DE69108403T2 - Boronsäurekonjugate enthaltende markierungsmittel. - Google Patents
Boronsäurekonjugate enthaltende markierungsmittel.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige Verbindungen, die als Markierungsmittel geeignet sind, insbesondere neuartige Farbstoffe, die ein Absorptionsmaximum im Bereich des roten Endes des sichtbaren Spektrums oder jenseits davon aufweisen.
- Markierungsmittel sind häufig bei Untersuchungen von Blutproben erforderlich, wie z.B. bei Messungen von glykosyliertem Hämoglobin als Teil einer Bewertung der Blutglucosewerte von Patienten, die an Diabetes mellitus leiden. Derartige Mittel sind beispielsweise in der DE-A-3720736 und in der US-A-4861728 beschrieben worden und umfassen typischerweise ein Boronsäurereagens, das zur Reaktion mit der cis-Diolgruppe des Glykosylrestes reagieren kann und an einen fluoreszierenden und/oder gefärbten Farbstoff, wie z.B. ein Diazokonjugat oder Fluorescein, Rhodamin oder Phycobiliprotein, gebunden ist. Die Bewertung oder Quantifizierung der Fluoreszenz oder der Extinktion, wie z.B. durch Reflektometrie, ermöglicht eine Messung des Gehalts an glykosyliertem Hämoglobin in den Blutproben.
- Ein Nachteil der Verwendung von Phycobiliproteinkonjugaten von Boronsäuren besteht darin, daß bei den meisten glykosylierten Hämoglobinen der Glykosylrest, der hauptsächlich an die N-terminale Aminosäure Valin der beta-Kette gebunden ist, effektiv in einer engen "Tasche" des Hämoglobinmoleküls angeordnet und deshalb für Reagenzien mit hohem Molekulargewicht nicht einfach erreichbar ist.
- Andere bereits vorgeschlagene farbige Markierungen, wie Fluorescein und Rhodamin, besitzen den Nachteil, daß deren Absorptionsspektrum mit dem Absorptionsspektrum von Hämoglobin signifikant überlappt. Dies kann eine effektive spektroskopische Quantifizierung der Markierung verhindern oder ernsthaft erschweren.
- Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entwicklung neuer Klassen von markierenden Verbindungen, die ein Absorptionsmaximum bei nicht weniger als 600 nm besitzen. Bei solchen Wellenlängen weist Hämoglobin minimale Absorption auf.
- Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden nichtproteinartige Boronsäurekonjugat-Verbindungen bereitgestellt, die ein Absorptionsmaximum bei nicht weniger als 600 nm aufweisen, wobei die Verbindungen die Formel (I) besitzen
- V - W - B(OH)&sub2; (I)
- worin V ein Cyanin-, Phenoxazin-, Phenothiazin- oder Triphenylmethan-Chromophor und/oder ein Fluorophorrest ist, der ein Absorptionsmaximum bei nicht weniger als 600 nm aufweist, und
- W für eine organische Brückengruppe steht.
- Es sei erwähnt, daß der Dihydroxyborylrest auch in anionischer Form
- -B(OH)&sub3;&supmin;
- vorliegen kann, was vom pH-Wert und dem Elektrolytgehalt der verwendeten Reagens-Zusammensetzung abhängt, und daß derartige Verbindungen in den Schutzbereich der Formel (I) fallen.
- Die erfindungsgemäßen Boronsäurekonjugate sind bei spektroskopischen Untersuchungen brauchbar, welche die Abschätzung oder Quantifizierung von cis-Diolen, insbesondere von glykosylierten Gruppen, wie z.B. Proteinen, in Gegenwart von Hämoglobin betreffen, da es praktisch keine Überlappung zwischen den Absorptionsspektren von Hämoglobin und Chromophor gibt.
- Das Boratom des Boronsäurerestes ist vorteilhafterweise an eine Phenylgruppe, wie z.B. an eine Aminophenylgruppe, wie eine m-Aminophenylgruppe, gebunden. In Abhängigkeit von dem für die Boronsäure gewünschten pKa-Wert kann die Phenylgruppe gegebenenfalls weiter substituiert sein, wie z.B. durch einen oder mehrere Substituenten, welche den pKa-Wert beeinflussen, ohne mit der Bindung zwischen dem Boronsäurerest und dem cis-Diol-Target sterisch wechselzuwirken. Beispiele für Elektronen-ziehende Substituenten, die verwendet werden können, um den Ionisationsgrad und somit die Assoziationskonstante zwischen Boronsäure und den cis-Diol-Targets, wie zum Beispiel glykosylierten Resten, zu erhöhen, umfassen Nitro-, Niedrigalkoxy-, wie Methoxy- oder Ethoxy-, und Acyl-Gruppen, wie z.B. Formyl- oder Niedrigalkanoyl- Gruppen. Repräsentative Boronsäuren dieses Typs umfassen 2-Nitro- 5-aminophenylboronsäure und die entsprechenden 3-Nitro- und 4- Nitro-Isomeren. Im allgemeinen kann jede derartige Phenyl- oder substituierte Phenyl-Gruppe direkt an den chromophoren und/oder fluorophoren Rest V gebunden sein, so daß die Phenylgruppe die Gruppe W in Formel (I) bildet. Die Bindung kann aber auch über Spacer-Gruppen, wie z.B. solche, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, erfolgen.
