FI105680B - Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten hydroksialkylideenisyaanietikkahappoamidien valmistamiseksi - Google Patents

Description

..1 105680

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten hydroksialkyli-deenisyaanietikkahappoamidien valmistamiseksi * Jakamalla erotettu FI-patenttihakemuksesta 925211.

5

Keksintö koskee menetelmää terapeuttisesti käyttökelpoisen yhdisteen valmistamiseksi, jolla on kaava Ia tai Ib " /R3 n z·*3 10 - c - C - N NC - CH - C - C XR8 c \?θ ?7/%0 da) (Ib) 15 sen mahdollisesti stereoisomeeristen muotojen ja/tai mahdollisesti sen fysiologisesti siedettävien suolojen valmistamiseksi, jolloin ryhmistä R3, R7 ja R8 kohdassa a) R7 on 1) vety, 20 2) alkyyli, jossa on 2 - 4 C-atomia, R8 on 1) vety, 2) metyyli, R3 on 25 1) fenyyli, 2) fenyyli, joka on substituoitu yksin- tai moninkertaisesti 2.1 halogeenilla, 2.2 alkyylillä, jossa on 1 - 3 C-atomia ja joka on 30 substituoitu yksin- tai monikertaisesti halogeenilla, kuten fluorilla, kloorilla, bromilla tai jodilla, 2.3 nitrolla b) R7 on 1) alkyyli, jossa on 1 - 4 C-atomia, 35 2) vety, 2 105680 R8 on 1) vety, 2) metyyli, 3) alkenyyli, jossa on 2 - 3 C-atomia, 5 R3 on 1) pyridyyli, 2) pyridyyli, joka on substituoitu yksin- tai moninkertaisesti 2.1 halogeenilla, kuten fluorilla, kloorilla, bro-10 millä tai jodilla, 2.2 alkyylillä, jossa on 1 - 3 C-atomia, 2.3 nitrolla 3) pyrimidinyyli, joka on substituoitu kuten kohdassa 2) 15 4) tiatsolyyli, joka on substituoitu kuten kohdassa 2) ja 4.1 alkoksikarbonyylimetyylillä, jonka alkyyliket-jussa on 1 - 3 C-atomia, 5) bentsotiatsolyyli, joka on substituoitu kuten 20 kohdassa 2), 6) bentsimidatsolyyli, joka on substituoitu kuten kohdassa 2), 7) indatsolyyli, joka on substituoitu kuten kohdassa 2), 25 8) fenyyli, joka on yksin- tai moninkertaisesti substituoitu 8.1 bentsoyylillä, 8.2 bentsoyylillä, joka on yksin- tai moninkertaisesti substituoitu . 30 8.2.1 halogeenilla, kuten fluorilla, kloorilla, bro milla tai jodilla, 8.2.2 alkyylillä, jossa on 1 - 3 C-atomia, 8.2.3 alkoksilla, jossa on 1 - 3 C-atomia, 8.2.4 alkoksilla, jossa on 1 - 3 C-atomia ja joka on 35 substituoitu yksin- tai moninkertaisesti halogeenilla, kuten fluorilla, kloorilla, bromilla tai jodilla, 3 105680 8.3 karboksilla, • 8.4 hydroksilla, 8.5 alkyylisulfonyylillä, jonka alkyyliketjussa on • 1-3 C-atomla, 5 8.6 fenoksilla, joka on yksin- tai moninkertaisesti substituoitu (C1_3)-alkyylillä, joka on yksin- tai moninkertaisesti substituoitu halogeenilla, kuten fluorilla, kloorilla, bromilla tai jodilla, 8.7 metyleenidioksirengasryhmällä 10 c) R7 on 1) vety, 2) alkyyli, jossa on 1 - 4 C-atomia, R8 on 1) vety, 15 2) metyyli, R3 on 1) ryhmä, jolla on kaava III, -(CH2)4-COOR10 20 jossa R10 on 1.1 vety, 1.2 alkyyli, jossa on 1 - 4 C-atomia,

Kirjallisuudessa on kuvattu joukko menetelmiä isok- 25 satsoli-4-karboksyylihappoamidien valmistamiseksi (DE- 2 524 959; DE-2 655 009; DE-3 405 727).

EP-patenttijulkaisusta 13 376 on tunnettua, että 5-metyyli-isoksatsoli-4-karboksyylihappo-(4-trifluorimetyy-li)anilidia voidaan käyttää farmakologisten ominaisuuksien-30 sa perusteella reumalääkkeenä, tulehduksen vastaisena ai neena, kuumelääkkeenä ja kipulääkkeenä sekä multippeliskleroosin hoitoon. Siinä on kuvattu myös menetelmiä tämän yhdisteen valmistamiseksi.

Nyt keksittiin^ että hydroksialkylideenisyaanietik-35 kahappoamideilla, joilla on kaava Ia, ja niiden tautomeeri- 4 105680 sella muodolla Ib on tuumorinvastainen vaikutus. Monet tunnetuista tuumorinvastaisista aineista saavat hoidon aikana aikaan sivuvaikutuksia, kuten pahoinvointia, oksentelua tai ripulia, jotka tekevät tarpeelliseksi myös lääkärinhoidon 5 sairaalassa. Lisäksi nämä aineet muuttavat myös muiden kehon solujen kasvunopeutta, mikä puolestaan johtaa oireisiin, kuten hiustenlähtöön tai vähäverisyyteen (anemia). Näitä oireita ei voitu havaita hoidettaessa ihmisiä ja eläimiä kaavan Ia ja Ib mukaisilla yhdisteillä. Näillä vai-10 kuttavilla aineilla ei ole tähän asti tunnettuihin sytotok-sisiin syövänvastaisiin aineisiin verrattuna ominaisuutta heikentää immuunisysteemiä (Bartlett, Int. J. Immunophar-mac. 8 (1986) 199 - 204). Siten avautuu uusia tuumoritera-pian keinoja, sillä kehon oma puolustussysteemi ei heiken-15 ny, kun taas tuumorisolujen kasvua estetään. Yllättävästi näillä vaikuttavilla aineilla estetään suurta joukkoa tuu-morisoluja, kun taas immuunisysteemin soluja, kuten esimerkiksi T-lymfosyyttejä, estetään korkeintaan vain noin 50 kertaa suuremmassa pitoisuudessa.

