JPH02226070A - 糖タンパク質の定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はジヒドロキシボリル基を利用して血液中の糖タ
ンパク質とくにグリコヘモグロビン、グリコアルブミン
の検出又は測定するための簡便な方法に関し、さらに糖
尿病患者の中期もしくは長期の血糖値の指標を得るため
の臨床検査システムに関するものである。

〔背景技術〕

生体成分を定量的に分析し、そのデータに基づいて病態
解析を行うといった臨床検査は今日ではきわめて日常的
に行なわれている。糖尿病の検査では通常血中もしくは
尿中の血糖値測定によｐ行なわれてきた。しかしな妙Ｓ
らこれらの方法ではきわめて短期の血糖値が判明するだ
けで、よυ長期の血糖値を測定する手段が望まれていた
。近年よシ長期の血糖値の情報を与えるものとしてグリ
コへモグロビ／が注目されている。グリコヘモグロビン
ハヘモグロビンとグルコースが非酵素的ＫＭ合したもの
で正常なヒトにおけるグリコヘモグロビン濃度は全ヘモ
グロビンのぶ〜り襲、糖尿病患者では２０％に達する場
合もある。ヘモグロビンの非酵素的グリコジル化は赤血
球の寿命である１００〜ｉｒｏ日のうちに起るためグリ
コヘモグロビンの測定は平均的な血中グルコース値を反
映する。

また同様に血中に存在するグリコアルブミンも同様にア
ルブミンとグルコースが非酵素的に結合し念ものである
がアルブミンの寿命はヘモグロビンに比べかなシ短く（
２０−３０日）、従ってグリコアルブミンの測定はより
短期の血糖値の情報を与える。

従って上記グリコジルタ／／蜜り質の精密な測定は臨床
的にきわめて重要である。

〔発明が解決すべき課題〕

現在用いられているグリコジルタンパク質の測定法はラ
ージカラム法、等電点電気泳動法、ＨＰＬＣ法、アフイ
ニテイクロマト法などがある。ラージカラム法は陽イオ
ン交換樹脂により荷電の差で定量する方法で、測定に長
時間要し多数の検体に不適当である。等電点電気泳動法
は等電点の差を利用して分離する方法であるが試料の前
処理が煩雑でかつ操作に熟練を要するなどの問題点があ
る。ＨＰＬＣ法は短時間で分離が可能で分離能も優れて
いるが装置が高価であるなど経済性が悪い。

アフイニテイクロマトグラフイー法はフェニルボラン酸
を担体に固足しシス−ジオール基をもつグリコジルタフ
、ｅり質のジヒドロキシボ乏ン酸への特異的結合を利用
しておシ、アミコン社及びピアス社より特許出願（英国
特許出願公開第コ、Ｏコグ、ｌ−タ号および米国特許第
参、−フタ、４０３号）され、かつキットも市販されて
いる。この方法は温度及び妨害物の影響などを受けにく
く、操作も比較的簡便であるが現状ではカラムのロット
差が大きい、高価なゲルを大量に使用する（コストが高
い）、自動化法がないなどの理由で日常検査法としては
普及していない。

上記で述べ±ジヒドロキシホウ酸を用いるアフイニテイ
クロマトグラフイー法は本質的に優れた方法であるがグ
リコヘモグロビンの吸着、及び脱着の一段階が必要とな
るので操作上の問題があり、この点が検査の自動化の防
げになっている。

〔課題を解決するための手段〕

アフイニティ法による一段階の操作の欠点を解決するた
めに種々の検討を加えた結果、ジヒドロキシメリル基を
固定した担体にジヒドロキシボリル基と可逆的に反応し
うる標識された化合物を予め結合させ、グリコジル化さ
れ九タンパク質の量に応じてジヒドロキシメリル基から
解離する該標識化合物を定量することによム上記課題が
解決できることを見出した。

すなわち、本発明はジヒドロキシメリル基を固定化した
担体とジヒドロキシボリル基と可逆的に反応することが
可能な標識化合物を共存させることにより得た反応剤に
糖タンパク質を接触させ、遊離した前記標識化合物の量
を測定することによｐ１該糖タンパク質を定量する方法
である。

上記の遊離した標識化合物の量の測定は、知られた量の
分析対象物（糖タンパク質）と上記ジヒドロキシボリル
基−標識化合物複合体との反応から標準曲線を得、この
曲線により未知！！度の分析対象物（糖タンパク質）の
濃度を内挿することにより答易に測定できる。