- Eine brauchbare Kategorie von Verbindungen gemäß vorliegender Erfindung umfaßt Verbindungen der Formel (II)
- worin X für ein Sauerstoff- oder Schwefelatom steht; Y&supmin; für ein Anion (beispielsweise ein Halogenidion, wie z.B. Chlorid oder Bromid, oder Perhalogenation, wie z.B. Perchlorat) steht; und
- R&sub1;-R&sub1;&sub0; jeweils ausgewählt sind unter Wasserstoffatomen und organischen Gruppen, oder R&sub1; und R&sub2; und/oder R&sub9; und R&sub1;&sub0; zusammen mit den Kohlenstoffatomen, an die sie gebunden sind, ein kondensiertes monocyclisches oder polycyclisches Ringsystem bilden, mit der Maßgabe, daß wenigstens einer der Reste R&sub3; und R&sub4; und wenigstens einer der Reste R&sub7; und R&sub8; von Wasserstoff verschieden ist und daß wenigstens einer der Reste R&sub1;-R&sub1;&sub0; eine organische Gruppe ist, die einen Boronsäurerest enthält.
- Wenn irgendeiner der Reste R&sub1;-R&sub1;&sub0; für eine organische Gruppe steht, so kann diese beispielsweise ausgewählt sein unter Alkyl-, Alkenyl- und Alkynyl-Gruppen, wie z.B. solche, die bis zu 6 Kohlenstoffatome enthalten, wie Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, sec-Butyl, t-Butyl, Vinyl, Allyl, Ethinyl oder Propargyl; Cycloalkyl oder Cycloalkenyl, wie z.B. solche die 5-7 Kohlenstoffatome enthalten, wie Cyclopentyl, Cyclohexyl, Cycloheptyl, Cyclohexenyl oder Cyclopentadienyl; Arylgruppen, wie z.B. solche die 6-12 Kohlenstoffatome enthalten, wie beispielsweise Phenyl, Tolyl oder Naphthyl; heterocyclischen Ringen, wie z.B. 5-7-gliedrigen, gesättigten und ungesättigten Ringen, die wenigstens ein Heteroatom enthalten, ausgewählt unter Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel, wie zum Beispiel Furyl, Thienyl, Pyridyl, Pyrimidyl, Pyridazyl, Thiazolyl, Thiazinyl, Triazinyl, Pyrrolyl, Imidazolyl, Pyrazolyl, Pyrrolidinyl, Piperidinyl, Piperazinyl oder Morpholinyl; Niedrig (z.B. C&sub1;&submin;&sub4;)-Alkyl, substituiert durch irgendeine der oben erwähnten Cycloalkyl-, Cycloalkenyl-, Aryl- oder heterocyclischen Gruppen; wobei jede der oben erwähnten Gruppen durch ein oder mehrere Heteroatome unterbrochen und/oder substituiert sein kann, so daß sie beispielsweise eine oder mehrere Thioether-, Amino-, Amido-, Carbonyl- oder Thiocarbonyl-Gruppen enthält; oder wobei jede der oben erwähnten Gruppen einen oder mehrere Substituenten trägt, die beispielsweise ausgewählt sind unter Hydroxy, Mercapto, Amino, Halo, Nitro, Azido, Carboxy, Cyano und Isothiocyanato oder anderen Substituenten, die mit dem Boronsäurerest kompatibel sind.
- Wenn keine anderen Angaben gemacht werden, so enthalten die Alkyl-, Alkenyl- und Alkenylen-Gruppen in den erfindungsgemäßen Verbindungen bis zu 6 Kohlenstoffatome und die cyclischen Gruppen weisen 5- bis 7-gliedrige Ringe auf.
- Eine aufgrund ihrer hydrophilen Eigenschaften brauchbare Gruppe von Verbindungen, die von Formel (II) umfaßt wird, betrifft Verbindungen der Formel (III)
- (worin X und Y&supmin; die oben angegebenen Bedeutungen besitzen; die Reste R&sub1;&sub1; unabhängig voneinander eine Niedrig(z.B. C&sub1;&submin;&sub6;)-alkylgruppe, wie zum Beispiel eine Methyl- oder Ethylgruppe bedeuten; und R&sub1;&sub2; für eine organische Gruppe steht, die einen Boronsäurerest enthält). Im Hinblick auf die Symmetrie des resonanzstabilisierten Ringsystems sei erwähnt, daß R&sub1;&sub2;-Substituenten in den Positionen 1, 2 und 4 äquivalent sind zu entsprechenden Substituenten in 5 den entsprechenden Positionen 9, 8 bzw. 6.
- Beispiele für Gruppen R&sub1;&sub2;, die in den Verbindungen (III) enthalten sein können, umfassen:
- worin Z für eine Gruppe steht, die einen Boronsäurerest, wie z.B. einen Aminophenylboronsäurerest, wie beispielsweise die Gruppe
- enthält.
- Eine weitere nützliche Klasse hydrophiler Verbindungen (II) wird dargestellt durch Formel (IV)
- (worin X, Y&supmin; und R&sub1;&sub1; die oben angegebenen Bedeutungen besitzen und R&sub1;&sub3; für eine organische Gruppe steht, die einen Boronsäurerest, beispielsweise wie oben erwähnt, enthält). Es sei erneut darauf hingewiesen, daß die organische, den Boronsäurerest enthaltende Gruppe den gleichen Effekt besitzt, unabhängig davon, ob sie ein Substituent der 3-Amino- oder der 7-Imino-Gruppe ist.
- Beispiele für organische Gruppen, die einen Boronsäurerest enthalten und in Verbindungen (IV) vorliegen können, umfassen
- worin Z die oben angegebenen Bedeutungen besitzt.
