FI105549B

FI105549B - Ei-proteiinipitoiset boorihappokonjugaattiyhdisteet, menetelmä niiden valmistamiseksi ja niiden käyttö

Info

Publication number: FI105549B
Application number: FI932149A
Authority: FI
Inventors: Erling Sundrehagen; Frank Frantzen
Original assignee: Axis Shield Asa
Priority date: 1990-11-14
Filing date: 1993-05-12
Publication date: 2000-09-15
Also published as: JPH06502170A; RU2076127C1; GB9024775D0; DE69108403T2; US5739318A; CA2096251C; JP2761494B2; NO931746D0; EP0557357A1; FI932149A; HUT64353A; FI932149A0; ES2069914T3; HU9301408D0; AU666294B2; DK0557357T3; HU216635B; AU8909291A; CA2096251A1; WO1992008722A1

Description

1 105549

Ei-proteiinipatoiset boorihappokonjugaattiyhdisteet, menetelmä niiden valmistamiseksi ja niiden käyttö Tämä keksintö koskee uusia ei-proteiinipitoisia 5 boorihappokonjugaattiyhdisteitä, jotka ovat käyttökelpoisia merkkiaineina, tarkemmin ilmaistuna uusia väriaineita, joilla ilmenee absorptiomaksimi näkyvän valon spektrin ääripunaisen kohdalla tai sen yläpuolella.

Keksintö koskee myös menetelmää näiden uusien ei-10 proteiinipitoisten boorihappokonjugaattiyhdisteiden val mistamiseksi sekä niiden käyttöä.

Merkkiaineita tarvitaan usein verinäytteiden tutkimuksissa, esim. glykosyloidun hemoglobiinin mittauksissa, jotka kuuluvat osana veren glukoositasojen määri-15 tykseen sokeritautia sairastavilla potilailla. Tällaisia aineita kuvataan esimerkiksi DE-patenttijulkaisussa A-3 720 736 ja US-patenttijulkaisussa 4 861 728, ja tavallisesti ne käsittävät boorihapporegenssin, joka voi reagoida glykosyyliosan cis-dioliryhmittymän kanssa ja 20 joka sitoutuu fluoresoivaan ja/tai värilliseen väriainee seen, kuten diatsokonjugaattiin tai fluoreseiiniin, rodamiiniin tai fykobiliproteiiniin. Määrittämällä fluoresenssi tai absorbanssi esim. reflektometrillä, saadaan ’f, mitta verinäytteissä olevista glykosyloiduista hemoglo- 25 biinitasoista.

• « · *···. Boorihappojen fykobiliproteiinikonjugaattien käytön ] * haittana on se, että useimmissa glykosyloiduissa hemoglo- *· “ biineissa glykosyyliosa, joka on pääasiallisesti kiinnit- * · · • *.· tynyt beta-ketjun N-terminaaliseen väliini-aminohappoon, • · * ·* 30 sijaitsee toiminnallisesti hemoglobiinimolekyylin kapeassa "taskussa", joten suuren molekyylipainon omaavat reagens-sit eivät helposti pääse sen lähelle.

• * ·

Muilla aikaisemmin ehdotetuilla värillisillä merk- « • « · kiaineilla, kuten fluoreseiinilla ja rodamiinilla, on • ( t • •1 ‘ 35 haittana se, että niiden absorbtiospektri menee merkittä- t · « • · • · • « » • · · • ♦ · • · • ·

Ml • · • · • · « 2 105549 västi päällekkäin hemoglobiinin absorptiospektrin kanssa; tämä voi vakavasti estää merkkiaineen tehokkaan spektroskooppisen kvantitoinnin.

Esillä oleva keksintö perustuu uusien merkki-5 aineiden ryhmään, johon kuuluvilla yhdisteillä ilmenee ab-sorptiomaksimi vähintään aallonpituudella 600 nm, jossa hemoglobiinilla on minimiabsorptio.

Keksintö koskee siten ei-proteiinipitoisia boori-happokonjugaattiyhdisteitä, joille on tunnusomaista, että 10 niiden absorptiomaksimi on vähintään aallonpituudella 600 nm ja niillä on kaava (I) V - W- B(0H)2 (I) 15 jossa V on syaaniini-, fenoksatsiini-, fenotiatsiini- tai trifenyylimetaanikromoforinen ja/tai -fluoroforinen ryhmä, jonka absorptiomaksimi on vähintään 600 nm, ja W on kytkevä muodostava orgaaninen ryhmä.

Tulee huomata, että dihydroksiboryylitähde voi 20 esiintyä myös anionimuodossa -B(OH)3- ... riippuen käytettävien reagenssikoostumusten pH:sta ja • · * , 25 elektrolyyttipitoisuudesta, ja että nämä yhdisteet kat- « sotaan kuuluviksi kaavan (I) suojapiiriin.

* ' Keksinnön mukaiset boorihappokonjugaatit ovat käyt- * · ·.’·· tökelpoisia spektroskooppisissa tutkimuksissa, jotka liit- • · · • \· tyvät cis-diolien, erityisesti glykosyloitujen osien, 30 esim. proteiinien, arviointiin ja kvantitointiin hemoglobiinin läsnä ollessa, koska hemoglobiinin ja kromoforin .···. absorptiospektrit eivät käytännöllisesti katsoen peitä r r < ,··, toisiaan lainkaan.

Boorihappotähteen booriatomi kiinnittyy edullisesti < · !.! : 35 f enyy li ryhmään, esim. aminofenyyliryhmään, kuten m-amino- * · « « • f · « • · * • « « * · • * * ψ 3 105549 fenyyliryhmään. Riippuen boorihapolle toivottavasta pKa-arvosta, fenyyliryhmä voidaan edelleen substituoida, esim. yhdellä tai useammalla substituentilla, joka vaikuttaa pKa-arvoon ilman, että se häiritsee steerisesti boorihap-5 potähteen ja kohde-cis-diolien välistä sitoutumista. Esimerkkeinä elektroneja puoleensa vetävistä substituenteis-ta, joita voidaan käyttää ionisaatioasteen ja siten boori-hapon assosiaatiovakion cis-dioleihin, kuten glyko-syloituihin ryhmiin, parantamiseksi ovat nitro-, alemmat 10 alkoksi-, kuten metoksi tai etoksi, ja asyyliryhmät, kuten formyyli ja alempi alkanoyyli. Esimerkkeinä tämän tyyppisistä boorihapoista ovat 2-nitro-5-aminofenyyliboorihap-po ja vastaavat 3-nitro- ja 4-nitroisomeerit. Yleisesti kaikki tällaiset fenyyli- tai substituoidut fenyyliryhmät 15 voidaan liittää sidoksella suoraan kromofori- ja/tai fluoroforiosaan V siten, että fenyyliryhmää muodostaa ryhmän W kaavassa (I) , tai sidoksen muodostavien tai väliryh-mien kautta, esim. vastaavien kemiassa tunnettujen ryhmien kautta.