担体またはマトリックス材料としては、天然もしくは合
成重合体物質、特ＫＳ　例えばポリアクリル、商品名「
ウルトロゲル（Ｕｌ　ｔｒｏｇｅｌ　）　Ｊ　（Ｄよう
なアルガロースポリアクリルアミド共重合体、アルガロ
ース、アセチルセルロース、再生セルロースなどのセル
ロース誘導体、澱粉、デキストリンおよび交叉結合デキ
ストリ／、例えば商品名「セファデックス（Ｓｅｐｈａ
ｄｅｘ）Ｊのような遊離ヒドロキシ基を有する重合体、
ポリビニルアルコールのような親水性物質からなるもの
を用いることができる。重合体物質は交叉結合していて
もしていなくてもよい。または所望ならば化学的に変性
することもできる。その他に使用できる重合体物質とし
ては商品名「セファロース（Ｓｅｐｈａ−ｒｏｓｅ）ｊ
（アガロース）、商品名「セファクリル（Ｓｅｐｈａｃ
ｒｙＪ　）Ｊ　（デキストリ／とアクリルアミドの共重
合体）、商品名「ス７エロン（Ｓｐｈｅｒｏｎ）Ｊ　（
交叉重合したヒドロキシエチルメタクリレート）、米国
特許り、／≠３．−０３号に記載の「マトリックス・ベ
ル（ＭａｔｒｉｘＰｅｌ）ノＯ／およびノｏＪＪ、ナイ
ロン、セルロースアセテート、ポリエチレ／テレフタレ
ートのようなポリエステル、クロロメチル化ポリスチレ
ンのような置換交叉結合ポリスチレン、金属酸化物、親
水性有機重合体を被覆し次長孔性セラミックス、ガラス
などが挙げられる。

マトリックスまたＦｉ担体は、ビーズまたは織物シート
ｔたは他の適当な流込成型屯しくけ押し出し成型した形
態をとることができる。マトリックスに十分な機械的安
定性を付与するために１　ゲルチューブもしくはカラム
または平らな支持体もしくは成型可能な容器内に保持す
ることができる。

この方法はララムまたは他の技術を使用して連続的ま九
はパッチ式で実施することができる。

フェニルホロ／ｅｓはう酸またはエタンボロン酸、ノー
プロパンボロ／＠、Ｊ−メチル−／−ブタンボロン酸の
ような他のボロン酸を物理的または化学的手段によって
重合体マトリックスま九は他の適当な固体もしくＦｉ液
体担体に結合させることができる。ま几リガンドを水素
結合のような靜亀力または共有結合によって物理的ま之
は化学的にマトリックスまたは担体に保持させることも
できる。

フェニルボロ／酸、はう酸ま九は他のボロ／酸はそれが
ｖｋ続の反応の間ＶＣｆ、ロン酸のヒドロキシルを遊離
しないような状態でマトリックスに結合させることが望
ましい。必要に応じてマトリックスまたはジヒドロキシ
ボリルリガンドは、両者を結合させる前に活性化させる
ことができる。

ジヒドロキシボリルリガンドの結合に先立っての重合体
マトリックスの活性化は、次の物質および技術の使用に
よって可能である。これらの物質を使用する活性化の具
体的な方法は様々な文献に５マトリツクス上の官能基に
応じて記述されている。

（１，）　−〇　Ｈ基例えば多糖類 （ａ）シアンハロゲン化物 （ｂ）　トリアジ／ （Ｃ）過よう木酸塩酸化 （ｄ）　ｐ−ベンゾキノン （ｅ）ビスオキシラン （ｆ）ジビニルスルホン （纜エビクロロヒドリン （ｈ）クロロ酢酸及びハロアセチルハライド（ｉ）ｐ−
ニトロベンジルクロリド （２）−ＮＨ２基例えばポリアクリルアミド（ａ）アミ
ノエチル化 （ｂ）　ＣＯＯＨへの脱アミド （Ｃ）ヒドラジド （ｄ）グルタルアルデヒド （３）Ｓｉ−ＯＨＴｉ例えばガラス ＜ａ＞シラン化 （４）Ｃ００Ｈｉ９１１えばＣＭセルロース、「マドレ
ックス・ベル１０／」又は上記の（２バｂ）（ａ）　Ｎ
−ヒドロキシサクシ／イミドエステル（ｂ）コールドシ
ュタイ／の≠−七ントレ反応かかる方法は、多数の公知
文献にＵピ載されている。

重合体マトリクスへのジヒドロキシボリルリガンドの直
接的又は間接的結合は、以下に記載の反応を包含するこ
とができる。かかる反応は文献に記載されているが、こ
れらはリガンド及びマトリクス上の特有の官能基を利用
している。

