DE69714033T2

DE69714033T2 - Mutierte ras peptide zur zeugung von cd8+ zytitoxischen t lymphoizyten

Info

Publication number: DE69714033T2
Application number: DE69714033T
Authority: DE
Inventors: Scott Abrams; Jeffrey Schlom
Original assignee: National Institutes of Health NIH
Current assignee: National Institutes of Health NIH
Priority date: 1996-04-19
Filing date: 1997-04-17
Publication date: 2003-02-13
Anticipated expiration: 2017-04-18
Also published as: DE69714033D1; ATE220718T1; EP0895538B1; AU2734397A; EP0895538A1; ES2180045T3; WO1997040156A1; US20100074945A1; US8883448B2; DK0895538T3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft mutante ras-Peptide und ihre Verwendung in der Erzeugung von humanen antigenspezifischen, zytotoxischen T-Lymphozyten für die Prävention und Behandlung von Krebs.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Krebserkrankungen im Menschen sind im Allgemeinen assoziiert mit Mutationen in dominanten und rezessiven Onkogenen. Diese Gene produzieren mutierte Proteine, die für Krebszellen einzigartig sind. Ras-Protoonkogene sind die am Besten charakterisierten, mutierten Gene im menschlichen Krebs (22-26). Sie kodieren für eine hochkonservierte Familie von 21 Kd-Proteinen (p21). Mit einer einzigen Aminosäure-Mutation kann das ras-Protein die Fähigkeit zur Transformation sowohl in Maus- als auch in humanen Zellen verstärken. Solch punktmutiertes ras ist in einem weiten Spektrum humaner Karzinome, insbesondere an den Codons 12, 13 und 61, gefunden worden. Mutationen des Codons 12 bilden mehr als 90% aller ras-Mutationen im menschlichen Krebs.
Punktmutationen in den ras p21-Protoonkogenen (d. h. K-ras, H-ras, N-ras) sind identifiziert, beschrieben und assoziiert worden mit einer hohen Frequenz von und mit einem Spektrum an menschlichen Krebsarten, einschließlich Adenokarzinome des Pankreas, des Colons und der Lunge sowie Melanome und myeloide Leukämien (Übersicht in Referenzen 1-4). Solche Mutationen führen zur Produktion von abnormen Proteinen, die sich von normalem endogenen ras-p21 sowohl in der Struktur (DNA- und Proteinsequenzen) als auch in der Funktion unterscheiden, und die frühe Vorgänge bei der zellulären Transformation repräsentieren. In humanen Karzinomen, die p21-Punkt-Mutationen beherbergen, ist es das K-ras-Gen an Codon 12, welches des Öfteren mutiert ist, wobei der normale Glycin (Gly) Rest entweder mit einem Aspartat-(Asp), Valin-(Val), Cystein-(Cys), Alanin-(Ala), Arginin-(Arg) oder einem Serin-(Ser)-Rest ersetzt worden ist (1, 2, 4). Zusammengenommen bilden jedoch Substitutionen von Gly mit Asp, Val und Cys die Mehrzahl an humanen Karzinomen mit solchen p21 Position 12 Punktmutationen (1, 2, 4).
T-Lymphozyten können Antigene (Ag) erkennen, die im Zusammenhang mit den Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC)-Klasse I- oder -Klasse II-Molekülen auf der Oberfläche von Antigenpräsentierenden Zellen (APC) präsentiert werden (27-31). Von diesen Oberflächenantigenen wird angenommen, dass sie kurze Peptide sind, die aus abgebauten, intakten Proteinen hergeleitet sind (32-34).
T-Lymphozyten werden in zwei Hauptpopulationen, CD4+ und CD8+ unterteilt, die CD8+ T- Zellen erkennen Peptide (8-10 Reste), die an MHC-Klasse I-Moleküle gebunden sind und mit zytotoxischer Aktivität assoziiert sind (30-31). Im Allgemeinen sind die CD4+-Lymphozyten an der Erkennung von Peptiden (13-18 Reste), die im Zusammenhang mit den MHC-Klasse- II-Molekülen präsentiert werden sowie an der Immunregulation durch Zytokinsektretion beteiligt. Von Th1, eine Untergruppe der CD4+ T-Zellen, wurde berichtet, dass sie lytische Aktivität zeigen (35-37).
Daten, die aus Mäusen gewonnen wurden, haben die Erzeugung von MHC-restringierten (spezifischen) zytotoxischen T-Zellen gezeigt, die in der Lage sind, endogene zytoplasmatische Peptidantigene (Antigene, die aus dem Inneren der Zellmembran auf der Zelloberfläche präsentiert werden) nachzuweisen38, 39. Diese T-Zellen können die Abstoßung (Lyse) von Zellen verursachen, die solche Peptide exprimieren. Diese Abstoßung wird durch Zellen vermittelt, die auf neuartige Peptide reagieren, die auf mutierte Gene zurückzufuhren sind (38, 39). T-Zellen sind in der Lage, einzelne Aminosäureunterschiede zwischen homologen Peptiden nachzuweisen, welche auf APC präsentiert sind (40, 41).
Die Erzeugung und Expression dieser bisher unbemerkten "Neo-Determinanten" kann jetzt einzigartige und hochspezifische Epitope für die T-Zell (CD4+ und/oder CD8+)-Erkennung darstellen, was in der Wirtsabwehr als wichtiger Effektorweg bei Kontrolle von Malignität vorgeschlagen worden ist (5). Studien sowohl in murinen als auch humanen Systemen haben bereits immunodominante CD4+ T-Zellepitope von mutantem K-ras an Codon 12 identifiziert und charakterisiert unter Verwendung von kurzen, synthetischen Peptiden (6-12). Im Bezug auf die humanen anti-ras, CD8+ zytotoxischen T-Lymphozyt (CTL)-Antworten ist jedoch bislang nichts für Position 12-Mutationen definiert worden, obwohl von einer für Position 13 und einer für Position 61 berichtet worden ist (13, 14). Somit hat die hierin erfolgte Identifizierung von humanen CD8+ T-Zellepitopen, die spezifische ras-p21-Punktmutationen reflektieren, wichtige und direkte Bedeutung für die Entwicklung von onkogen-spezifischen Vakzinen in der Krebsimmuntherapie.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft mutante ras-Peptide, die antigenspezifische, zytotoxische T-Lymphozyten elizitieren. Die mutanten ras-Peptide sind T-Zellepitope für CD8+ humane T-Lymphozyten.
Ein weiterer Erfindungsgegenstand ist eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein oder mehrere mutante ras-Peptide und einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Die pharmazeutische Zusammensetzung ist nützlich als Immunogen und als ein Therapeutikum in der Prävention oder in der Behandlung von Krebs und für die Inhibition des Wachstums von Tumoren, die eine ras-Mutation zeigen. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann weiterhin ein Adjuvans oder eine Liposomenformulierung umfassen.
Eine weitere pharmazeutische Zusammensetzung umfasst eine mit einem mutanten ras-Peptid gepulste Antigen präsentierende Zelle und einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Die Zusammensetzung ist nützlich als Immunogen und als Therapeutikum.
In einem weiteren Erfindungsgegenstand werden zytotoxische T-Lymphozyten, die spezifisch gegen Tumore gerichtet sind, die eine ras-Mutation aurweisen, erzeugt und zwar durch in vivo-Verabreichung einer wirksamen Menge von mindestens einem mutanten ras-Peptid alleine oder in Kombination mit einem Adjuvans in einer Liposomenformulierung oder durch Verabreichung von mit mutiertem ras-Peptid gepulsten Antigen präsentierenden Zellen. Die antigenspezifischen, zytotoxischen T-Lymphozyten, die aus der Immunisierung hervorgehen, sind nützlich in Verfahren zur Inhibition oder Tötung von Tumorzellen, die ein mutantes ras p21-Protein oder Peptid exprimieren.
Ein noch weiterer Erfindungsgegenstand ist ein in vitro-Verfahren zur Erzeugung von zytotoxischen T-Lymphozyten, die spezifisch gegen Tumore gerichtet sind, die eine ras-Mutation exprimieren, durch Stimulation von Lymphozyten aus einer Quelle mit einer wirksamen Menge eines mutanten ras-Peptids, alleine oder in Kombination mit einem oder mehreren Zytokinen. Solche antigenspezifischen, zytotoxischen T-Lymphozyten können in adoptiver Weise in ein Säugetier übertragen werden zur Vorbeugung oder Behandlung von Krebs und zur Inhibition oder Tötung von Tumoren, die das mutante ras-Protein oder -Peptid exprimieren. Weiterhin sind die zytotoxischen T-Lymphozyten nützlich für screening-Verfahren für Antigene und Kartierung von Epitopen ("epitope mapping").
Eine weitere Ausführungsform betrifft die Verwendung eines erfindungsgemäßen, mutanten ras-Peptids zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in einem Verfahren zur Prävention des Auftretens, zur Inhibition des Wachstums oder zur Tötung von Tumorzellen, die mutantes ras p21-Protein oder Peptide exprimieren, umfassend a) Erzeugung von zytotoxischen T-Lymphozyten, die spezifisch gegen mutantes ras-Protein oder -Peptid gerichtet sind in vitro durch Stimulation der Lymphozyten aus einer Quelle mit einer wirksamen Menge eines mutanten ras-Peptids, alleine oder in Kombination mit einem oder mehreren Zytokinen, wobei die Menge wirksam ist zur Erzeugung von zytotoxischen T-Lymphozyten, die spezifisch gegen mutantes ras-Protein oder -Peptid gerichtet sind, und b) adoptive Übertragung der zytotoxischen T-Lymphozyten, die spezifisch gegen mutantes ras-Protein oder -Peptid gerichtet sind, alleine oder in Kombination mit einem oder mehreren Zytokinen in ein Säugetier und in einer Menge, die ausreicht, um das Auftreten von Tumorzellen zu verhindern, das Wachstum von Tumorzellen zu inhibieren oder um die Tumorzellen zu Töten.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft die Verwendung eines mutanten ras- Peptids der Erfindung für die Herstellung eines Medikaments zur Prävention des Auftretens, Inhibition des Wachstums oder Tötung von Tumorzellen, die mutantes ras p21-Protein oder Peptid in einem Säugetier exprimieren, umfassend a) Erzeugung von zytotoxischen T-Lymphozyten, die spezifisch gegen mutantes ras p21-Protein oder Peptid gerichtet sind, in vivo durch Verabreichung einer wirksamen Menge eines mutanten ras-Proteins, alleine oder in Kombination mit einem Adjuvans oder als eine Liposomenformulierung, und b) die auf diese Weise erzeugten zytotoxischen T-Lymphozyten, die spezifisch gegen mutantes ras p21-Protein oder Peptid gerichtet sind, die das Auftreten der Tumorzellen in dem Säugetier verhindern, das Wachstum der Tumorzellen in dem Säugetier inhibieren oder die Tumorzellen in dem Säugetier töten.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist eine DNA-Sequenz, die für ein oder mehrere mutante ras-Peptide kodiert.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Vektor, umfassend mindestens eine Insertionsstelle, die eine für ein oder mehrere ras-Peptide kodierende DNA-Sequenz enthält, die funktionell mit einem Promoter verknüpft ist, der die Fähigkeit zur Expression in einer Wirtszelle besitzt.
In einer noch weiteren Ausführungsform der Erfindung werden zytotoxische T-Lymphozyten, die spezifisch gegen mutantes ras-Peptid gerichtet sind, durch Verabreichung einer wirksamen Menge eines rekombinanten Virusvektors in ein Säugetier erzeugt, wobei der rekombinante Virusvektor mindestens eine Insertionsstelle umfasst, die eine DNA-Sequenz enthält, die für ein mutantes ras-Peptid kodiert.

BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1A und 1B. Erzeugung einer peptidspezifischen CD4+ T-Zelllinie aus immunen Lymphozyten des RAS-Patienten 43. Nach der dritten Vakzination wurde eine CD4+ T-Zelllinie vom RAS-Patienten 43 etabliert und in Kultur gehalten durch fortwährende wöchentliche IVS von unfraktionierten immunen Lymphozyten mit autologen PBMC (bis zu Zyklus 3) oder BLCL (danach) als APC, inkubiert mit dem mutanten ras 13-mer-Peptid und IL-2. Darstellung der Antigenspezifität und -Stärke der T-Zellkultur wurde anhand der Lymphoproliferation untersucht und die Ergebnisse als Stimulationsindex aufgezeigt. (Fig. 1A) proliferative Antwort, wöchentlich gemessen, beginnend bei IVS-Zyklus 3; und (Fig. 1B) proliferative Antwort bei IVS-Zyklus 6 gegen spezifische und irrelevante Peptide. Phänotypische Analyse offenbarte > 85% CD4+ in der T-Zellkultur.
Fig. 2A und 2B. Proliferative Antwort der RAS 43 T-Zellinie wird durch CD4+ -Lymphozyten vermittelt, die MHC-Klasse II-restringiert sind. (Fig. 2A) MAb gerichtet gegen HLA- Klasse I (d. h. Anti-HLA-A, -B, -C) oder Klasse II (d. h. Anti-HLA-DR, -DP oder -DQ)-Moleküle wurden verwendet, um die Rolle und Wichtigkeit der MHC-Restriktion für die T-Zellaktivierung zu definieren. Die T-Zelllinie des RAS-Patienten 43 wurde nach IVS-Zyklus 10 untersucht unter Verwendung von autologen BLCL als APC, inkubiert mit Peptid (10 ug/ml) ± MAb bei verschiedenen Konzentrationen. Ergebnisse sind ausgedrückt als %-Kontrolle, wie durch die Gleichung [(Aktivität mit MAbcpm - Kontrollecpm)/(Aktivität ohne MAbcpm - Kontrollecpm)] · 100 definiert ist, wobei Kontrollecpm unstimulierte Kulturen von T-Zellen + BLCL ohne Peptid betrifft. (Fig. 2B) In einem getrennten Experiment wurden MAb, gerichtet gegen die CD4 (Klon OKT4; Hybridoma-Überstand, 20% v/v)- oder CD8 (Klon OKT8; Hybridoma-Überstand, 20% v/v)-Moleküle, verwendet, um die funktionelle(n) T-Zell- Untergruppe(n) zu identifizieren und zu bestätigen. In diesem Assay ebenfalls mit eingeschlossen waren MAb gerichtet gegen HLA-Klasse I- oder II-Moleküle (jeweils 3 ug/ml), wie in Fig. 2A. In Fig. 2B wurde die T-Zelllinie nach IVS-Zyklus 5 getestet unter Verwendung autologer BLCL als APC, inkubiert mit Cys 12-Peptid (10 ug/ml) ± MAb. Zusätzliche Kontrollkulturen (cpm ± SFM) beinhalteten: bestrahlte BLCL, 8,520 ± 225; T-Zellen + BLCL + Gly 12-Peptid (10 ug/ml), 7,690 ± 383).
Fig. 3. Erzeugung einer peptidspezifischen CD8+ T-Zelllinie aus immunen Lymphozyten des RAS-Patienten 32. Nach der dritten Vakzination wurden PBMC von RAS-Patient 32 in CD8+ (46,9%; CD4+, 2.2%) T-Zellen angereichert. Kulturen wurden angesetzt und aufrecht erhalten durch fortwährende wöchentliche IVS-Zyklen unter Verwendung autologer PBMC (bis zu Zyklus 3) oder BLCL (danach) als APC, die mit mutantem ras-Peptid plus β&sub2;- Mikroglobulin und IL-2 inkubiert wurden. Das mutante ras-Peptid stellt eine verschachtelte HLA-A2-bindende, 10-mer-Sequenz [d. h. ras5-14(D12)] dar. Zytotoxizität wurde wöchentlich ermittelt durch einen Standard 6 h-&sup5;¹Cr-Feisetzungs-Assay unter Verwendung der T2-Zelllinie als target (Ziel), das mit mutantem oder normalem ras-Peptid (d. h. 10-mer Sequenzen, jeweils 10 ug/ml) wie gezeigt inkubiert wurde. Ergebnisse sind bei E/T-Verhältnissen von 10/1 und 5/1 verdeutlicht.
Fig. 4. Zytolytische Aktivität der CD8+ CTL-Linie des RAS-Patienten 32 ist HLA-A2-beschränkt. Die CD8+ CTL-Linie des RAS-Patienten 32 (siehe Fig. 3) wurde gegen einen Satz HLA-A2+ targets (Ziele) untersucht, mit und ohne Peptid (10 ug/ml). Zytotoxizität wurde durch &sup5;¹Cr-Freisetzung ermittelt und die Ergebnisse bei E/T-Verhältnis von 20/1 nach IVS- Zyklus 16 ausgedrückt. Ähnliche Ergebnisse wurden beobachtet unter Verwendung einer zweiten, separat gewonnenen CD8+ CTL-Linie, wie in Tabelle 6 beschrieben. Außerdem inhibierte der anti-HLA-A2 MAb (Klon BB7.2) unter Verwendung dieser zweiten CD8+ CTL- Linie die peptidspezifische Zytotoxizität gegen C1R-A2-targets(Ziele) (nicht gezeigt).
Fig. 5. Zytolytische Aktivität der CD8+ CTL-Linie von RAS-Patient 32 ist peptidspezifisch. Die CD8+ CTL-Linie des RAS-Patienten 32 (siehe Fig. 3) wurde gegen die T2-Zelllinie als target (Ziel) untrsucht, die mit und ohne verschiedene ras-Peptide (10 ug/ml), wie gezeigt, inkubiert wurde. Parallel dazu wurde das Ausmaß der NK-Aktivität gegen K562-Zellen ermittelt. Zytotoxizität wurde durch &sup5;¹Cr-Freisetzung bestimmt und die Ergebnisse bei verschieden E/T-Verhältnissen im Anschluss an IVS-Zyklus 7 angegeben. Ahnliche Resultate wurden beobachtet unter Verwendung der zweiten, separat gewonnen CD8+ CTL-Linie, wie in Tabelle 6 beschrieben.
Fig. 6. Generierung einer CD8+ T-Zelllinie spezifisch für das mutante ras4-2(V12)-Peptid. Eine CD8+ CTL-Linie, spezifisch für ras4-12(V12) wurde angesetzt aus einem normalen HLASpender unter Verwendung eines Modell-Antigen-Präsentationssystems, bestehend aus der T2-Zelllinie (exprimiert erhöhte Mengen an B7.1), Peptid, β&sub2;-Mikroglobulin und Zytokinen (IL-2, IL-12). Mit autologem Epstein-Barr-Virus transformierte B-Zellen ersetzten T2-Zellen als Antigen präsentierende Zellen nach dem zweiten IVS-Zyklus. Hier wurde die Bedeutung sowohl von Peptid-Spezifität als auch HLA-Restriktion für die Zytotoxizität gegen targets (Ziele) untersucht, die entweder HLA-A2 (d. h. allogenetische B-Zelllinie passend für HLA-A2 oder die Melanom-Linie MEL-624) exprimierten oder denen HLA-A2 fehlte (d. h. allogenetische B-Zellline nicht passend für HLA-A2). Zytotoxizität wurde nach IVS-Zyklus 6 bestimmt in Abwesenheit oder Anwesenheit von mutiertem oder normalem ras-Peptid (d. h. 9- mer-Sequenzen je 5 ug/ml), wie gezeigt. Ergebnisse sind bei einem Effektor-/Target(Ziel)- Verhältnis von 20/1 angegeben und als Mittelwert ± SFM von drei Vertiefungen ausgedrückt.
Fig. 7. Zytolytische Aktivität durch CD8+ CTL-Linie des Patienten 32 ist HLA-A2-beschränkt. Die Erfordernis für HLA-A2 in Peptidpräsentation (durch C1R-A2-targets(Ziele) wurde in Blockierungsexperimenten bestimmt unter Verwendung von MAb (Klon BB7.2; Aszites = 1 : 100-Verdünnung), gerichtet gegen dieses Molekül (oder einen "isotyp-passenden MAb). IVS-Zyklus = 16; Effektor/Target(Ziel)-Verhältnis = 10/1; ras5-14(Asp12)Peptid = 1 ug/ml. MAb, gerichtet gegen die CD4 (Klon OKT4; Hybridoma-Überstand, 20% v/v)- oder CD8 (Klon OKT8; Hybridoma-Überstand, 20% v/v)- Moleküle wurden verwendet, um die funktionelle(n) T-Zellsubklasse(n) zu identifizieren und zu bestätigen. Kontroll-Lyse in Abwesenheit von Peptid oder in Anwesenheit von ras5-14(Gly12) war < 3%.
Fig. 8A und 8B. Produktion einer peptidspezifischen CD4+ T-Zelllinie aus Lymphozyten nach Vakzination des Patienten 29. Fig. 8A: Unfraktionierte PBMC, vor der Vakzination und nach der dritten Vakzination wurden zweiwöchentlich stimuliert unter Verwendung von autologen PBMC als APC, die mit mutiertem ras-13-mer-Peptid inkubiert wurden [d. h. ras5- 17(Val12)] und IL-2, in ähnlicher Weise wie bei Patient 43 (siehe Tabelle 3). PBMC-Kulturen folgten der zweiten IVS. Proliferation wurde durch ³H-Thymidin-Aufnahme gemessen und die Ergebnisse als Stimulationsindex (SI) ausgedrückt. Fig. 8B: MAb, gerichtet gegen die CD4 (Klon OKT4; Hybridoma-Überstand, 20% v/v)- oder CD8 (Klon OKT8; Hybridoma- Überstand, 20% v/v)- Moleküle wurden verwendet, um die funktionelle(n) T-Zell-Subklasse(n) zu identifizieren und zu bestätigen. Die T-Zelllinie von Patient 29 wurde nach IVS- Zyklus 4 untersucht unter Verwendung autologer EBV-B-Zellen als APC, die mit ras5- 17(Val12)-Peptid (3 ug/ml) ± MAb inkubiert wurden. Zusätzliche Kontrollkulturen (cpm ± SFM) beinhalteten: bestrahlte EBV-B-Zellen (3,535 ± 372); T-Zellen + EBV-B-Zellen (19,256 ± 1926); T-Zellen + EBV-B-Zellen + Gly12-Peptid (3 ug/ml), (18,116 ± 1474).
Fig. 9A und 9B. Produktion einer peptidspezifischen CD8+ T-Zelllinie aus Lymphozyten nach Vakzination des Patienten 29. Fig. 9A: eine CD8+ CTL-Linie wurde etabliert aus PBMC nach Vakzination des Patienten 29 und auf Peptidspezifität gegen C1R-A2- targets(Ziele) geprüft. Zytotoxizität wurde bestimmt mittels &sup5;¹Cr-Freisetzung und die Ergebnisse wurden ausgedrückt bei verschiedenen Effektor/Target(Ziel)-Verhältnissen nach IVS-Zyklus 7. Fig. 9B: Unter Verwendung dieser CD8+ CTL-Linie wurde das Erfordernis für HLA-A2 in der Peptid-Präsentation (durch autologe EBV-B-Zellen als targets (Ziele)) in Blockierungsexperimenten untersucht unter Verwendung von MAb (Klon BB7.2; Aszites = 1 : 30-Verdünnung), gerichtet gegen dieses Molekül (oder unter Verwendung eines "isotyppassenden MAb). IVS-Zyklus = 11; Effektor/Target(Ziel)-Verhältnis = 10/1; ras5-14(Val12)- Peptid = 3 ug/ml. CD4 und CD8 MAbs waren wie in Fig. 8A und 8B beschrieben. Kontroll- Lyse in Abwesenheit von Peptid oder in Anwesenheit von ras5-14(Gly12) war < 3%.
Fig. 10A und JOB. Anti-ras Val12-spezifische CTL aus Patient 29 lysieren SW480 Tumorziele in der Abwesenheit von exogenem Peptid. Fig. 10A: Anti-ras, Val12-spezifische CD8+ CTL aus Patient 29 wurden gegen die SW480-Kolonkarzinomzell.linien (HLA-A2+, rasVal12+) in der Abwesenheit von exogenem Peptid, mit oder ohne IFN-γ-Vorbehandlung (250 U/ml für 24 Std.) der Zielzellen untersucht. Mit dem MART-1&sub2;&sub5;&submin;&sub2;&sub7;-Peptid reagierende CD8+ CTL wurden verwendet als eine irrelevante Effektor-Zellpopulation. Zytotoxizität wurde bestimmt durch &sup5;¹Cr-Freisetzung und die Ergebnisse sind angegeben bei verschiedenen Effektor/Target(Ziel)-Verhältnissen. Fig. 10B: Parallel zu 10A wurden anti-nzy oder anti- MART-1 spezifische CTL gegen SW480 (± IFN-γ- Vorbehandlung) bei einem Effektor/Target(Ziel)-Verhältnis von 10/1 in Abwesenheit oder Anwesenheit von exogenem Peptid (5 ug/ml) untersucht. Für anti-ras CTL: spezifisches Peptid = ras5-14(Val12); Kontrollpeptid = ras5-14(Gly12). Für anti-MART-1 CTL: spezifisches Peptid = MART-1&sub2;&sub7;&submin;&sub3;&sub5;; Kontrollpeptid = ras5-14(Val12). Durchflußzytometrische Analyse von SW480 Zellen für die Expression von HLA-A2: unbehandelt = 65,4% mit MFI von 29,8; IFN-γ vorbehandelt = 99,5% mit MFI von 349.6. Durchflußzytometrische Analyse von SW480 Zellen auf Expression von ICAM-1: unbehandelt = 16,0% mit MFI von 30,3; IFN-γ-Vorbehandlung = 98,6% mit MFI von 181,9.
Fig. 11. Identifizierung einer humanen mutanten ras CD8+ CTL-Peptidepitop-Variante, die Effektorfünktion steigert. Die CD8+ CTL-Linie von Patient 32 wurde gegen die C1R-A2- Zelllinie als target (Ziel) untersucht, mit den verschiedenen ras-Peptiden bei unterschiedlichen Konzentrationen, wie gezeigt, inkubiert. Zytotoxizität wurde durch einen Standard 6 Std- &sup5;¹Cr-Freisetzungs-Assay bestimmt, und die Ergebnisse bei einem Effektor/Target(Ziel)- Verhältnis von 10/1 ausgedrückt. Ergebnisse zeigen, dass die Einführung eines N-terminalen Tyr-Restes (Y5) in mutantem ras-Peptid 5-15(Asp12) CTL-Aktivität gegen Peptid-gepulste targets (Ziele) erhöht.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft mutante ras-Peptide. Die mutanten ras-Peptide sind gekennzeichnet durch ihre Fähigkeit, eine Immunantwort spezifisch gegen mutantes ras-p21-Protein oder Teile davon und gegen Zellen, die mutantes ras-p21-Protein oder Teile davon binden oder exprimieren, hervorzurufen.
Die mutanten ras-Peptide der vorliegenden Erfindung elizitieren antigen-spezifische zytotoxische T-Lymphozyten, die Zellen, die mutantes ras-p21-Protein oder Peptide davon exprimieren, töten oder in ihrem Wachstum hemmen.
Zellen, die mutantes ras-p21-Protein oder Peptide davon exprimieren, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Krebszellen, im Besonderen humane Krebszellen. Solche Krebsarten umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Adenokarzinome des Pankreas, des Colons, des Endometriums, der Lunge, der Schilddrüse, Melanom, oral Laryngeal, Seminom, Hepatozelluär, Gallengang, akute Myeloblastische-Leukämie, Basalzell-Karzinom, Plattenepithelkarzinom und dergleichen.
Von besonderem Interesse sind Krebsarten mit Position-12-Mutationen in dem ras-p21-Protein oder Peptid.
Drei ras-Gene mit transformationspotential umfassen H-, K- und N-ras,. H-, K- und N-ras- p21-Proteine teilen eine Gesamtaminosäure-Homologie von 75%. Innerhalb der N-terminalen katalytischen Domänen (Positionen 5 bis 120) ist die Homologie zwischen den drei Onkogenen größer als 97%. Somit sind die punktmutierten ras-Peptide der vorliegenden Erfindung wirksam in der Behandlung von Krebs, der von ein oder mehreren ras-Onkogenen hervorgerufen wird. Solche Zellen, die mutantes ras p21-Protein oder Peptide exprimieren, können in ihrem Wachstum gehemmt werden oder getötet werden durch mutante ras-p21-spezifische zytotoxische T-Lymphozyten oder CD8+-Lymphozyten sowohl in vitro als auch in vivo.
Die mutanten ras-Peptide der vorliegenden Erfindung umfassen zwischen etwa 8-13 Aminosäuren, vorzugsweise etwa 9-10 Aminosäuren.
In den mutanten ras-Peptiden gemäß der vorliegenden Erfindung ist das normale Glycin an Position 12 mit einer Aminosäure ausgetauscht, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Asparaginsäure, Valin, Cystein, Alanin, Arginin und Serin. In einer bevorzugten Ausfuhnmgsform ist das Glycin an Position 12 mit einer Aminosäure ausgetauscht, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Asparaginsäure, Valin und Cystein.
Die folgende Liste veranschaulicht das Glycin an Position 12 in einem Peptid, gewonnen aus normalem ras, und zeigt Peptide mit dem Glycin an Position 12, welches durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt worden ist.

Aminosäure und Position

ras-Peptide 4 5 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

Normales ras5-17

(Gly12) Lys-Leu-Val-Val-Val[]-Gly-Ala-Gly-Gly-Val-Gly-Lys-Ser (SEQ. ID-Nr. 1)

Mutantes ras5-17

(Asp12) Lys-Leu-Val-Val-Val[]-Gly-Ala-Asß-Gly-Val-Gly-Lys-Ser (SEQ. ID-Nr. 2)

Mutantes ras5-14

(Asp12) Lys-Leu-Val-Val-Val-Gly-Ala-Asf-Gly-Val (SEQ. ID-Nr. 3)

Mutantes ras5-14

(Val12) Lys-Leu-Val-Val-Val-Gly-Ala-Val-Gly-Val (SEQ. ID-Nr. 4)

Mutantes ras5-4

(Cys12) Lys-Leu-Val-Val-Val-Gly-Ala-Cys-Gly-Val (SEQ. ID-Nr. 5)