20 Eräs käyttökelpoinen ryhmä keksinnön mukaisia yh disteitä käsittää kaavan (II) mukaiset yhdisteet '·.'=! 25 OfSf irSf1' r ("1 • · ♦ • · • · ♦ • · · • φ • · : : : 30 jossa X on happi- tai rikkiatomi, Y' on anioni (esim. halo- genidi, kuten kloridi tai bromidi, tai perhalogenaatti- .2·. ioni, kuten perkloraatti) , ja Rx - R10 valitaan kukin vety- • « · - .···, atomeista ja orgaanisista ryhmistä, tai Rj^ ja R2 ja/tai R9 " ja R10 voivat yhdessä niiden hiiliatomien kanssa, joihin ne : 35 ovat kiinnittyneet, muodostaa fuusioidun monosyklisen tai • « · • · • · • ♦ · · • · • · · 2 • « 4 105549 polysyklisen rengassysteemin, edellyttäen, että ainakin toinen R3:sta ja R4:stä ja ainakin toinen R7:stä ja R8: sta on jokin muu kuin vety, ja että ainakin yksi Rx - R10:stä on orgaaninen ryhmä, jossa on boorihappotähde.

5 Kun jokin R3 - R10:stä on orgaaninen ryhmä, nämä voidaan valita esimerkiksi alkyyli-, alkenyyli- ja alky-nyyliryhmistä, esim. sellaisista, joissa on korkeintaan kuusi hiiliatomia, kuten metyyli, etyyli, n-propyyli, iso-propyyli, n-butyyli, sek-butyyli, t-butyyli, vinyyli, al-10 lyyli, etynyyli tai propargyyli; sykloalkyyli- tai syklo-alkenyyliryhmistä, esim. sellaisista, joissa on 5 - 7 hiiliatomia, kuten syklopentyyli, sykloheksyyli, sykloheptyy-li, sykloheksenyyli tai syklopentadienyyli; aryyliryhmis-tä, esim. sellaisista, joissa on 6 - 12 hiiliatomia, kuten 15 fenyyli, tolyyli tai naftyyli; heterosyklisistä ryhmistä, esim. 5-7 jäsenisistä tyydyttyneistä ja tyydyttymättömistä renkaista, joissa on vähintään yksi heteroatomi, joka on valittu hapesta, typestä ja rikistä, ja tällaisia ovat furyyli, tienyyli, pyridyyli, pyrimidinyyli, pyridat-20 syyli, tiatsolyyli, tiatsinyyli, triatsinyyli, pyrrolyyli, imidatsolyyli, pyratsolyyli, pyrrolidinyyli, piperi-dinyyli, piperatsinyyli tai morfolinyyli; alemmasta alkyylistä (esim. C^,,-) , joka on substituoitu jollakin ... aikaisemmin kuvatuista sykloalkyyli-, sykloalkenyyli-, * · · ’ . 25 aryyli- tai heterosyklisistä ryhmistä; kaikista aikai- * < t semmista ryhmistä, jossa on ja/tai jotka on substituoitu yhdellä tai useammalla heteroatomilla, esim. siten, että • · *. *: niissä on yksi tai useampia eetteri-, tioeetteri-, amino-, ·· · • amido-, karbonyyli- tai tiokarbonyyliryhmiä; tai kaikista m »9 : 30 aikaisemmista ryhmistä, joissa on yksi tai useampia subsi- tuentteja, jotka voidaan valita esimerkiksi seuraavista: hydroksi, merkapto, amino, halogeeni, nitro, atsido, kar- * f w ,··, boksi, syaani ja isotiosyanato, tai mistä tahansa muusta '·' substituentista, joka pystyy kilpailemaan boorihappo- « « « : 35 tähteen kanssa.

• · · • · • · II* 9 • · · • · · 9 9 • 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 5 105549

Yleisesti keksinnön mukaisissa yhdisteissä, ellei toisin ole mainittu, alkyyli-, alkenyyli- ja alkenyyliryh-missä on korkeintaan kuusi hiiliatomia ja syklisissä ryhmissä on 5 - 7-jäsenisiä renkaita.

5 Eräs hydrofiilisten ominaisuuksiensa vuoksi käyttö kelpoinen ryhmä yhdisteitä, jotka kuuluvat kaavaan (II) , ovat yhdisteet, joilla on kaava (III) /„ 10 r * · " (n.) *11 jossa X ja Y' ovat kuten tässä edellä on määritelty, kukin 15 R1X on muista riippumatta alempi (esim. C^-) alkyyliryhmä, kuten metyyli tai etyyli, ja R12 on orgaaninen ryhmä, jossa on boorihappotähde. Tulee ymmärtää, että resonanssi-stabiloidun rengassysteemin symmetrian kannalta R12-substi-tuentit, jotka ovat 1-, 2- ja 4-asemissa, vastaavat sub-20 stituentteja, jotka ovat 9-, 8- ja 6-asemissa, vastaavassa järjestyksessä.

Esimerkkejä R12-ryhmistä, joita voi olla mukana tällaisissa yhdisteissä (III), ovat seuraavat yhdisteet: 25 ^ ; * Ö • · · · w « • · ;ci -xx Α(χ : : : 30 :***: 0 o ' i 35

::j Ύ -γ-CK

• · 6 105549 jossa Z on ryhmä, jossa on boorihappotähde, esim. aminofe-nyyliboorihappotähde, kuten ryhmä H B (o H ) 2

5 /KnO

Edelleen käyttökelpoinen ryhmä hydrofiilisia yhdis-10 teitä (II) voidaan kuvata kaavalla (IV) Y"

D . ^ /Ov \ /R1J

15 ? ' (IV) R I I R" jossa X, Y' ja Ru ovat kuten tässä edellä on määritelty ja R13 on orgaaninen ryhmä, jossa on boorihappotähde, esim.

20 kuten tässä edellä on määritelty. Jälleen tulee huomata, että orgaanisella, boorihappotähteen sisältävällä ryhmällä on sama vaikutus, riippumatta siitä, onko siinä 3-amino-vai 7-iminoryhmittymän substituentti.

Esimerkkeinä orgaanisista ryhmistä, joissa on boo-**’ ' 25 rihappotähde, joita voi olla mukana tällaisissa yhdisteis- .«j sä (IV) , ovat • · • · * i · • ·# « ·

K 30 jwQK

*·· « · • · # 11 • i · p • · jossa Z on kuten tässä edellä on määritelty.