（ａ）シアンハロゲン化物 Φ）カルボジイミド縮合 （１）Ｈ２０可溶性 （＋１））−１２０不溶性 （Ｃ）こはく酸無水物 （ｄ）二官能性薬剤 （ｅ）ジビニルスルホン （ｆンアリル・・ライド （リアルキルハライド （ｈ）Ｎ−（置換）ヒドロキシサクシンイミド反応（ｉ
）インチオシアネート （ｋＪデオール化 （監）エピクロロヒドリン （ｍ）過よう木酸塩酸化 （ｎ）混成無水物の形成 （０）還元アルキル化 （υアシル７ジド生成 間接的結合は、ジヒドロキシボリルリガンドとマトリク
ス又は担体との間のスイーサー（これは、親水性単量体
若しくは重合体（ポリエチレングリコール）、疎水性単
量体若しくは重合体（ポリエチレン又はポリエチレンイ
ミン）又は芳香族架橋あるいはそれらの組合せであって
よい〕を包含することができる。

また、ジヒドロキシボリル反応剤は、ボロン酸誘導体例
えばジヒドロキシボリルフェニルアクリルアミドを重合
させることＫよって作ることもできる。

本発明の方法ではジヒドロキシボリル担体は、例えばカ
ラムに充填できるイレットもしくは円柱状の形態で使用
することもできるし、試料溶液を多孔性のシートを通過
させることが可能な平膜状マトリックスの形態にするこ
ともできる。さらにデイツプステッキ、又はデイ−パッ
クのような多孔質の袋に収容された粒子の形態でもよい
。

標識化合物としては定量可能なものであればとくに制限
はないが例えば酵素、抗体、などのタンバク質、色素、
染料、ケイ元色素、放射性元素などと結合し７’ｔンス
ジオ一ル化合物が挙げられる。

シスジオール化合物の例としてはソルビトール、マンノ
ース、ガラクトース、フルクトース、リボース、グルコ
ン酸などの糖類、アデノシン、グアノシ／、シチジンな
どのヌクレオシド類などである。

標識化合物が酵素である場合、その酵素特有の反応を利
用して発色させることができる。とくに注目すべき方法
は酵素反応によって過酸化水素を発生させる系である。

例えばペルオキシダーゼ存在下にμｍアミノア／チビリ
ンと水素供与体としてフェノール、Ｎ、Ｎ−ジメチルア
ニリ／などを共存させることにより生成し次過散化水素
量に応じて弘−アミンアンチピリンと水素供与体との酸
化縮合反応が起シ色素全生成する。この呈色を測定する
ことによう定量が可能である。

標識化合物が色素もしくはその前駆体である場合、かか
る成分は当業者にとって周知のものであジアゾ、アゾメ
チ／、アゾビラゾロン、インドアニリン、インドフェノ
ール、アンスラキノ／、トリアリールメタン、アリザリ
／、メロシアニン、ニトロ、キノリン、シアニン、イン
ジゴイド、フタロシアニ／、金属錯体形成染料などを含
む、ま九色素前駆物質として種々のカプラー成分、例え
ばフェノール、ナフトール、インダシロン、ベンゾイル
アセトアニリド、ピパリルアセトアニリド、ピラゾロン
などの米国特許第コ、７１４．／≠−号に記載の化合物
であってもよい。標識化合物が色素もしくは色素前駆体
である場合好ましくは血奨成分と異なる色相すなわちＪ
ＯＯｎｒｎより長波長の化合物を選択することが望まし
い。

上記色素及びその前駆体とシス−ジオール化合物との結
合は通常の化学反応により容易に合成が可能である。例
えば色素のスルホニルクロリドとエチレンジアミンと反
応させることにより一級アミン基をもつ九色素を合成す
ることができる。このアミンとグルコースとの反応によ
シ、アマトリ転位を経て色素を標識したフルクトースを
合成することによシ下記ヌキームに従って合成できる。

Ｈ Ｈ マ几グルコン酸、カルボキシメチルガラク）−ス、カル
ボキシリボースなどのカルボキシル基をもつシスジオー
ル化合物ではアミノ基を持つ標識化合物と、例えばＤＣ
Ｃのような縮合剤を用いるととによ６８合することがで
きる。

