JPS602040B2 - クレアチニンの測定方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はクレアチニンの測定方法に関するものである。

更に詳しくは、クレアチニンを分解する酵素、クレアチ
ニン、アミドヒドロラーゼ（以下ＣＮと略す）と、ＣＮ
の反応によって生成するクレアチンを分解する酵素、ク
レアチン・アミジノヒドロラーゼ（以下ＣＩと略す）と
の両方を同じ１種の不溶’性担体に固定化した不溶化酵
素とＣＩの反応によってて生成するザルコシンを分解す
る酵素、ザルコシン・オキシダ−ゼ（以下ＳＯと略す）
との併用により、クレアチニンを測定する方法に関する
ものである。クレアチニンはクレアチンの無水物であり
、筋肉組織ではクレアチン・リン酸から不可逆的かつ非
酵素的に脱水されて生じ、代謝終産物として腎糸球体を
通過し、尿細管で再及収されることなく排池されている
。

したがって尿毒症、懐性腎炎、尿路閉塞などの啓機能疾
患の時には、クレアチニンを正常に擬池できずに、血清
中にクレアチニンが増加してくることになる。このよう
にクレアチニンの検査は、腎臓疾患の重要な検査項目で
あり、その検体数は年々増加の一途をたどっている。従
来、クレアチニンの測定はほとんどャツフェ法に基づく
ものであり、この方法はクレアチニンを水酸化ナトリウ
ムとピクリン酸で呈色させ定量するもので、安価に分析
できるよい点はあるが、反面、非特異的呈色反応である
ため、血清中の各種の成分の影響を受けること、感渡も
あまり高くないため、血清の使用量を多くする必要があ
ること、また除タンパク操作を行う必要が多く、接作が
煩雑であること多くの欠点がある。

最近、これらの欠点を克服するために、クレアチニンを
酵素的に定量する各種の方法が試みられるようになった
。

前記ＣＮ，ＣＩ，ＳＯを用いるクレアチニンの測定法も
そのひとつであるが、これらの酵素を可溶性の状態で使
用すると、酵素は使い捨てであるため、検体当りのコス
トが高くなること、血清に添加した場合反応が終了する
まで長時間かかること、また反応で生成するホルムアル
デヒドを４ーアミノ−３−ヒドラジノー５−メルカプト
ー１，２，４ートリアゾール（ＡＨＭＴ）という試薬で
呈色させて測定するため、発泡が激しく自動化に通さな
いことなど多くの欠点があった。またその他の酵素的測
定方法も、酵素が高価で不安定であるとか、感度が低い
とか、操作に長時間を要するとか、それぞれ一長一短が
あり、満足できる酵素的測定法はいまだ無いと言ってよ
い。本発明者らは、前記ＣＮ，ＣＩ，ＳＯを用いるクレ
ァチニンの酵素的測定方法について、種々研究を重ねた
結果、ＣＮ，ＣＩの両酵素を同じ不落性担体に固定した
不落化酵素とＳＯを試料に作用させ、消費される酵素又
は生成した過酸化水素を測定することにより、クレアチ
ニンを特異的に、数分という短時間で、しかも感度も高
く、コストも安価で自動化も容易であるという方法の開
発に成功したのである。

本発明によれば、クレアチニンを含有する試料の徴量を
、たとえばマイクロシリンジのようなもので、前記不溶
イ技酵素を充填したマイクロカラムに注入すれば、数分
後にクレアチニン値が得られるのである。

本発明方法は、クレアチニンを含むすべての試料に適用
できるが、血液および尿中のクレアチニンの定量におい
てより好適に用いることができる。

血液中クレアチニンを定量するには、血液を２５００〜
３００仇．ｐ．ｍで分離して血清を採取し、この血清を
試料として供する。尿の場合は、尿をそのままか、ある
いは水で適当な濃度に稀釈して試料に供する。次に本発
明を更に具体的に説明する。