• · * · I « * · « · * « ψ · f « · • ·

Ml • I < f t I » • · « «

• · V

0 « » *

• M

7 105549

Toinen käyttökelpoinen kategoria keksinnön mukaisia yhdisteitä käsittää sellaiset yhdisteet, joissa V johdetaan trifenyylimetaaniväriaineesta, esim. yhdisteet, joilla on kaava (V) 5 * 1 1 ?»4 (y)

R . 4 K

10 o . 1 Ä.

A

15 jossa kukin R14 on muista riippumatta vetyatomi, orgaaninen ryhmä (esim. tässä edellä Rx - R10:n yhteydessä kuvattu ryhmä) tai (edullisesti hydrofiilinen) substituoiva ryhmä (esim. hydroksi, karboksi, sulfo tai kloorisulfonyyli), ja vähintään kaksi A-ryhmistä on auksokromiryhmiä, ja kaikki 20 A-ei-auksokromiryhmät ovat kuten on määritelty R14:lle. Edullisia auksokromiryhmiä ovat amiini/imiinisysteemit, joita kuvaavat N (R) 2/lT (R) 2- ja NHR/N+HR-systeemit (joissa kukin R on orgaaninen ryhmä, esim. kuten tässä edellä on • <.j määritelty R! - R10:n yhteydessä, edullisesti alempi alkyy-• · · 25 liryhmä, kuten metyyli tai etyyli), yksinään tai yh- • i · ·1··, distelmänä 0/0H:n kanssa. -W-B (OH) 2-osa voidaan kiinnittää | | yhteen fenyylirenkaista, esim. liittämällä ryhmän, kuten *. 1: karboksin tai sulfon välityksellä, tai johonkin R-ryhmistä * · « V amiini/imiiniauksokromisysteemissä. Tulee ymmärtää, että : 30 muiden resonanssirakenteiden, joita voidaan saada, on myös tarkoitus kuulua kaavan (V) piiriin.

;’2· Edelleen käyttökelpoinen keksinnön mukaisten yh-

IM

• .,··, disteiden kategoria käsittää sellaisia yhdisteitä, joissa *«' V johdetaan ftalosyaniiniväriaineesta, kuten esim. määri- 35 teltynä kaavan (VI) avulla • · · v

I I

• 4 · •

· I

I I I • ·

t I

1 « * ·

• I

2

• n I

8 105549 R I i_ R I 5 D —/» M—n κ I 5 \ / κ I 5 R I j R i 5 ::ä-|-ä: ·"

Rti nvjh R.i R.s-y^-R.j R t j RI i 10 jossa kukin R15 on toisistaan riippumatta vetyatomi, orgaaninen ryhmä (esim. kuten sellainen, joka on kuvattu tässä edellä Rx - R10:n yhteydessä) tai (edullisesti veteen liukeneva) substituoiva ryhmä (esim. karboksi-, sulfo-, kloo-15 risulfonyyli-, hydroksi-, fenoksi- tai aminoryhmä) ja X2 kuvaa kahta vetyatomia tai "metalloivan" rakenneosan atomia (esim. alumiini, kadmium, kromi, kupari, gallium, germanium, magnesium, fosfori, silikoni, tina tai sinkki), jossa voi olla, jos sen valenssi on sopiva (^ 3), yksi tai 20 useampia aksiaalisia ligandeja (esim. hydroksi tai halogeeni, kuten kloori).

Edelleen käyttökelpoinen esillä olevan keksinnön mukaisten yhdisteiden kategoria käsittää sellaisia yh-*· , disteitä, joissa V johdetaan syaniini- tai merosyaniini- • 25 väriaineesta, esim. yhdisteistä, joilla on kaava (VII) tai * * (VII), tässä järjestyksessä • · i · i • · · !S ©m/?

3° R - R

• · · • · « · «·· • ♦ ♦ (»ui) o 35 * " «· « tv· • » • · »Il • « « «

III

105549 9 ja vastaavat vaihtoehtoiset resonanssirakenteet. Edellä olevissa kaavoissa A' ja A" kuvaavat kvaternoituja hetero-atomisia emäksiä, D on ketometyleenistä johdettu ydin, R on kuten tässä edellä on määritelty ja m on kokonaisluku, 5 esim. 1-3, tarkoituksenmukaisesti 2 tai 3. Esimerkkeinä tämän tyyppisistä väriaineista ovat yhdisteet, joilla on kaava (IX)

R“ T R R R

Rlt K Ki« jossa m ja R ovat kuten tässä edellä on määritelty, X3 on 15 heteroatomi, kuten happi tai rikki tai valinnaisesti mono-tai disubstituoitu metyleeniryhmä, ja kukin R16 on toisistaan riippumatta vetyatomi, orgaaninen ryhmä (esim. kuten tässä edellä on määritelty Rx - R10:lle) tai (edullisesti vesiliukoinen) substituoiva ryhmä, tai viereiset R16-ryhmät 20 voivat yhdessä niiden hiiliatomien kanssa, joihin ne ovat kiinnittyneet, muodostaa monosyklisiä tai polysyklisiä rengassysteemejä. Vesiliukoisuutta parantavia substi-... tuentteja on mielellään mukana yhtenä tai useampana R16:na, ’ . ja yksi tällainen edullinen substituentti on karbok- 25 simetyyli, joka konjugoidaan amiinin sisältäviin molekyy- * * leihin, kuten m-aminofenyyliboorihappoon siten, että • · ·.**: syaniinikromoforin absorptio-ominaisuudet muuttuvat vähän • · · • tai eivät muutu lainkaan.

:: : Edelleen edustavaa ryhmää keksinnön mukaisia at- 30 siiniväriainekonjugaatteja ja edustavaa valmistuskaavaa .**·. valaistaan seuraavassa reaktionkulkukaaviossa: • · • · · • · · • · 35 • · • m 105549 10 H l-etyyli-3-(3-dimetyyliaminopropyyli)- γ karbodi-imidihydrokloridi

£X

g f OH ), Γ-0 10 jossa kukin A2 on aikaisemmin kuvattu N(R) 2/N+ (R) 2, NHR/tTHR tai O/OH -systeemi.