Mutantes ras4-12

(Val12) Tyr-Lys-Leu-Val-Val-Val-Gly-Ala-Val (SEQ. ID-Nr. 6)
Die mutanten ras-Peptide der vorliegenden Erfindung umfassen
Xaa&sub1; Leu Xaa&sub2; Val Val Gly Ala Xaa&sub3; Gly Val;
wobei Xaa&sub1; die Aminosäure Lysin oder Tyrosin ist;
wobei Xaa&sub2; eine Aminosäure ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Valin, Tryptophan, Leucin, Tyrosin und Phenylalanin,
wobei Xaa&sub3; ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Asparaginsäure, Valin, Cystin, Alanin, Arginin und Serin mit dem Vorbehalt, dass, wenn Xaa&sub2; Valin ist, ist Xaa&sub1; Tyrosin, und besagte Peptide elizitieren peptidspezifische humane CD8+-zytotoxische T-Lymphozyten.
Obwohl die vorliegende Erfindung mutante ras-Peptide betrifft, die zusätzlich zu einer Aminosäuresubstitution an Position 12 eine Aminosäuresubstitution an den Positionen 5 und/oder 7 beinhalten, ist die Erfindung für vergleichende Zwecke und zur Veranschaulichung auch beschrieben bezüglich mutanter ras-Peptide, die eine einzige Aminosäuresubstitution an Position 12 besitzen, die nicht innerhalb des Bereichs sind, der von den Ansprüchen umfasst wird.
Die mutanten ras-Peptide der vorliegenden Erfindung wurden konstruiert für eine erhöhte Bindungsfähigkeit an MHC-Klasse I-Molekülen und/oder erhöhte Bindungsfähigkeit an dem T-Zell-Rezeptor für eine verbesserte Immunantwort. Mutante ras-Peptide der vorliegenden Erfindung schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Peptide, die eine einzelne Aminosäuresubstitution besitzen, die von Position 12 verschieden ist. Solche Substitutionen schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf den Austausch von Lys an Position 5 mit Tyr. In einer solchen Ausführungsform beinhaltet ein mutantes ras-Peptid der vorliegenden Erfindung Tyr- Leu-Val-Val-Val-Gly-Ala-Asp-Gly-Val (SEQ. ID Nr. 11).
Die mutanten ras-Peptide können durch rekombinante DNA-Technologie erhalten werden, durch chemische Peptidsynthese oder durch entsprechende Proteasespaltung eines isolierten mutanten ras-Proteins oder Peptids.
Die mutanten ras-Peptide können in einer pharmazeutischen Zusammensetzung formuliert sein in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger für die Verwendung als Immunogen in einem Säugetier, vorzugsweise einem Menschen. Die Zusammensetzung kann weiterhin ein oder mehrere andere Bestandteile zur Steigerung der Immunantwort umfassen, die biologische Antwort-Modifizierer ("response modifiers") wie Interleukin-2, Interleukin- 12, Interferon, Tumomekrosefaktor, GM-CSF und Zyklophosphamid umfassen, jedoch nicht auf diese beschränkt sind.
Das mutante ras-Peptid wird einem Säugetier verabreicht in einer Menge, die wirksam ist in der Erzeugung einer mutanten ras-peptidspezifischen Immunantwort, vorzugsweise einer zellulären Immunantwort. Die Wirksamkeit des mutanten ras-Peptids als Immunogen kann durch in vivo- oder in vitro-Parameter, wie sie im Fachgebiet bekannt sind, bestimmt werden. Diese Parameter schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf antigen-spezifische Zytotoxizitätsassays, Regression von Ras-p21+-Tumoren, Inhibition von Ras-p21+-Krebszellen, Produktion von Zytokinen und dergleichen.
Mindestens ein oder mehrere mutante ras-Peptide können in einer Dosierung von etwa 0,05 mg bis etwa 10 mg pro Vakzination des Säugetiers verabreicht werden, vorzugsweise von 0,1 mg bis etwa 5 mg pro Vakzination. Mehrere Gaben können je nach Indikation über einen Zeitraum von mehreren Wochen bereitgestellt werden. In einer Ausführungsform wird eine Gabe jeden Monat für drei Monate zur Verfügung gestellt. Das mutante ras-Peptid kann alleine oder in Kombination mit Adjuvantien, in einer Liposomenfbrmulierung, Zytokinen, biologischen Antwort-Modifizierem ("response modifiers") oder anderen Reagenzien, von denen im Fachgebiet bekannt ist, dass sie die Immunantwort verstärken, verabreicht werden. Adjuvanzien schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf RIBI Detox , QS21, Alaun und unvollständiges Freund'sches Adjuvans. In einer Ausführungsform wird das mutante ras- Peptid in Kombination mit Detox (RIBI Imunochem, Hamilton, MT) verabreicht.
Die mutanten ras-Peptide können auch konjugiert sein an Helferpeptide oder an große Trägermoleküle, um die Immunogenität des Peptids zu erhöhen. Diese Moleküle beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf das Influenza-Peptid, Tetanustoxoid, Tetanustoxoid CD4-Epitop, Pseudomonas-Exotoxin A, Poly-L-Lysin und dergleichen.
Eine weitere wirksame Form des mutanten ras-Peptids zur Erzeugung einer mutanten ras- peptidspezifischen Immunantwort in einem Säugetier ist eine durch ein mutantes ras-Peptid gepulste Antigen präsentierende Zelle. Die Antigen präsentierende Zellen schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf dendritische Zellen, B-Lymphozyten, Monozyten, Makrophagen und dergleichen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die mit mutantem ras-Peptid aktivierte Antigen präsentierende Zelle eine dendritische Zelle.
Die Erfindung stellt auch bereit ein Verfahren zur Erzeugung von mutanten ras-peptidspezifischen zytotoxischen T-Lymphozyten in vivo oder in vitro durch Stimulation von Lymphozyten aus einer Quelle mit einer wirksamen Menge eines mutanten ras-Peptids alleine oder in Kombination mit einem biologischen Antwort-Modofizierer ("response modifier") und/oder Adjuvans oder in einer Liposomenformulierung. Die Quellen der Lymphozyten schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf peripheres Blut, Tumorgewebe, Lymphknoten und Ergüssen wie Pleuralflüssigkeit oder Aszitesflüssigkeit und dergleichen.
Die mutanten ras-p21-protein- oder peptidspeziflschen zytotoxischen T-Lymphozyten sind immunreaktiv mit mutantem ras-p21-Protein oder Peptid. Die zytotoxischen T-Lymphozyten inhibieren das Auftreten von Tumorzellen und Krebs und inhibieren das Wachstum von oder töten mutantes ras p21-Protein- oder Peptid-exprimierende Tumorzellen. Die zytotoxischen T-Lymphozyten sind zusätzlich zu ihrer Antigenspezifität MHC-Klasse I-restringiert. In einer Ausführungsform sind die zytotoxischen T-Lymphozyten MHC-Klasse I HLA-A2-restringiert. Die zytotoxischen T-Lymphozyten haben einen CD8+-Phänotyp. Die zytotoxischen T- Lymphozyten können restringiert sein durch andere HLA-Allele, die A3, A11, A68, A24 und dergleichen einschließen, jedoch nicht auf diese beschränkt sind.
Eine peptidbasierende Phase I klinische Studie wurde mit Patienten mit metastatischem Karzinom eingeleitet, deren Tumore Punktmutationen in den ras-p21-Proto-Onkogenen an Codon 12 enthielten. Die Mehrzahl der Patienten in dieser Studie zeigten primäre Malignitäten des Kolons, des Gastrointestinaltrakts, der Lunge und des Pankreas und beherbergten Position 12-Mutationen von Gly zu Asp, Cys oder Val. Ausgewählte Patienten wurden bis zu dreimal in monatlichen Intervallen subkutan vakziniert mit Detox -Adjuvans, dem geeignetes, mutiertes ras 13-mer-Peptid, umfassend Positionen 5-17, das der spezifischen Punktmutation an Codon 12 in den metastatischen Karzinomen dieser Patienten entsprach, beigemischt wurde. Vor kurzem berichtete Gjertsen et al. (15) über die Vakzination von Pankreaskarzinom-Patienten mit autologen mononukleären Zellen des peripheren Blutes, die ex vivo mit mutanten ras-Peptiden (umfassend Positionen 5-21), die Codon-12-Mutationen widerspiegelten, vorgepulst waren. Von 5 Patienten, die mehrere Vakzinationen erhielten, zeigten zwei Patienten Anzeichen von anti-ras-T-Zellantworten, wie mittels Proliferations-Assays gemessen wurde. In einem Patient war die T-Zellantwort spezifisch für das immunisierende Peptid (Val12), wobei im anderen Patienten die T-Zellantwort sowohl mit immunisierenden (Asp12) und nicht-mutierten (Gly12)-Peptiden kreuzreagierte. In beiden Patienten waren diese Antworten zeitlich vorübergehend in dem Sinne, dass sie am Tag 40 nach Beginn der Impfung nachweisbar waren, aber während der folgenden Wochen nicht nachweisbar waren. Es wurde über keine weiteren phänotypischen oder funktionellen Studien berichtet.
In der vorliegenden Erfindung wurde die Fähigkeit, peptidspezifische zelluläre Immunantworten in Patienten, die mit mutanten ras-Peptiden vakziniert waren, zu induzieren, gezeigt. Außerdem stellt die vorliegende Erfindung zum ersten Mal ein humanes HLA-A2-restringiertes CD8+-CTL-Epitop, das die Codon12-Mutation Gly zu Asp widerspiegelt, bereit. Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC)-Klasse II-restringierte CD4+ T-Zelllinien wurden aus einzelnen Patienten gewonnen. Weiterhin wurde eine MHC-Klasse I-restringierte CD8+ T-Zelllinie produziert, die eine verschachtelte Sequenz des ursprünglichen Immunogens erkannte. Sowohl CD4+ als auch CD8+ T-Zelllinien konnten in Langzeitkulturen aufrecht erhalten werden ohne Verlust von Antigen-(Ag)-Spezifität. Im Weiteren wurden keine spezifischen T-Zellantworten gegen die normale ras-Sequenz in den Patienten gefunden, und es wurden aus präimmunen Lymphozyten keine T-Zelllinien in Kultur erzeugt. Zusammengenommen induzieren die onkogen abgeleiteten mutanten ras-Peptide der vorliegenden Erfindung hochspezifische und systemische anti-ras-zelluläre Immunantworten. Außerdem hat die Entwicklung solcher MHC-Klasse I-restringierten, mutanten ras-Peptide wichtige Bedeutung sowohl für aktive, (d. h. Vakzination) und passive (d. h. ex-vivo-Expansion für zellulären, adoptiven Transfer ("cellular adoptive transfer")) Immuntherapien, die für die Induktion und Vermehrung in spezifischen CD8+ CTL-Antworten in Krebspatienten verwendet werden können.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wurde der Immunstatus des Patienten vor der Vakzination und nach der dritten Vakzination verglichen. Die phänotypischen und funktionellen Eigenschaften der resultierenden T-Zelllinien, die aus den Patienten etabliert wurden, die Anzeichen von zellvermittelter Immunität zeigten, wurden charakterisiert. Die Fähigkeit zur Induktion von peptidspezifischen CD4+ T-Zellantworten in einer Untergruppe von Patienten nach Impfung mit ras-onkogenen Peptiden, die die entsprechende ras-Mutation widerspiegelten, wurde bestätigt. Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung zum ersten Mal die Identifizierung von humanen HLA-A2-restringierten, CD8+ CTL-Epitopen, die zwei ausgeprägte Codon-12-Mutationen widerspiegeln, bereit. Es wurde gefunden, dass diese Mutationen innerhalb des längeren 13-mer-Peptidimmunogens (d. h. ras5-14(D2)) eingebettet waren. Somit wurde in einer Ausführungsform der Erfindung gezeigt, dass ein einziges mutantes ras- Peptidimmunogen sowohl CD4+ ung CD8+ T-Zellepitope in einer verschachtelten Konfiguration enthielt. Experimentelle Modelle wurden in vitro etabliert, die die Fähigkeit von CD4+ und CD8+ T-Zelllinien demonstrierten, Antigen präsentierende Zell-(APC)- Populationen, die das entsprechende Onkoprotein präsentierten, oder Tumorzellen, die die natürlich vorkommende Mutation beherbergten, zu erkennen.
Dass ein einzelnes, mutantes ras Peptid-Immunogen sowohl CD4+ als auch CD8+ T-Zell- Epitope in einer überlappenden oder verschachtelten Konfiguration, wie durch die vorliegende Erfindung gezeigt, enthält hat wichtige biologische Konsequenzen für die Erzeugung und Koordination einer effizienteren anti-pathogenen Immunantwort. In ähnlicher Weise wurden in einem Maus-Modell ebenfalls überlappende MHC-Klasse II-restringierte CD4+ und MHC-Klasse I-restringierte CD8+ CTL Peptid-Epitope identifiziert, was die ras- Val 12-Mutation widerspiegelt. In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung können onkogen-spezifische CD4+ und CD8+ T-Zelllinien für den Einsatz in der adoptiven Immuntherapie in Betracht gezogen werden, vielleicht gemeinsam mit einer aktiven Immunisierung zur Erzeugung eines umfassenderen antitumor-Angriffs. Wie von der vorliegenden Erfindung im Weiteren gestützt, kommen Modifikationen der Immunogen- Gestaltung ("immunogen design"), -Aufstellung ("schedule") und -Zuführ zusammen mit der gleichzeitigen Verabreichung von Zytokinen wie z. B. IL-2, IL-12 oder GM-CSF sowohl für eine gesteigerte Entfaltung der Immunantwort als auch für einen größeren klinischen Nutzen in Frage.
Im Einklang mit der vorliegenden Erfindung wurden Verfahren entwickelt zur Verbesserung der Sensitivität und Stetigkeit zum Nachweis von schwachen, positiven peptidspezifischen, proliferativen Reaktionen und zur fünktionellen Auswertung von kultivierten Lymphozytenpopulationen. Zu diesem Zweck wurden Lymphozytenpopulationen von Patienten mit einer autologen Quelle von APC, mutiertem ras-Peptid als Antigen (Ag) und IL-2 in vitro inkubiert (bei 7 bis 14-täglichen Intervallen) und anschließend nochmals auf peptidspezifische Reaktivität am oder gegen Ende eines IVS-Zyklus' geprüft. Solche Kulturbedingungen wurden entwickelt, um die nominellen Erfordernisse für die Ag-speziflsche Zunahme von in vivo Peptidstimulierten Lymphozyten und ihre nachfolgende Untersuchung als Anzeichen für "recall"- Antworten auf die Vakzination anzuzeigen. Diese IVS-Zyklen wurden etabliert, um: (i) eine schwache, aber spezifisch-funktionelle Antwort nachzuweisen; (ii) prävakzine- und postvakzine-Lymphozyten innerhalb einer gewissen Zeitspanne miteinander zu vergleichen, um potentielle peptidspezifische Reaktivität zu ermitteln; und. (iii) peptidspezifische T-Zelllinien in Kultur zu erhalten für eine detaillierte phenotypische und funktionelle Charakterisierung
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Verfahren zur Induktion von CD8+ CTL, die spezifisch für Position 12-Mutationen sind, bereitgestellt. HLA-A2-restringierte Antworten wurden bei zwei von drei vakzinierten Patienten festgestellt. Dies wurde größtenteils ermöglicht durch die anfängliche Identifizierung einer verschachtelten Peptidsequenz mit einem Konsensus-Anker-Motiv für HLA-A2, welches funktionelle Bindung an dieses Molekül zeigte (Tabelle 7). Die in vivo-Stimulierung der CD8+ T-Zellantwort resultierte wahrscheinlich aus in vitro-Vorgängen bezüglich der Ag-Prozessierung (d. h. extrazellulär oder intrazellulär), vielleicht beinflusst und verstärkt in Anwesenheit von Adjuvans, mit der anschließenden Erzeugung von MHC-Klasse I-reaktiven Epitopen. Obwohl die CTL-Analyse anfangs für HLA-A2/Peptid-Interaktionen untersucht und gezeigt woirde, stellt die vorliegende Erfindung Vakzination-induzierte CTL-Antworten bereit, die durch weitere HLA-Klasse I-Allele restringiert sind. Somit können Einblicke in die Fähigkeit zur Immunantwort des Patienten auf diese Immunogene bereit gestellt werden durch eine detaillierte Analyse von HLA-Restriktionsmustem für die Peptid-Präsentation und Identifikation von möglichen Konsensus- Anker-Motiven.
Patienten mit massiven Tumoren, die mutantes ras exprimieren, umfassend, aber nicht beschränkt auf Darmkrebs, Lungenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Endometriumkrebs, Schilddrüsenkrebs, Melanom, Oralkrebs, Laryngealkrebs, Seminom, hepatozellulärer Krebs, Gallengangkrebs, akute myeloblastische Leukämie, Basalzell-Karzinom, Plattenepithelkarzinom, Prostatakrebs und dergleichen, profitieren von der Immunisierung mit den mutanten ras-Peptiden. Eine Tumorgewebeprobe wird zur Bestimmung der ras-Muiaüon aus einem Patienten erhalten, wobei im Fachgebiet bekannte Techniken wie die PCR-Analyse angewandt werden. Patienten, die der Behandlung unter Verwendung der mutanten ras-Peptide der vorliegenden Erfindung zugänglich sind, sind solche Patienten, die Tumore mit ras-Mutationen im normalen ras p21-Protein besitzen. Von besonderem Interesse sind Tumore mit einer Punktmutation im Codon 12, im Einzelnen sind dies die Mutationen Gly zu Cys, Gly zu Asp, Gly zu Val, Gly zu Ala, Gly zu Arg und Gly zu Ser an Position 12.
Das mutante raw-Peptid, das für die Immunisierung verwended wird, ist dasjenige, welches der ras-Mutation im Tumor des Patienten entspricht. Die Peptide können unter GMP-Bedingungen chemisch synthetisiert, und mittels HPLC auf eine Reinheit von > 95% angereinigt und lyophilisiert werden. Pharmazeutische Zusammensetzungen werden formuliert durch Wiederherstellung des Peptids mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger wie Natriumchlorid. In einem Beispiel enthält jeder Milliliter Lösung 1500 ug eines mutanten ras-Peptids plus 9.0 mg Natriumchlorid. Die mutanten ras-Peptide mit Cys oder Val an Position 12 werden bei einem pH-Wert von etwa 4.5 bis etwa 6.5 hergestellt. Die mutanten ras-Peptide mit Asp an Position 12 werden bei einem pH-Wert von etwa 3.5 bis etwa 5.5 hergestellt. Wenn das mutante ras-Peptid mit einem Adjuvans verabreicht wird, ist es wünschenswert, das Peptid mit dem Adjuvans kurz vor der Verabreichung an einen Patienten zu Vermischen.
Die Verabreichung des mutanten ras-Peptids an einen Patienten kann auf verschiedenen Wegen erfolgen, einschließend, aber nicht beschränkt auf subkutane, intramuskuläre, intradermale, intraperitoneale, intravenöse und ähnliche Verabreichungsformen. In einer Ausrührungsform wird das mutante ras-Peptid subkutan verabreicht. Das Peptid kann einem Patienten an einer oder mehreren Stellen verabreicht werden. In einer Ausfühnmgsform wird das Peptid, alleine oder in Kombination mit einem Adjuvans, in drei Stellen subkutan verabreicht, und zwar über die Deltamuskel, die Schenkel und das Abdomen.
Bei einer weiteren Methode zur Erzeugung einer Immunantwort werden mutantes ras-Peptidgepulste antigenpräsentierende Zellen einem Patienten in einer Menge verabreicht, die wirksam ist, um eine antigenspezifische Immunantwort zu erzeugen. Die antigenpräsentierenden Zellen schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf dendritische Zellen, B-Lymphozyten, Monozyten, Makrophagen und dergleichen. In einer Ausführungsform werden dendritische Zellen aus einem Patienten nach Verfahren isoliert, die in Romani, N. et al (1994) beschrieben werden. Die isolierten dendritischen Zellen werden in vitro mit einem mutanten ras-Peptid für eine Zeitdauer von etwa 0.5 bis etwa 3 Stunden kultiviert und anschließend gewaschen, um nicht gebundenes Peptid zu entfernen. Die mutantes ras-Peptid-gepulste dendritischen Zellen werden dem Patienten in einer Konzentration von etwa 10&sup6; bis etwa 10&sup9; dendritische Zellen zurückübertragen. Solch eine Konzentration ist wirksam in der Erzeugung einer Immunreaktion in dem Patienten. Diese Immunantwort beinhaltet die Erzeugung von mutantes ras p21-Protein oder Peptid-spezifischen zytotoxischen T-Lymphozyten, die die Fähigkeit besitzen, das Wachstum von Tumorzellen zu inhibieren oder diese zu töten.
Die Kriterien zur Bestimmung einer anti-Tumor-Antwort in dem immunisierten Patienten sind wie folgt:
1. Vollständige Remission (CR): Vollständiges Verschwinden aller Anzeichen von Tumor und Wiederkehr von abnormalen Tests zu normalen Mengen für ein Minimum von vier Wochen.
2. Partielle Antwort (PR): Abnahme von mindestens 50% der Summe der Produkte der senkrechten Durchmesser aller gemessenen Läsionen in der Abwesenheit von Progression irgendeiner Läsion und kein Auftreten von neuen Läsionen für mindestens vier Wochen.
3. Dauerhafte Erkrankung (SD): Veränderung der messbaren Erkrankung, die zu gering sind, um die Erfordernisse für Partielle Antwort oder Progression zu erfüllen sowie das Erscheinen keiner neuen Läsionen für eine Zeitdauer von mindestens 12 Wochen. Es können keine Verschlimmerungen der Symptome auftreten.
4. Progressive Erkrankung (PD) oder Rückfall: Eins der unten aufgeführten Kriterien müssen erfüllt sein, um als progressive Erkrankung (PD) in Betracht gezogen zu werden:
Entwicklung irgendeines neuen Bereichs einer malignen Erkrankung (Mess- oder tastbar), Steigerung (> 25%) in irgendeinem vorbehandeltem Bereich der messbaren, malignen Erkrankung.
Die immunologische Reaktion auf die Immunisierung mit mutanten ras-Peptiden werden durch in vitro T-Zellproliferationsassay und/oder durch in vitro T-Zell zytotoxischen Assay vor und nach Vakzination bewertet.

In vitro T-Zellproliferation-Aassay

Die Patienten-PBMC werden in vitro mit dem angemessenen tumorspezifischen ras-Peptid inkubiert und hinsichtlich Pepid-induzierter Proliferation nach bis zu sechs Tagen Inkubation ausgewertet. Kulturen werden mit [³H]-Thymidin für die abschließenden 18-24 Stunden ihrer Kultur gepulsed. Proliferation wird anhand der [³H]-Thymidin-Aufhahme gemessen und quantifiziert. Eine Proliferation von mehr als dem Dreifachen über der Kontrolle (d. h. ohne Peptidstimulation oder mit dem normalen ras-Peptid) wird als positive Antwort bewertet.