ＳＷ＊化合物が酵素、抗体のようなタンパク質であるｊ
ｉｌ＃４同様にり／ノ噛り質Ｑアミノ基を利用すること
により合成することができる。

以下に本発明に使用し得る色素積繊シヌージオール化合
物ｔ−ガ示する。

化合物ｌ。

化合物よ 化合物ム 化合物ｌ 化合物２ ＨＯＨ 本発明はすでに記載した如く、不動化したジヒドロキシ
ボリル化合物と標識化合物との反応によって錯化したジ
ヒドロボリル化合物−標識化合物複合体に糖タ／バク質
を反応させることによって脱着し之標識化合物を測定す
ることによシ、糖り／ツク質を定量する方法を提供する
。従って本発明はグリコジル化タンパク質を定量するの
に好適で６９糖尿病患者の処置のモニターとして人間の
血中の糖タン−９り質の含量を迅速かつ簡便に測定する
のに有用である。

かかる方法に包含される工程は次のように要約すること
ができる。

（１）不動化したジヒドロボリル担体と標識化合物を反
応させた後、十分洗滌すること。

（２）（１）で得られ九ジヒドロボリルー標識化合物複
會体とグリコジル化タンパク質を含む試料溶液を反応さ
せること。

（３）上記反応で脱着し次標識化合物を適当な方法で定
量すること。

例えば簡単な実施態様を示すと、ジヒドロキシボリル基
を含む担体と青色色素で標識したフルクトースをあらか
じめ反応させ得られ九錯体をカラムに充填する。十分緩
衝液で洗滌したのち溶血し几赤血球をカラム上に展開し
緩衝液でで溶出させる。溶出液は血中のグリコヘモグロ
ビンの量に応じてＳ度を増すので、この溶出液の吸光度
を測定することにより定量することができる。好ましく
は第三成分として血液試料に対する醇解剤とじて例え＃
″ｊ（１）　、　／　％のサポニンを含有する溶液も含
まれる。

実施例１ ／２のＣＮＢｒ活性化セファロース（商品名ファルマシ
ア社製）を膨潤させ、ｏ、７Ｍ重炭酸塩（ｐＨ２）Ｍ衡
剤で洗滌した。次いで−ｒｘｌの０゜７Ｍ重炭酸塩（ｐ
Ｈり）緩衝剤中に溶解させたｍ−アミノフェニルホウ酸
Ｑ、／？の溶液に前記ＣＮＢｒ活性化セファロースを加
え≠６Ｃで７を時間反応させた。次いで未反応の７エニ
ルホウ酸をｐ）１７．０のリン酸ナトリウム緩衝液にて
洗滌によシ除去した（洗液のＵＶ吸収により監視）。

このフェニルホク酸結合セファロースをｐＨり。

Ｏの重炭酸緩衝液中に溶解させた標識化合物（化合物例
／）と反応させ７ｔｃｒ時間、室ｍ）。反応後ｐＨり、
０ｏ２炭酸緩衡液で洗滌した。（洗液が無色になる葦で
〕このグル担体をバスツールビイツトカラムに充填し念
。

静脈血／ｄをへ・ぞリンナトリクム管（チル七社製、ベ
ノジエクトＶＴ−ｏ３．２Ｈヘノリンナトリクムｊ　ｊ
　Ｉ　Ｕ／　ｔｕｂｅ含有）Ｋ採取し、その血液、２ｏ
ｏｐｉｌＫ生理食塩水／ｄ加え攪拌後ＪＯＯＯｒｐｍで
７０分間遠心を行い上清成分を除いた。

仁の操作を一度くり返し得られた洗浄赤血球成分に生理
食塩水／　ｍｌ加えて攪拌後再菫遠心後上清を除去し、
残った血球に溶血剤（０、／　Ｓ　Ｆｒ１ｔｏｎＸ）を
１０ｘｌ加えたものを試料とした。

前記のようにしてＩ！Ｉｌ！ｌたゲル担体を充填したパ
ヌツールピペット力ラムに上記試料／ｙｄ加え、さらに
コ１１のｐＨり、Ｏの炭酸塩緩衝液をカラムに通した。

溶出した液の全量を！ｄＫ調整した後＆３０ｎｍでの吸
光度を測定した。

別に知られた童の分析対象物との反応から得られた標準
臼ａを得、この曲線から求めた未知のグリコヘモグロビ
ン量を比較した結果、健常人と糖尿病患者とのグリコヘ
モグロビン量に明確な差が認められ、十分定量可能であ
ることが分った。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）ジヒドロキシボリル基を固定化した担体とジヒド
   ロキシボリル基と可逆的に反応することが可能な標識化
   合物を共存させることにより得た反応剤に糖タンパク質
   を接触させ遊離した前記標識化合物の量を測定すること
   を特徴とする糖タンパク質の定量方法。