Keksinnön mukaiset boorihappokonjugaatit voidaan valmistaa keksinnön mukaisella menetelmällä, jolle on tun-15 nusomaista, että saatetaan sopivasti funktionalisoitu syaniini-, atsiini- tai trifenyylimetaaniväriaine, jonka absorptiomaksimi on vähintään 600 nm, reagoimaan yhden tai useamman sellaisen reagenssin kanssa, joka toimii boori-happotähteen luovuttajana. Tähteet, kuten fenyyliboorihap-20 po, syntetisoidaan tarkoituksenmukaisesti aminofenyyli- boorihaposta, edullisesti m-aminofenyyliboorihaposta, liittämällä molekyylin loppuosaan, ja se suoritetaan esimerkiksi muodostamalla diatsoniumioni, silanisoimalla • · · • . tai käyttämällä kytkentäainetta (esim. kuten yleisessä * * * ···· 25 kemian kirjallisuudessa neuvotaan) , kuten glutaarialdehy- * * diä, karbodi-imidiä, syanogeenihalogenidia tai suk- ♦ · kinimidiä. Esillä olevan menetelmän edullisia näkökohtia • · · • \· ovat (i) m-aminofenyyliboorihapon reaktio karboksyyliryh- män sisältävän väriaineen kanssa karbodi-imidin, kuten 1- 30 etyyli-3-(3-dimetyyliaminopropyyli)karbodi-imidin (EDC) .*··. läsnä ollessa, jolloin saadaan yhdiste (I) , jossa on • · · .···. amidisidoksellinen fenyyliboorihapporyhmä, (ii) karbok- syyliryhmän sisältävän väriaineen aktivointi seosanhyd- • · i.i i ridimenetelmällä, esimerkiksi saattamalla reagoimaan halo- • · · ’...· 35 geeniformaattiesterin (esim. alemman alkyylihalogeenifor- • · « • · • · • ta at 11 105549 maatin, kuten isobutyyliklooriformaatin kanssa), ennen kuin se saatetaan reagoimaan m-aminofenyyliboorihapon kanssa, jolloin saadaan amidi-sidoksellinen fenyyli-boorihapporyhmä, (iii) m-aminofenyyliboorihapon saatta-5 minen reagoimaan isotiosyanaattiryhmän sisältävän prekur-sorin kanssa, jolloin saadaan yhdiste (I), jossa on tio-urea-sidoksellinen fenyyliboorihapporyhmä, ja (iv) sulfo-ryhmän sisältävän väriaineen aktivointi esimerkiksi muuttamalla se sulfonyylihalogenidiksi, kuten kloridiksi, 10 esim. saattamalla se reagoimaan halogenoivan aineen, kuten oksalyylikloridin tai fosfori(3)oksikloridin kanssa, ennen kuin se saatetaan reagoimaan m-aminofenyyliboorihapon kanssa, jolloin saadaan sulfonamidi-sidoksellinen boori-happo ryhmä .

15 Fenoksatsiiniprekursorit, joita käytetään valmis tettaessa kaavojen (II) - (IV) mukaisia yhdisteitä, voidaan valmistaa esimerkiksi seuraavilla reaktiosarjoilla: (A) 20 "... j·* -YV0 + f-γ Z* happo/alkoholi

' ' ' Il n R

»7. "»· 25 • · j::;: 'vxyrY'· —- =.=: Yt -«''γγ’· • · · • · • m • · · • · · ·'·' ? I Oo *lo i.ij 35 R»!0 R/o R«« R5o R4q • · · * ·»« 12 105549 (B) jc: HHOj/K* 5 ' " R», R4* [l,

JL^O i «2· P4/C

10 fl 1 * /Rj.

HO *f R 5· *<« 15 R I Oo *5e R 4 o

... ? I 0« I U

*·* ' R»HJ

....: 25 r5 \ ;· . 5e 0 ·.’· R 7 e *»· Ri« R<« • · · • · (C) « · · R ie.

30

... M I HONO . H

:...! *..Vy\>H ' .··*. : *

...’ R 7· R»· D

lii .:- <&.

35 R.-vV ' . Ύα r,°oc B‘* : * : r,*n'h/1svtvoh - ..] · ' (R· esteröivä ryhmä) : : r7, k»· 13 105549 * I·· R I · VY yV j* hydrolyysi

R *H

H 0 K

5 R,. »·. « OOC R4t Tätä kaaviota voidaan muunnella vaihtamalla keskenään ryhmiä Rla ja ROOC, jolloin saadaan 1-karboksi-funktionalisoitu fenoksatsiiniprekursori.

10 (D) f,.

/v 15 II cH3.co.c1 hc'Y^n^»· --

I I A I C I J

fi. R .

3 g 4 o RJ. Ra, ί'° L* f1 »· 25 ^.nA/no Ηο/γΝΗ/ί« • · **Se^4e lo • · ··· 1 ---► : R.o. ' "1. “«

Rf.\ /H. -A A.

\y\i xy \O

·***· I

t · ♦ J III I

··· rSo\ A,As

.···. hx γ 0^ y^ M

*?, Ri« RJg R*« :]A 35 • · « • 1 · 105549 14

Edellä olevissa reaktiokaavioissa Rla - R10a ovat kuten aikaisemmin on määritelty Rx - R10:lle, paitsi, että niissä ei ole boorihappotähdettä, joka halutaan lopputuotteeseen (II) .

5 Fenotiatsiiniprekursoreita voidaan valmistaa vas taavilla menetelmillä tai käyttäen yleisesti kemiassa tunnettuja menetelmiä, joita käytetään tiatsiiniväriaineiden valmistukseen.

Näin saadut fenoksatsiini- ja fenotiatsiiniprekur-10 sorit, joissa toinen R3a:sta ja R4a:sta, tai toinen R7a:sta ja R8a:sta on vetyatomi, voidaan saattaa reagoimaan esimerkiksi alkyylihalogenidin kanssa N:ään kiinnitetyn funktionalisoidun ryhmän tai funktionalisoidun väliryhmän liittämiseksi, esim. seuraavassa reaktiokaaviossa esite-15 tyllä tavalla: _ U _ \^ /OM"

U..-XXXX

1/ 0 ( r - esteröivä ryhmä) U« M t 20

. i : U. u 1 v—' 0R

25 ja sen jälkeen hydrolysoimalla, jolloin saadaan yhdiste, : jossa R' = H.