20 Keksintö koskee siten menetelmää kaavan Ia ja Ib

mukaisten yhdisteiden valmistamiseksi, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että yhdiste, jolla on kaava I

° R3 k ΧοΛ,7 saatetaan reagoimaan emäksisen aineen läsnä ollessa vastaa-. 30 vaksi kaavan Ia tai Ib mukaiseksi yhdisteeksi.

Kaavojen I, Ia ja Ib mukaisille yhdisteille läheistä rakennetta ovat tunnetut yhdisteet: 5-metyyli-isoksatsoli-4-karboksyylihappo- (4-trif-luorimetyyli )anilidi (yhdiste 1) ja N-(4-trifluorimetyyli)-35 2-syaani-3-hydroksikrotonihappoamidi (yhdiste 2).

5 105680

Sopivia fysiologisesti siedettäviä kaavojen Ia ja Ib . mukaisten yhdisteiden suoloja ovat esimerkiksi alkali-, maa-alkali- ja ammönTumsuolat mukaan lukien orgaanisten . ammoniumemästen suolat.

5 Kaavan Ia ja Ib mukaiset yhdisteet ja niiden fysio logisesti siedettävät suolat sopivat erityisellä tavalla monien syöpäsairauksien hoitoon. Syöpälajeihin, joita näillä yhdisteillä erityisesti estetään, kuuluvat esimerkiksi leukemia, erityisesti krooninen T- ja B-solutyypin leuke-10 mia, imusolmukesyöpä, esimerkiksi Hodgkinin tauti tai ei-Hodgkinin tauti, karsinoomat, sarkoomat tai ihosyöpä. Vaikuttavat aineet voidaan antaa joko yksinään, esimerkiksi mikrokapseleina, keskinäisinä seoksina tai yhdessä sopivien apu-ja/tai kantaja-aineiden kanssa.

15 Kaavan I, Ia tai Ib mukaisen yhdisteen valmistus tapahtuu tunnetulla tavalla (DE-2 524 959; DE-2 655 009; DE-3 405 727; DE-2 524 929; DE-2 555 789; DE-2 557 003).

Kaavan Ia tai Ib mukaisia yhdisteitä ja/tai vähintään jonkin niiden fysiologisesti siedettävää suolaa voi-20 daan käyttää lääkkeiden valmistukseen reumasairauksien ennaltaehkäisemiseksi ja/tai hoitamiseksi.

On mahdollista valmistaa lääkkeitä, jotka koostuvat vähintään yhdestä kaavojen Ia ja Ib mukaisesta yhdisteestä ja/tai vähintään yhdestä hiiden fysiologisesti siedettäväs-25 tä suolasta tai sisältävät vähintään yhtä näistä vaikuttavista aineista farmaseuttisesti sopivien ja fysiologisesti siedettävien kantaja-aineiden, laimentimien ja/tai muiden apuaineiden kanssa.

Tällaisia lääkkeitä voidaan antaa oraalisesti, toop-. ,· 30 pisesti, rektaalisesti tai mahdollisesti myös parenteraali- sesti, jolloin oraalinen käyttö on edullista.

Sopivia kiinteitä tai nestemäisiä galeenisia anto-muotoja ovat esimerkiksi granulaatit, pulverit, rakeet, tabletit, (mikro)kapselit, peräpuikot, siirapit, mehut, 35 suspensiot, emulsiot, tipat tai injektoitavat liuokset sekä 6 105680 valmisteet, joilla on pitkittynyt vaikuttavan aineen vapautuminen, joiden valmistuksessa voidaan käyttää tavallisia apuaineita, kuten kantaja-aineita, hajoamista auttavia aineita, side-, päällyste-, turpoamis-, liuku- tai voiteluai-5 neita, makuaineita, makeutusaineita tai liukenemista edistäviä aineita. Tavallisesti käytettyinä apuaineina mainittakoon esimerkiksi magnesiumkarbonaatti, titaanidioksidi, laktoosi, manniitti ja muut sokerit, talkki, maidonvalkuai-nen, gelatiini, tärkkelys, selluloosa ja sen johdokset, 10 eläin- ja kasviöljyt, polyetyleeniglykolit ja liuottimet, kuten esimerkiksi steriili vesi ja yksi- tai moniarvoiset alkoholit, esimerkiksi glyseriini.

Edullisesti farmaseuttiset valmisteet valmistetaan ja jaetaan annosteluyksiköinä, jolloin jokainen yksikkö 15 sisältää aktiivisena aineosana tietyn annoksen vähintään yhtä kaavan Ia tai Ib mukaista yhdistettä ja/tai vähintään yhtä sen fysiologisesti siedettävistä suoloista. Kiinteiden annosteluyksiköiden, kuten tablettien, kapseleiden, rakeiden tai peräpuikkojen yhteydessä tämä annos voi olla kor-20 keintaan noin 300 mg, edullisesti kuitenkin noin 10 - 50 mg.

Leukemiaan sairastuneen aikuisen potilaan (70 kg) hoitoon tarpeellisia ovat - aina riippuen kaavan Ia tai Ib mukaisten yhdisteiden ja/tai niiden fysiologisesti siedet-25 tävien suolojen vaikutuksesta ihmiseen - päiväannokset noin 5 - 300 mg vaikuttavaa ainetta, edullisesti noin 25 - 100 mg, käytettäessä oraalista antotapaa. Kuitenkin voidaan mahdollisesti käyttää myös suurempia ja pienempiä päiväannoksia. Päiväannoksen anto voi tapahtua sekä kerta-annokse-. 30 na yksittäisenä annosteluyksikkönä tai useampana pienempänä annosteluyksikkönä että jaettuina annoksina moneen kertaan annettuna tietyin aikavälein.