In vitro T-Zell zvtotoxischer Assay

Der T-Zell zytotoxische Assay wird mit Hilfe des Standard [&sup5;¹Cr]-Freisetzungs-Assay gemessen. Kurz gesagt, werden target(Ziel)-Zellen (autologe Tumorzellen oder autologe EBV-transformierte B-Zellen) mit Na&sub2;&sup5;¹CrO&sub4; radioaktiv markiert. Die PBMC des Patienten (die zuvor mit dem geeigneten ras-Peptid stimuliert worden sind) werden zu den markierten Zielzellen in Anwesenheit oder Abwesenheit des entsprechenden ras-Peptids hinzugegeben. Zell-Lyse wird anhand der spezifischen Freisetzung von &sup5;¹Cr (spezifische Lyse) bestimmt. Falls eine nachweisbare präimmunisierungsspezifische Lyse vorhanden ist, wird eine 1,5fache Erhöhung der Lyse als positive Reaktion bewertet. Falls keine nachweisbare präimmunisierungsspezifische Lyse vorhanden ist, wird eine postimmunisierungsspezifische Lyse von 15 % als positive Reaktion bewertet.
Die vorliegende Erfindung schließt ein in vitro-Immunisierung für T-Zellproliferation and Erzeugung von zytotoxischen T-Zelllinien auf das tumorspezifische ras-mutierte Peptid. In vitro-Kultivierung von peptidspezifischer Zellen aus mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC), Lymphknotengewebe (LNT) oder Tumorinfiltrierenden Lymphozyten (TIL) mit mutantem ras-Peptid und IL-2 führt zur Erzeugung von peptidspezifischen T-Zellen. Diese T-Zellen werden auf Zytotoxizität gegen mutantes ras Peptid-stimulierte APC (autologe EBV-transformierte B-Zellen oder autologe Tumorzellen), wie hierin beschrieben, untersucht. Erzeugte T-Zellklone werden phenotypisch mittels Durchflusszytometrie auf Expression von CD3, CD4 und CD8 untersucht Mutantes ras-Petid-spezifische zytotoxische Lymphozyten können in einen Patienten adoptiv übertragen werden, um mutantes ras p21-exprimierende Tumorzellen zu inhibieren oder zu töten. Patienten können anschließend mit dem mutanten ras-Peptid, vorzugsweise mit einem Adjuvans, reimrnunisiert werden.
Im Allgemeinen werden zwischen etwa 1 x 10&sup5; und etwa 2 · 10¹¹ zytotoxische T-Zellen pro Infusion verabreicht, in z. B. ein bis drei Infusionen von jeweils etwa 200 bis etwa 250 ml über einen Zeitraum von 30 bis 60 Minuten verabreicht. Nach Beendigung der Infusionen kann der Patient mit einem biologischen Antwort-Modifizierer ("response modifier"), wie z. B. Interleukin 2 (IL-2) behandelt werden. Im Falle von IL-2 wird rekombinantes IL-2 intravenös in einer Dosierung von 720 000 IU pro Kilogramm Körpergewicht alle acht Stunden verabreicht. Nach adoptivem Transfer der antigenspezifischen zytotoxischen T-Zellen in den Patienten, kann der Patient zusätzlich mit dem mutanten ras-Peptid, welches zur Stimulation der zytotoxischen T-Zellen verwendet wurde, behandelt werden, um die T-Zellzahl weiterhin in vivo zu vermehren.
Die Erfindung umfasst eine DNA-Sequenz und Analoga davon, welche für ein mutantes ras- Peptid kodieren. Die DNA-Sequenzen umfassen eine Punktmutation am Codon, dass für die Aminosäure an Position 12 kodiert. Das normale Codon, welches für Glycin an Position 12 kodiert, d. h. GGT, wird durch ein mutu rtes Codon substituiert, welches für Asparaginsäure, Cystein, Valin, Alanin, Arginin und Serin kodiert. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das normale Codon durch ein imitiertes Codon, dass für Asparaginsäure, Valin oder Cystein kodiert, substituiert.
Eine DNA-Sequenz, die für ein ras-Peptid kodiert, dass eine Aminosäuresubstitution an Position 12 aufweist, kann umfassen:
oder Teil oder Variante davon gemäß Ans pruch l.
Eine DNA-Sequenz, die für ein ras-Peptid kodiert, das eine Aminosäuresubstitution an Position 12 umfasst, kann auch umfassen:
oder Teil oder Variante davon gemäß Anspruch 1, oder
oder Teil oder Variante davon gemäß Anspruch 1.
Die vorliegende Erfindung umfasst konservative Substitutionen, die auf Codon-Degeneration beruhen, sofern die Modifikation zu einem funktionell äquivalenten mutanten ras-Protein oder -Peptid mit erhöhter Immunogenität führt. Mit eingeschlossen sind Substitutionen in Codons an Positionen, die verschieden sind von dem Codon, dass für die Aminosäure an Position 12 kodiert. Beispielsweise kann desjenige Codon, dass für die Aminosäure Lysin an Position 5 kodiert, durch das Codon ersetzt sein, dass für die Aminosäure Tyrosin kodiert.
Die Erfindung stellt weiterhin bereit Vektoren und Plasmide, die eine DNA-Sequenz umfassen, die für ein mutantes ras-Peptid kodieren. Die Vektoren schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf E. coli Plasmid, einen Listeria-Vektor und einen rekombinanten, viralen Vektor. Rekombinante, virale Vektoren schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt aufOrthopoxvirus, Avipoxvirus, Capripoxvvirus, Suipoxvirus, Vaccinia, Baculovirus, humanes Adenovirus, SV-40, bovines Papillomavirus und dergleichen, umfassend die DNA-Sequenz, die für ein mutantes ras-Peptid kodiert.
Rekombinantes, mutantes ras-Peptid kann erhalten werden durch Verwendung eines Baculovirus-Expressionssystems in Übereinstimmung mit der Methode von Bei et al. (J. Clin. Lab. Anal. 9: 261-268 (1995)). Rekombinante, virale Vektoren können konstruiert werden mittels Verfahren, die im Fachgebiet bekannt sind, wie z. B. U.S.-Patent Nr. 5,093,258; Cepko et al. (Cell 37: 1053-1062 (1984)); Morin et al. Proc. Natl. Acad. Bei. USA 84: 4626-4630 (1987)); Lowe et al. (Proc. Natl. Acad. Bei. USA 84: 3896-3900 (1987)); Panicali & Paoletti (Proc. Natl. Acad. Bei. USA 79: 4927-4931 (1982)); Mackett et al. (Proc. Natl. Acad. Bei. USA 79: 7415-7419 (1982)); WO91/19803; Perkus et al. (Science 229: 981-984 (1985)); Kaufmann et al. (Int. J. Cancer 48: 900-907 (1991)); Moss (Science 252: 1662 (1991)); Smith und Moss (BioTechniques Nov/Dec, S. 306-312 (1984)); U.S.-Patent Nr. 4,738,846; Sutter und Moss (Proc. Natl. Acad. Bei. USA 89: 10847-10851 (1992)); Sutter et al. (Virology (1994); und Baxby und Paoletti (Vaccine 10: 8-9 (1992).
Wirtszellen, welche die DNA exprimieren können, die für das mutante ras-Peptid kodieren und von Vektoren oder Plasmiden getragen werden, sind prokaryotische und eukaryotische Wirtszellen und schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf E. coli, Listeria, Bacillus-Spezies, COS-Zellen, Vero-Zellen, Kücken-Embryo, Fibroblasten, Tumorzellen, antigenpräsentierende Zellen und dergleichen. Falls die Wirtszelle eine antigenpräsentierende Zelle ist, sollte die Wirtszelle zusätzlich ein MHC-Klasse I-Molekül exprimieren.
Die Erfindung ist im Einzelnen beschrieb in worden einschließlich der bevorzugten Ausführungsformen davon.

BEISPIELE

Beispiel 1

Material und Methoden

Auswahl der Patienten

Erwachsene Krebspatienten mit histologisch bestätigter Diagnose von Adenokarzinom des Kolons, des Gastrointestinaltraktes, der Lunge oder des Pankreas mit metastatischer Erkrankung, wurden als potentielle Kandidaten für diese Phase-1 klinische Studie geprüft. Tumorproben von diesen Patienten wurden untersucht auf Punktmutationen in dem K-ras-Gen an Codon 12 mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) von Paraffineingebetteten Schnitte unter Anwendung von Verfahren, die im Fachgebiet bekannt sind. Zusätzlich zur Erfüllung aller weiteren notwendigen Aufnahmekriterien, wie im FDA-genehmigten NCI klinischen Protokoll spezifiziert, wurden diejenigen Patienten, die die entsprechende K-ras- Mutation aufwiesen, für die Studie ausgewählt.

Peptide und Immunisierungen

Mutante ras-13-mer-Peptide, die als Immunogene verwendet wurden, wurden als klinisch reine Reagenzien unter GMP-Bedingungen synthetisiert (Bachem, Torrance, CA: > 97% Reinheit mittels HPLC). Kontrollpeptide und weitere, experimentelle Peptide, die in vitro verwendet wurden, wurden entweder kommerziell hergestellt (Bacherm) oder im Labor auf einem Applied Biosystems Model 432A personal peptide Synthesizer (Foster City, CA) unter Verwendung von Fmoc-Chemie (> 90% Reinheit mittels HPLC) synthetisiert. Diese Reagens-reinen Produkte wurden in wässriger Lösung zu 2 mg/ml gelöst, filter-sterilisiert und in Aliquots bei -70ºC aufbewahrt. Die normale Sequenz von rasp21, die Position 5-17 entspricht, ist Lys-Leu-Val-Val-Val-Gly-Ala-Gly-Gly-Val-Gly-Lys- Ser (KLVVVGAGGVGKS) (SEQ. ID NO: 1) Die mutanten ra-13-mer-Peptide, die in dieser Studie als Immunogene verwendet wurden, entsprachen der Substitution von Gly an Position 12 mit entweder einem Asp, Cvs oder Val-Rest. Patienten wurden subkutan (s. c.) an mehreren Stellen (d. h. Deltamuskel, Schenkel und Abdomen) mit dem passenden mutanten ras-13-mer- Peptid, welches der spezifischen Punktmutation entsprach, die vorher in einer autochthonischen Tumorprobe identifiziert wurde, injiziert. Vor jeder Vakzinierung wurde das Peptid aus einem lyophilisierten Vorrat frisch hergestellt, in sterilem Wasser rekonstituiert und durch Vortexen kimisch reinem Detox -Adjuvans (RIBI ImmunoChem research, Hamilton, MT) beigemischt, wie vom Hersteller beschrieben.
Das Detox -Adjuvans, welches in lyophilisierter Form bereitgestellt wurde, war aus zwei aktiven Immunostimulantien zusammengesetzt: Zellwandskellett (CWS) aus Mvcobactenum phlei und Monophosphoryl Lipid A (MPL) aus Salmonella minnesota R595, und als eine Öl- in-Wasser-Emulsion mit Squalene und Tween 80 hergestellt. Die Endkonzentrationen von CWS und MPL pro Vakzination waren jeweils 250 ug und 25 ug. Eine dosis-steigerungs- ("dose-escalation"), Phase-I klinische Studie wurde für bis zu zwölf Patienten, die in vier Gruppen aufgeteilt worden waren, entworfen. Gruppen I, II, III und IV wurden ausgewählt, um eine Gesamtmenge von jeweils 0.1 mg, 0.5 mg, 1.0 mg und 1.5 mg Peptid pro Vakzination zu erhalten, wobei bis zu drei Vakzinationen in einmonatlichen Abständen erfolgten.

Isolierung und Herstellung von mononukleären Zelllen des peripheren Blutes (PBMC)

PBMC wurden aus 50 ml heparinisiertem Vollblut mittels Ficoll-Hypaque Dichtegradientenzentrifügation isoliert (Lymphozyt-Separationsmedium; Organon-Teknika, Durham, NC), und zwar vor der ersten Vakzination und vier Wochen nach jeder Vakzination. Im Anschluss an die Isolierung nach jedem Intervall, wurden die PBMC in Flüssigstickstoff in einem sterilem Cocktail von 90% hitzeinaktiviertem, gepooltem, humanem AB-Serum (Valley Biomedical, Winchester, VA) und 10% Dimethylsulfoxid (DMSO) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) kryokonserviert. Grundlegende Immunantworten auf Mitogene und Antigene wurden zuerst bestimmt unter Verwendung frisch-aufgetauter, unfraktionierter PBMC, die vor der Vakzination und nach der dritten Vakzination gewonnen wurden. Für alle funktionellen Assays und Herstellung von Zellkulturen, wurden PBMC in einem Medium auf RPMI-1640-Basis suspendiert, mit 15 mM HEPES-Puffer (pH 7.4), 2 mM L-Glutamin, 0.1 mM; nicht-essentiellen Aminosäuren, 1 mM Natriumpyruvat, 50 uM β-Mercaptoethanol, 50 ug/ml Gentamicin (alle von GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD) und 10% hitzeinaktiviertem humanen AB-Serum (Valley Biomedical) suspendiert. Zelloberflächenphänotyp ruhender und aktivierter Lymphozyten wurden mittels direkter Immunfluoreszenz analysiert. Zellen wurden mit dem entsprechenden primären, monoklonalen Antikörper (MAb), konjugiert mit Fluorescein Isothiocyanat (FITC) (von Pharmingen, San Diego, CA oder Becton Dickinson, Mountain View, CA) behandelt, mit 1% Paraformaldehyd fixiert und mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung eines FACScan (Becton Dickinson) auf den Prozentsatz von positiven Zellen und mittlerer Fluoreszenzintensität (MFI) ausgewertet.

In vitro-Stimulations (IVS)-Zyklen für die Auswertung von CD+ T-Zellantworten

IVS- Zyklen wurden etabliert, um: (i) Nachweis einer schwachen, proliferativen Antwort zu amplifizieren, (ii) präimmune mit postimmune Lymphozyten über einen Zeitraum zu vergleichen für die Bewertung der potentiellen Peptid-spezifischen Reaktivität und (iii) peptidspezifische T-Zelllinien in Kultur zu gewinnen für eine detaillierte phänotypische und funktionelle Charakterisierung. Bei dem ersten IVS-Zyklus wurden frisch-aufgetaute PBMC (5 · 10&sup5;/well), gewonnen vor der Vakzination und nach der dritten Vakzination, in parallelen Kulturen in 24- well-Platten (Costar, Cambridge, MA) mit bestrahlten (2,000 rad), autologen PBMC (3-5 · 10&sup6;/well) als antigenpräsentierende Zellen (APC) plus das immunisierende ras-Peptid (50 ug/ml) und rekombinantem, humanem I1-2 (10 U/ml, Cetus, Emeryville, CA) inkubiert. Nach Inkubation für 7 Tage, wurden lebensfähige Zellen gewonnen und nochmals auf peptidspezifische Reaktivität mittels Proliferationsassays untersucht (siehe unten) und/oder durch fortwährende, wöchentliche Stimulation mit Peptid und I1-2 rekultiviert. Für nachfolgende IVS- Zyklen wurden die gewonnenen Lymphozyten bei 2-5 · 10&sup9;/well und APC bei 5 · 10&sup6;/well in Kultur gehalten. Nach dem dritten oder vierten IVS-Zyklus wurden autogene PBMC durch Epstein-Barr Virus (EBV)-transformierte, autologe B-Zellen als APC (d. h. Blymphoblastoide Zelllinie (BLCL) bei 5 · 10&sup5;/well und bestrahlt bei 20 000 rad) ersetzt. Obwohl IL-2 bei 10 U/ml bei allen IVS-Zyklen gehalten wurde, wurde die Peptid-Dosierung allmählich auf 5 ug/ml für die Vermehrung ausschließlich von Ag-spezifischen T-Zellkulturen herabgesetzt.

IVS-Zyklen für die Bewertung von CD8+ T-Zellantworten aus HLA-A2+-Patienten

Frisch aufgetaute PBMC (aus ras-Patienten 32 und 33), gewonnen vor der Vakzinierung und nach der dritten Vakzinierung, wurden mit T-Lymphozyten durch Passage über Nylonwoll- Säulen angereichert (Robbins Scientific, Sunnyvale, CA) und anschließend von CD4+ T-Zellen entleert durch negative Selektion durch Waschen ("panning") in anti-CD4 Mab-beschichteten T25-Flaschen (Applied Immune Sciences, Santa Clara, CA). Für den ersten IVS- Zyklus wurden CD8+-angereicherte Lymphozyten (5 · 10&sup5;/well) in Platten mit 24 Vertiefungen mit bestrahlten, autologen PBMC (5 · 10&sup6;/well) als APC kultiviert, die für 3 Stunden mit dem entsprechenden mutanten ras-Peptid (50 ul/ml) plus humanem β&sub2;-Mikroglobulin (10 mg/ml) (Calbiochem, san Diego, CA) vorinkubiert waren. Das mutante ras-Peptid, das hier verwendet wurde [d. h. ras5-14(Asp12)] entsprach jedoch einer kürzeren Sequenz des ursprünglichen Immunogens, welches an HLA-A2 binden konnte (siehe Bioassay weiter unten). IL-2 (10 U/ml) wurde drei Tage später hinzugefügt. Nach weiteren sieben Tagen wurden lebensfähige Zellen (2-5 · 10&sup5;/well) rekultiviert durch wöchentliche Stimulation mit APC, die mit Peptid/β&sub2;-Mikroglobulin vorgepulsed waren und IL-2-Zugabe einen Tag später. Nach dem dritten oder vierten IVS-Zyklus wurden autologe PBMC durch EBV-transformierte, autologe BLCL (5 · 10&sup5;/well) als APC ersetzt. Die Peptid-Dosis wurde allmählich auf 5 ug/ml für die Vermehrung ausschließlich von Ag-spezifischen CTL-Kulturen reduziert. CTL-Aktivität wurde von Kulturen 5 bis 6 Tage nach Ag-Restimulation bewertet.

Proliferationsantwort

Frisch aufgetaute PBMC (1.5 · 10&sup5; Zellen/well) wurden in Flachbodenplatten mit 96 Vertiefungen (Costar in der Abwesenheit und Anwesenheit von Mitogenen für bis zu 3 Tagen und Antigenen für bis zu 6 Tagen inkubiert. Die Mitogene schlössen ein Phytohemagglutinin (PHA-P) und Pokeweed mitogen (PWM) (beide von Sigma), während die Antigene Tetanus Toxoid (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Wyeth Laboratories, Marietta, PA) und die erwähnten Ras 13-mer-Peptide einschlössen. Weiterhin wurden am Ende eines jeden IVS-Zyklus' Lymphozytkulturen (5 · 10&sup4;/well) aufPeptid-spezifische Proliferation untersucht unter Verwendung bestrahlter APC (d. h. PBMC, 5 · 10&sup5;/well oder BLCL, 5 · 10&sup4;/well), die mit unterschiedlichen Konzentrationen an mutanten und Kontroll-ray-Peptiden für bis zu drei oder vier Tagen inkubiert wurden. In allen Assays wurden die Kulturen mit [³H]-Thymidin (1 uCi/well; Amersham, Arlington Heights, IL) für die letzten 18-24 Stunden ihrer Inkubation gepulsed. Zellen wurden mit einem TOMTEC MACH II 96 Emter (Wallace, Inc., Gaithersburg, MD) gesammelt und die aufgenommene Radioaktivität wurde mittels Flüssigszintillationsspektroskopie bestimmt (1205 Betaplate flat bed LS counter; Wallace). MHC-Klasse I oder II Restriktion wurde mittels MAb-Blockierungsexperimenten unter Verwendung von Anti-HLA-A, B, C (Klon G46-2.6) oder Anti-HLA-DR, Anti-HLA-DP oder Anti-HLA-DQ (jeweils Klone TU36, HI43 oder TU 169) (Alle von Pharmingen) analysiert. Anti-CD4 (Klon OKT4) und Anti-CD8 (Klon OKT8) (beide von ATCC) wurden in funktionellen Assays verwendet, um den Phänotyp der reagierenden T- Zell-Untergruppen zu bestätigen. Ergebnisse wurden berechnet als Durchnitts-cpm ± SFM von Dreifachkulturen oder Stimulationsindex, welcher berechnet wurde durch Division der cpm von experimentellen Kulturen (Durchschnittswerte aus je drei wells) mit dem cpm der unstimulierten Kontrollkulturen (Durchschnittswerte aus je drei wells).

HLA-A2-Bindungs-Bio-Assay

Die 174CEM. T2-Zelllinie ("T2") (Transport-Deletionsmutante), wie in Anderson et al., 1993, J. Immunol. 151: 3407-3419, beschrieben, wurde als Bio- Assay verwendet, um die potentielle funktionelle Bindung von exogen-bereitgestellten Peptide an humanes HLA-A2 zu messen, ähnlich wie beschrieben (16) mit einigen Abänderungen. Kurz gesagt, wurden T2-Zellen (1 · 10&sup6;/Behandlung) in einer Platte mit 24 Vertiefungen übernacht in Serumfreiem IMDM-Medium in Abwesenheit und Anwesenheit der verschiedenen mutanten ras-Peptide (50 ug/ml) plus humanem β&sub2;-Mikroglobulin (10 ug/ml für Calbiochem oder 3 ug/ml gereinigtes Protein von Intergen, Purchase, NY) inkubiert. Das CEA&sub5;&sub7;&sub1;&submin; &sub5;&sub7;&sub9;-Peptid wurde hier als positive Kontrolle für die Bindung an HLA-A2 mit eingeschlossen (17). Nach Inkubation wurden T2-Zellen frei gewaschen von ungebundenem Peptid und β&sub2;- Mikroglobulin und mittels indirekter Immunfluoreszenz auf die phenotypische Expression und mögliche Hochregulation von HLA-A2 unter Verwendung eines HLA-A2-speziflschen MAb (One Lambda, Canoga Park, CA) gefärbt. Zusätzlich wurden T2-Zellen mit einem Pan HLA-Klasse I-MAb, W6/32, und einem isotyp-passenden (IgG2a) MAb, UPC-10 (Cappel, West ehester, PA), gefärbt. Messwerte wurden als MFI der selektierten positiven Zellen ausgedrückt.