Vaihtoehtoisesti ja edullisesti, kun kaikki sub- • · stituenteista R3a, R4a, R7a ja R„a ovat joitakin muita kuin 30 vetyjä, funktionalisoitu ryhmittymä (joka valinnaisesti S··m sisältää väliryhmän) voidaan kiinnittää fenatsiinirengas- · systeemin hiiliatomiin Mannich-tyyppisellä synteesillä, r esim. seuraavassa reaktiokaaviossa esitetyllä tavalla: • · ·

• · I

• · » • · · 105549 15

>'vOt0XXr>' O-C

I » II E1 ( R ' 1 esteröivt ryhmä)

5 /—\ Q

l 1

—---- . R ‘ - H

' , j, hydrolyysi 10 Tällaiset karboksyyliryhmän sisältävät prekursorit voidaan helposti saattaa reagoimaan esimerkiksi m-aminofe-nyyliboorihapon (esim. tässä edellä kuvatun) kanssa, jolloin saadaan yhdisteitä (II), joissa on amidi-sidokselli-nen fenyyliboorihapporyhmä.

15 2-aminofenoksatsiini- tai fenotiatsiiniprekursorit, esim. sellaiset, jotka on valmistettu edellä olevan kaavion (B) mukaan, voidaan esimerkiksi diatsotoida ja saattaa sitten reagoimaan alkalimetallitiosyanaatin kanssa, jolloin saadaan vastaava 2-isotiosyanatoyhdiste. 20 Tämä tuote voidaan saattaa reagoimaan nukleofiilisen amiinin sisältävän molekyylin, kuten m-amino-fenyyliboorihapon tai funktionalisoidun väliryhmän kanssa esim. jommassa kummassa seuraavassa reaktiokaaviossa ' esitetyllä tavalla:

• I I I

• · · » • · • · « · · • · · • · • · · *09 • ·

• I

• · · « · · * · · ·«· • · • ♦ ·1· • · 1(1 • · · • « « I · I · • · « I 1 · · « · « • 9 • ·

• M

• · • · » · · 105549 16 i. i.

YVY'imi'

10 UJJ

I I

H. M· 15 ^ N NCS -,^ fYY1r or· M2 1«->L „M« N (R ’ · esteröivä ryhmä)

Me ύ·

20 νγϊI

γγ-Ηγ^γΗ νγ u « O R · ...^ Uc u« ...: 25 ja sen jälkeen suorittamalla hydrolyysi, jolloin saadaan c yhdiste, jossa R' = H.

• · : 1- tai 4-karboksifenoksatsiini- tai fenotiatsiini- • 2 ·3: prekursoreita, esim. sellaisia, jotka on valmistettu kaa- • · ·1 ·" j vion (C) mukaan, voidaan saattaa reagoimaan suoraan 30 esimerkiksi aminofenyyliboorihapon kanssa liukoisen kar- .···. bodi-imidin läsnä ollessa, tai ne voidaan ensin muunnella • 1 funktionalisoidun väliryhmän liittämiseksi, esim. seuraa- *" vassa reaktiokaaviossa kuvatulla tavalla: • · * t · • · · « « · · « 1 « · • 1 • t · * « · • · · • ψ • · · · • · 2 « « 3 • 1 · 17 105549 ·Ό-Υ

V— OR

U 1 (R ' ' esteröivä ryhmä) Μι Η ο o C ΰβ 5

M « — · r -H

i I i hyarolyysi OR 2 2-asetyylifenoksatsiini- tai fenotiatsiiniprekurso-reille, esim. sellaisille, jotka on valmistettu kaavion (D) mukaan, voidaan esimerkiksi suorittaa Mannich-reaktio 15 N:ään sidotun väliryhmän liittämiseksi, kuten esitetään esimerkkinä seuraavassa reaktiokaaviossa:

M» _H.CHO

-1O0c£. <H, M2 ( R1 2esteröivä ryhmä)

rvK

! '-' OR

...

25 il Uc hydrolyysi • · • ♦ !/·· Fenoksatsiini- ja fenotiatsiiniprekursoreille, :3: esim. tunnetulla tavalla valmistetulle fenotiatsiiniväri- • · aineelle, kuten 3-dimetyyliamino-7-dimetyyli-iminofenoti- 30 atsoniumille, voidaan vastaavasti suorittaa Mannich-reak- - t···. tio amiiniryhmän sisältävän funktionalisoidun ryhmän kiin- • · ΥΛ nittämiseksi renkaaseen, esim. käyttäen m-aminofenyyliboo- rihappoa amiinina, kuten esitetään seuraavassa reaktio-l.l · kaaviossa: 35 • · · · · 2 « · · • · • · • · · • · 3 • » 18 105549 ,.,Ä'XX..

I I 8(oh)j 5 ΓΙ M* /\ (OM ), .^COX·· I I .

10

Keksintö koskee edelleen edellä määriteltyjen boo-rihappokonjugaattien käyttöä veren analyysimenetelmässä, esim. kuten edellä mainituissa tekniikan tason julkaisuissa tai WO-A-90/13 818 on kuvattu.

15 Seuraavat ei-rajoittavat esimerkit valaisevat kek sintöä:

Esimerkki 1

Fenok satsiini-boorihappokonjugaatti a) m-fonnamidofenoli 20 Seosta, jossa oli 100 g m-aminofenolia ja 150 g muurahaishappoa, kuumennettiin palautusjäähdytyslämpöti-lassa 1,5 tuntia ja haihdutettiin sitten kuiviin alenne-,,, tussa paineessa (90 - 95 °C, 10 - 15 mmHg) . Kiinteää ai- t ' netta kuivattiin 100 °C:ssa, 10 mmHg:ssa 1,5 tuntia. 117 g

* 1 I

25 otsikon yhdistettä eristettiin, sulamispiste 112 °C.

***** b) m- (N-metyyliamino) fenyyli • · S/·· Jatkuvasti sekoittaen, 13,8 g edellisen vaiheen (a) :*’’: tuotetta lisättiin vähitellen tunnin aikana liuokseen, • · ·*·*: jossa oli litiumalumiinihydridiä (9,5 g) 180 ml:ssa kuivaa 30 tetrahydrofuraania 15 - 20 °C:ssa. Seosta kuumennettiin .···. palautusjäähdytyslämpötilassa 0,5 tuntia, se jäähdytettiin • · ill -5 °C:seen ja 385 ml 3-N:ista HCl:a lisättiin hitaasti.

