 2010-04-20 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Gene products differentially expressed in cancerous cells |
| GB0031430D0 (en) | 2000-12-22 | 2001-02-07 | Norsk Hydro As | Polypeptides |
| GB0105238D0 (en) * | 2001-03-02 | 2001-04-18 | Norsk Hydro As | Vaccines |
| EP1472375B1 (en) * | 2002-01-08 | 2009-04-01 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Gene products differentially expressed in cancerous breast cells and their methods of use |
| US20030206916A1 (en) * | 2002-05-03 | 2003-11-06 | Rush-Presbyterian-St. Luke's Medical Center | Immunogenic peptides |
| US7439042B2 (en) * | 2002-12-16 | 2008-10-21 | Globeimmune, Inc. | Yeast-based therapeutic for chronic hepatitis C infection |
| US8343502B2 (en) | 2002-12-16 | 2013-01-01 | Globeimmune, Inc. | Yeast-based vaccines as immunotherapy |
| DK1581174T3 (en) * | 2002-12-16 | 2018-06-18 | Globeimmune Inc | Yeast-based vaccines such as immunotherapy |
| CN101437964B (zh) * | 2004-10-18 | 2012-06-13 | 全球免疫股份有限公司 | 基于酵母的对慢性丙型肝炎感染的治疗 |
| US9732131B2 (en) | 2006-02-27 | 2017-08-15 | Calviri, Inc. | Identification and use of novopeptides for the treatment of cancer |
| CN101448848B (zh) * | 2006-03-27 | 2013-12-04 | 全球免疫股份有限公司 | Ras突变及其相关组合物和方法 |
| US20080079547A1 (en) * | 2006-09-29 | 2008-04-03 | Sensormatic Electronics Corporation | Radio frequency identification reader having a signal canceller and method thereof |
| EP2331125A4 (en) | 2008-09-19 | 2013-03-27 | Globeimmune Inc | IMMUNOTHERAPY FOR CHRONIC HEPATITIS C-VIRUS INFECTIONS |
| GB0821616D0 (en) | 2008-11-26 | 2008-12-31 | Lytix Biopharma As | Compounds |
| EP3363457A1 (en) | 2013-12-09 | 2018-08-22 | Targovax Asa | A peptide mixture |
| JP2017514847A (ja) * | 2014-05-06 | 2017-06-08 | タルゴバックス エーエスエー | 突然変異ｒａｓペプチド及び化学療法剤を含むペプチドワクチン |
| CN110430894A (zh) | 2017-02-01 | 2019-11-08 | 莫得纳特斯公司 | 编码活化致癌基因突变肽的免疫调节治疗性mrna组合物 |
| WO2018145020A1 (en) * | 2017-02-03 | 2018-08-09 | The Medical College Of Wisconsin, Inc. | Kras peptide vaccine compositions and method of use |
| EP3630131B1 (en) | 2017-06-02 | 2022-08-31 | Arizona Board of Regents on behalf of Arizona State University | A method to create personalized canine cancer vaccines |
| WO2019055618A1 (en) | 2017-09-15 | 2019-03-21 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University | METHODS OF CLASSIFYING RESPONSES TO ANTICANCER IMMUNOTHERAPY |
| SG11202008433QA (en) * | 2018-03-02 | 2020-09-29 | Elicio Therapeutics Inc | Compounds including a mutant kras sequence and a lipid and uses thereof |
| CN114573688A (zh) * | 2018-10-19 | 2022-06-03 | 杭州纽安津生物科技有限公司 | 通用性多肽疫苗及其在制备治疗/预防胰腺癌药物中的应用 |
| WO2021067550A1 (en) | 2019-10-02 | 2021-04-08 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University | Methods and compositions for identifying neoantigens for use in treating and preventing cancer |
| US11058751B1 (en) | 2020-11-20 | 2021-07-13 | Think Therapeutics, Inc. | Compositions for optimized RAS peptide vaccines |
| US11421015B2 (en) | 2020-12-07 | 2022-08-23 | Think Therapeutics, Inc. | Method of compact peptide vaccines using residue optimization |
| US11464842B1 (en) | 2021-04-28 | 2022-10-11 | Think Therapeutics, Inc. | Compositions and method for optimized peptide vaccines using residue optimization |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1252046A (en) * | 1982-11-04 | 1989-04-04 | Martin J. Cline | Methods for oncogenic detection |
| CA1219232A (en) * | 1983-08-17 | 1987-03-17 | Richard A. Lerner | Polypeptide-induced monoclonal receptors to protein ligands |
| US4898932A (en) * | 1985-01-29 | 1990-02-06 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Monoclonal antibodies reactive with activated and oncogenic ras p21 proteins |
| CA1296660C (en) * | 1985-01-29 | 1992-03-03 | Walter P. Carney | Monoclonal antibody against a ras oncogene p21 related dodecapeptide |
| US5100664A (en) * | 1985-09-20 | 1992-03-31 | Cetus Corporation | Human IL-2 as a vaccine adjuvant |