- Eine weitere nützliche Kategorie von Verbindungen gemäß vorliegender Erfindung umfaßt solche Verbindungen, bei denen V von einem Triphenylmethanfarbstoff abgeleitet ist, wie beispielsweise durch Formel (V) dargestellt:
- worin die Reste R&sub1;&sub4; unabhängig voneinander für ein Wasserstoffatom, eine organische Gruppe (z.B. wie oben im Zusammenhang mit R&sub1;-R&sub1;&sub0;) beschrieben oder für eine (vorzugsweise hydrophile) Substituentengruppe (z.B. Hydroxy, Carboxy, Sulfo oder Chlorsulfonyl) stehen und wobei wenigstens zwei der Gruppen A für Auxochrom-Gruppen stehen, und wobei jede nicht-auxochrome Gruppe A die für R&sub1;&sub4; angegebenen Bedeutungen besitzt. Bevorzugte auxochrome Gruppen umfassen Amin/Imin-Systeme, wie zum Beispiel dargestellt durch die Systeme N(R)&sub2;/N&spplus;(R)&sub2; und NHR/N&spplus;HR, (worin jeder der Reste R für eine organische Gruppe, wie zum Beispiel im Zusammenhang mit R&sub1;-R&sub1;&sub0; beschrieben, vorzugsweise für eine Niedrigalkylgruppe, wie beispielsweise Methyl oder Ethyl, steht), alleine oder in Kombination mit O/OH. Die -W-B(OH)&sub2;-Gruppe kann beispielsweise an einen der Phenylringe angelagert sein, beispielsweise durch Kupplung über eine Gruppe, wie zum Beispiel eine Carboxy- oder Sulfo-Gruppe, oder kann an eine der R-Gruppen in einem auxochromen Amin/Imin-System gebunden sein. Es sei betont, daß die anderen Resonanzstrukturen, die gezeichnet werden können, ebenfalls in den Schutzumfang der Formel (V) fallen.
- Eine weitere nützliche Kategorie von Verbindungen gemäß vorliegender Erfindung umfaßt Verbindungen, in denen V abgeleitet ist von einem Phthalocyaninfarbstoff wie beispielsweise durch folgende Formel (VI) dargestellt
- worin die Reste R&sub1;&sub5; unabhängig voneinander für ein Wasserstoffatom, eine organische Gruppe (wie z.B. oben im Zusammenhang mit R&sub1;-R&sub1;&sub0; beschrieben) oder für eine (vorzugsweise der Solubilisierung in Wasser dienliche) Substitutionsgruppe (z.B. Carboxy-, Sulfo-, Chlorsulfonyl-, Hydroxy-, Phenoxy- oder eine Aminogruppe) stehen und X² für zwei Wasserstoffatome oder für ein Atom eines "Metallierungs"-Elementes (z.B. Aluminium, Cadmium, Chrom, Kupfer, Gallium, Germanium, Magnesium, Phosphor, Silicium, Zinn oder Zink) steht, das bei geeigneter Valenz (≥3) einen oder mehrere axiale Liganden (z.B. Hydroxy oder Halo, wie beispielsweise Chlor) tragen kann.
- Eine weitere Kategorie von brauchbaren erfindungsgemäßen, Verbindungen umfaßt Verbindungen, bei denen V von einem Cyanin- oder Merocyanin- oder Merocyanin-Farbstoff abgeleitet ist. Beispiele sind Verbindungen der Formeln (VII) bzw. (VIII)
- und die entsprechenden alternativen Resonanzstrukturen.
- In obigen Formeln stehen A' und A" für quaternisierte heteroaromatische Basen, D steht für einen Ketomethylen-abgeleiteten Kern, R besitzt die oben angegebenen Bedeutungen und m ist eine ganze Zahl, wie z.B. 1-3, zweckmäßigerweise 2 oder 3. Beispiele für Farbstoffe dieses Typs umfassen Verbindungen der Formel (IX)
- worin m und R die oben angegebenen Bedeutungen besitzen, X³ für ein Heteroatom, wie Sauerstoff oder Schwefel oder für eine gegebenenfalls mono- oder disubstituierte Methylengruppe steht, und die Reste R&sub1;&sub6; unabhängig voneinander für ein Wasserstoffatom, eine organische Gruppe (z.B. wie oben für R&sub1;-R&sub1;&sub0; beschrieben) oder für eine (vorzugsweise die Wasser-Solubilisierung fördernde) substituierende Gruppe stehen, oder worin benachbarte R&sub1;&sub6;-Gruppen zusammen mit den Kohlenstoffatomen, an die sie gebunden sind, kondensierte monocyclische oder polycyclische Ringsysteme bilden. Die Wasserlöslichkeit fördernde Substituenten sind wünschenswerterweise in einem oder mehreren der Reste R&sub1;&sub6; vorhanden, wobei ein bevorzugter derartiger Substituent Carboxymethyl ist, der mit amin-haltigen Verbindungen, wie m-Aminophenylboronsäure konjugiert und dabei die Absorptionseigenschaften des Cyaninchromophors wenig oder nicht verändert.
- Eine weitere repräsentative Klasse von Azinfarbstoff-Konjugaten gemäß vorliegender Erfindung und eine repräsentative Herstellungssequenz werden im folgenden Reaktionsschema gezeigt: 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid Hydrochlorid
- worin jeder Rest A² für ein N(R)&sub2;/N&spplus;(R)&sub2;, NHR/N&spplus;HR oder O/OH- System gemäß obiger Definition steht.