• * J v

Suspension tilavuus pienennettiin 300 ml:ksi pyörivässä • « :.· : haihduttimessa 60 - 70 °C:ssa, 400 ml vettä lisättiin ja :<t#: 35 suspensio haihdutettiin uudelleen lopulliseen tilavuuteen- ··’·, sa, 400 ml:ksi. Jäljelle jääneeseen harmaaseen suspensioon • t » » * M « * I · I ) i 105549 19 lisättiin 2 g aktiivihiiltä ja 10 g Celiteä; syntynyt seos suodatettiin ja lisättiin 60 ml 40-%:ista NaOH:a. Lopuksi liuos uutettiin kahdesti, kummallakin kerralla 100 ml :11a eetteriä, ja uute kuivattiin viskosiksi öljyksi ja tislat-5 tiin. 9,3 g otsikon yhdistettä, kp. 160 °C, eristettiin viskoosina öljynä.

c) m-(N-2-etoksikarbonyylietyyli)-N-metyyliamino)- fenoli

Seosta, jossa oli 9,3 g edellä olevan vaiheen (b) 10 tuotetta, 27,4 g etyyli-3-bromipropionaattia, 12,6 g natriumbikarbonaattia ja 120 ml asetonia, kuumennettiin palautus jäähdytyslämpötliassa 43 tuntia. Uusi erä, 27,4 g, etyyli-3-bromipropionaattia lisättiin sitten ja liuosta kuumennettiin palautusjäähdytyslämpötilassa 72 tuntia. 15 Lopuksi liuos jäähdytettiin ja suodatettiin. Suodos haihdutettiin kuiviin (10 mmHg, 85 - 90 °C) ja jäännös solubi-lisoitiin 50 ml:aan CHC12 :EtOAc :a 9:1. Silikageelillä kro-matografoinnin jälkeen, käyttäen eluenttina CHC12:EtOAc:a 9:1, eristettiin 3,8 g otsikon yhdistettä.

20 d) 3-(N-2-etoksikarbonyylietyyli-N-metyyliamino)-6- (4-N,N-dimetyyliaminofenyyli-iniino) sykloheksa-2,4-dienoni, sinkkikloridiadditiotuote

Seosta, jossa oli 6,6 g edellä olevan vaiheen (c)

¥ I

' tuotetta, 4,5 g 4-nitroso-N,N-dimetyylianiliinia ja 4,9 g 4 I » ...I 25 sinkkikloridia 88 ml: ssa metanolia, kuumennettiin palau- c '·**· tusjäähdytyslämpötilassa kolme tuntia. Kiinteä aine eris- :/·· tettiin suodattamalla, se pestiin kahdesti 25 ml :11a meta- nolia ja kuivattiin 50 °C:ssa, 10 mmHg:ssa. 11,6 g otsikon • · yhdistettä eristettiin.

3 0 e) 3-dimetyyliamino-7-(N-metyyli-N-2-etoksikarbo- - ,···, nyylietyyli-imino) fenoksatsonium • i I" 1,0 g edellä olevan vaiheen (d) tuotetta liuotet- m 9 r tiin 50 ml:aan etikkahappoa, kuumennettiin 70 °C:seen ja « f ; sitten lisättiin 180 mg NaN02:a. Liuosta pidettiin : ! 35 70 °C:ssa, jatkuvasti sekoittaen, kuusi tuntia, sitten se

IM

«4 * I I I % · * · • > · 9 * *99 105549 20 jäähdytettiin, suodatettiin ja haihdutettiin kuiviin. Jäännös liuotettiin 40 ml:aan H20:ta ja suodatettiin. Lopuksi suodos haihdutettiin kuiviin 60 °C:ssa, 10 mmHg:ssa. 0,6 g otsikon yhdistettä eristettiin.

5 f) 3-dimetyyliaininio-7- (N-metyyli-N-2-karboksi- etyyli-imino)fenoksatsonium

Edellä olevan vaiheen (e) tuote hydrolysoitiin ek-vimolaarisen määrän kanssa NaOH(aq):a 80-%:isessa dioksaa-nissa, ja otsikon yhdiste eristettiin anioninvaihtokroma-10 tografoimalla.

g) Konjugointi m-aminofenyyliboorihappoon 9,0 mg (2,29 x 10~5 mol) edellisen vaiheen (f) tuotetta lisättiin 1 000 μl:aan dimetyyliformamidia ja liuos jäähdytettiin -10 °C:seen. N-metyylimorfoliinia (2,78 mg, 15 2,75 x 10'5 mol) ja isobutyylikloroformaattia (3,76 mg, 2,75 x 10"5 mol) lisättiin -10 °C:ssa ja inkuboitiin jäissä 0,5 tuntia, m-aminofenyyliboorihappoa (14,2 ,g, 9,17 x 10'5 mol) ja edelleen N-metyylimorfoliinia (2,78 mg, 2,75 x 10"5 mol) lisättiin ja reaktioseosta inkuboitiin kaksi tuntia 20 4 °C.-ssa ja neljä tuntia huoneenlämpötilassa. 4 mg fenyy- liboorihappo/fenoksatsiinikonjugaattia eristettiin kään-teisfaasikromatografoimalla. Tämän tuotteen absorptiomak-simi spektrin näkyvällä alueella havaittiin aallonpi-tuudella 642 nm, ja moolinen ekstinktiokerroin (e) oli >

t « I

25 70 000 1/mol.cm.

Ill *·1· Esimerkki 2 * 1 Trifenyylimetaaniväriaine-boorihappokonjugaatti *. 1ϊ a) Ksyleenisyaanilia, jonka kaava on •« · • · · « · • · 0': 30 C H j CH, φ < < · « « i 35

S V

: · : s o,n o

• · J

«· • · · • · · 2i 105549 (75 mg, 80 % puhdasta, 1,11 x 10"6 mol) kuivattiin yön yli 100 °C:ssa. Fosfori (3)oksikloridia (205 μΐ, 2,24 x 10"3 mol) lisättiin ja seosta inkuboitiin huoneenlämpötilassa kosteudelta suojattuna. Kun seos oli ollut tässä lämpöti-5 lassa 24 tuntia, se pestiin useita kertoja kuivalla n-hek-saanilla reaktion ei-toivotun, keltaisen sivutuotteen ja reagoimattoman fosfori(3)oksikloridin uuttamiseksi. Kun heksaaniuutteessa ei enää ollut väriä, uutteeseen lisätiin kloroformia ja ksyleenisyanolisulfonyylikloridia. Lopuksi 10 kloroformiuute (15 ml) pestiin viisi kertaa 1 ml :11a kylmää vettä ja haihdutettiin sitten kuiviin alennetussa paineessa ja kosteudelta suojattuna.

Kiinteä aine solubilisoitiin välittömästi 200 ^l:aan N,N-dimetyyliformamidia (DMF), ja tähän liuokseen 15 lisättiin 3-aminofenyyliboorihappomonohydraattia (17 mg, 1,10 x 10'4 mol) joka oli 100 μΐ-.ssa DMF:a. Seoksen annettiin seistä viisi minuuttia, minkä jälkeen lisättiin 2 ml 0,75-M:ista natriumkarbonaatti/natriumbikarbonaattipusku-ria (pH 10,0) jatkuvasti sekoittaen 3-12 tunnin ajan. 20 Liuoksen pH:ta valvottiin ja se pidettiin arvossa 8 - 9,5.