Lopuksi kaavan Ia ja Ib mukaiset yhdisteet ja/tai vähintään yksi niiden fysiologisesti siedettävistä suolois-35 ta voidaan muotoilla edellä mainittujen galeenisten valmis- 7 105680 temuotojen valmistuksen yhteydessä myös muiden sopivien ' vaikuttavien aineiden, esimerkiksi muiden tuumorinvastais- ten aineiden, immunoglobuliinien, monoklonaalisten vasta-• aineiden, immuunistimuloivien aineiden tai antibioottien 5 kanssa. Näitä yhdisteitä voidaan antaa myös sädehoidon yhteydessä.

Farmakologiset kokeet ja tulokset

Kemoterapeiittisten aineiden tehokkuuskokeena suoritettiin soluviljelmien proliferäätiotesti in vitro. Tulok-10 set on esitetty taulukossa 4.

Esimerkki 1

Prolif eraatiökoe

Jauhemuodossa olevaa Clicks-/RPMI 1640 -väliainetta (50:50), jossa on L-glutamiinia ilman NaHC03:a, 10 litraa 15 varten (Seromed, Biochrom, Berliini, Saksan Liittotasavalta), liuotetaan 9 litraan aqua bidest’ia ja steriilisuoda-tetaan 900 ml:n pulloihin.

Pesuaine 900 ml perusainetta puskuroidaan 9,5 ml:11a 7,5-20 prosenttista natriumvetykarbonaattiliuosta ja 5 ml:11a HEPES'tä(N-2-hydroksietyylipiperatsiini-N-2-etanolisulfo-nihappo) (Gibco, Eggenstein, Saksan Liittotasavalta).

Käyttöliuos 900 ml perusainetta ja 19 ml NaHC03-liuosta (7,5 %; 25 10 ml HEPES-liuosta ja 10 ml L-glutamiiniliuosta (200 mM)).

Väliaine mitogeeni-indusoitua lymfosyyttien proli-feraatiota varten Käyttöliuos sekoitetaan 1 %:n kanssa kuumuuden avulla aktivoitua (30 mln7 56 eC) fetaalista vasikanseerumia - .· 30 (FCS).

Tuumorisoluväliaine = Tuumorisolujen ja hybridomisolujen säilyttämiseksi sekoitetaan käyttöliuosta 5 %:n kanssa FCS:a.

8 105680

Solulinjojen viljelyväliaine

Solulinjojen säilyttämiseksi sekoitetaan 900 ml käyttöliuosta 10 %:n kanssa FCS:a, 10 ml:n kanssa NEA-liuosta (non-essential amino acids) (Gibco), 10 ml:n kanssa 5 natriumpyruvaattiliuosta (100 mM, Gibco) ja 5 ml:n kanssa 10"2 M merkaptoetanolia.

Pernasolujen tuotanto ja viimeistely mitogeenien indusoimaa lymfosyyttiproliferäätiota varten

Hiiret tapetaan katkaisemalla kaula ja pernat pois-10 tettiin steriilisti. Pernat hienonnetaan käyttäen steriiliä seulaa, jonka silmäkoko oli 80 "mesh", ja pipetoidaan muo-viruiskun (10 ml) männän avulla varovasti petrimaljaan yhdessä käyttöliuoksen kanssa. Erytrosyyttien poistamiseksi pernasolususpensiosta seosta inkuboidaan noin 1 min ravis-15 telemalla satunnaisesti hypotonisessa, 0,17 M ammoniumklo-ridiliuoksessa huoneenlämpötilassa. Tällöin erytrosyytit hajoavat, kun taas lymfosyyttien elinvoima ja reaktiivisuus eivät huonone. Sentrifugoinnin jälkeen (7 min/340 g) ly-saatti heitetään pois, solut pestään kahdesti ja sen jäl-20 keen siirretään kyseiseen testiväliaineeseen.

Mitogeenien indusoima lymfosyyttien proliferaatio 5xl05 valmistettua NMRI-naarashiirten pernasolua pi-petoitiin yhdessä erilaisten mitogeenien ja preparaatin kanssa 200 pl:ssa testiväliainetta tasapohjaisten mikro-25 tiitterilevyjen syvännettä kohti. Käytettiin seuraavia mi-togeeni-ja preparaattipitoisuuksia:

Concanvalin A [Serva]: 0,5 - 0,12 pg/ml

Lipopolysaccharid [Calbiochem]: 1,0 - 0,5 - 0,1 pg/ml ,« 30 Phytohämagglutinin [Gibco]: 0,5 - 0,25 - 0,12 % kan- taliuosta

Pokeweed mitogen [Gibco] yhdiste 1 tai 2: 50, 25, 10, 7,5, 5, 2,5, 1, 0,5, 0,1 pmol

Positiivisiksi kontrollinäytteiksi määriteltiin ryh-35 mä, jossa on mitogeenilisäyksiä ilman preparaattia. Nega- 9 105680 tiivisten kontrollinäytteiden yhteydessä kyseessä olivat viljelyväliaineessa olevat solut preparaatin kanssa ilman mitogeenilisäyksiä. Jokaista mitogeenipitoisuutta testat-- tiin kaikilla preparaattipitoisuuksilla useita kertoja.

5 Olosuhteissa 37 eC/5 % C02 suoritetun 48 tunnin inkuboinnin jälkeen soluihin lisätään 25 μΐ/syvänne tritiumtymidiiniä (Amersham), jonka aktiivisuus on 0,25 Ci/syvänne (9,25xl03 Bq). Tämän jälkeen suoritettiin lisäinkubointi samoissa olosuhteissa 16 tunnin ajan. Testierän arvioimiseksi solut 10 kerätään solunkeräyslaitteella (Flow Laboratories) suodatinpaperille, jolloin kiinnittymätön tymidiini kerätään erityiseen jätepulloon. Suodatinpaperi kuivataan, stanssa taan ja laitetaan yhdessä 2 ml:n kanssa tuikeainetta (Ro-tiszint 22, valmistaja Roth) pieniin lääkepulloihin, joita 15 sen jälkeen jäähdytetään vielä 2 tuntia lämpötilassa 4 eC. Määrä, joka saadaan soluissa olevasta radioaktiivisuudesta, mitataan beetalaskurissa (valmistaja Packard, Tricarb-460c).