- Die erfindungsgemäßen Boronsäurekonjugate können gemäß vorliegender Erfindung hergestellt werden durch Umsetzung eines in geeigneter Weise funktionalisierten Farbstoffes, der die erforderlichen spektralen Eigenschaften aufweist, mit einem oder mehreren Reagenzien, die dazu dienen, um einen Boronsäurerest einzuführen. Reste, wie eine Phenylboronsäure, werden zweckmäßigerweise aus einer Aminophenylboronsäure, vorzugsweise m-Aminophenylboronsäure, hergestellt, und die Kopplung an den Rest des Moleküls wird beispielsweise durch Diazoniumionen-Bildung, Silanisierung oder die Verwendung eines Kopplungsmittels (wie z.B. aus der allgemeinen chemischen Literatur bekannt), wie Glutardialdehyd, Carbodiimid, Cyanogenhalogenid oder Succinimid, bewirkt. Bevorzugte Aspekte des vorliegenden Verfahrens umfassen (i) die Reaktion von m-Aminophenylboronsäure mit einem Carboxylgruppenhaltigen Farbstoff in Gegenwart eines Carbodiimids, wie 1-Ethyl- 3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) unter Bildung einer Verbindung (I), die eine Amid-verknüpfte Phenylboronsäuregruppe enthält; (ii) die Aktivierung eines Carboxylgruppen-haltigen Farbstoffes mit Hilfe der gemischten Anhydridmethode, beispielsweise durch Umsetzung mit einem Haloformiat-Ester (wie z.B. einem Niedrigalkylhaloformiat, wie Isobutylchlorformiat), vor der Reaktion mit m-Aminophenylboronsäure unter Bildung einer Amidverknüpften Phenylboronsäuregruppe; (iii) die Reaktion von m- Aminophenylboronsäure mit einem Isothiocyanatogruppen-enthaltenden Präkursor unter Ausbildung einer Verbindung (I), die eine Thioharnstoff-verknüpfte Phenylboronsäuregruppe enthält; und (iv) die Aktivierung eines Schwefelgruppen-haltigen Farbstoffs, beispielsweise durch Umwandlung in ein Sulfonylhalogenid, wie zum Beispiel ein Chlorid, beispielsweise durch Reaktion mit einem Halogenierungsmittel, wie beispielsweise Oxalylchlorid oder Phosphoroxychlorid, vor der Reaktion mit m-Aminophenylboronsäure unter Bildung einer Sulfonamid-verknüpften Boronsäuregruppe.
- Phenoxazinpräkursoren zur Verwendung bei der Herstellung von Verbindungen der Formeln (II)-(IV) können beispielsweise mit Hilfe der folgenden Reaktionssequenzen hergestellt werden: Säure/Alkohol R' = Veresterungsgruppe Hydrolyse
- Dieses Schema kann durch Vertauschen der Gruppen R1a und R'OOC modifiziert werden, wobei man einen 1-Carboxy-funktionalisierten Phenoxazinpräkursor erhält.
- In obigen Schemen besitzen Rias R1a - R10a die für R&sub1; - R&sub1;&sub0; angegebenen Bedeutungen, mit Ausnahme davon, daß sie nicht den für das Endprodukt (II) gewünschten Phenylboronsäurerest enthalten können.
- Phenothiazinpräkursoren können mit Hilfe analoger Techniken oder unter Verwendung von Verfahren hergestellt werden, die aus dem Stand der Technik für die Herstellung von Thiazinfarbstoffen allgemein bekannt sind.
- Phenoxazin- und Phenothiazinpräkursoren, die auf diese Weise erhalten wurden, und in denen einer der Reste R3a und R4a oder einer der Reste R7a und R8a ein Wasserstoffatom bedeutet, können beispielsweise mit einem Alkylhalogenid umgesetzt werden, um eine N-verknüpfte, funktionalisierte Gruppe oder funktionalisierte Spacergruppe, wie beispielsweise in folgenden Reaktionsschema gezeigt, einzuführen: (R' = Veresterungsgruppe)
- wobei sich eine Hydrolyse anschließt, um eine Verbindung mit R' = H zu erhalten.
- Alternativ dazu und vorzugsweise dann, wenn alle Reste R3a, R4a, R7a und R8a kein Wasserstoffatom bedeuten, kann eine funktionalisierte Gruppe (die gegebenenfalls eine Spacergruppe enthält) an ein Kohlenstoffatom des Phenazinringsystems durch eine Mannich-Synthese angelagert werden, wie es beispielsweise durch folgendes Reaktionsschema gezeigt wird: (R' = Veresterungsgruppe) Hydrolyse
- Solche Carboxylgruppen enthaltenden Präkursoren können in einfacher Weise, beispielsweise mit m-Aminophenylboronsäure (wie z.B. in obiger Weise beschrieben) umgesetzt werden, um Verbindungen (II) zu erhalten, die eine Amid-verknüpfte Phenylboronsäuregruppe enthalten.
- 2-Amino-Phenoxazin- oder Phenothiazin-Präkursoren, die beispielsweise gemäß obiger Sequenz (B) hergestellt wurden, können zum Beispiel diazotiert und anschließend mit einem Alkalimetallthiocyanat umgesetzt werden, um eine korrespondierende 2-Isothiocyanatoverbindung zu erhalten. Dieses Produkt kann mit einem nukleophilen Amin-haltigen Molekül umgesetzt werden, wie z.B. m- Aminophenylboronsäure, oder einem funktionalisierten Spacer, wie es beispielsweise durch eines der folgenden Reaktionsschemen gezeigt wird: (R' = Veresterungsgruppe)
- gefolgt von einer Hydrolyse unter Ausbildung einer Verbindung mit R' = H.