Boorihappokonjugaatit eristettiin käänteisfaasikro-matografoimalla, pääosin mono(fenyyliboorihappo)funktio-nalisoituna väriaineena, lambda max 619 nm (e > 70 000).

... b) Tämän esimerkin (a)-vaihe toistettiin, paitsi,

• I

’ . 25 että 2-nitro-5-aminofenyyliboorihappomonohydraattia •••\ (22 mg, 1,1 x 10'4 mol) käytettiin 3-aminofenyyliboorihapon ' ’ sijaan, ja näin saatiin pääosin mono(fenyyliboorihappo)- • · ·. 1: funktionalisoitua väriainetta, jonka spektroskooppiset • · · • V ominaisuudet olivat samanlaiset kuin vaiheen (a) tuotteen.

: : : 30 Esimerkki 3

Ftalosyaniiniväriaine-boorihappokonjugaatti .1··. Kloor i alumiini f talosyaniinitetrasulf onaatt ia (100 mg, 1,12 x 10'4 mol) kuivattiin yön yli 100 °C:ssa.

Fosfori (3) oksikloridia 410 μΐ, 4,48 x 10'3 mol) lisättiin :: 35 ja seosta inkuboitiin huoneenlämpötilassa kosteudelta suo- • « · • · « · • · · • · · · 22 105549 jattuna. Oltuaan tässä lämpötilassa 24 tuntia, kiinteä aine pestiin useita kertoja yhteensä 10 ml :11a n-heksaania reagoimattoman fosfori(3)oksikloridin poistamiseksi.

Jäljelle jäänyt kiinteä ftalosyaniinisulfonyyliklo-5 ridi kuivattiin alennetussa paineessa kosteudelta suojattuna, ja sitten se solubilisoitiin välittömästi DMF:ssa (500 /il) . Tähän liuokseen lisättiin 3-aminofenyyliboori-happomonohydraattia (20 mg, 1,29 x 10'4 mol), joka oli DMF:ssa (100 μΐ) . Seoksen annettiin seistä viisi minuut-10 tia, minkä jälkeen lisättiin 2 ml 0,75-M:ista natriumkar-bonaatti/natriumbikarbonaattipuskuria (pH 10,0). Reaktios-eosta inkuboitiin huoneenlämpötilassa jatkuvasti sekoittaen 3-12 tuntia, jona aikana liuoksen pH:ta valvottiin ja se pidettiin arvossa 8 - 9,5. Boorihappokonjugaatit 15 eristettiin käänteisfaasikromatografoimalla, pääosin mono-(fenyyliboorihappo)funktionalisoidun väriaineen muodossa, lambda max 676 nm (e ~ 160 000) .

Esimerkki 4

Syaniiniväriaine-boorihappokonjugaatti 20 Fosfori (3) oksikloridia (470 μΐ, 5,13 x 10'3 mol) lisättiin syaniiniväriaineeseen, 2-[7-[1,3-dihydro-l,1-dimetyyli-3-(4-sulfobutyyli)-2H-bents[e]indol-2-yylidee-ni] -1,3,5-heptatrienyyli]-1,l-dimetyyli-3-(4-sulfobutyy-... li)-ΙΗ-bents[e]indoliumhydroksidiin, sisäiseen suolaan, "1 , 25 natriumsuolaan (kaupallisesti tunnetaan nimellä IR 125 tai

«M

indosyaniinivihreä) (100 mg, 1,29 x 10'4 mol), ja syntynyt- * 1 tä seosta inkuboitiin huoneenlämpötilassa kosteudelta suo- • · jattuna 24 tuntia. Tumman ruskea liuos kaadettiin sitten • · · • murskattuun jäähän ja jätettiin siihen viideksi minuutik- 30 si. IR-125-sulfonyylikloridi uutettiin kloroformiin ja uute pestiin viisi kertaa 1 ml :11a kylmää vettä ja haihdu-.·1·. tettiin sitten kuiviin alennetussa paineessa ja kosteudel ta suojattuna.

Syntynyt kiinteä aine solubilisoitiin välittömästi i 35 DMF:iin (500 μΐ) , johon liuokseen lisättiin 3-aminofenyy- * 1 f • · « < « · ·

• · I

• · · m · » 9 99 ,3 105549 liboorihappomonohydraatia (17 mg, 1,10 x 10'4 mol), joka 011 DMF:ssa (100 μΐ). Seoksen annettiin seistä viisi minuuttia, minkä jälkeen lisättiin 2 ml 0,75-M:ista karbo-naatti/natriubikarbonaattipuskuria (pH 10,0) jatkuvasti 5 sekoittaen, ja liuosta inkuboitiin huoneenlämpötilassa 3 - 12 tuntia, jona aikana liuoksen pH:ta seurattiin ja se pidettiin arvossa 8 - 9,5. Boorihappokonjugaatit eristettiin käänteisfaasikromatografoimalla, pääosin mono(fenyy-liboorihappo) funktionalisoidun väriaineen muodossa, lambda 10 max 799 nm (e ~ 200 000).

Esimerkki 5

Syaniiniväriaine-boorihappokonjugaatti

Reaktiiviseen sukkinimidyyliesteri-syaniiniväriai-neeseen Cy 5,18 (1,3 x 10'7 mol) lisättiin 2 mg 3-aminofe-15 nyyliboorihappoa, joka oli 0,5 ml:ssa 0,1-M:ssa natrium-karbonaatti/natriumbikarbonaattipuskuria (pH 9,3), minkä jälkeen sekoitettiin perusteellisesti. Seosta inkuboitiin jatkuvasti sekoittaen huoneenlämpötilassa neljä tuntia, ja lopulta fenyyliboorihappokonjugaatti eristettiin käänteis-20 faasikromatografoimalla, lambda max 652 nm (e » 200 000) . Esimerkki 6

Glykosyloidun hemoglobiinin mittaaminen kokoverestä £talosyaniiniväriaine-boorihappokonjugaattia käyttäen

Kokoverinäyte sekoitettiin hemolysoivan reaktiopus- • · · ‘ . 25 kurin (pH 9,4) kanssa, jossa puskurissa oli 160 mM pipe- • · *··*. ratsiinia, 0,07 % Triton X-100, 9,4 % etanolia (v/v) , * j 9,4 % butanolia (v/v) ja ftalosyaniini-boorihappokonjug- ·. aattia, joka oli valmistettu esimerkissä 3 kuvatulla ta- • · · • valla, siten, että lopullinen konsentraatio li 2,1 x 10'5 ··· : : 30 M. Lopullinen hemoglobiinikonsentraatio oli noin 2 mg/ml.