Zytotoxische Antwort

Zytotoxizität wurde über einen konventionellen &sup5;¹Cr-Freisetzungs- Assay, wie beschrieben (6), untersucht. Kurz gesagt, wurden target(Ziel)-Zellen (d. h. T2, C1R-A2, BLCL, K562) mit 200 uCi Na&sub2;[&sup5;¹Cr]O&sub4; (Amersham) für 60 Minuten bei 37ºC radioaktiv markiert, gefolgt von gründlich am Waschen, um nicht aufgenommenes Isotop zu entfernen. Effektoren und targets (1 x 10&sup4;/well) wurden in U-Boden-Platten mit 96 Vertiefungen (Costar) bei verschiedenen Effektor-Target (E/T)-Verhältnissen in Abwesenheit und Anwesenheit von Peptid (+/- monoklonalem Antikörper (MAb), gerichtet gegen CD4, CD 8 oder HLA-A2-Moleküle (Klon BB7.2 von ATCC)) für bis zu sechs Stunden inkubiert. Nach Inkubation wurden Überstände gesammelt unter Verwendung eines Überstand-Sammelsystems (Skatron, Sterling, VA) und es wurde die Radioaktivität in einem γ-Zähler (Packard Instruments, Downers Grove, IL) gemessen. Zytotoxische Aktivität wurde definiert als prozentspezifische Freisetzung von &sup5;¹Cr und über die Gleichung [(experimentellcpm - spontancpm)/maximumcpm - spontancpm)] · 100 berechnet. Ergebnisse wurden als Durchschnittswert ± SFM der Dreifachkulturen ausgedrückt. Die C1R-A2-Linie ist eine BLCL, transfiziert mit dem HLA-A2-Gen (erhalten von Dr. P. Creswell, Yale Universität) (Storkus et al. 1987, J. Immunol. 138: 1657-1659) und K562 ist eine erythroleukämische Zelllinie (ATCC, Rockville, MD), die zur Messung von NK-Aktivität verwendet wird.

Immuno-Assays für den Nachweis von mutantem K-ras-Protein in humanen Tumorzelllinien

Proliferations-Antwort

Normale und mutante ras-Proteine wurden aus verschiedenen Tumorzelllinien gewonnen (ATCC). Diese Zelllinien schlössen ein: Calu-1, ein Lungenkarzinom mit einer Cys12-Mutation; SW480, ein Kolonkarzinom mit einer Val12-Mutation; und HT-29, ein Kolonkarzinom mit keiner bekannten ras-Codon 12-Punktmutation (1, 18, 19). Detergenz-Lysate wurden aseptisch ausjeier Zelllinie durch Extraktion (bei 10&sup7; Zellen/ml) in Puffer, der 10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40 und Proteaseinhibitoren (2 ug/ml Aprotinin; 0,2 mM PMSF; 0.5 ug/ml Leupeptin) enthielt, hergestellt. Nach der Extraktion in nichtionischem Detergenz und der Entfernung von Kernen und Trümmern, wurden Proteinkonzentrationen in den Lysaten mittels BCA Protein-Assay Reagenz (Pierce, Rockford, IL) bestimmt und Aliquots wurden bei -70ºC bis zur Analyse aufbewahrt. Um ras-Proteine spezifisch aus diesen zellulären Extrakten zu trennen und zu gewinnen, wurden sie in Vertiefungen inkub ert (von Flachbodenplatten mit 96 Verteilungen; Costar), die mit einem Pan ras-Mab, Kon RAS 10 (Onkogene Science, Cambridge, MA), zuvor beschichtet worden waren. Klon RAS 10 ist zuvor als capture-MAb in einem sandwich ELISA verwendet worden (20). Kurz gesagt, wurden Platten mit RAS 10 (3 ug/ml in 0.05 ml/well oder 0.15 ug/well), der in 0.1 M Carbonatpuffer (pH 9.6) suspendiert war, übernacht bei 4ºC beschichtet. Die Vertiefungen ivurden anschließend mit PBS gewaschen und mit PBS, das 5% BSA enthielt, für 60 Minuten bei 37ºC blockiert. Lysate wurden bei spezifischen Proteinkonzentrationen hinzugegeben und übernacht bei 4ºC mit zusätzlichem BSA (0.5%) und Extraktionspuffer inkubiert, um ein Endvolumen von 0.1 ml zu erreichen. Kontroll-Vertiefüngen erhielten ausschließlich Verdünnungsmittel (d. h. Extraktionspuffer). Vorbereitend für den Proliferations-Assay wurden Platten gründlich (sechs bis acht mal) mit Kulturmedium gewaschen.

Durchflusszytometrie

Jede Zelllinie wurde auf die Expression von intrazellulären ras p21- Proteinen, unabhängig von Mutationen, mittels Durchflusszytometrie, auch unter Verwendung des Pan ras-MAb, Klon RAS 10 (Oncogene Science protocols), untersucht, Zellen wurden gewaschen, um Serum zu entfernen, mit 2% Paraformaldehyd für 10 Minuten bei Raumtemperatur fixiert (bei 10&sup6; Zellen/ml) und in PBS-Puffer, dass 10% hitzeinaktiviertes Ziegensemm (GIBCO/BRL) plus 0.1% Saponin (Calbiochem) enthielt, gewaschen und gehalten. Anschließend wurden die Zellen mit dem entsprechenden primaren MAb behandelt, gefolgt von einer Zweitfärbung mit FITC-konjugiertem, affinitätsgereinigtem, Ziegen Anti-Maus IgG (Southern Biotechnology, Birmingham, AL) und Analysiert. Tabelle 1 Ras p21-Expression in Karzinomzelllmien, gemessen mittels Durchflusszytometrie

Enzym-Immuno-Assay

In ähnlicher Weise wurde jede Zelllinie ebenfalls auf die Expression von intrazellulären ras p21-Proteinen, unabhängig von Mutationen, mittels eines ELISA untersucht. Wie oben beschrieben, wurden Platten übernacht bei 4ºC mit RAS 10 (0.15 ug/well) beschichtet, der in 0.1 M Carbonatpuffer (pH 9.6) suspendiert war. Zur selben Zeit wurden Lysate (300 ug an Protein) oder Lösungsmittelkontrollen in separaten Polypropylenröhrchen mit MAb-Klon Y 13-238 (1 ug/ml) (Oncogene Science) inkubiert, der sowohl mit K-ras-, als auch mit H-ras-Proteinen (21) oder einsm isotyp-passenden MAb (Ratten-IgG2a anti-Maus B7.1; Pharmingen) reagiert. Am nächsten Tag wurden die Vertiefungen mit PBS gewaschen und mit PBS, dass 5% BSA enthielt, für 60 Minuten bei 37ºC blockiert. Die Lösungsmittelkontrolle oder Lysate wurden bei festgelegten Proteinkonzentrationen hinzugegeben und es wurde übernacht bei 4ºC mit zusätzlichem BSA (0.5%) und Extraktionspuffer (um ein Gesamtvolumen von 0.05 ml zu erhalten) in kubiert. Platten wurden sechs mal mit PBS, das 0.05 % Tween 20 (PBST) enthielt, gewaschen und für 60 Minuten bei Raumtemperatur mit einem affinitätsgereinigtem, Ziegen-anti-Ratte IgG, das an Meerrettichperoxidase konjugiert war (1 : 1,000-Verdünnung; Southem Biotechnology), inkubiert. Platten wurden sechs mal mit PBST gewaschen und die Reaktionen wurden sichtbar gemacht nach Hinzurügen des Chromogens o-phenylendiamin-Dihydrochlorid (Sigma) und Wasserstoffperoxyd und es wurde bei einer Absorption von 490 nm unter Verwendung eines ELISA automatischen Mikrotiterplattenlesegerätes (Bio-Tek Instruments, Winoski, VT) gemessen. Tabelle 2 Ras p21-Expression in Karzinomzelllinien, gemessen mittels Enzym-Immuno-Assay

Beispiel 2

Vakzination von Krebspatienten mit mutanten ras-Peptiden und Herstellung von antimutantes, ras-spezifischen, MHC-Klasse II-restringierte CD4+ T-Zelllinien

Eine Peptid-basierende, Phase-I klinische Studie wurde in Patienten mit metastatischem Karzinom initiiert. Die Tumore dieser Patienten beherbergten Punktmutationen in den ras p21- Protoonkogenen an Codon 12. Ausgewählte Patienten wurden mit einem, mutanten ras 13- mer-Peptid, umfassend Positionen 5-17, die der spezifischen Punktmutation an Codon 12 in ihren Tumoren entsprachen, vakziniert. Nach Abschluss der Vakzination bei zwei der vier Gruppen (drei Patienten/Gruppe) zeigten zwei Patienten peptidspezifische, zelluläre Immunreaktionen, die aus der Vakzination resultierten.

Patient 43; Mutantes ras5-17(Cys12)-Peptid

Patient 43 erhielt drei vollständige Vakz nations-Zyklen mit dem mutanten ras5-17(Cys12)- Peptid, 0.5 mg/Vakzination (d. h. Gruppe II), verabreicht in Detox -Adjuvans. Lymphozyten wurden in vitro mittels IVS (siehe Beispiel 1) aus Lymphozyten nach der dritten Vakzination des RAS-Patienten 43. Antigenspezifische, Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC)-Klasse II-restringierte CD4+-Zelllinien wurden etabliert durch Kultivierung auf dem immunisierenden Peptid [d. h. Ras5-17(Cys12)] (Fig. 1A und 1B). Lymphozytenkulturen wurden auch vor der Vakzination aus diesem Patienten gewonnen. Die Lymphozytenkulturen wurden analysiert und hinsichtlich peptidspezifischer zellvermittelter Immunität verglichen (Tabelle 3). Lymphozytenkulturen, die nach der Vakzination erhalten wurden, zeigten eine Dosisabhängige proliferative Antwort nach Stimulierung mit dem immunisierenden Peptid, wie durch cpm und SI-Werte ausgedrückt wird. Im Gegensatz dazu war keine proliferative Antwort detektierbar nach Inkubation mit normalem ras5-17(Gly12)-Peptid, was das Fehlen von Kreuzreaktivität mit Wildtyp-ras und die Spezifität für die Erkennung der mutierten ras-Sequenz offenbarte. Außerdem konnten Lymphozytenkulturen, die vor der Impfung erhalten wurden, nicht als Reaktion auf Stimulierung mit dem mutanten ras5-17(Cys12)-Peptid proliferieren, auch nicht nach vier IVS-Zyklen mit dem selben Peptid (Tabelle 3). Während Lymphozytenkulturen, die nach der Vakzination erhalten wurden, weiterhin als eine Ag-spezifische Zelllinie in vitro proliferierten (siehe z. B. Fig. 1A und 1B), begannen Lymphozytenkulturen, die vor der Impfung erhalten worden waren, eine beträchtliche Verminderung zu zeigen, was ihre Fähigkeit betraf, bei IVS-Zyklus 5 zu wachsen. Somit deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die proliferative Aktivität, die von der Lymphozytenkultur nach der dritten Vakzination ausging, wahrscheinlich aus einer in vivo-Stimulation ("priming") resultierte.
Die Kinetik für die Entwicklung dieser Lymphozyten-Antwort wurde untersucht und beispielhaft von den IVS-Zyklen 3-7 gezeigt (Fig. 1A). Peptidspezifische Lymphozyten-reaktivität nahm über die Zeit zu, wie bei zwei verschiedenen ray5-17(Cys12)-Peptidkonzentrationen gemessen wurde. Diese Messwerte zeigten, dass die Stärke des Peptid-induzierten proliferativen Signals mit höherem IVS-Zyklus zunahm, wobei keine nachweisbare Kreuzreaktivität gegen die Wildtyp ras-Sequenz induziert oder beobachtet wurde. Auch wurde keine nachweisbare Proliferation beobachtet bei Verwendung eines irrelevanten mutanten ras5-17- Peptids, welches Val an Stelle von Cys an Position 12 enthielt (Fig. 1B), was weiterhin die Lymphozyt-spezifische Erkennung des mutanten ras5-17(Cys12)-Peptids zeigte.
Obwohl die Durchflusszytometrie den Phänotyp dieser Lymphozytenkultur als überwiegend CD4+ offenbarte, waren anti-CD4-MAb in Proliferations-Assays enthalten, um die funktionelle T-Zell-Subklasse zu identifizieren und zu bestätigen (Fig. 2B). In der Tat inhibierte anti-CD4-MAb, nicht jedoch anti-CD5-MAb die Lymphoproliferation, was daraufhindeutete, dass die peptidspezifische proliferative Antwort über CD4+-T-Zellen vermittelt wurde. Weiterhin wurden MAb, die gegen nicht-polymorphe Determinanten von HLA-Klasse I und II (DP, DR, DQ)-Moleküle gerichtet waren, verwendet, um die Natur und die Erfordernisse der MHC-Restriktion für die Peptidprä sentation zu definieren. Die proliferative Antwort wurde als HLA-Klasse II-restringiert bestimmt, was auf das (die) HLA-DP-Allel(e) zurückfiel, da MAb, die gegen HLA-DP, aber nicht HLA-DR oder HLA-DQ oder HLA-Klasse I gerichtet waren, die peptidspezifische Sti nulierung wirksam inhibierte.
Somit schien die Vakzinierung des Patenten mit mutantem Ras5-17(Cys12)-Peptid zur in vitro-Stimulierung ("priming") einer Ag-spezifischen, HLA-DP-restringierten CD4+ -T-Zellantwort, was in vitro durch die Herstellung und Vermehrung der Vorläuferpopulation bestimmt wurde. Obwohl keine spezifische zytotoxische Reaktion gegen Peptid-gepulste, autogene EBV-B-Zellen als targets (Ziele) ermittelt wurde, wurde eine spezifische IFN-γ-Produktion als Reaktion auf Ag-Stimulation nachgewiesen.

Patient 29; Mutantes Ras5-17(Val12)-Peptid

Patient 29 hatte ein Zwölffmgerdarmkarzinom als primäre Krebsform, das eine K-ras-Mutation an Codon 12 beinhaltete, welches für die Substitution von Gly mit Val kodierte. Patient 29 erhielt drei vollständige Vakzinations-Zyklen mit dem mutanten ras5-17(Val12)-Peptid, zu 1 mg/Vakzination (d. h. Gruppe III), was in Detox -Adjuvans verabreicht wurde. Patient 29 teilte ein HLA-A2-Allel, und PBMC's des Patienten 29 wurden auf Anzeichen von CD4+- und CD8+-T-Zell-Antworten ausgewertet
Wie bei Patient 43 (Tabelle 3), proliferierten die nach Impfung erhaltenen PBMC's des Patienten 29 nach IVS in Antwort auf Stimulation mit dem immunisierenden Peptid (Fig. 8A). Im Gegensatz dazu war keine proliferative Antwort nach Inkubation mit dem normalen ras5- 17(Gly12)-Peptid nachweisbar, was somit die TCR-Spezifität für die Erkennung der mutierten ras-Sequenz bekräftigte. PBMC-Kulturen, die vor der Vakzination erhalten und in paralleler Weise nach dem selben IVS-Zyklus untersucht wurden, zeigten keine Proliferation in Antwort auf Stimulation mit dem mutanten ras5-17(Val12)-Peptid (Fig. 5B). Somit konnte gezeigt werden, dass die proliferative Aktivität, die von der Lymphozytenkultur nach Vakzination ausging, wahrscheinlich ein Ergebnis einer in vivo-Sensibilisierung darstellte. Ebenso wurde, wie bei Patient 43, eine Ag-spezifische T-Zelliinie der PBMC nach Vakzination des Patienten 29 durch IVS mit autologen EBV-Zellen, antigenem Peptid und IL-2 vermehrt und aufrechterhalten. Es konnte gezeigt werden, dass die peptidspezifische, proliferative Antwort von CD4+-T-Zellen vermittelt wurde, da anti-CD4-MAb, jedoch nicht anti-CD5-MAb die Lymphoproliferation inhibierte (Fig. 8b). Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass die proliferative Antwort HLA-Klasse II-restringiert war, was überwiegend auf das HLA-DQ-Allel zurückfiel, da MAb, die gegen HLA-DQ, jedoch nicht gegen HLA-DR, HLA-DP oder HLA- Klasse I gerichtet waren, Peptid spezifische Stimulation inhibierte. Somit schien die Impfung des Patienten 29 mit mutantem ras5-17(Val12)-Peptid zur in vivo-Stimulierung ("priming") einer Ag-spezifischen, HLA-DQ-restringierten CD4+-T-Zellantwort zu führen. Wie bei Patient 43, zeigte die CD4+-T-Zelllinie des Patienten 29 keine spezifische Zytotoxizität gegen Peptid-gepulste, autologe EBV-B-Zellen als targets (Ziele), obwohl sie in Antwort auf spezifische Ag-Stimulation sowohl IFN-Gamma, als auch IL-4, produzierte.