本発明において酵素の不溶化に使用される不溶性担体と
しては、たとえばシリカゲル、グラスビーズ、イオン交
換樹脂のような粒状の担体があり、水に不綾性であれば
どのような物でもよいが、特に粒度としては４０〜１０
０メッシュぐらい粒状担体が適当である。

粒度がこれより大きいと、固定化のための表面積が少な
くなり不利であるし、これより細かいと血清などを通液
した時に詰まる恐れがあるからである。不溶性担体とし
ては、シリコーンゴム、メチルメタクリレートあるいは
アセチルセルロ−スなどの膜を用いてもよい。これらの
不落性担体に酵素を固定化するには、公知の方法を使用
することができる。たとえば、シリカゲル、グラスビー
ズなどであれば種々の有機シラン剤を用いてァミノ基な
どの官能基を導入し、しかるのち、グルタルアルデヒド
、カルボジイミド、ヘキサメチレンジイソシアネートな
どの二官能性試薬を用いて酵素を共有結合させることが
できる。ここで有機シラン剤としてはｙ−クロロプロピ
ルトリメトキシシラン、ｙーメルカプトプロピルトリメ
トキシシラン、ｙーアミノプロピルトリエトキシシラン
などが用いられる。また不溶性担体がイオン交換樹脂の
ような物であれば、酵素を及着させるだけでも固定化で
きるが、好ましくは樹脂表面の種々の官能基を活性化し
て酵素を共有結合させる方がよい。たとえばアンバーラ
イトＸＥ−６４ アンバーライトＩＲＣ−５０などのカ
ルボキシル基を塩化チオニルで活性化すると容易に酵素
が結合される。ＣＮ，ＣＩをこれらの不溶性粒状担体に
固定化させる場合において、ＣＮ，ＣＩをそれぞれ別々
の不瀞性粒状迫体に固定化して、それぞれの不落化酵素
を後で混合して使うとか、あるいはそれぞれの不溶化酵
素を直列的に配置して使うとかすると、クレアチニンの
分解効率が極端に悪くなり、感度が低下する。

というのはＣＮ‘こよるクレアチニンからクレァチンへ
の変換反応は平衡反応であって、しかも平衡定数が１．
５と大きく、反応は容易にクレアチン生成の方向には進
行しない。そこで本発明者らはＣＮ，ＣＩの両酵素を同
じひとつの不溶性粒状担体上に固定化させることにより
、ＣＮの反応により生成するクレアチンは直ちにＣＩに
よりサルコシンへと分解されるため、全体として反応は
クレアチン生成の方向へ懐くことになり、クレアチニン
の分解効率が良くなり、感度が上昇することを見出し、
本発明を完成したのである。次にＣＮ，ＣＩの両酵素を
固定化する場合のより具体的な方法について、前記不溶
性流状担体のち、たとえばグラスビーズを用いた場合に
ついて説明する。まず４０〜１００メッシュに破砕、ふ
るい分けしたグラスビーズに、ｙーアミノプロピルトリ
エトキシシラン剤を加えて７０ｏｏ〜１００ｑｏで反応
させた後、よく水洗し乾燥する。

次にこのアミノプロピル化ビーズにグルタルアルデヒド
を加えてよく蝿拝し、過剰のアルデヒド‘ま洗浄して除
く。この活性化したグラスビーズにＣＩを水または緩衝
液に溶解して添加し、０℃〜１ぴ○で反応させＣＩを結
合させる。次に余剰のＣＩを水で洗浄して除いた後、Ｃ
Ｎを同様にして添加し、０℃〜１０ｑｏで結合させる。
最後に水洗して、得られたＣＮ−ＣＩ不溶化酵素ビーズ
は緩衝液中に懸濁して保存存する。ここでＣＮ，ＣＩを
結合させる順序は、ＣＮが先であってもよく、両酵素を
同時に溶解して結合させてもかまわないが、蛋白量の比
として、ＣＮＩ部に対してＣＩ５〜１５部が通である。
次にかくして得られたＣＮ、ＣＩ不溶イ技酵素とＳＯと
を用いてクレアチニンを測定する方法についてより具体
的に説明する。