Tuumorisolujen ja solulinjojen viimeistely prolife-20 raatiokoetta varten

Kokeessa käytetyt tuumorisolut tai soluiinjät otetaan pois kannan säilytyksen logaritmisessa kasvuvaiheessa, pestään kahdesti pesuaineella ja suspendoidaan vastaavaan väliaineeseen.

25 Proliferaatiokokeen suoritus ja arviointi

Proliferaatiokoe suoritettiin pyöreäpohjaisissa mik-rotiitterilevyissä. Yhdistettä 1 ja interleukiinia liuotettiin 50 μΐ kutakin^yhtä vastaavan väliaineen syvännettä kohti, ja soluluku C5xl05) säädettiin 100 μ1:η avulla sy-30 vännettä kohti, niin että saadaan lopputilavuus 200 μΐ/sy-vänne. Kaikissa kokeissa arvot määritettiin useita kertoja. Ilman preparaattia"jiTTlman kasvutekijää olevat valmisteet määriteltiin negatiivisiksi kontrollinäytteiksi, ja ilman preparaattia olevat, mutta kasvutekijää sisältävät solut 35 antoivat arvot positiivisia kontrollinäytteitä varten. Ne- 10 105680 gatiivisten kontrollinäytteiden arvo saatiin kaikista ilmoitetuista arvoista, ja erotus positiiviset kontrollinäyt-teet miinus negatiiviset vertailunäytteet asetettiin 100 prosentiksi. Levyjä inkuboitiin 72 tuntia olosuhteissa 37 5 eC/5 % C02 ja proliferaationopeus määritettiin vastaavasti kuin mitogeeni-indusoidussa lymfosyyttiproliferaatiossa.

Solulinjat otettiin kantakokoelmasta American Type Culture Collection (ATCC).

Taulukko 1 osoittaa ne pitoisuudet, joilla tapahtuu 10 50-prosenttinen esto:

Taulukko 1

Solulinja Alkuperä ED50 CTLL Hiiren T-solulinja (Tc~Clon IL-2) 40 - 50 ^im HT-2 Hiiren T-solulinja (IL-2) 40 - 50 jim 15 CTL-J-K Hiiren T-solulinja (Tc, IL-2) 40 - 50 pm

Cl 9/4 Hiiren T-solulinja (IL-4 dep.) 25 pm K III 5 Hiiren T-solulinja (Th, IL-2) 1-3 pm

Perna T Hiiri (Con A ja PWM) 10 pm

Perna B Hiiri (LPS) 10 ^im 20 A20 2J Hiiren B-solutuumori (BALB/c) 1-3 ^im TRK 4 Hiiren B-soluhybridooma 5 ^um TRK 5 Hiiren B-soluhybridooma 5 pm

Luuydin Hiiri (M-CSF, GM CSF) 5 ^im WEHI 279 Hiiren B-solulymfooma < 1 pm 25 p 388 Dl Hiiren M0-tuumori 10 pm 7TD1 Hiiren B-soluhybridooma (IL-6) 10 G53 Hiiren T-soluklooni PB-3C Hiiren Mast-solulinja {IL—3) 20 ^im DA-1 Hiiren tuumori (IL-3) 5 pm 30 7D4 Rottien hybridooma < 1 ^pm A431 Ihmisen ihoaiheinen rakkulakasvainkarsinooma 15 pm KB Ihmisen ihoaiheinen rakkulakasvainkarsinooma 15 ^um HFF Ihmisen esinahkafibroblastocma 40 ^im 35 HL-60 Ihmisen promyelomonosyyttinen Leukemia 25 pm 11 105680

Esimerkki 2

Akuutti toksisuus oraalisen annon yhteydessä Yhdistettä 1 annettiin hiirille ja rotille akuutin , toksisuuden määrittämiseksi. LD50-arvot määritettiin Litch- 5 fieldin ja VIilcoxonin mukaan. NMRI-hiirten (NMRI: Naval Medical Research Institute) paino on 20 - 25 g ja SD-rot-tien (SD: Sprague-Dawley) paino on 110 - 165 g. Ennen koetta hiiret olivat ilman ravintoa noin 18 tuntia. Viisi tuntia testattujen yhdisteiden annon jälkeen ruokitaan taas 10 normaalisti. Kolmen viikon kuluttua eläimet tapettiin kloroformilla ja leikeltiin. Kutakin annosta kohti käytettiin 6 eläintä. Tulokset on koottu taulukkoon 2:

Taulukko 2 15

Yhdiste 1 Yhdiste 2

Akuutti toksisuus Akuutti toksisuus

per OS per OS

LD50 (mg/kg) LD50 (mg/kg) 20 NMRI-hiiri 445 (362 - 546) SD-rotta 160 (133 - 193) SD-rotta 235 (167 - 332)

Esimerkki 3

Akuutti toksisuus intraperitoneaalisen annon jälkeen

Testattavien aineiden akuutti toksisuus intraperi- • < 25 toneaalisen annon jälkeen suoritettiin käyttäen NMRI-hiiriä (20 - 25 g) ja SD-röttia (120 - 195 g). Testattava aine suspendoitiin 1-prosenttiseen natriumkarboksimetyylisellu-loosaliuokseen. Testattavan aineen erilaiset annostukset annettiin hiirille tilavuutena 10 ml/kg ruumiinpainoa ja . · 30 rotille tilavuutena 5 ml/kg ruumiinpainoa. Annostusta kohti käytettiin 10 eläintä. Kolmen viikon kuluttua määritettiin „ akuutti toksisuus Litchfieldin ja Wilcoxonin mukaan. Tulok set on koottu taulukkoon 3.

12 105680

Taulukko 3

Yhdiste 1 Yhdiste 2

Akuutti toksisuus Akuutti toksisuus 5 intraperitoneaalisesti intraperitoneaalisesti LD50 (mg/kg) LD50 (mg/kg) NMRI-hiiri 185 (163 - 210) NMRI-hiiri (100 - 200) SD-rotta 170 (153 - 189)

Proliferaatiotesti 10 Seuraavat proliferaatiotestit suoritettiin siten, kuin on kuvattu selityksen sivuilla 9-10. Taulukossa 5 esitetään ne pitoisuudet, joilla saadan 50-% esto.