- 1- oder 4-Carboxy-Phenoxazin- oder Phenothiazin-Präkursoren, die beispielsweise gemäß Sequenz (C) hergestellt wurden, können beispielsweise direkt mit einer Aminophenylboronsäure in Gegenwart eines löslichen Carbodiimids umgesetzt werden oder können zunächst modifiziert werden, um einen funktionalisierten Spacer einzuführen, wie dies beispielsweise in folgendem Reaktionsschema gezeigt wird: (R' = Veresterungsgruppe) Hydrolyse
- 2-Acetyl-Phenoxazin- oder Phenothiazin-Präkursoren, die beispielsweise gemäß Sequenz (D) hergestellt wurden, können zum Beispiel einer Mannichreaktion unterzogen werden, um eine N- verknüpfte Spacergruppe einzuführen, wie dies beispielsweise in folgendem Reaktionsschema gezeigt wird: (R' = Veresterungsgruppe) Hydrolyse
- Phenoxazin- und Phenothiazin-Präkursoren, wie beispielsweise ein in herkömmlicher Weise hergestellter Phenothiazinfarbstoff, wie 3-Dimethylamino-7-dimethyliminophenothiazonium, können in ähnlicher Weise einer Mannichreaktion unterzogen werden, um eine Ring-Anlagerung einer amingruppenhaltigen, funktionalisierten Gruppe zu bewirken, wie z.B. unter Verwendung von m-Aminophenylboronsäure als Amin in der im folgenden Reaktionsschema gezeigten Weise:
- Die Beschaffenheit des aktivierten Restes, der in wenigstens einer der Gruppen R&sub1;-R&sub1;&sub0; vorliegt, ist natürlich abhängig von der Beschaffenheit der zu markierenden funktionalen Zielgruppe. Beispiele für aktivierte Derivate mit spezifischer Aktivität gegenüber Amingruppen umfassen zum Beispiel aktive N-Hydroxysuccinimidester, Imidoester, Isothiocyanate und Nitroarylhalogenide. Aktivierte Derivate mit spezifischer Reaktivität gegenüber Sulfhydrylgruppen umfassen Maleimide, Pyridyldisulfide, Thiophthalimide und aktive Halogenide. Umfaßt die funktionale Zielgruppe eine olefinische oder aromatische Kohlenstoff-Kohlenstoff- Doppelbindung, so können Carben-Präkursoren, wie zum Beispiel Diazoalkane und Diazirine, und Nitren-Präkursoren, wie Azide, nützliche aktive Gruppen darstellen.
- Die aktivierte Gruppe kann an den Rest des Phenoxazins oder Phenothiazins (II) entweder direkt, über eine Linker-Gruppe (die beispielsweise eine oder mehrere Amin- oder Amid-Gruppen enthält) oder über eine Spacer-Gruppe (wie z.B. aus dem Stand der Technik bekannt) gebunden werden.
- Diese Verbindungen (II) gemäß vorliegender Erfindung können aufgrund ihrer charakteristischen Absorptionsmaxima bei Wellenlängen oberhalb von 600 nm als Chromophore (und gegebenenfalls als Fluorophore) in einer Vielzahl von Markierungs-Anwendungen, insbesondere in Gegenwart von Hämoglobin und anderen herkömmlicherweise angetroffenen Substanzen mit spektroskopischer Wechselwirkung verwendet werden. Sie sind außerdem brauchbar im Rahmen von fluorometrischen Einfach- und Mehrfach-Markierungsmethoden, da deren Fluoreszenz-Emission im roten Bereich des Spektrums liegt, in dem die Hintergrund-Fluoreszenz weniger ausgeprägt ist. Folglich besitzen die Verbindungen brauchbare Anwendungsmöglichkeiten als Signal-erzeugende Moleküle in einem weiten Bereich von Assay-Techniken, die auf Absorptions-, Reflektions- und Fluoreszenz-Messungen basieren, insbesondere im Rahmen von Techniken, die Untersuchungen von Gesamtblut-Proben beinhalten. Sie sind außerdem brauchbar als Fluoreszenz-Sonden im Rahmen von Techniken, wie der Fluoreszenzmikroskopie, der fluorohistochemischen Untersuchung und der Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung und -analyse.
- Die Verbindungen (II) können erfindungsgemäß hergestellt werden durch Umsetzung eines entsprechenden Präkursors, so daß man das gewünschte aktive Molekül erhält. Beispielsweise kann ein Hydroxylgruppen-enthaltender Präkursor aktiviert werden durch Behandlung mit einem Reagens, wie zum Beispiel einem Cyanogenhalogenid, einem Triazin, einem Perjodat, einem Bisoxiran, Tresylchlorid oder Tosylchlorid. Ein Amingruppen-enthaltender Präkursor kann beispielsweise aktiviert werden durch Diazotierung oder durch Umsetzung mit einem bifunktionellen Agens, wie zum Beispiel einem Dialdehyd. Carboxylgruppen-haltige Präkursoren können beispielsweise aktiviert werden durch N-Hydroxysuccinimidester, Maleimide, Carbodiimide oder ein Carbonyldiimidazol oder mit Hilfe der gemischten Anhydridmethode.
- Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft außerdem die Verwendung der oben definierten Boronsäurekonjugate in einem Bluttestverfahren, wie es beispielsweise aus dem oben erwähnten Stand der Technik oder aus der WO-A-90/13818 bekannt ist.
- Die folgenden nicht-limitierenden Beispiele dienen der Veranschaulichung der Erfindung:
- Ein Gemisch aus 100 g m-Aminophenol und 150 g Ameisensäure wurde 1,5 Stunden auf Rückflußtemperatur erhitzt und anschließend zur Trockene unter verringertem Druck (90-95ºC, 10-15 mm Hg) eingedampft. Festes Material wurde bei 100ºC, 10 mm Hg 1,5 Stunden getrocknet. 117 g der Titelverbindung wurden isoliert, Schmelzpunkt 112ºC.