Beispiel 3

Fähigkeit der Peptid-abgeleiteten CD4+-T-Zeminie des Patienten 43 zur Erkennung des passenden, mutanten ras-Proteins

Es war eine wichtige, immunologische Fragestellung, herauszufinden, ob die ras-Peptid-induzierten T-Zelllinien auch eine prozessierte Form des korrespondierenden mutanten ras-Proteins erkennen konnten, welches entweder von dem Tumor oder der APC-Population exprimiert und präsentiert würde. Ein Modellsystem wurde entwickelt, um die Fähigkeit der antiras5-17(Cys12)-peptidspezifischen CD4+-T-Zelllinie des Patienten 43 zu untersuchen, das mutante ras-Cys12-Protein zu erkennen, welches von einer autologen APC-Population (d. h. EBV-B-Zellen) prozessiert und präsentiert wurde (Tabelle 4). Da eine aufgereinigte oder rekombinante Quelle von mutantem ras-Cys12-Protein nicht verfügbar war, wurde das Protein durch Extraktion (mit nichtionischem Detergenz) aus einer humanen Tumorzelllinie, dem Calu-1 Lungenkarzinom, das die bestimmte Codon 12-Mutation beherbergt, isoliert. Die HT- 29 und SW480 Colonkarzinomzelllinien, die jeweils entweder keine bekannte Codon 12- oder eine Val 12-Mutation beherbergen, wurden als Quelle für negative Kontrollproteine verwendet, um die Spezifität der Immunreaktion zu verfolgen. Um die Gesamt-ras-Proteine für die biologische Präsentation durch eine APC-Population aus diesen rohen Detergenz-Lysaten abzutrennen und spezifisch zu gewinnen, wurden sie zunächst in Vertiefungen (Platte mit 96 Vertiefungen) inkubiert, die mit Pan ras-MAb, Klon FLAS 10, vorbeschichtet worden waren, der zuvor als "Fänger" MAb in einem ELISA-Format charakterisiert wurde (20). Nichtgebundenes Material wurde aus diesen Vertieft ngen vor Zugabe von Zellen durch reichliches Waschen in physiologischer Pufferlösung und Kulturmedium entfernt.
Unter Verwendung dieses Modellsystems wurde gefunden, dass die anti-rasCys12-Peptidspezifische CD4+-T-Zelllinie, in Anwesenheit von EBV-B-Zellen als APC, in Antwortt auf das Calu-1-Lysat (d. h. "Extrakt") in einer Dosisabhängigen Weise proliferierten (Tabelle 4). Die Abwesenheit von spezifischer CD4+-Proliferation unter Verwendung von SW480 oder HT-29-Lysaten bekräftigte die Vermutung einer spezifischen TCR-Erkennung von ein oder mehreren Epitopen, die von den Calu-1-abgeleiteten ras-Proteinen exprimiert wurden. Zusätzliche Kontrollkulturen zeigten eine produktive CD4+-T-Zellproliferation in der Anwesenheit des spezifischen mutanten ras5-17(Cys12)-Peptids in einer dosisabhängigen Weise und das Fehlen einer spezifischen Proliferation in der Abwesenheit von Peptid oder in der Anwesenheit der nicht-mutierten ras-Peptidseq ienz (Tabelle 4). Die Anwesenheit von immobilisiertem Pan ras-MAb stimulierte weder Peptid-induzierte Proliferation, noch inmhibierte sie diese.
Die Kombination von EBV-B-Zellen als APC und immobilisiertem Pan ras-MAb erwies sich als unabdingbar in diesem Modellsystem, um die CD4+-T-Zellproliferation zu dem mutanten ras-Cys12-Protein hin zu stimulieren (Tabelle 5). In Abwesenheit von EBV-B-Zellen, jedoch in Anwesenheit von immobilisiertem Pan ras-MAb, konnte keine Proliferation beobachtet werden, was darauf hindeutete, dass eine APC-Population für die Prozessierung/Präsentation des mutanten ras-Proteins erforderlich war (Tabelle 5). Es war wahrscheinlich, dass Ag-prozessierende Vorgänge von der APC-Population benötigt wurden, da die Vorbehandlung von EBV-Zellen mit Chloroquine die Protein-induzierte, nicht jedoch die Peptid-induzierte Proliferation blockierte. Umgekehrt wurde trotz Anwesenheit von EBV-B-Zellen, in der Abwesenheit von immobilisiertem Pan ras-MAb oder in der Anwesenheit eines isotyp-passenden MAb, keine spezifische Proliferation beobachtet (Tabelle 5), was darauf hindeutete, dass der anti-ras-MAb von entscheidender Bedeutung für die spezifische Bindung der Calu-1-abgeleiteten ras-Proteine war. Die Unfähigkeit der SW480- und HT-29-abgeleiteten Lysate, CD4+-Proliferation zu stimulieren, beruhte wahrscheinlich nicht auf der Abwesenheit oder schwachen Expression des RAS 10 MAb-reaktiven Epitops, das für die effiziente Bindung von mv-Proteinen an solch ein Substrat erforderlich ist (Tabelle 2).
Ein Enzym-Immunoassay wurde entwickelt, der den spezifischen Nachweis von ras-Proteinen gestattete, die durch den Pan ras-MAb (Klon RAS 10) gebunden worden waren, unabhängig von der ras-Mutation, die für eine Tumorzelllinie intrinsisch ist. Unter Verwendung dieses Assay-Formats wurden demonstrierbare und vergleichbare Mengen an Bindungs-Reaktivität unter den drei verschiedenen Tumorzelllinien gefunden (Tabelle 2), was darauf hindeutete, dass die CD4+-Proliferation die TCR-Erkennung eines mutanten ras-Epitops, dass ausschließlich von den Calu-1-, nicht jedoch von den SW480- oder HT-29-Lysaten exprimiert wurde, widerspiegelte (Tabelle 4). Verg eichbare intrazelluläre Mengen an RAS 10-Expression wurden ebenfalls mittels Durchflusszytometrie unter Analyse von sowohl Prozent positive Zellen als auch MFI von permeabilisierten, fixierten Zellen, beobachtet. Tabelle 3 Wirkung der Peptid-Vakzination auf die proliferative Antwort des RAS-Patienten 43
Weiterhin war die Antwort antigenspezifisch und MHC-Klasse II-restringiert (Fig. 2A und B). Tabelle 4 CD4+ T-Zelllinie des RAS-Patienten 43 proliferiert als Antwort auf mutantes K-ras-Proteina

Beispiel 4

Identifizierung einer verschachtelten Peptidsequenz mit MHC-Klasse I (HLA-A2)- Bindungsaktivität

Die Induktion der CD8+ T-Zellreaktivität wurde untersucht. Solch eine CD8+ T-Zellaktivität hätte zusammen mit oder in Abwesenheit ier CD4+-T-Zellantwort auftreten können. In dieser Hinsicht könnte die in vivo-Stimulation ("priming") der CD8+-T-Zellantwort aus der in vivo- Prozessierung des Immunogens mit anschließender Erzeugung von MHC-Klasse I-reaktiven Epitopen resultieren. In einem Mausmodell wurden überlappende MHC-Klasse II-restringierte CD4+ und MHC-Klasse I-restringierte CD8+ CTL-Peptid-Epitope, die die ras-Val12- Mutation widerspiegelten, identifiziert. Zu diesem Zweck wurden in einem Arbeits-Modellsystem die ras5-17-Peptidsequenzen auf mögliche HLA-Klasse I-Konsensus-Anker-Motive, die das HLA-A2-Allel widerspiegelten, abgetastet. Die Ras-10-mer-Sequenz 5-14, unabhängig von einer Ras-Mutation, wurde als ein potentieller Kandidat für eine HLA-A2-Bindung identifiziert, da sie die bevorzugten dominanten Anker, Leu und Val, jeweils an der zweiten Position (d. h. Leu6) und an der C-Terminus-Position (d. h. Val14) des Peptids enthielt (43, 44). Die ras-9-mer-Sequenz 4-12 schien dis Motiv für bindende Interaktionen an Positionen 1 (d. h. Tyr4) und 9 (d. h. Val 12) zu erfüllen. Die N-terminale Lage des ersten dominanten Ankers, Leu, wurde an Position 3 (d. h. Leu6) gefunden.
Dementsprechend wurde ein Satz von ras5-14-Peptiden synthetisiert, die entweder die mutierten oder Wildtyp-Reste an Position 12 enthielten. Anschließend wurde die Fähigkeit dieser ras-Peptide, an HLA-A2 zu binden, mit Hilfe des T2-Bio-Assays und der Durchflusszytometrie auf die spezifische Hochregulation dieses Klasse I-Moleküls analysiert (Tabelle 7). CEA&sub5;&sub7;&sub1;&submin;&sub5;&sub7;&sub9;, ein 9-Aminosäuren-Peptid, dass ein CTL-Epitop ist, welches von HLA-A2 restringiert ist, wurde in diese Experimente als Positivkontrolle eingeschlossen. Inkubation von T2-Zellen mit mutanten Ras5-14-Peptiden, die entweder die Asp12, Cys12 oder Val12- Substitutionen aurwiesen, führte zur erhöhten Immunfärbung mit anti-HLA-A2-reaktivem MAk sowie mit einem "Pan"-Klasse I-MAb (W6/32), verglichen mit der Kontrolle ohne Peptid, was auf funktionelle Bindung zum HLA-Klasse I-A2-Allel hindeutete. Zusätzlich rührte die Inkubation von T2-Zellen mit dem Wildtyp ras5-14(Gly12)-Peptid zu einer erhöhten anti- HLA-A2-Färbung, was darauf hindeutete, dass weder die Abwesenheit noch die Anwesenheit des mutierten Restes wesentliche Auswirkungen auf die Bindung an HLA-A2 hatte.
Der Einfluss von Peptidgröße und relativer Lage der um Position 12 gelegenen Reste auf die HLA-A2-Bindung wurde unter Verwendung eines Spektrums an ras-Peptiden untersucht (Tabelle 7). Beispielsweise schien das 13-mer ras5-17(Asp12)-Peptid, dass die Kern-Reste für die Bindung an HLA-A2 enthielt, nicht an T2-Zellen unter diesen (semmfreien) Assay- Bedingungen zu binden, was auf eine kritische Peptidlänge und/oder erforderliche Lage von MHC-Anker-Resten hindeutete. Ähnliche Ergebnisse wurden mit ras5-17(Val12) und ras5- 17(Cys12)-Peptiden erzielt. Weiterhin wurde die Spezifität der Bindung dieser ras5-14-Peptide an HLA-A2 auf T2-Zellen unter Verwendung eines Satzes von mutanten rasVal12-Peptiden gezeigt, denen: (i) trotz passender Länge entweder ein [d. h. Ras5-13(Val12)] oder beide [d. h. nzs'8-16(Val12)] dominante Anker-Reste fehlten; und (ii) eine bevor2iigte Länge fehlte, obwohl sie dominante Anker-Reste in der zweiten und C-terminalen Position [d. h. ras5- 12(Val12)] besaßen.

Beispiel 5

Herstellung einer anti-rasAsp12-spezifischen, MHC-Klasse I-restringierten CD8+-T- Zelllinie aus Patient 32

Die oben beschriebenen mutanten ras5-14-Peptide wurden als in vitro-Immunogene verwendet und auf ihre Fähigkeit hin geprüft, Ag-spezifische CD8+-CTL-Linien aus HLA-A2-Patienten zu generieren, und zwar Vor- verglichen mit Nachvakzination, um zu bestimmen, ob die ras5-14-Peptidsequenzen HLA-A2-restringierte, CD8+ CTL-Epitope darstellten, und ob die nxs-Peptidvakzination zur Induktion einer CD8+ T-Zellantwort führte.
Patient 32, der ein HLA-A2-Allel exprimierte, hatte als primären Krebs Kolonkarzinom, das eine K-ras-Mutation an Codon 12 beherbergte, welches für die Substitution von Gly mit Asp kodierte. Patient 32 erhielt drei vollständige Vakzinations-Zyklen mit mutantem ras5- 17(Asp12)-Peptid bei 0.1 mg/Vakzination (d. h. Gruppe I), verabreicht in Detox -Adjuvans. Es wurde keine spezifische CD4+ proliferative Antwort von PBMC nach Vakzination gegen das immunisierende 13-mer-Peptid beobachtet, auch nicht nach mehreren IVS-Zyklen, jedoch schloss dies nicht die in vivo-Prozessierung des Peptids und die Erzeugung von HLA-Klasse I-reaktiven Epitopen für eine mögliche in vivo-Stimulierung ("priming") von CD8+ T-Zellen aus.
CD8+ T-Lymphozyten, isoliert aus RAS-Patient 32 vor der Vakzinierung und nach der dritten Vakzinierung, wurden durch IVS vermehrt (Beispiel I) und anschließend hinsichtlich der Entwicklung peptidspezifischer, zellvermittelter Zytotoxizität gegen C1R-A2-targets (Ziele) analysiert und verglichen (Tabelle 6). CD8+ Lymphozytenkulturen, die nach der Impfling erhalten wurden, fingen an peptidspezifische, zell vermittelte, bei IVS-Zyklus 6 beginnende Lyse aufzuzweisen, wobei die Stärke der Lyse mit der Zeit zunahm. Es war keine spezifische zytotoxische Antwort in Anwesenheit des normalen ras5-17(Gly12)-Peptids nachweisbar, was das Fehlen von Kreuzreaktivität mit dem Wildtyp-ras offenbarte und die Spezifität für die Erkennung der mutierten ras-Sequenz bekräftigte. Im Gegensatz dazu zeigten CD8+ Lymphozytenkulturen, die vor der Vakzination erhalten worden waren, keine spezifische Zytotoxizität. Während außerdem CD8+ Lymphozytenkulturen, die nach der Impfung erhalten wurden, weiterhin effizient als eine Ag-spezifische Zelllinie in vitro proliferierten (Tabelle 6), verloren CD8+ Lymphozytenkulturen, die vor der Vakzination erhalten worden waren, ihre Fähigkeit, über IVS-Zyklus 7 hinaus zu wachsen. Somit resultierte die zytotoxische Aktivität, die von der Lymphozytenkultur nach Vakzination des Patienten 32 ausging, wahrscheinlich aus in vivo-Stimulation ("priming"), wobei die ras5-14(Asp12)-Peptidsequenz ein HLA-A2- restringiertes CD8+ CTL-Epitop darstellte.
Es konnte bestätigt werden, dass die peptidspezifische, zellvermittlelte Zytotoxizität, die von der T-Zelllinie des Patienten 32 ausging, über CD8+ T-Zellen vermittelt wurde, da MAb, die gegen das CD8-, nicht jedoch gegen das CD4-Molekül gerichtet waren, die lytische Antwort zunichte machten (Fig. 7). Zusätzlich inhibierten MAb, gerichtet gegen HLA-A2 (Klon BB7.2) auf der Zielzelle, die Zytotoxizität (Fig. 7), was die Erfordernis für HLA-A2 für die Peptidpräsentation zeigte, was im Einklang mit den Bindungseigenschaften des Peptids war (d. h. durch den T2-Bioassay; Tabelle 7).
Die genaue Spezifität in der TCR-Erkennung des Peptids für die Lyse wurde unter Verwendung eines Satzes von ras-Peptiden untersucht (Fig. 5). Von den untersuchten ras5-14-Peptiden, sensibilisierte lediglich ras5-14(Asp12) die T2-Zelllinie für die Lyse. Im Gegensatz dazu konnten Ras5-14-Peptide, die die Wildtyp-Sequenz (Gly12) oder eine irrelevante Mutation (Val12) darstellten, die Lyse nicht; stimulieren, trotz ihrer Fähigkeit an HLA-A2 zu binden (Tabelle 7). Weiterhin schien ras5-17(Asp12), das als ursprüngliches Immunogen für die Vakzination verwendet wurde, Zytotoxizität unter diesen Versuchsbedingungen nicht zu induzieren, was auf die Unfähigkeit hindeutete, das entsprechende Peptidfragment in vitro zu generieren und/oder eine ausreichende Menge des relevanten Epitops herzustellen, um eine nachweisbare lytische Antwort zu induzieren. Das Fehlen der Lyse gegen K-562-Zellen (Fig. 5) sprach gegen einen Beitrag von NK-Ativität in diesen zytotoxischen Reaktionen. Somit konnte gezeigt werden, dass sowohl die Aminosäuresequenz als auch die Peptidlänge wichtig für die HLA-A2-Bindung und/oder TCR-Erkennung ist, die für die anti-ras, CD8+ CTL-vermittelte Lyse erforderlich sind.

Beispiel 6

Herstellung einer anti-rasVal12-spezifischen, MHC-Klasse I-restringierten CD8+ T- Zelllinie aus Patient 29

Die Erzeugung einer HLA-A2-restringierten CD8+ CTL-Antwort wurde bei Patient 29 untersucht. Als Folge der beschränkten Verfügbarkeit von Vollblut, das aus diesem Patienten gewonnen wurde (nach der dritten Vakzination), wurde eine T-Zelllinie aus unfraktionierten PBMC ohne CD8+ T-Zellanreicherung gewonnen. Da im Weiteren keine CD4+ T-Zellantwort mit Lymphozytenkulturen vor der Vakzination des Patienten 29 beobachtet wurde (Fig. 8A), was auf die Unwahrscheinlichkeit einer nachweisbaren, bereits existierenden Immunantwort hindeutete, wurden ausschließlich Lymphozyten nach der Vakzination auf CD8+ T- Zellreaktivität untersucht. Wie weiter oben für die Patienten 43 und 32 beschrieben, zeigten nur die Lymphozytenkulturen nach der Vakzination jeweils Peptid spezifische CD4+ oder CD8+ T-Zellaktivität. Im Gegensatz dazu wurden unter denselben Kultur- und Versuchsbedingungen in den Lymphozyten vor der Vakzination dieser Patienten keine nachweisbaren, bereits existierenden peptidspezifischen Immunantworten beobachtet. Lymphozyten aus Patient 29 wurden in vitro mit dem homologen mutanten ras 10-mer-Peptid [d. h. hier ras5- 14(Val12)] als Immunogen, was seine Fähigkeit, an HLA-A2 zu binden, widerspiegelte, vermehrt (Tabelle 7). Wie gezeigt, entfalteten solche Lymphozyten nach IVS-Zyklus 7 peptidspezifische, zellvermittelte Lyse gegen C1R-A2-targets (Ziele), die in Anwesenheit des ras5- 14(Val 12)-Peptids, jedoch nicht in Anwesenheit des normalen ras5-17(Gly12')-Peptids inkubiert wurden (Fig. 9A). Es konnte gezeigt werden, dass die Peptid spezifische, zellvermittelte Zytotoxizität, die von der T-Zelllinie des Patienten 29 ausging, über CD8+ T-Zellen vermittelt wurde, da MAb, gerichtet gegen das CD8-, jedoch nicht gegen das CD4-Molekül, die lytische Antwort inhibierte (Fig. 9B). Phänotypische Analyse dieser T-Zellen enthüllte einen Anteil von > 90% CD8+, wie von IVS-Zyklus 8 analysiert. Zusätzlich inhibierten MAb, gerichtet gegen HLA-A2 (Klon BB7.2) auf der target(Ziel)-Zelle (d. h. autologe EBV-B-Zellen), die Zytotoxizität (Fig. 9B), was ein Erfordernis für HLA-A2-Restriktion zeigte. In Anbetracht der Ergebnisse aus diesem und den oben aufgeführten Beispielen konnte die Produktion einer anti-rasVal12-spezifischen CD+ und CD8+ T-Zellantwort in demselben Patienten gezeigt werden (Fig. 8A, 8B, 9A, 9B).
Studien wurden ebenfalls durchgeführt, um zu bestimmen, ob solche peptidinduzierte CD8+ CTL eine prozessierte Form des entsprechenden mutanten nxy-Proteins erkennen konnten. Um diese Hypothese zu untersuchen, wurde die funktionelle Interaktion zwischen CD8+ T- Zellen aus Patient 29 und der SW480 Kolonkarzinom-Zelllinie untersucht. SW480 exprimierte endogen sowohl das passende MHC-Restriktionselement (HLA-A2) als auch die entsprechende ras-Mutation an Codon 12, was eine Voraussetzung für die T-Zellerkennung ist (18). Im Gegensatz zur CD4+-Analyse, welche die Lymphoproliferation auf lösliches Protein maß, spiegelte die CTL-Analyse die lytische Fähigkeit gegen SW480-Zellen, welche die natürlich vorkommende Mutation in Abwesenheit von Peptid, das exogen hinzugefügt wurde, wider. Im Weiteren wurden SW480-Zellen untersucht, und zwar unbehandelt oder nach einer kurzzeitlichen Vorbehandlung mit IFN-Gamma, das verantwortlich für die Hochregulation der HLA-A2-Expression sowie weiterer Vorgänge sein könnte, die möglicherweise mit der Epitop-Prozessierung und -Präsentation assoziiert sein könnten.
Unter diesen Versuchsbedingungen erhöhte die IFN-Gamma (IFN-γ)-Vorbehandlung den Prozentsatz an SW480-Zellen, die positiv für HLA-A2 waren sowie die Dichte der HLA-A2- Moleküle pro Zelle (basierend auf dem MFI), ohne naclweisbare Veränderungen in der Expression des rasVal12-Proteins, wie mittels ELISA bestimmt, zu induzieren. In der Abwesenheit von IFN-γ-Vorbehandlung war keine CTL-Lyse nachweisbar; jedoch wurde im Anschluss an die IFN-γ-Vorbehandlung nachweislich Zytotoxizität bei verschiedenen Effektor/Target(Ziel)-Verhältnissen beobachtet (Fig. 10A), die mit einer erhöhten HLA-A2- und ICAM 1-Expression auf SW480-Zellen Korrelierten. Effektor-Zellspezifität der Lyse wurde offenbart durch die Unfähigkeit einer irrelevanten HLA-A2-restringierten CD8+ CTL-Linie (d. h. anti-MART-127-35-peptidspezifisch) SW480-Zellen m lysieren (mit oder ohne IFN-γ) (Fig. 10A), es sei denn, dass das entsprechende exogene Peptid hinzugerügt wurde (Fig. 10B). Anti-MART-CTL waren ebenso nicht in der Lage, SW480 target(Ziel)-Zellen (mit oder ohne IFN-γ) in Anwesenheit eines von außen hinzugefügten ras5-14(Val12)-Peptids zu lysieren (Fig. 10B), was somit die Spezifität für die Erkennung von MART-1, jedoch nicht von ras-Epitopen zeigt.
Im Gegensatz dazu war die anti-rasVal12 CTL-vennittelte Lyse von SW480-Zellen in Anwesenheit von exogen hinzugefügtem ras5-14(Val12)-Peptid, jedoch nicht in Anwesenheit des Wildtyp ras-Peptids, stärker ausgeprägt, was darauf hindeutete, dass die Präsentation des exogen-hergestellten mutanten ras-Epitops (oder -Epitope) limitierend war.
Zielzellen-Spezifität für die Lyse wurde durch die Unfähigkeit von anti-rasValll-CTL offenbart, HLA-A2+ Melanomzellen (mit oder ohne IFN-γ), denen die rayVal12-Mutation in Abwesenheit von exogenem Peptid fehlte, zu lysieren. Die Beobachtung, dass jedes der CTL- Linien IFN-γ-Vorbehandelte SW480-Zellen wirksamer als unbehandelte SW480-Zellen lysierte, wenn sie in Anwesenheit ihrer entsprechenden relevanten Peptide inkubiert wurden, hätte zum Teil von einer verstärkten Expression von zelloberflächlichem HLA-A2, welches für die Peptidbeladung zur Verfügung steht, herrühren können, was somit mehr Antigen- Komplexe für die CTL-Erkennung bereitgestellt hätte. Tabelle 5 Erfordernisse für CDi+ T-Zell-Antwort aufmutantes K-ras-Protein Tabelle 6 Vergleich der zytologischen Aktivität von CD8+-Kulturen von RAS-Patient 32 vor und nach Immunisierung Tabelle 7 Identifizierung von mutanten ras-Peptiden, die an humanes HLA-A2 binden
Zusammenfassend gesagt, wurde das mutante m-Protein um die Position 12 herum auf potentielle HLA-A2-Peptidbindungsmotive untersucht. Ein Überlappendes oder verschachteltes 10-mer-Peptid wurde identifiziert [d. h. ras5-14(Asp12)], welches an HLA-A2 binden konnte und eine spezifische, funktionelle Fähigkeit zur Vennehrung von den in vivo-stimulierten ("primed") CD8+ CTL-Vorläufern zeigte (Fig. 4 und 5). Von Wichtigkeit ist, dass keine spezifischen CTL-Antworten gegen die normale proto-rcü-Sequenz nachweisbar waren und keine CTL-Linie aus präimmunen Lymphozyten produziert wurde (Tabelle 6). Im Gegensatz zum verschachtelten 10-mer-Peptid zeigte das längere 13-mer-Peptid, welches als Immunogen verwendet wurde, keine nachweisbare Bindung an HLA-A2, wie mittels Bio- Assay bestimmt wurde (Tabelle 7) und konnte in vivo targets (Ziele) für die Lyse nicht sensibilisieren (Fig. 5). Somit muss iie Immunisierung mit ras5-17(Asp12) in vivo prozessiert worden sein, was das entspre Aende 10-mer-Fragment generierte, welches dann zur peptidspezifischen CD8+ CTL-Aktiv ierung führte. Obwohl anfänglich für die Asp12- Substitution identifiziert, waren ras5-14-Peptide, die aridere K-ras-Mutationen an Codon 12 widerspiegelten, ebenfalls immunogen und stellen HLA-A2-restringierte, mutante ras CD8+ CTL-Epitope dar, während das HLA-A2-Peptidbindungsmotiv in den ras5-14-Sequenzen unverändert bleibt.