13 105680 o o o o o o i es in m in m es , 0]

•H I I · I I I I

_ E (O O) +* CTjc-h in o o · o o o o · o o o o <n I -H E rHinrH C H CO H in (1) m H CO «H <-l ‘“o CS Αί <" VO 3 Q in ©

W * H

O O O o o O in m in in co

•H H

III· Il

O I +J

g o es oooo · o o o om

i 3 HHinHH''es«-ico<DininHcocsH

S.B

H -rl i μ E* μ S' £ co

J O

ω *w * I o o o o o o O 3 in in in in in in M h co 3 O i i i i i i 3 w i

HIO1 OOO O OO O

3 T-, E-· (0 HinHHHONHCOH^inHcsinin

(0 e E

S BO

H ^ .2 3 I Ό

! H O -H

o T1 b

w ' -Q

es Λ a> co

! -H

i ^ τ) oo £ ! CO \ ·* im oooo o - J in in in in in “

• C < co S

Q)m 1 I I i · i 5 μ i oi '2 •H OOO^O ·οοο 2

•H *H rH ίΠ H lH r·^ H ι—I ^ C ^ i—i (N LO LO

s u ~ i o 6 <3 e - - es 3 cp .a o μ o μ μ μ n a en (0 < h μ ^ E co .' h O) μ μ •H (0

X 10 -H

X 0) >0) u μ * O) co m OrHCOvot^oioes^esco -h ii g-h ^'inioaiHHHHHHeseses^f'J1 0) H Ό co o ii μ ω in e ___* <s> 14 105680

Esimerkki 4 A) 5-metyyli-isoksatsoli-4-karboksyylihappo-(4-trif-luorimetyyli)anilidin valmistus

Liuos, joka sisältää 0,05 mol 5-metyyli-isoksatsoli-5 4-karboksyylihappokloridia (7,3 g) 20 ml:ssa asetonitrii-liä, lisätään pisaroittaln huoneenlämpötilassa liuokseen, joka sisältää 0,1 mol 4-trifluorimetyylianiliinia (16,1 g) 150 ml:ssa asetonitriiliä. 20 minuutin sekoituksen jälkeen muodostunut 4-trifluorimetyylianiliinihydrokloridi erote-10 taan imusuodatuksen avulla, pestään kahdesti kulloinkin 20 ml:11a asetonitriiliä ja yhdistetyt suodokset haihdutetaan alennetussa paineessa. Niin saadaan 12,8 g valkoista, kiteistä 5-metyyli-isoksatsoli-4-karboksyylihappo-(4-trifluo-rimetyyli)anilidia (yhdiste 1).

15 B) N-(4-trifluorimetyylifenyyli)-2-syaani-3-hydrok- sikrotonihappoamidin valmistus (ei vaatimusten mukainen yhdiste) 0,1 mol 5-metyyli-isoksatsoli-4-karboksyylihappo-(4-trifluorimetyyli)anilidia liuotetaan 100 ml:aan metanolia 20 ja sekoitetaan lämpötilassa +10 °C:ssa liuokseen, joka sisältää 0,11 mol (4,4 g) natronlipeää 100 ml:ssa vettä. Sekoitetaan 30 min ja vedellä laimennuksen jälkeen tehdään happamaksi väkevällä suolahapolla. Muodostunut kidemassa erotetaan imusuodatuksen avulla, pestään vedellä ja kuiva- « 25 taan ilmassa. Saanto on 24,4 g N-(4-trifluorimetyylifenyy-li)-2-syaani-3-hydroksikrotonihappoamidia (yhdiste 2). Sulamispiste metanolista 205 - 206 °C.

Valmistusesimerkkejä

Kaikkien seuraavassa kuvattujen yhdisteiden rakenne ·’ 30 varmistettiin alkuaineanalyysin ja IR- ja ^-NMR-spektrien avulla.

5. N-(4-trifluorimetoksifenyyli)-2-syaani-3-hyd-roksikrotonihappoamidi

Liuotettiin 0,1 mol (28,6 g) N-(4-trifluorimetoksi-35 fenyyli)-5-metyyli-isoksatsoli-4-karboksiamidia 100 ml: aan 15 105680 etanolia ja sekoitettiin lämpötilassa 20 °C liuoksen kanssa, joka sisälsi 0,11 mol (4,4 g) natronlipeää 100 ml:ssa vettä. Sekoitetaan 30 min ja vedellä laimennuksen jälkeen tehdään happamaksi väkevällä suolahapolla. Muodostunut ki-5 demassa erotetaan imusuodatuksen avulla, pestään vedellä ja kuivataan ilmassa. Saadaan 27,7 g (97,1 % teoreettisesta) N-(4-trifluorimetoksifenyyli)-2-syaani-3-hydroksikro-tonihappoamidia, jonka sulamispiste on 171 - 176 "C (etanolista).

10 Edellä kuvatun esimerkin mukaan valmistetaan seuraa- vat kaavan Ia tai Ib_mukaiset yhdisteet.

6. 2-syaani-3-hydroksi-N-(4-(1,1,2,2-tetrafluo-rietoksi)fenyyli]krotonihappoamidi (sulamispiste 166 164 eCN-[4-(1,1,2,2-tetrafluorietoksi)fenyyli]-5-metyyli- 15 lsoksatsoli-4-karboksiamidista.

7. N-(5-kloori-2-pyridyyli)-2-syaani-3-hydroksi-krotonihappoamidi [sulamispiste 213 - 215 °C (haj.)] N-(5-kloori-2-pyridyyli)-5-metyyli-isoksatsoli-4-karboksiamidis-ta.

20 8. N-(2-kloori-3-pyridyyli)-2-syaani-3-hydroksi- krotonihappoamidi (sulamispiste 128 - 131 °C) N-(2-kloori- 3-pyridyyli)-5-metyyli-isoksatsoli-4-karboksiamidista.

9. N-(4-bentsoyylifenyyli)-2-syaani-3-hydroksikro-tonihappoamidi (sulamispiste 186 - 188 eC) N-(4-bentsoyyli- « 25 fenyyli)-5-metyyli-isoksatsoli-4-karboksiamidista.