- Unter konstantem Rühren wurden 13,8 g des Produkts aus Stufe (a) portionsweise innerhalb von 1 Stunde zu einer Lösung von Lithiumaluminiumhydrid (9,5 g) in 180 ml trockenem Tetrahydrofuran bei 15-20ºC gegeben. Das Gemisch wurde 0,5 Stunden auf Rückflußtemperatur erhitzt, auf -5ºC abgekühlt und mit 385 ml 3N HCl langsam versetzt. Das Volumen der Aufschlämmung wurde auf 300 ml im Rotationsverdampfer bei 60-70ºC verringert, 400 ml Wasser wurden zugesetzt und der Niederschlag wurde erneut auf ein Endvolumen von 400 ml eingedampft. Zu der verbleibenden grauen Aufschlämmung wurden 2 g Aktivkohle und 10 g Celit zugesetzt. Das resultierende Gemisch wurde filtriert und anschließend wurden 60 ml 40 %ige NaOH zugesetzt. Schließlich wurde die Lösung zweimal, jeweils mit 100 ml Ether, extrahiert. Das Extrakt wurde zu einem viskosen Öl getrocknet und destilliert. 9,3 g der Titelverbindung, Siedepunkt 160ºC, wurden in Form eines viskosen Öls isoliert.
- Ein Gemisch aus 9,3 g des Produkts aus obiger Stufe (b), 27,4 g Ethyl-3-brompropionat, 12,6 g Natriumbicarbonat und 120 ml Aceton wurden 43 Stunden auf Rückflußtemperatur erhitzt. Eine weitere Portion von 27,4 g Ethyl-3-brompropionat wurde anschließend zugesetzt und die Lösung wurde weitere 72 Stunden auf Rückflußtemperatur erhitzt. Schließlich wurde die Lösung abgekühlt und filtriert. Das Filtrat wurde zur Trockene eingedampft (10 mm Hg, 85-90ºC). Der Rückstand wurde solubilisiert in 50 ml CHCl&sub3;:EtOAc 9:1. Nach Chromatographie über Kieselgel unter Verwendung von CHCl&sub3;:EtOAc 9:1 als Elutionsmittel wurden 3,8 g der Titelverbindung isoliert.
- Ein Gemisch aus 6,6 g des Produktes obiger Stufe (c), 4,5 g 4-Nitroso-N,N-dimethylanilin und 4,9 g Zinkchlorid in 88 ml Methanol wurden 3 Stunden auf Rückflußtemperatur erhitzt. Festes Material wurde abfiltriert, zweimal mit 25 ml Methanol gewaschen und bei 50ºC, 10 mm Hg getrocknet. Man erhielt 11,6 g der Titelverbindung.
- 1,0 g des Produktes aus obiger Stufe (d) wurden in 50 ml Essigsäure gelöst, auf 70ºC erhitzt und anschließend mit 180 mg NaNO&sub2; versetzt. Die Lösung wurde unter konstantem Rühren 6 Stunden bei 70ºC gehalten, anschließend abgekühlt und filtriert und zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in 40 ml H&sub2;O aufgelöst und filtriert. Schließlich wurde das Filtrat bei 60ºC, 10 mm Hg zur Trockene eingedampft. Man isolierte 0,6 g der Titelverbindung.
- Das Produkt aus obiger Stufe (e) wurde mit einer äquimolaren Menge von NaOH(aq) in 80 % Dioxan hydrolysiert und die Titelverbindung wurde durch Anionenaustauscherchromatographie isoliert.
- 9,0 mg (2,29 x 10&supmin;&sup5; mol) des Produkts aus obiger Stufe (f) wurden zu 1000 ul trockenem Dimethylformamid gegeben und die Lösung wurde auf -10ºC abgekühlt. N-Methylmorpholin (2,78 mg, 2,75 x 10&supmin;&sup5; mol) und Isobutylchlorformiat (3,76 mg, 2,75 x 10&supmin;&sup5; mol) wurden bei -10ºC zugesetzt und 0,5 Stunden in Eis inkubiert. m-Aminophenylboronsäure (14,2 mg, 9,17 x 10&supmin;&sup5; mol) und zusätzliches N-Methylmorpholin (2,78 mg, 2,75 x 10&supmin;&sup5; mol) wurden zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde 2 Stunden bei 4ºC und 4 Stunden bei Zimmertemperatur inkubiert. 4 mg Phenylboronsäure/Phenoxazin- Konjugat wurden durch Reversed Phase-Chromatographie isoliert. Das Absorptionsmaximum (λ max) des Produktes im sichtbaren Bereich des Spektrums wurde bei 642 nm aufgezeichnet, wobei der molare Extinktionskoeffizient (ε) bei > 70 000 1/mol.cm lag.
- a) Xylolcyanol, das durch folgende Formel dargestellt werden kann
- (75 mg, 80 %ige Reinheit, 1,11 x 10&supmin;&sup4; mol) wurde über Nacht bei 100ºC getrocknet. Phosphoroxychlorid (205 ul, 2,24 x 10&supmin;³ mol) wurde zugesetzt und das Gemisch wurde unter Feuchtigkeitsausschluß bei Zimmertemperatur inkubiert. Nach 24 Stunden bei dieser Temperatur wurde das Gemisch mehrere Male mit trockenem n-Hexan gewaschen, um ein unerwünschtes gelbes Reaktionsnebenprodukt und unumgesetztes Phosphoroxychlorid zu extrahieren. Nachdem der Hexanextrakt frei von Farbe war, wurde Chloroform zugesetzt, um das Xylolcyanol-Sulfonylchlorid zu extrahieren. Schließlich wurde der Chloroformextrakt (15 ml) fünfmal mit 1 ml-Portionen kalten Wassers gewaschen und anschließend unter vermindertem Druck und Feuchtigkeitsausschluß zur Trockene eingedampft.
- Das feste Material wurde unmittelbar anschließend in 200 ul N,N-Dimethylformamid (DMF) solubilisiert. Zu dieser Lösung gab man 3-Aminophenylboronsäure-monohydrat (17 mg, 1,10 x 10&supmin;&sup4; mol) in 100 ul DMF. Das Gemisch ließ man 5 Minuten stehen und gab anschließend 2 ml eines 0,75 M Natriumcarbonat/Natriumbicarbonatpuffers (pH 10,0) unter konstantem Rühren hinzu und inkubierte die Lösung 3-12 Stunden bei Zimmertemperatur. Der pH-Wert dieser Lösung wurde aufgezeichnet und zwischen 8 und 9,5 gehalten.