Kokoveri hemolysoitiin ja muodostui saostuma. Saostunut ·'*· hemoglobiini erotettiin suodattamalla ja sen reflektanssi mitattiin aallonpituuksilla 685 nm ja 470 nm Schimadzu Dual Wavelength Flying Spot Scanner CS 9000 -laitteella.

< f r ·' ' 35 Aallonpituuksien 685 ja 470 nm reflektanssien suhde las- i I f I f

I I

I · f « · I I · · • * · • · · • · • · · 24 105549 kettiin ja glykosyloidun hemoglobiinin prosentuaalinen määrä kokonaishemoglobiiniin nähden määritettiin kali-brointisuorasta, joka saatiin käyttäen hemoglobiinikon-sentraatioiltaan ja glykosyloidun hemoglobiinin konsent-5 raatioiltaan tunnettuja liuoksia.

Esimerkki 7

Glykosyloidun hemoglobiinin mittaaminen kokoverestä ksyleenisyanoli-boorihappokonjugaattia käyttäen

Esimerkin 6 menetelmä toistettiin, paitsi, että 10 käytettiin ksyleenisyanoli-boorihappokonjugaattia, joka oli valmistettu esimerkissä 2 kuvatulla tavalla, konsent-raationa, joka oli 2,1 x 10"5 M, ftalosyaniiniväriainekon-jugaatin sijaan ja että reflektanssit mitattiin aallonpituuksilla 635 ja 470 nm.

« · · • · II» ««·· • · • · • ♦ ♦ • ·· • · ·· · « 1 « • · • · • · · ♦ · ♦ • · · ·«· « · • · « « « « « « · • · · · 1 • t 1 • · • · • · · • « M «

Claims

25 1 0 5 5 4 9

1. Ei-proteiinipitoiset boorihappokonjugaattiyhdis-teet, tunnetut siitä, että niiden absorptiomaksi- 5 mi on vähintään aallonpituudella 600 nm ja niillä on kaava (I) V-W-B(0H)2 (I) 10 jossa V on syaniini-, fenoksatsiini-, fenotiatsiini- tai trifenyylimetaani-kromoforinen ja/tai -fluoroforinen ryhmä, jonka absorptiomaksimi on vähintään 600 nm, ja W on kytkevä orgaaninen ryhmä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukaiset yhdisteet, 15 tunnetut siitä, että booriatomi on kiinnitetty aminofenyyliryhmään, jossa fenyylirengas voi valinnaisesti edelleen olla substituoitu yhdellä tai useammalla substi-tuentilla, jotka valitaan nitro-, alemmista alkoksi- ja formyyliryhmistä.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukaiset yhdisteet, tunnetut siitä, että booriatomi on kiinnitetty m-aminofenyyliryhmään.

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukaiset yhdisteet, tunnetut siitä, että niillä on kaava (II) I ” jrfofr...... : ·’ R, R, R1 30 « jossa X on happi- tai rikkiatomi, Y' on anioni ja Rx - R10 .···. on kukin valittu vetyatomeista ja orgaanisista ryhmistä, • · '<·, tai Rx ja R2 ja/tai R9 ja R10 voivat yhdessä niiden hii liatomien kanssa, joihin ne ovat kiinnittyneet, muodostaa : 35 fuusioidun monosyklisen tai polysyklisen rengassysteemin, I f • · « · · f · · • · • · 105549 edellyttäen, että ainakin toinen R3:sta ja R4:stä ja ainakin toinen R7:sta ja R8:sta on jokin muu kuin vety, ja että ainakin yksi R7 - R10:stä on orgaaninen ryhmä, jossa on boo-rihappotähde.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukaiset yhdisteet, tunnetut siitä, että kukin Rl Rio:n edustama or gaaninen ryhmä on alkyyli-, alkenyyli- tai alkynyyliryhmä, jossa on korkeintaan kuusi hiiliatomia, C5_7-sykloalkyyli-tai -sykloalkenyyliryhmä, C6.12-aryyliryhmä, 5 - 7-jäseninen 10 tyydyttynyt tai tyydyttymätön heterosyklinen rengas, jossa on vähintään yksi heteroatomi, joka on valittu hapesta, typestä ja rikistä, Cj.^-alkyyliryhmä, joka on substituoitu yhdellä tai useammalla sykloalkyyli-, sykloalkenyyli-, aryyli- tai heterosyklisellä ryhmällä, jotka on määritelty 15 tässä edellä, mikä tahansa edellä oleva ryhmä, jossa on ja/tai joka on substituoitu yhdellä tai useammalla hetero-atomilla, tai mikä tahansa edellä oleva ryhmä, jossa on yksi tai useampia substituentteja, jotka on valittu seu-raavista: hydroksi, merkapto, amino, halogeeni, nitro, 20 atsido, karboksi, syaani ja isotiosyanato.

6. Patenttivaatimuksen 4 mukaiset yhdisteet, tunnetut siitä, että niillä on kaava (III)

25 R, ^R.. ... ir ^ x 11 (mi) ···· I I R>. • · • · Ϊ.*·· jossa X ja Y" merkitsevät samaa kuin patenttivaatimuksessa :*·]: 4, kukin Rn on muista riippumatta Ci.g-alkyyliryhmä ja R12 30 on orgaaninen ryhmä, jossa on boorihappotähde.

7. Patenttivaatimuksen 4 mukaiset yhdisteet, .···. tunnetut siitä, että niillä on kaava (IV) • · I r 35. v H (|V) ‘ ‘f 1 o Rll ” « * « 4 * * I Γ ( i « 27 105549 jossa X ja Y' merkitsevät samaa kuin patenttivaatimuksessa 4, kukin Ru on muista riippumatta C^g-alkyyliryhmä ja R13 on orgaaninen ryhmä, jossa on boorihappotähde.

8. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 mukainen boori- 5 happokonjugaatin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että saatetaan sopivasti funktionalisoitu syaniini-, at-siini- tai trifenyylimetaaniväriaine, jonka absorptiomak-simi on vähintään 600 nm, reagoimaan yhden tai useamman sellaisen reagenssin kanssa, joka toimii boorihapporyhmän 10 luovuttajana.

9. Jonkin patenttivaatimuksen 1-7 mukaisen yhdis teen käyttö veren analyysimenetelmässä. • · · 4 4 • « · • · « ·«·· • · • « • ♦ « • 1« • · • · · • · · • · • · • · · • · · * 1 « • · · • · • · < « I t 4. f 4 « · 4 1 • € · t « · f « « « « 28 105549