10. N-[4-(4-klooribentsoyyli)fenyyli]-2-syaani-3- hydroksi-4-metyylikrotonihappoamidi (sulamispiste 157 - 159 °C) N-[4-(4-klooribentsoyyli)fenyyli]-5-etyyli-isoksat-soli-4-karboksiamidista.

30 11. N-[4-(4-brömibentsoyyli)fenyyli]-2-syaani-3-hyd- roksikrotonihappoamidi (sulamispiste 221 - 223 °C) N-[4-(4-bromibentsoyyli) fenyyli] -5-metyyli-isoksatsoli-4-karboksi-amidista.

12. N-[4-(4-metoksibentsoyyli)fenyyli]-2-syaani-3- 35 hydroksikrotonihappöamidi (sulamispiste 74 - 75 °C) N-[4(4- 105680 . 16 metoksibentsoyyli)fenyyli] -5-metyyli-isoksatsoli-4-karbok-siamidista.

13. N-[4-(4-metyylibentsoyyli)fenyyli]-2-syaani-3-hydroksikrotonihappoamidi (sulamispiste 177 - 179 °C) N-[4- 5 (4-metyylibentsoyyli )fenyyli] -5-metyyli-isoksatsoli-4-kar-boksiamidista.

14. N-(5-kloori-2-pyridyyli)-2-syaani-3-hydroksi- 4-metyylikrotonihappoamidi (sulamispiste 206 - 208 °C) N-(5-kloori-2-pyridyyli )-5-etyyli-isoksatsoli-4-karboksiami- 10 dista.

15. N-(5-bromi-2-pyridyyli)-2-syaani-3-hydroksi-4-metyylikrotonihappoamidi [sulamispiste 200 - 202 °C (haj.)] N-(5-bromi-2-pyridyyli)-5-etyyli-isoksatsoli-4-karboksiami-dista.

15 16. 2-syaani-3-hydroksi-4-metyyli-N-(4-nitrofenyy- li)krotonihappoamidi [sulamispiste 202 - 203 °C (haj.)] N-(4-nitrofenyyli)-5-etyyli-isoksatsoli-4-karboksiamidista.

17. N-(3,4-metyleenidioksifenyyli)-2-syaani-3-hyd-roksi-4-metyylikrotonihappoamidi (sulamispiste 99 - 100 °C) 20 N- (3,4-metyleenidioksifenyyli)-5-etyyli-isoksatsoli-4-kar- boksiamidista.

18. N-(4-bentsoyylifenyyli)-2-syaani-3-hydroksi-4-propyylikrotonihappoamidiN-(4-bentsoyylifenyyli)-5-butyy-li-isoksatsoli-4-karboksiamidista.

25 19. N- 5-bromi-2-pyridyyli)-2-syaani-3-hydroksikro- tonihappoamidi [sulamispiste 220 - 223 eC (haj.)] N-(5-bro-mi-2-pyridyyli)-5-metyyli-isoksatsoli-4-karboksiamidista.

20. N-[4-(4-klooribentsoyyli)fenyyli]-2-syaani-3-hydroksikrotonihappoamidi [sulamispiste 219 - 223 °C

« 30 (haj.)] N-[4-(4-klooribentsoyyli)fenyyli]-5-metyyli-iso- ksatsoli-4-karboksiamidista.

21. N-[4-(4-fluoribentsoyyli)fenyyli]-2-syaani-3-hydroksikrotonihappoamidi [sulamispiste 229 - 231 °C (haj.)] N- 4-(4-fluoribentsoyyli)fenyyli]-5-metyyli-iso- 35 ksatsoli-4-karboksiamidista.

17 105680 22. N-[4-(4-kIooribentsoyyli)fenyyli]-2-syaani-4-me-tyyli-3-hydroksikrotonihappoamidi (sulamispiste 147 - 148 °C)N-[4-(4-fluoribentsoyyli)fenyyli]-5-etyyli-iso-ksatso-li-4-karboksiamidista.

5 23. N-[4-(4-bromibentsoyyli)fenyyli]-2-syaani-3- hydroksi-4-metyylikrotonihappoamidi (sulamispiste 153 - 155 °C)N-[4-(4-bromibentsoyyli)fenyyli]-5-etyyli-isoksat-soli-4-karboksiamidista.

24. N-(4-trifluorimetoksi)fenyyli-2-syaani-3-hyd-10 roksi-4-metyylikrotonihappoamidi (sulamispiste 166 - 167 °C) N-(4-trifluorimetoksi)fenyyli-5-etyyli-isoksatsoli-4-karboksiamidista.

25. N-(4-fluorifenyyli)-2-syaani-3-hydroksi-4-me-tyylikrotonihappoamidi (sulamispiste 145 °C) N-(4-fluori- 15 fenyyli)-5-etyyli-isöksätsoli-4-karboksiamidista.

26. N-(3,4-metyleenidioksifenyyli)-2-syaani-3-hyd-roksi-4-metyylikrotonihappoamidi (sulamispiste 99 - 100 °C)N-(3,4-metyleenidioksifenyyli)-5-etyyli-isoksatsoli-4-karboksiamidista.

20 27. N-(4-metyylisulfonyyli)fenyyli-2-syaani-3-hyd- roksikrotonihappoamidi (sulamispiste 196 - 198 eC) N-(4-me-tyylisulfonyyli)fenyyli-5-metyyli-isoksatsoli-4-karboksi-amidista.

28. N-allyyli-N-fenyy1i-2-syaani-3-hydroksikroto- 25 nihappoamidi (sulamispiste 57 - 50 eC) N-allyyli-N-fenyyli- 5-metyyli-isoksatsoIT^4-karboksiamidista.

29. N-(4-etoksikarbonyylimetyyli-2-tiatsolyyli)- 2-syaani-3-hydroksikrotönihappoamidi (sulamispiste 147 °C) N-(4 - etoks ikarbonyy 1 imetyy 1 i - 2 -1 i a t so lyy 1 i) - 5 - me tyy 1 i - i so- .* 30 ksatsoli-4-karboksiamidista.