- Die Boronsäurekonjugate wurden durch Reversed Phase-Chromatographie isoliert, und zwar hauptsächlich in Form des Mono(phenylboronsäure)-funktionalisierten Farbstoffs, λ max 619 nm (ε > 70 000).
- b) Das Reaktionsprodukt aus Teil (a) dieses Beispiels wurde wiederholt, mit Ausnahme davon, daß 2-Nitro-5-aminophenylboronsäure-Monohydrat (22 mg, 1,1 x 10&supmin;&sup4; mol) anstelle von 3-Aminophenylboronsäure verwendet wurde. Man erhielt einen Mono(phenylboronsäure)-funktionalsierten Farbstoff mit ähnlichen spektroskopischen Eigenschaften wie das Produkt aus Teil (a).
- Chloraluminium-phthalocyanin-tetrasulfonat (100 mg, 1,12 x 10&supmin;&sup4; mol) wurde über Nacht bei 100ºC getrocknet. Phosphoroxychlorid (410 ul, 4,48 x 10&supmin;³ mol) wurde zugesetzt und das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur unter Feuchtigkeitsausschluß inkubiert. Nach 24 Stunden bei dieser Temperatur wurde das feste Material mehrere Male mit insgesamt 10 ml n-Hexan gewaschen, um nicht umgesetztes Phosphoroxychlorid zu entfernen.
- Das verbleibende, feste Phthalocyanin-Sulfonylchlorid wurde bei vermindertem Druck und unter Feuchtigkeitsausschluß getrocknet und anschließend sofort in DMF (500 ul) solubilisiert. Zu dieser Lösung gab man 3-Aminophenylboronsäure-monohydrat (20 mg, 1,29 x 10&supmin;&sup4; mol) in DMF (100 ul). Das Gemisch ließ man 5 Minuten stehen und gab anschließend 2 ml eines 0,75 M Natriumcarbonat/Natriumbicarbonatpuffers (pH 10,0) hinzu. Das Reaktionsgemisch wurde bei Zimmertemperatur unter konstantem Rühren 3-12 Stunden inkubiert. Während dieser Zeit wurde der pH-Wert der Lösung überwacht und bei 8 bis 9,5 gehalten. Die Boronsäurekonjugate wurden durch Reversed Phase-Chromatographie hauptsächlich in Form eines Mono (phenylboronsäure) -funktionalisierten Farbstoffs, λ max 676 nm (ε 160 000) isoliert.
- Phosphoroxychlorid (470 ul, 5,13 x 10&supmin;³ mol) wurde zu dem Cyaninfarbstoff 2-[7-[1,3-Dihydro-1,1-dimethyl-3-(4-sulfobutyl)2H-benz[e]indol-2-yliden]-1,3,5-heptatrienyl]-1,1-dimethyl-3-(4- sulfobutyl)-1H-benz[e]indoliumhydroxid, inneres Salz, Natriumsalz (im Handel bekannt als IR 125 oder Indocyaningrün) (100 mg, 1,29 x 10&supmin;&sup4; mol) gegeben und das resultierende Gemisch wurde unter Feuchtigkeitsausschluß 24 Stunden bei Zimmertemperatur inkubiert. Die dunkelbraune Lösung wurde anschließend über zerstoßenes Eis gegossen und darin 5 Minuten belassen. Das IR-125-Sulfonylchlorid wurde in Chloroform extrahiert und der Extrakt wurde fünfmal mit 1 ml-Portionen kalten Wassers gewaschen und anschließend bei vermindertem Druck unter Feuchtigkeitsausschluß zur Trockene eingedampft.
- Das resultierende feste Material wurde sofort in DMF (500 ul) solubilisiert. Zu dieser Lösung gab man 3-Aminophenylboronsäure-monohydrat (17 mg, 1,10 x 10&supmin;&sup4; mol) in DMF (100 ul). Das Gemisch ließ man 5 Minuten stehen und gab anschließend 2 ml 0,75 N Natriumcarbonat/Natriumbicarbonat-Puffer (pH 10,0) unter konstantem Rühren hinzu und inkubierte die Lösung bei Zimmertemperatur 3-12 Stunden. Während dieser Zeit wurde der pH-Wert der Lösung aufgezeichnet und zwischen 8 und 9,5 gehalten. Die Boronsäurekonjugate wurden durch Reversed Phase-Chromatographie überwiegend in Form des Mono(phenylboronsäure)-funktionalisierten Farbstoffs, λ max 799 nm (ε 200 000), isoliert.
- Zu dem reaktiven Succinimidylester-Cyaninfarbstoff Cy5,18 (1,3 x 10&supmin;&sup7; mol) gab man 2 mg 3-Aminophenylboronsäure in 0,5 ml 0,1 M Natriumcarbonat/Natriumbicarbonat-Puffer (pH 9,3). Anschließend wurde sorgfältig gemischt. Das Gemisch wurde unter konstantem Rühren 4 Stunden bei Zimmertemperatur inkubiert und das Phenylboronsäurekonjugat wurde schließlich durch Reversed Phase Chromatographie isoliert, λ max 652 nm (ε 200 000).