Beispiel 7

Gleichzeitige Experimente in der Maus (BALB/c; H-2d) führte zur Identifizierung eines mutanten ras 9-mer-Peptids, das die Substitution von Gly mit Val [d. h. ras4-12(V12)] widerspiegelte, was zur Induktion von MHC-Klasse I-restringierten CD8+ CTL-Antworten führte. Die Grundlage der Immunogenität wurde tei Weise der Einführung des mutierten Val12-Restes zugeschrieben, was einen dominanten C-terminalen Anker für MHC-Klasse I-Bindung schuf. Die resultierende CD8+ CTL-Antwort spiegelte somit wahrscheinlich die T-Zellerkennung eines zuvor unbemerkten Peptid/MHC-Komplexes wider. Im Gegensatz zur ras5-14-Sequenz teilte ras4-12(V12) nur unvollständig das Konsensus-Motiv für die HLA-A2-Bindung, da der Leucin-Anker von Position 2 auf Position 3 rückte. Von Wichtigkeit ist, das die Einführung des mutierten Val12-Restes nun, wie in der Maus, einen dominanten C-terminalen Anker schuf. Trotz der Veränderung in der bevc rzugten Lage des möglichen Leucin-Ankers, zeigte das ras4-12(V12)-Peptid spezifische, wem auch schwache, Bindung an HLA-A2, wie mittels Bio-Assay nachgewiesen wurde. Im Gegensatz dazu konnte die proto-ras-Sequenz ras4- 12(G12) nicht an HLA-A2 binden, was die Spezifität hinsichtlich der Bindung der mutanten 9-mer-Sequenz demonstrierte. Eine CD8+ CTL-Linie spezifisch für ras4-12(V12) wurde dann aus einem normalen HLA-A2+-Individuum gewonnen unter Verwendung eines Modellantigenpräsentierungssystems, d. h. T2-Zellen gepulst mit exogenem ras4-12(V12)-Peptid als APC für die in vitro-Gewinnung von antigenspezifischen CTL (Siehe Fig. 6).
Um weiterhin die immunogene Stärke dieses APC-Systems zu erhöhen, wurde zusätzliche B7-1-Oberflächenexpression (für Kostimulation) auf T2-Zellen durch transiente Infektion mit einem rekombinantem Vaccinia-Virus (rV-B7.1) bereitgestellt. In Kontrollexperimenten wurde unter Verwendung eines alloreakt ven Systems ermittelt, dass unter diesen Bedingungen die B7. l-Oberflächenexpression auf T2-Zellen um das 2-3fache anstieg (durch MFI), mit nomineller Wirkung auf die Klasse I-Expression, und die Entwicklung und/oder lytische Stärke der resultierenden allo-HLA-A2-reaktiven CTL-Aritwort beschleunigte. Dieses Modellsystem wurde dann für die Erzeugung einer peptidspezifischen CTL-Antwort angewendet. In der Tat wurde, wie hier beschrieben, eine CD8+ CTL-Linie in vitro aus einem normalen HLA-A2+-Spender hergestellt, welcher peptidspezifische und HLA-A2-restringierte Zytotoxizität gegen Peptid-gepulste targets (Ziele) aufwies. Keine Lyse war nachweisbar bei Verwendung des Wildtyp-ras-Peptids, um target (Ziel)-Zellen zu sensibilisieren.
Insgesamt zeigen diese Befunde zum ersten Mal die Definition von mutanten K-ras HLA-A2- restringierten, CD8+ CTL-Epitopen an Codon 12. Hinv/eise, zur Verfügung gestellt aus Lymphozyten des peripheren Blutes sowohl als normalen Individuen als auch aus Karzinom-patienten, unterstützen die Hypothese, dass Vakzination mit Onkogen-hergeleiteten Peptiden hochspezifische und systemische anti-ras zelluläre Immunantworten induziert. Weiterhin hat die Identifizierung und Entwicklung diesisr neuartigen 9-mer oder 10-mer mutanten ras-Peptide wichtige Bedeutung sowohl für aktive (d. h. Impfung) als auch für passive (d. h. ex vivo- Expansion für den zellulären adoptiven Transfer) Immuntherapien, die für die Induktion und Ausbreitung von spezifischen CD8+ CTL-Antworten in Krebspatienten verwendet werden könnten.

Beispiel 8

Identifizierung von mutanten ras CD8+ CTL-Peptidvarianten

Wie in dem Mausmodell können mögliche Varianten von definierten Peptidepitopen, die i) Bindung an HLA and ii) die Fähigkeit, T-Zellvorläufer in vitro ohne Änderung der TCR-Spezifität zu vermehren, verstärken können, in dem HLA-A2-System getestet werden unter Verwendung der mutanten ras5-14-Peptide, die die Asp12 oder Val 12-Substitutionen widerspiegeln. Obwohl diese Peptide als HLA-A2-reaktive CD8+ CTL-Epitope aus Vakzinierten Patienten identifiziert wurden, schienen sie eher schwache Bindung an HLA-A2 zu zeigen (wie oben beschrieben), und sie benötigten exogenes β&sub2;-Makroglobulin, um MHC/Peptid-Interaktion weiter zu verbessern. Die Identifizierung von Peptidvarianten, die die Stabilität oder Halbwertszeit der MHC/Peptid-Interaktion (in vivo und in vitro) verstärken oder erhöhen können, könnte die Wirksamkeit von intrinsisch schwachen immunogenen Peptiden für die Induktion und Amplifikation der relevanten T-Zellantwort erhöhen. Da das Konsensus-Ankermotiv für HLA-A2 im Fachgebiet bekannt ist, werden mutmaßliche ras-Peptidvarianten, die Aminosäuresubstitutionen entweder an primären oder an sekundären Anker-Positionen widerspiegeln, synthetisiert werden.
Da die ras5-14-Sequenz bereits die bevorzugten Aminosäurereste an den dominanten Anker- Positionen 2 (Leu6) und 10 (Val14) der Peptidsequenz beinhaltet, werden sie wahrscheinlich unverändert bleiben. Stattdessen werden Substitutionen an den mutmaßlichen sekundären Anker-Positionen l und 3 der Peptidsequenz eingeführt. Kandidaten schließen den Ersatz an Position l durch ein Tyr-Rest oder den Ersatz an Position 3 jeweils durch einen Trp-, Tyr- oder Phe-Rest sowie doppelte Substitutionen an beiden Positionen l und 3, mit ein. Variante Peptide, die die entsprechende ras Codon 12-Mutation widerspiegeln und die diese Substitutionen enthalten, werden synthetisiert werden. In vergleichenden Studien mit den nativen Peptiden, werden diese Varianten zuerst auf ihre Fähigkeit, an HLA-A2 zu binden untersucht und geprüft, und zwar mit Hilfe des T2- Bio-Assays oder eines funktionellen Kompetitions- Assays, der die Inhibition einer kontroll-HLA-A2-restringierten, Ag-spezifischen CTL-Antwort misst. Varianten, die erhöhte Bindung an HLA-A2 zeigen, werden anschließend im Vergleich zu den nativen Peptidsequenzen hinsichtlich ihrer Fähigkeit bewertet, (a) targets (Ziele) für die Lyse zu sensibilisieren unter Verwendung etablierter axit-ras CTL-Linien, (b) Proliferation und Vermehrung von etablierten anti-ras-CTL-Linien zu stimulieren und (c) anti-ras CTL-Linien aus der ursprünglichen Quelle von immunen Lymphozyten zu erzeugen.
Unter Verwendung der anti-ras5-14(Asp12) CTL-Linie in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung, wurde gefunden, dass einzelsubstituierte Tyr- und Trp-Varianten eine höhere Bindungsaktivität zu HLA-A2 auf T2-Zellen zeigten als die native Peptidsequenz, mit einer geringeren Abhängigkeit für exogenes β&sub2;-Makroglobulin. Außerdem scheint die Tyr- Variante targets (Ziele) für die Lyse besser zu sensibilisieren als die native Peptidsequenz, mit einer Verlagerung in der Dosis-Antwort um das 3fache auf der Grundlage von halbmaximaler Aktivität (Fig. 11). Das mutante ras-Peptid 5-14(Asp), SEQ. 1D NO: 3, welches einen N- terminalen Tyr-Rest besitzt (z. B. SEQ. ID NO: 11) erhöhte die zytotoxische T-Zellaktivität gegen antigen-gepulste target (Ziel)-Zellen.
Die Identifizierung solcher Peptidvarianten, die Immunogenität in vivo erhöhen, versprechen wichtige und wirksame Reagenzien für nachfolgende T-Zellklonierung und Vorläufer-Frequenzanalyse zu sein. Weiterhin können Peptidvarianten verwendet werden, um die Vermehrung von Ag-speziflschen T-Zelllinien/-klone zu verbessern zur möglichen klinischen Verwendung in adoptiver Übertragung.

Beispiel 9

CD4+ und CD8+ T-Zellsubtvpen bei Krebs

Eine wichtiger Aspekt der T-Zellsubgruppen-Balance ist die Einsicht in die immunologische Grundlage von Erkrankung, die diese Balance bietet. In der Tat sind eine Unmenge pathologischer Prozesse, wie hauptsächlich bestimmt in Modellsystemen von infektiöser Erkrankung, Allergie und Autoimmunität und in gewissem Maße, Krebs, mit der Balance der Th1/Th2 CD4+-Subgruppen-Antwort und der Art des resultierenden Zytokinmusters assoziiert worden. Wenig ist bekannt hinsichtlich der genauen Rollen der Tel und Tc2 CD8+-Subgruppen in Erkrankungen, besonders in Neoplasie. Obwohl Ausnahmen zu den folgenden Mustern existieren können, ist im Allgemeinen gezeigt worden, dass Typ-1 T-Zellklone hauptsächlich und selektiv IL-2, IFN-γ und TNF-β/Lymphotoxin sezernieren. Es ist beschrieben worden, dass Typ-2 T-Zellklone primär und selektiv IL 4, IL-5, IL-6, IL-10 und IL-13 produzieren. Auf der Grundlage von dem Spektrum und den funktionellen Eigenschaften der verschiedenen Zytokinmuster, sind Typ-1-Zellen mit zellvermittelter Immunität in Verbindung gebracht worden, während vorgeschlagen wurde, dass Typ-2-Zellen an der humoralen Immunität beteiligt sind. Dementsprechend ist, basierend auf ihrer Beteiligung an der zeUvermittelten Immunität, die Induktion und Expression der Typ-1 T-Zellantwort als der bedeutendere und wünschenswertere Weg für die antitumor-Reaktivität vorgeschlagen worden.
Ähnlich dem murinen System können im menschlichen.Krebs mögliche Veränderungen in der Entwicklung und Balance der "Th1/Th2" und "Tc1/Tc2"-Phänotypen korreliert werden. Zu dem Zweck werden CD4+ und CD8+ T-Zellen aus Lymphozyten des peripheren Blutes von Patienten, die vor und nach jedem Vakzinationszyklus erhalten wurden, aufgereinigt, und in vitro unter maximalen Bedingungen mit anti-TCR MAb stimuliert. Danach werden Zytokinmengen, z. B. IFN-γ und IL-4, IL-5 oder IL-10 mittels ELISA oder Elispots-Assays als Prototyp-Zytokine für jeweils Typ-1 und Typ-2-Antworten, bestimmt. Weiterhin können Zytokin-Profile von CD4+ und CD8+ T-Zelllinien, die aus immunisierten Patienten als Antwort auf Aktivierung mit anti-TCR-MAb gegen antigenem Peptid hergestellt wurden, als einen eher physiologischen Stimulus bewe rtet werden. Die Ergebnisse dieser Studien können als stellvertretende Endpunkte in klinischen Studien für antikrebs-Vakzine dienen und werfen auch Licht auf mögliche Mechanismen der Immunsuppression während des Krebsverlaufs (d. h. Tendenz zu Typ-2-Mustem) und Immunverstärkung, die mit objektiven Tumorantworten (d. h. Tendenz zu Typ-1-Mustern) assoziiert sind. Solche Korrelationen können auch beim Entwurf angemessener Adoptivtransfer-Kultur-Strategien, wie diejenigen, die bei murinen Studien beschrieben werden, die die Identifizierung, Selektion und Amplifizierung der relevantesten T-Zellsubgruppen ausnutzen behilflich sein.