« 30. N-(2-bentsimidatsolyyli)-2-syaani-3-hydroksi-krdtönihappoamidi (hajoamispiste > 3ÖÖ °C) N-(2-bentsimidatsolyyli )-5-metyyli-isoksatsoli-4-karboksiamidista.

31. N-(4-metyyli-2-tiatsolyyli)-2-syaani-3-hydrok-35 sikrotonihappoamidi [sulamispiste 210 - 212 °C (haj.)] 18 105680 N-(4-metyyli-2-tiatsolyyli)-5-metyyli-isoksatsoli-4-kar-boksiamidista.

32. N-(4-kloori-2-bentsotiatsolyyli)-2-syaani-3-

hydroksikrotonihappoamidi [sulamispiste 211 - 213 eC

5 (haj.)] N-(4-kloor±-2-bentsotiatsolyyli)-5-metyyli-iso- ksatsoll-4-karbokslamldlsta.

33. N-(3-pyridyyli)-2-syaani-3-hydroksikrotonihap-poamldl [sulamispiste 240 - 250 °C (haj.)] N-(3-pyridyyli)-5-metyyli-isoksatsoli-4-karboksiamidista.

10 34. N-(4,6-dimetyyli-2-pyridyyli)-2-syaani-3-hyd- roksikrotonihappoamidi (sulamispiste 184 - 186 °C) N-(4,6-dimetyyli-2-pyridyyli )-5-metyyli-isoksatsoli-4-karboksi-amidista.

35. N-(4,6-dimetyyli-2-pyrimidyyli)-2-syaani-3- 15 hydroksikrotonihappoamidi (sulamispiste 221 °C) N-(4,6-dime- tyyli-2-pyrimidyyli)-5-metyyli-isoksatsoli-4-karboksiami-dista.

36. N-(6-indatsolyyli)-2-syaani-3-hydroksikrotoni-happoamidi (sulamispiste > 300 °C) N-(6-indatsolyyli)-5-me- 20 tyyli-isoksatsoli-4-karboksiamidista.

37. N-(5-indatsolyyli)-2-syaani-3-hydroksikrotoni-happoamidi (sulamispiste 220 - 223 °C) N-(5-indatsolyyli)-5-metyyli-isoksatsoli-4-karboksiamidista.

38. N-(4-karboksi-3-hydroksifenyyli)-2-syaani-3-

25 hydroksikrotonihappoamidi [sulamispiste 242 - 246 °C

(haj.)] N-(4-karboksi-3-hydroksifenyyli]-5-metyyli-iso-ksatsoli-4-karboksiamidista.

39. N-(3-karboksi-4-hydroksifenyyli)-2-syaani-3-hyd-roksikrotonihappoamidi [sulamispiste 248 - 252 °C (haj.)] 30 N-(3-karboksi-4-hydroksifenyyli]-5-metyyli-isoksatsoli-4- karboksiamidista.

40. N-(4-karboksi-3-kloorifenyyli)-2-syaani-3-hyd-roksikrotonihappoamidi [sulamispiste 218 - 224 eC (haj.)] N-(4-karboksi-3-kloorifenyyli]-5-metyyli-isoksatsoli-4-kar- 35 boksiamidista.

19 105680 41. N-(4-hydroksifenyyli)-2-syaani-3-hydroksikro- ' tonihappoamidi [hajoamispiste 184 - 186 eC (haj.)] N-(4- hydroksifenyyli] -5-metyyli-isoksatsoli-4-karboksiamidista.

42. N-[4-(4-trifluorimetyylifenoksi)fenyyli]-2- 5 syaani-3-hydroksi-4-metyyllkrotonihappoamidi(sulamispiste 147 - 149 eC) N-[4-(4-trifluorimetyylifenoksi)fenyyli]-5-etyyli-isoksatsoli-4-karboksiamidista.

43. N-[4-(4-trifluorimetyylifenoksi)fenyyli]-2-syaa-ni-3-hydroksikrotonihappoamidi (sulamispiste 171- 173 eO

10 N-[4-(4-trifluorimetyylifenoksi)fenyyli]-5-metyyli-isoksat- soli-4-karboksiamidista.

44. N-metyyli-N-(4-trifluorimetyylifenyyli)-2-syaani-3-hydroksikrotonihappoamidi (sulamispiste 69 - 70 °C) N-metyyli-N-(4-trifluorimetyylifenyyli)-5-metyyli-isok- 15 satsoli-4-karboksiamidista, (ei vaatimusten mukainen yhdis te) .

45. 2-hydroksietylideenisyaanietikkahappopiperidi-diN-(5-metyyli-4-isoksatsolyylikarbonyyli)piperidiinistä.

46. 2-hydroksietylideenlsyaanletikkahappo-4-metyy- 20 lipiperididi N-(5-metyyli-4-isoksatsolyylikarbonyyli)-4- hydroksipiperidiinistä.

47. N-(4-karbqksibutyyli)-2-syaani-3-hydroksikroto-nihappoamidi (sulamispiste 92 °C) N-( 5-metyyli-4-isoksatso-lyylikarbonyyli)-5-aminovaleriaanahaposta.

*? 25 48. N-(4-etoksikarbonyylibutyyli)-2-syaani-3-hyd- roksikrotonihappoamIdlN-(4-etoksikarbonyylibutyyli)-5-me-tyyli-isoksatsoli-4-karboksiamidista.

49. N-(6-karboksiheksyyli)-2-syaani-3-hydroksikro-tonihappoamidi (sulamispiste 93 - 94 eC) N-(5-metyyli-4-^ 30 isoksatsolyylikarbonyyli)-7-aminoheptaanihaposta, (ei vaa- * timusten mukainen yhdiste).