- Eine Gesamtblut-Probe wurde mit einem hämolysierenden Reaktionspuffer (pH 9,4), enthaltend 160 mM Piperazin, 0,07 % Triton X-100, 9,4 % Ethanol (v/v), 9,4 % Butanol (v/v) und Phthalocyanin-Boronsäurekonjugat, hergestellt wie in Beispiel 3 beschrieben, in einer Endkonzentration von 2 x 10&supmin;&sup6; M vermischt. Die Hämoglobinendkonzentration betrug etwa 2 mg/ml. Das Gesamtblut wurde hämolysiert und ein Niederschlag wurde gebildet. Das präzipitierte Hämoglobin wurde durch Filtration abgetrennt und dessen Reflektionskoeffizient wurde bei 685 und 470 nm mit Hilfe eines CS 9000 Schimadzu Dual Wavelength Flying Spot Scanner bestimmt. Das Verhältnis der Reflektionen bei 685 und 470 nm wurde berechnet und der Prozentsatz an glykosyliertem Hämoglobin bezogen auf Gesamthämoglobin wurde anhand einer Eichkurve bestimmt, die man unter Verwendung von Standardlösungen mit bekannten Konzentrationen an Hämoblobin und glykosyliertem Hämoglobin erhielt.
- Das Verfahren gemäß Beispiel 6 wurde wiederholt, mit Ausnahme davon, daß das Xylolcyanol-Boronsäurekonjugat, hergestellt gemäß Beispiel 2, in einer Konzentration von 2,1 x 10&supmin;&sup5; M anstelle des Phthalocyaninfarbstoffkonjugates verwendet wurde und daß die Reflektionskoeffizienten bei 635 und 470 nm bestimmt wurden.
Claims (9)
1. Nicht-proteinartige Boronsäurekonjugat-Verbindungen mit
einem Absorptionsmaximum bei nicht weniger als 600nm, wobei die
Verbindungen die Formel (I) besitzen
V - W - B(OH)&sub2; (I)
worin V ein Cyanin-, Phenoxazin-, Phenothiazin- oder
Triphenylmethanchromophor und/oder ein Fluorophorrest ist, der
ein Absorptionsmaximum bei nicht weniger als 600nm aufweist und
W eine organische Brückengruppe ist.
2. Verbindungen nach Anspruch 1, worin das Boratom an eine
Aminophenylgruppe angelagert ist, worin der Phenylring
gegebenenfalls weiter mit einem oder mehreren Substituenten,
ausgewählt unter Nitro-, Niedrigalkoxy- und Formylgruppen,
substituiert ist.
3. Verbindungen nach Anspruch 2, worin das Boratom an eine
m-Aminophenylgruppe angelagert ist.
4. Verbindungen nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
welche die Formel (II) besitzen
worin X für ein Sauerstoff- oder Schwefelatom steht; Y- für ein
Anion steht; und R&sub1;-R&sub1;&sub0; jeweils ausgewählt sind unter
Wasserstoffatomen und organischen Gruppen, oder R&sub1; und R&sub2;
und/oder R&sub9; und R&sub1;&sub0; zusammen mit den Kohlenstoffatomen, an die
sie gebunden sind, ein kondensiertes monocyclisches oder
polycyclisches Ringsystem bilden, mit der Maßgabe, daß
wenigstens einer der Reste R&sub3; und R&sub4; und wenigstens einer der
Reste R&sub7; und R&sub8; von Wasserstoff verschieden ist und daß
wenigstens einer der Reste R&sub1;-R&sub1;&sub0; eine organische Gruppe ist,
die einen Boronsäurerest enthält.
5. Verbindungen nach Anspruch 4, worin die durch R&sub1;-R&sub1;&sub0;
dargestellten organischen Gruppen umfassen: Alkyl-,
Alkenyloder Alkinylgruppen mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen; C&sub5;&submin;&sub7;-
Cycloalkyl- oder -Cycloalkenylgruppen; C&sub6;&submin;&sub1;&sub2;-Arylgruppen; 5-7-
gliedrige gesättigte oder ungesättigte heterocyclische Ringe,
welche wenigstens ein Heteroatom, ausgewählt unter Sauerstoff,
Stickstoff und Schwefel, enthalten; C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylgruppen,
substituiert durch eine oder mehrere Cycloalkyl-,
Cycloalkenyl-, Aryl- oder heterocyclische Gruppen wie oben
definiert; wobei jede der vorhergehenden Gruppen durch ein oder
mehrere Heteroatome unterbrochen und/oder substituiert sein
kann; oder wobei jede der vorhergehenden Gruppen einen oder
mehrere Substituenten trägt, ausgewählt unter Hydroxy,
Mercapto, Amino, Halo, Nitro, Azido, Carboxy, Cyano und
Isothiocyanato.
6. Verbindungen nach Anspruch 4, welche die Formel (III)
besitzen
worin X und Y&supmin; die in Anspruch 4 angegebenen Bedeutungen
besitzen, und die Reste R&sub1;&sub1; unabhängig voneinander eine
C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylgruppe bedeuten und R&sub1;&sub2; für eine organische Gruppe
steht, welche einen Boronsäurerest enthält.
7. Verbindungen gemäß Anspruch 4, welche die Formel (IV)
besitzen
worin X und Y die in Anspruch 4 angegebenen Bedeutungen
besitzen, die Reste R&sub1;&sub1; unabhängig voneinander für eine
C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylgruppe stehen und R&sub1;&sub3; für eine organische Gruppe steht,
die einen Boronsäurerest enthält.
8. Verfahren zur Herstellung eines Boronsäurekonjugates nach
Anspruch 1, wobei man einen geeigneten funktionalisierten
Cyanin-, Azin- oder Triphenylmethanfarbstoff mit einem
Absorptionsmaximum von nicht weniger als 600nm mit einem oder
mehreren Reagenzien, welche der Einführung eines
Boronsäurerestes dienen, umsetzt.
9. Verwendung von Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis
7 in einem Bluttest-Verfahren.
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