まず、ＣＮ，ＣＩ不落化酵素を内径２豚、長さ５肌程度
のガラスカラムに充填し、これに緩衡液を一定の流速で
流しておく。

緩衡液としてはどのようなものでもよいが、より好適に
は６．５〜８．０のｐＨ範囲にある緩衝液が選ばれる。
餌がこの範囲より高くしても、低くしても酵素反応は円
滑に進行しない。次にこのカラムは３ぴ○〜４び○の範
囲の環境下に置く。温度が３０ｑｏより低いと酵素反応
速度は低下するし、４０ｑｏより高いと不溶化酵素の安
定性が悪くなり寿命が短かくなるからである。さて、こ
のＣＮ，ＣＩ不溶化酵素カラムに、カラム入口手前に設
けた注入口より、クレアチニンを含む試料をマイクロシ
リンジなどで注入すると、カラム内でクレァチニンは次
のように変換される。クレアチニン２９クレアチンＣＩ
ザルコシンここで生成するザルコシンに酵素ＳＯを作用
させると次のような反応が起る。

ザルコシン十日２０十０２２９ グリシン＋ホルムアルデヒド十日２０２ したがって、ＣＮ，ＣＩ不溶化酵素カラムを通過した液
にＳＯを添加して、生成する過酸化水素（日２０２）を
公知の発色剤で発色させると、その発色程度は試料中の
クレアチニンの濃度に比例することとなり、クレアチニ
ンが測定できる。

ここで言う公知の発色剤とは、日２０２を発色させるな
らば、ベルオキシダーゼと４ーアミノアンチピリンとフ
ェノールなどであり、これらは臨床検査分野において極
めてよく知られた試薬である。しかしながら、上記の如
く、ＳＯを可溶性の状態で反応液に添加して、公知の発
色剤で発色させ、クレアチニンを測定するのは、ＳＯが
使い捨てであること、自動化が難しいこと、さらに最大
の欠点である感度が低いことなどのために、最良とは言
い難い。

つまり本発明をより好適に実施するためには、ＳＯも不
溶性粒状担体に固定化し、ＳＯ不落化酵素カラムを先に
述べたＣＮ，ＣＩ不溶化酵素カラムに連結し、クレアチ
ニンの連続分解反応を行わしめ、ＳＯ不溶化酵素カラム
内で、反応によって消費される酸素量を酸素電極で測定
するか、あるいは同じ反応によって生成する過酸化水素
の量を過酸化水素電極で測定するのが良い。

要するに試料中のクレアチニンをＣＮ，ＣＩ不溶化酵素
カラム及びＳＯ不落化酵素カラムの２個のカラムで分解
し、反応で減少する酵素の量か、あるいは生成する過酸
化水素の量をそれぞれの電極で測定すれば、その際電極
で発生する電流量は試料中のクレアチニン濃度に比例し
、クレアチニンが測定できるのである。このように反応
に関与する物質の量を電極で捕えることにより、高感度
で、しかも短時間に、徴量の試料で測定が可能となるの
である。さらに不溶化酵素を用いることにより、繰返し
測定ができ、１検体当りのコストが安くなるのは言うま
でもない。ここでＳＯの固定化に使用される不縁性粒状
担体は、ＣＮ，ＣＩの固定化に使用された不溶性粒状担
体と全く同じものであってよいし、別の種類の不綾性粒
状担体でもよく、また当然ながら、ＣＮ，ＣＩが固定化
された不溶性粒状担体上にさらにＳＯが固定化されてい
てもよく、ＣＮ，ＣＩ固定イＧ物とＳＯ固定化物を混合
して用いても良い。ＳＯの固定化の方法は既に述べたよ
うな手法で充分固定化できる。また酸素電極及び過酸化
水素電極は市販の電極を用いることができ、これらの電
極を実際に使用するに際しては、それぞれの電極の先端
検出部に、カラムを通過した反応液がスムーズに流れる
ように細工を施したフローセルを取付けて使用する。ま
たそれぞれの電極表面と反応液とは、それぞれ酸素透過
性テフロン膜、過酸化水素選択性透過膜を介して接触す
るようになっていて、電極反応を妨害する成分は通過さ
せないようにして用いる。次に実施例を挙げて本発明を
具体的に説明する。