Claims (3)

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen yhdisteen valmistamiseksi, jolla on kaava Ia tai Ib 5 0 r3 OR3 NC ‘ f ' C " NC - CH - C - N ^ A x*3 N.* R7 ^OH R 10 (Ia) (Ib) sen mahdollisesti stereoisomeeristen muotojen ja/tai mahdollisesti sen fysiologisesti siedettävien suolojen valmistamiseksi, jolloin ryhmät R3, R7 ja R8 ovat kohdassa 15 a) R7 on 1. vety, 2. alkyyli, jossa on 2 - 4 C-atomia, R8 on 1. vety, 20 2) metyyli, R3 on 1. fenyyli, 2. fenyyli, joka on substituoitu yksin- tai monin- . kertaisesti 25 2.1 halogeenilla, 2.2 alkyylillä, jossa on 1 - 3 C-atomia ja joka on substituoitu yksin- tai monikertaisesti halogeenilla, kuten fluorilla, kloorilla, bromilla tai jodilla, 2.3 nitrolla 30 b) R7 on : 1) alkyyli, jossa on 1 - 4 C-atomia, 2. vety, R8 on 1) vety, 35 2) metyyli, 21 105680 3. alkenyyli, jossa on 2 - 3 C-atomia, R3 on 1. pyridyyli, 2. pyridyyli, joka on substituoitu yksin- tai monin-5 kertaisesti 2.1 halogeenilla, kuten fluorilla, kloorilla, bromilla tai jodilla, 2.2 alkyylillä, jossa on 1 - 3 C-atomia, 2.3 nitrolla 10 3) pyrimidinyyli, joka on substituoitu kuten kohdas sa 2) 4. tiatsolyyli, joka on substituoitu kuten kohdassa 2. ja 4.1 alkoksikarbonyylimetyylillä, jonka alkyyliket- 15 jussa on 1 - 3 C-atomia, 5. bentsotiatsolyyli, joka on substituoitu kuten kohdassa 2), 6. bentsimidatsolyyli, joka on substituoitu kuten kohdassa 2), 20 7) indatsolyyli, joka on substituoitu kuten kohdassa 2), 8. fenyyli, joka on yksin- tai moninkertaisesti substituoitu 8.1 bentsoyylillä, » 25 8.2 bentsoyylillä, joka on yksin- tai moninker taisesti substituoitu 8.2.1 halogeenilla, kuten fluorilla, kloorilla, bromilla tai jodilla, 8.2.2 alkyylillä, jossa on 1 - 3 C-atomia, - 30 8.2.3 alkoksilla, jossa on 1 - 3 C-atomia, ’ * 8.2.4 alkoksilla, jossa on 1-3 C-atomia ja joka on „ substituoitu yksin- tai moninkertaisesti halogeenilla, ku ten fluorilla, kloorilla, bromilla tai jodilla, 8.3 karboksilla, 35 8.4 hydroksilla, 22 105680 8.5 alkyylisulfonyylillä, jonka alkyyliketjussa on 1-3 C-atomia 8.6 fenoksilla, joka on yksin- tai moninkertaisesti substltuoltu (Ci.jJalkyylillä, joka on yksin- tai moninker- 5 taisesti substituoitu halogeenilla, kuten fluorilla, kloorilla, bromilla ja jodilla. 8.7 metyleenidioksirengasryhmällä c) R7 on 1. vety, 10 2) alkyyli, jossa on 1 - 4 C-atomia, R8 on 1. vety, 2. metyyli, R3 on 15 1) ryhmä, jolla on kaava III, -(CH2)4-COOR10 jossa

20 R10 on 1.1 vety, 1.2 alkyyli, jossa on 1 - 4 C-atomia, tunnettu siitä, että yhdiste, jolla on kaava I • 25 _/c_Nvv 30 jossa R7, R3 ja R8 tarkoittavat samaa kuin edellä, saatetaan reagoimaan emäksisen aineen läsnä ollessa vastaavaksi kaavan Ia tai Ib mukaiseksi yhdisteeksi. „

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ryhmät R7, R8 ja R3 ovat koh- 35 dassa • i 23 105680 a) R7 on alkyyli, jossa on 2 - 4 C-atomia, R8 on vety, R3 on » 1) fenyyli, 5 2) fenyyli, yoka on substituoitu yksin- tai monin kertaisesti 2.1 halogeenilla, kuten fluorilla, kloorilla, bromilla tai jodilla, 2.2 alkyylillä, jossa on 1 - 3 C-atomia ja joka on 10 substituoitu yksin- tai moninkertaisesti halogeenilla, kuten fluorilla, kloorilla, bromilla tai jodilla, 2.3 nitrolla^ b) R7 on alkyyli, jossa on 1 - 4 C-atomia, R8 on vety,

15 R3 on 1. pyridyyli, 2. pyridyyli, joka on substituoitu yksin- tai moninkertaisesti 2.1 halogeenilla, kuten fluorilla, kloorilla, bro-20 millä tai jodilla, 2.2 alkyylillä, jossa on 1 - 3 C-atomia, 3. fenyyli, joka on yksin- tai moninkertaisesti substituoitu j 3.1 bentsoyylillä, 25 3.2 bentsoyylillä, joka on yksin- tai moninker taisesti substituoitu 3.2.1 halogeenilla, kuten fluorilla, kloorilla, bromilla tai jodilla, 3.2.2 alkyylilXä, jossa on 1 - 3 C-atomia, „ 30 3.2.3 alkoksilla, jossa on 1 - 3 C-atomia, : * 3.2.4 alkoksilla, jossa on 1 - 3 C-atomia ja joka on substituoitu yksin- tai moninkertaisesti halogeenilla, kuten fluorilla, kloorilla, bromilla tai jodilla.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n-35 n e t t u siitä, että valmistetaan N-(4-trifluorimetoksi- 24 105680 fenyyli)-2-syaani-3-hydroksikrotonihappoamidi, N- [4-(1,1,2,2-tetrafluorietoksi)fenyyli]-2-syaani-3-hydroksikro-tonihappoamidi, N-[4-(4-fluoribentsoyyli)fenyyli]-2-syaani- 3-hydroksikrotonihappoainidi, N-(3,4-metyleenidioksifenyy-5 li)-2-syaani-3-hydroksi-4-metyylikrotonihappoamidi, 2-syaa-ni-3-hydroksi-4-metyyli-N-(4-nitrofenyyli)krotonihappoamidi taiN-[4-(trifluorimetyylifenoksi)fenyyli]-2-syaani-3-hyd-roks i-4-metyy1ikrotonihappoamidi. « • " « 25 105680