Beispiel 10

Ras-Onkogen-spezifische T-Zellen: Isolierung und Analyse der Effektormechanismen

Die Fähigkeit von epitopspezifischen T-Zellpopulationen, prozessierte Formen des endogenproduzierten Onkoproteins, das von Tumorzellen exprimiert wird, zu erkennen, ist außerordentlich entscheidend für den Erfolg von Techniken wie ASI oder zelluläre adoptive Immuntherapie. Sowohl in normalen Spendern als auch in Krebspatienten betrifft die vorliegende Erfindung die Hypothese der Prozessierung und Präsentation der entsprechenden Peptide (oder nahe verwandten Sequenzen) als multiple (sub)dominante Epitope mit produktiver TCR-Erkennung der antigenen Komplexe. Um jedoch eine messbare anti-rasVal12 CTL- Antwort in Abwesenheit von exogenem Peptid zu elizitieren, z. B. die SW480 Tumor-targets (-Ziele), mussten die Zellen zuvor kurzzeitlich IFN-γ ausgesetzt werden. Obwohl die genauen Mechanismen, durch die IFN-γ in diesem Modell wirkte, noch vollständig aufgeklärt werden müssen, korrelierte die Zytotoxizität wenigstens teilweise mit erhöhter Expression von HLA- A2-, ICAM-1- und Fas (CD95)-Molekülen, was auf die folgenden nicht-limitierenden und nicht-bindenden theoretischen Möglichkeiten hindeutete: (a) die endogenproduzierten, mutanten ras-Epitope waren limitierend, konnten jedoch durch Erhöhung der Dichte von Klasse-I/Peptid-Komplexen, die für TCR-Erkennung zur Verfügung standen, verstärkt werden; (b) die Stärke der CTL/target-Interaktion war schwach, konnte jedoch erhöht werden durch Erhöhung der Dichte von akzessorischen Molekülen, die wichtig für Ag-unabhängige Interaktionen waren oder (c) Tumorzell-Sensibilität auf CTL-vermittelter Lyse über einen FasL/Fas-abhängigen apoptotischen Weg war ursprunglich unvollkommen oder schwach, konnte jedoch wiederhergestellt oder erhöht werden durch Erhöhung der Dichte von zelloberflächlichem Fas. Diese und andere Möglichkeiten können Erklärungen liefsm, mit Hilfe derer Tumorzellen der Immunerkennung und dem -angriff, welche(r) sich auf der Ebene des TCR- MHC/Peptid-, Zell-Zell-Adhäsions- oder des zytotoxischen Mechanismus ereignen, entkommen. Umgekehrt eröffnet die Beobachtung, dass die Zytotoxizität durch IFN-γ verstärkt werden konnte, die Möglichkeit für die Anwendung von IFN-γ oder IFN-γ-induzierenden Zytokinen, wie IL-12, in ASI.
Die Rolle eines Fas-abhängigen Weges in der anti-nzyVal 12CTL- vermittelten Lyse von IFNy-vorbehandelten SW480-Tumorzellen kann in Blockierungsexperimenten erforscht werden unter Verwendung kommerziell erhältlicher anti-CD95 MAb (Klon ZB4), anti-CD9SL MAb (Klone 4H9 oder 4A5) oder der Kombination von beiden für maximale Neutralisation. Isotyppassende Ab und Fas-sensitive, autologe Peptid-gepulste EBV-B-Zellen werden als entsprechende Kontrollen verwendet werden. Zusätzliche Kontrollexperimente schließen einen Vergleich von unbehandelten mit Zytokine-vorbehandelten SW480 Tumorzellen für Sensitivität auf Fas Abinduzierte/n Apoptose/Zelltod (unter Verwendung kommerziell erhältlicher Klone DX2 oder CH-11), wie mittels Isotop-Freisetzungs- oder TUNEL-Assays bestimmt. Jurkat oder EBV-B-Zelllinien werden als Positivkontrollen verwendet. Zusätzliche Unterstützung für die Rolle von Fas im lyrischen Mechanismus beinhaltet die Verwendung von Membranpermeablen, Peptid-basierten Inhibitoren, von denen gezeigt worden ist, dass sie den apoptotischen Zelltod in Fas-sensitiven Zelltypen wie Jurkat Tumorzellen, blockieren.
Diese Inhibitoren blockieren spezifisch die funktionelle Aktivität von bestimmten endogenen, intrazellulären Cystein Proteasen (z. B. Caspasen, vor allem ICE- und CPP-32-ähnliche Subfamilien), die im biochemischen Apoptoseweg involviert sind, wenn sie zuvor in empfängliche Zellen eingeführt worden sind. Zusammengenommen können diese Experimente Einsichten in die Rolle von Fas und von apoptotischen Wegen in der Tumorzell-Empfänglichkeit für die CTL-vermittelte Lyse und Modulation ihres lyrischen Phänotyps durch Zytokin-Interaktionen liefern.
Da die Tumorzellen-Expression von endogen-hergeleiteten mutanten ras-Epitopen ein limitierender Vorgang sein kann, der die CTL-lytische Aktivität beeinflusst, wird die Isolierung von CD8+ T-Zellen innerhalb der Gesamtpopulation durchgeführt. Solche T-Zellen können eine höhere Affinität für die Erkennung von Antigenen zeigen, die bei extrem geringen Antigendichten vorhanden sind. Weiterhin kann die Interaktion zwischen höheraffinem TCR mit MHC/Peptid von ausreichender Stärke sein, um dem Bedarf an Ag-unabhängigen Interaktionen zu begegnen. Wie im murinen System wird eine Herangehensweise auf konventionelle T-Zellklonierung basieren, und zwar bei limitierender Verdünnung und anschließender Untersuchung der lytischen Wirksamkeit gegen target(Ziel)-Zellen, die mit titrierenden Mengen relevanter Peptide oder Tumorzellen (±IFN-γ-Vorbehandlung), welche das ras-Onkogen enthalten, gepulst sind. Klone werden auf dem entsprechenden mutanten ras-Peptid (oder einer definierten Variante davon) vermehrt, wobei die Peptid-Dosierung allmählich über die Zeit und während der Kultur im Bemühen, die Ag-sensitivsten Klone zu gewinnen und aufrechtzuerhalten, reduziert wird. Ähnliche Studien können durchgeführt werden für die Isolierung von Peptidspezifischen CD4+ T-Zellklone, wie durch ihre proliferative Fähigkeit oder Zytokinsekretion (z B. IFN-γ) in Antwort auf titrierende Mengen relevanter Peptide oder exogenen Quellen von Tumor-hergeleitetem Protein bestimmt. Die Herstellung und Vermehrung von solchen Onkogen-spezifischen CD4+ und/oder CD8+ T-Zellklone hat direkte Konsequenzen für die adoptive Immuntherapie.
Zusätzlich kann die TCR-αβ-Ketten-Verwendung der ras-Onkogen-spezifischen T-Zellklone verwendet werden, um TCR-Phänotyp (Repertoire) mit funktioneller Antwort auszuwerten und zu korrelieren. Wenn prädominante oder restringierte Vα- oder Vβ-Muster beschrieben sind, können anti-TCR-spezifische MAb für eine schnellere Zell-Isolierung aus ursprünglichen Gesamt- oder polyklonalen Populationen von immunen Lymphozyten eingesetzt werden. Die Identifizierung von solchen TCR-αβ-Mustern kann auch zur Entwicklung von molekularbasierten Protokollen führen zur: (a) Verfolgung der Entwicklung der T-Zellantwort nach jedem Vakzinationszyklus als eine quantitative Messung, um den Ag-spezifischen Immunstatus zu überwachen und (b) Isolierung und Klonierung von hochaffinem TCR als ein experimentelles Modell zur Erforschung der Fähigkeit, autologe, naive Lymphozyten in Agspezifische Effektorzellen umzuwandeln und funktionell zu konvertieren. Die molekulare Technologie für die hoch wirksame Urmwandlung von naiven T-Zellpopulationen mit viralen Expressionsvektoren, die für neuartige Rezeptormoleküle kodieren, ist denjenigen bekannt, die Fachkenntnisse im Fachgebiet besitzen. Die Gesamtziele dieser Studien ermöglichen die Entwicklung und Erforschung von experimentellen Krebs-Immuntherapiemodellen, die Prinzipien sowohl der Gentherapie als auch der Immuntherapie vereinen, die in der Erzeugung von Effektorpopulationen mit modifizierten und verstärkten tumorspezifischen Ag-Erkennungs- und targeting-Fähigkeiten für der adoptiven Transfer resultieren.

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Ein mutantes ras-Peptid, umfassend

Xaa&sub1; Leu Xaa&sub2; Val Val Gly Ala Xaa&sub3; Gly Val;

wobei Xaa&sub1; die Aminosäure Lysin oder Tyrosin ist;

wobei Xaa&sub2; eine Aminosäure ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Valin, Tryptophan, Leucin, Tyrosin und Phenylalanin;

wobei Xaa&sub3; ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Asparaginsäure, Valin, Cystein, Alanin, Arginin und Serin;

unter der Voraussetzung, dass Xaa&sub1; Tyrosin ist, wenn Xaa&sub2; Valin ist, und das Peptid elizitiert Peptid spezifische humane CDSzytotox sehe T-Lymphozyten.

2. Mutantes ras-Peptid gemäß Anspruch 1, umfassend die Aminosäuresequenz Tyr Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val (SEQ ID NO: 11).

3. Mutantes ras-Peptid gemäß Anspruch 1, wobei das Peptid eine Aminosäuresequenz von 13 Aminosäuren umfasst.

4. Mutantes ras-Peptid gemäß Anspruch 1, wobei das Peptid eine Aminosäuresequenz von 10 Aminosäuren umfasst.

5. Mutantes ras-Peptid gemäß Anspruch 1, 3 oder 4, wobei Xaa&sub1; Tyrosin ist.

6. Mutantes ras-Peptid gemäß Anspruch 1, 3, 4 oder 5, wobei Xaa&sub1; Tyrosin und Xaa&sub3; Asparaginsäure ist.

7. Mutantes ras-Peptid gemäß Anspruch 1, 3, 4 oder 5, wobei Xaa&sub1; Tyrosin und Xaa&sub3; Valin ist.

8. Mutantes ras-Peptid gemäß Anspruch 1, 3, 4 oder 5, wobei Xaa&sub1; Tyrosin und Xaa&sub2; Cystein ist.

9. Mutantes ras-Peptid gemäß Anspruch 1, 3 oder 4, wobei Xaa&sub1; Lysin und Xaa&sub2; Asparaginsäure ist.

10. Mutantes ras-Peptid gemäß Anspruch 1, 3 oder 4, wobei Xaa&sub1; Lysin und Xaa&sub3; Valin ist.

11. Mutantes ras-Peptid gemäß Anspruch 1, 3 oder 4, wobei Xaa&sub1; Lysin und Xaa&sub2; Cystein ist.

12. Mutantes ras-Peptid gemäß Anspruch 1, 3, 4, 9 oder 10, wobei Xaa&sub1; Lysin und Xaa&sub2; Tryptophan ist.

13. Mutantes ras-Peptid gemäß Anspruch 1, 3, 4, 6, 7 oder 8, wobei Xaa&sub1; Tyrosin und Xaa&sub2; Tryptophan ist.

14. Mutantes ras-Peptid gemäß Ansrruch 1, 3 oder 4, wobei Xaa&sub1; Lysin ist, Xaa&sub2; ist Tryptophan und Xaa&sub2; ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Asparaginsäure, Valin und Cystein.

15. Mutantes ras-Peptid gemäß Anspruch 1, 3 oder 4, wobei Xaa&sub1; Tyrosin ist, Xaa&sub2; ist Tryptophan und Xaa&sub3; ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Asparaginsäure, Valin und Cystein.

16. Ein mutantes ras-Peptid Trägerm alekülkonjugat, umfassend das mutante ras-Peptid gemäß den Ansprüchen 1-14 oder 15 und ein Trägermolekü1, wobei das Trägermolekül die Immunogenität des Peptids erhöht.

17. Mutantes ras-Pepild Trägermole külkonjugat gemäß Anspruch 16, wobei das Trägermolekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Influenzapeptid, Tetanus-Toxoid, Tetanus-Toxoid-CD4-Epitop, Pseudomonas Exotoxin A und Poly-L-Lysin.

18. Ein Immunogen zur Elizitierung humaner CD8+-zytotoxischer T-Lymphozyten, die für mutantes ras-Peptid spezifisch sind, umfassend ein rnutantes ras-Peptid gemäß den Ansprüchen 1-14 oder 15 oder eine Kombination davon, wobei das Immunogen humane CD8+ zytotoxische T-Lymphozyten, die für mutantes ras-Peptid spezifisch sind, elizitiert.

19. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend das mutante ras-Peptid gemäß den Ansprüchen 1-17 oder 18 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger, und optional umfassend einen Modifikator der biologischen Antwort.

20. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 19, weiter umfassend ein Adjuvans, eine Liposom-Formulierung oder eine Antigen präsentierende Zelle.

21. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 20, wobei das Adjuvans RIBI Detox , QS21, Alaun oder unvollständiges Freund'sches Adjuvans ist.

22. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß den Ansprüchen 19, 20 oder 21, wobei der Modifikator der biologischen Antwort ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Interleukin 2, Interleukin 6, Interleukin 12, Interferon, Tumomekrosefaktor, GM-CSF, Cyclophosphamid, β&sub2;-Mikroglobulin oder Kombinationen davon.

23. Eine mit einem mutanten ras-Peptid gepulste Antigen präsentierende Zelle, wobei die Zelle mit dem mutanten ras-Peptid gemäß einem der Ansprüche 1-15 oder 18 gepulst ist.

24. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine mit einem mutanten ras- Peptid gepulste Antigen präsentierende Zelle gemäß Anspruch 23 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.

25. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 24, wobei die Antigenpräsentierende Zelle eine dendritische Zelle, ein B-Lymphozyt, ein Monozyt oder ein Macrophage ist.

26. Eine isolierte DNA-Sequenz, umfassend eine DNA-Sequenz, die für ein mutantes ras- Peptid gemäß den Ansprüchen 1-15 oder 18 kodiert.

27. Ein Plasmid- oder Virusvektor, der die mutanten ras-Peptid DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 26 umfasst.

28. Vektor gemäß Anspruch 27, wobei der Vektor ein E. coli Plasmid, ein Listeria-Vektor, Orthopoxvirus, Avipoxvirus, Capripoxvirus, Suipoxvims, Vacciniavirus, Baculovims, humanes Adenovirus, SV40 oder bovines Papillomavirus ist.

29. Verwendung eines mutanten ras-Peptids gemäß den Ansprüchen 1-15 oder 18 zur Herstellung eines Medikaments zur Vermeidung des Auftretens, zur Hemmung des Wachstums von oder zur Abtötung von Tumorzellen, die mutantes ras p21 Protein oder Peptide exprimieren, umfassend:

a. Erzeugung von zytotoxisc ien T-Lymphozyten, die für mutantes ras-Protein oder -Peptid spezifisch sind, in vitro duch Stimulierung von Lymphozyten einer Quelle mit einer wirksamen Menge des mutanten ras-Peptids, allein oder in Kombination mit einem oder mehreren Cytokinen, wobei diese Menge wirksam ist, für mutantes ras-Peptid spezifische zytotoxische T-Lymphozyten zu generieren; und wobei das Medikament dazu fähig ist,

b. die für das mutante ras-Protein oder -Peptid spezifischen zytotoxischen T- Lymphozyten allein, oder mit einem Cytokin adoptiv in einer Menge in einen Säuger zu transferieren, die ausreicht, um das Auftreten von Tumorzellen zu vermeiden, deren Wachstum zu hemmen oder diese abzutöten.

30. Verwendung des mutanten ras-Peptids gemäß Anspruch 29, wobei die Tumorzellen abgeleitet sind von Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Lungenkrebs, Darmkrebs, Melanom, Schilddrüsenkrebs, Endometriumkrebs, Oralkrebs, Laryngealkrebs, Seminom, hepatozellulärer Krebs, Gallengangkrebs, akute myeloblastische Leukämie, Basalzell- Karzinom oder Plattenepithelkarzinom.

31. Verwendung der mutanten ras-Peptide gemäß den Ansprüchen 29 oder 30, wobei das Medikament weiter dazu fähig ist, einen Modifikator der biologischen Antwort zu verabreichen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Interleukin 2, Interieukin 6, Interleukin 12, Interferon, Tumornekrosefaktor, GM-CSF, Cyclophosphamid.

32. Verwendung des mutanten ras-Peptids gemäß Anspruch 31, wobei der Modifikator der biologischen Antwort Interleukin 2 ist.

33. Verwendung des mutanten ras-Peptids gemäß den Ansprüchen 29-31 oder 32, wobei das Medikament weiter fähig ist, eine "Booster"-Menge eines mutanten ras-Peptids an den Säuger zu verabreichen.

34. Verwendung eines mutanten ras-Peptids gemäß den Ansprüchen 1-15 oder 18 zur Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung des Auftretens, Hemmung des Wachstums oder Abtöten der Tumorzellen, die mutantes ras p21 Protein oder Peptid in einem Säuger exprimieren, umfassend:

Erzeugen von zytotoxischen T-Lymphozyten, die für mutantes ras p21-Protein oder Peptid spezifisch sind, in vivo durch Verabreichung einer wirksamen Menge eines mutanten ras-Peptids allein, oder in Kombination mit einem Adjuvans oder einer Liposomen- Formulierung, wobei die für mutantes ras p21-Protein oder Peptid spezifischen, so erzeugten zytotoxischen T-Lymphozyten das Auftreten von Tumorzellen in einem Säuger verhindern, deren Wachstum hemmen oder die Tumorzellen in dem Säuger abtöten.

35. Verwendung eines mutanten ras-Peptids gemäß Anspruch 34, wobei das Adjuvans ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus RIBI Detox , QS21, Alaun und unvollständigem Freund'schem Adjuvans.

36. Verwendung des mutanten ras-Peptids gemäß den Ansprüchen 34 oder 35, wobei die Tumorzellen abgeleitet sind von Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Lungenkrebs, Darmkrebs, Melanom, Schilddrüsenkrebs, Endometriumkrebs, Oralkrebs, Laryngealkrebs, Seminom, hepatozellulärer Krebs, Gallengangkrebs, akute myeloblastische Leukämie, Basalzell-Karzinom oder Plattenepithelkarzinom.

37. Verwendung der mutanten ras-Peptide gemäß den Ansprüchen 34, 35 oder 36, wobei das Medikament weiter dazu fähig ist, einen Modifikator der biologischen Antwort, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Interleukin 2, Interleukin 6, Interleukin 12, Interferon, Tumomekrosefaktor, GM-CSF und Cyclophosphamid zu verabreichen.

38. Verwendung eines mutanten ras-Peptids gemäß den Ansprüchen 1-15 oder 18 zur Herstellung eines Medikaments zur Elizitierung von zytotoxischen T-Lymphozyten, die für mutantes ras p21-Protein oder Peptid spezifisch sind, wobei das Medikament dazu fähig ist,

a. eine Quelle, die T-Lymphozyten enthält, einem mutanten ras-Peptid auszusetzen, und

b. für mutantes ras p21-Protein oder Peptid spezifische zytotoxische T- Lymphozyten zu elizitieren.

39. Verwendung des mutanten ras-Peptids gemäß Anspruch 38, wobei die Quelle der Lymphozyten peripheres Blut, Lymphkno tengewebe, Tumorgewebe oder Ergüsse sind.

40. Verwendung eines mutanten ras-Peptids gemäß den Ansprüchen 1-15 oder 18 zur Herstellung eines Medikaments zur Elizitierung von zytotoxischen T-Lymphozyten, die für mutantes ras Protein oder Peptid spezifisch sind, wobei das Medikament dazu fähig ist,

a. Antigen präsentierende Zellen mit einem mutanten ras-Peptid zu pulsen, um Antigen präsentierende Zellen herzustellen, die mit mutantem ras-Peptid gepulst sind; und

b. eine Quelle, die T-Lymphozyten enthält, den mutanten ras-Peptid-gepulsten Antigen räsentierenden Zellen auszusetzen, um die zytotoxischen T-Lymphozyten zu elizitieren.

41. Verwendung des mutanten ras-Peptids gemäß Anspruch 40, wobei die Antigenpräsentierenden Zellen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus dendritischen Zellen, B-Lymphozyten, Monozyten und Makrophagen.

42. Verwendung eines mutanten ras-Peptids gemäß den Ansprüchen 1-15 oder 18 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs in einem Menschen, wobei das Medikament dazu fähig ist, einen Mensel ien, der an einem Tumor leidet, der ein mutantes ras p21-Protein oder Peptid exprimiert, mit euer wirksamen Menge eines mutanten ras-Peptids zu immunisieren, wobei diese Menge wirksam ist, eine für das mutante ras p21-Protein oder Peptid spezifische Immunantwort zu generieren, wobei die Immunantwort zur Behandlung des Krebs wirksam ist.

43. Verwendung des mutanten ras-Peptids gemäß Anspruch 42, wobei der Krebs Adenokarzinom, Bauchspeicheldrüsenkrebs. Prostatakrebs, Darmkrebs, Lungenkrebs, Endometriumkrebs, Schilddrüsenkrebs, Melanom, Oralkrebs, Laryngealkrebs, Seminom, hepatozellulärer Krebs, Gallengang-Krebs, akute myeloblastische Leukämie, Basalzell- Karzinom oder Plattenepithelkarzinom ist.

44. Verwendung eines mutanten ras-Peptids gemäß den Ansprüchen 42 oder 43, wobei die Immunantwort Zytotoxizität des Tumors ist.