| DK354487A (da) * | 1986-07-11 | 1988-01-12 | Noboru Yanaihara | Oncogen-relaterede peptider |
| CA1339069C (en) * | 1987-11-09 | 1997-07-29 | Henry Lee Niman | Polypeptide-induced monoclonal receptors to protein ligand |
| US4957859A (en) * | 1988-02-16 | 1990-09-18 | Hoffmann-La Roche Inc. | Antibodies for transforming ras protein |
| EP0370012A1 (en) * | 1988-03-08 | 1990-05-30 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Monoclonal antibodies reactive with activated and oncogenic ras p21 proteins |
| DE68929511T2 (de) * | 1988-04-22 | 2004-11-18 | Bayer Corp. | Nachweis, Quantifizierung und Klassifizierung von RAS-Proteinen in Körperflüssigkeiten und Geweben |
| EP0354808B1 (en) * | 1988-08-12 | 1997-12-03 | Ligand Pharmaceuticals Incorporated | Polypeptide-induced monoclonal receptors to protein ligands |
| ES2070492T3 (es) * | 1990-01-26 | 1995-06-01 | Washington Res Found | Reactividad inmunitaria para oncogenes expresados activos para diagnostico y tratamiento de estados malignos. |
-
1991
- 1991-02-26 GB GB919103974A patent/GB9103974D0/en active Pending
-
1992
- 1992-02-21 CA CA002077537A patent/CA2077537C/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-02-21 EP EP92905196A patent/EP0529023B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-02-21 DE DE69229428T patent/DE69229428T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-02-21 AU AU12729/92A patent/AU660452B2/en not_active Ceased
- 1992-02-21 AT AT92905196T patent/ATE181337T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-02-21 DK DK92905196T patent/DK0529023T3/da active
- 1992-02-21 ES ES92905196T patent/ES2134797T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-02-21 WO PCT/NO1992/000032 patent/WO1992014756A1/en active IP Right Grant
- 1992-02-26 GB GB9204098A patent/GB2253211A/en not_active Withdrawn
- 1992-09-11 FI FI924069A patent/FI108139B/fi active
- 1992-10-12 NO NO92923953A patent/NO923953L/no unknown
-
1995
- 1995-05-03 US US08/433,133 patent/US5961978A/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-11-30 HK HK98112448A patent/HK1011370A1/xx not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-09-16 GR GR990402325T patent/GR3031234T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO923953L (no) | 1993-03-26 |
| DE69229428D1 (de) | 1999-07-22 |
| GB2253211A (en) | 1992-09-02 |
| CA2077537A1 (en) | 1992-08-27 |
| CA2077537C (en) | 2000-06-13 |
| AU660452B2 (en) | 1995-06-29 |
| FI924069A (fi) | 1992-09-11 |
| ES2134797T3 (es) | 1999-10-16 |
| FI924069A0 (fi) | 1992-09-11 |
| NO923953D0 (no) | 1992-10-12 |
| GB9103974D0 (en) | 1991-04-10 |
| WO1992014756A1 (en) | 1992-09-03 |
| AU1272992A (en) | 1992-09-15 |
| US5961978A (en) | 1999-10-05 |
| GR3031234T3 (en) | 1999-12-31 |
| ATE181337T1 (de) | 1999-07-15 |
| EP0529023B1 (en) | 1999-06-16 |
| HK1011370A1 (en) | 1999-07-09 |
| EP0529023A1 (en) | 1993-03-03 |
| DK0529023T3 (da) | 2000-01-17 |
| GB9204098D0 (en) | 1992-04-08 |
| DE69229428T2 (de) | 2000-06-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI108139B (fi) | Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen peptidin valmistamiseksi | |
| JP4422903B2 (ja) | 癌抑制遺伝子ｗｔ１の産物に基づく癌抗原 | |
| US7524930B2 (en) | Tumor antigen | |
| JP3096739B2 (ja) | Ｈｌａ分子によって提示される単離ノナペプチドとその使用 | |
| AU5096993A (en) | Isolated nonapeptide derived from mage-3 gene and presented by hla-a1, and uses thereof | |
| JP2003520606A (ja) | 癌抗原ｎｙｅｓｏ−１由来の新規ｍｈｃクラスｉｉ拘束ｔ細胞エピトープ | |
| US6821517B1 (en) | Compositions and methods for enhancing immune responses mediated by antigen-presenting cells | |
| US6218363B1 (en) | MHC peptides and methods of use | |
| CA2301840A1 (en) | Peptides which elicit cytotoxic t cellular immunity | |
| JPH05506039A (ja) | 治療に有用なペプチドおよびペプチド断片 | |
| Product | Cancer Immunotherapy Targeting Wilms' | |
| Myers | Custom designed MHC binding peptides for cancer immunotherapy |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC | Transfer of assignment of patent |
Owner name: GEMVAX AS Free format text: GEMVAX AS |