実施例 １ ４０〜１００メッシュのグラスビーズ聡をよく水で洗浄
し、１の重量パーセントのｙーアミノプロピルトリェキ
シシラン溶液５雌を加えて７５ｑｏで３時間反応させる
。

反応後、充分水洗し、乾燥してァミノプロピル化ビーズ
を得た。このアミノプロピル化ビーズ１ｇに５％グルタ
ルアルデヒド溶液を５の‘加えて、室温で２０分間反応
させた後、水洗し、クレアチン、アミジノヒドロラーゼ
（ＣＩ、東洋紡簿製）１００腿を０．０８Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７．５）３の‘に溶解して加えた。４℃で１餌
時間縄拝した後、リン酸緩衝液で洗浄し、続いてクレア
チニン・アミドヒドロラーゼ（ＣＮ、東洋紡績製）１０
雌を０．０９Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）３の【に溶
解して加え、３７ｏ０で３時間反応させ、リン酸緩衝液
で洗浄して、ＣＮ，ＣＩ不熔化酵素を得た。

このものはＣＩ活性、２２１単位／ｇ、ＣＮ活性、５１
５単位／ｇの活性を保持していた。同様にしてザルコシ
ン・オキシダーゼ（Ｓ０、盛進製薬製）をアミノプロピ
ル化ビーズに固定化し、８．５単位／ｇの活性を有する
ＳＯ不熔化酵素を得た。次にこれらの不溶化酵素各１０
０の９を内径２．５側、長さ６伽のガラスカラムに充填
し、それぞれのカラムをシリコンチューフで連結し、３
９０の恒温槽内に設置し、カラムの出口にはフローセル
を取付けた酸素電極を配置し、０．０８Ｍのリン酸緩衝
液（ｐＨ７．５）流連１の‘／分で経路内に流した。こ
のようにしておいて、試料としてクレアチニン標準液（
１〜１０の９／ｄそ）、及び管理血清を、カラム入口手
前に設けた注入口より、マイクロシリンジにて２０仏そ
注入し、電極に発生する電流値を読み取り、クレアチニ
ン値を測定した。この時のクレアチニン濃度と電流値と
の関係を示す標準曲線を第１図に示す。また管理血清を
試料とした場合の測定値の再現性は第１表に示す通りで
あった。またこの装置において、不溶化酵素が劣化して
感度が低下し、測定不能になるまで約２０００回の測定
が可能であった。第１表 管理血清でのクレァチニンの
測定値実施例 ２４０〜８０メッシュのアンバーライト
ｍＣ−５０（オルガノ株式会社製）滋に塩化チオニル溶
液滋を加えて、室温で２独特間反応させた後、よく水洗
した。

このものにＣＩ（東洋紡額製）９０雌、ＣＮ（東洋紡績
製）１物ｃを０．０５のリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１
０泌に溶解して加え、０℃にて２拍時間反応させた後、
リン酸緩衝液にて洗浄し、ＣＮ，ＣＩ不落化酵素を得た
。このものはＣＩ活性１２６単位／ｇ、ＣＮ活性３１５
単位／ｇの活性を保持している。このＣＮ，ＣＩ不溶イ
Ｑ酵素と実施例１で得たＳＯ不溶化酵素とを各１００の
９、内径２．５肋、長さ６弧のガラスカラムに充填し、
それぞれカラムをシリコンチューブで連結し、３５℃の
陣温槽内に設置した。カラムの出口にはフローセルを取
付けた過酸化水素電極を配置し、０．０９Ｍのリン酸緩
衝液（ｐＨ７．５）を流速１泌／分で経路内に流した。
このようにしておいて、試料として、クレアチニン標準
液（１〜１０の９／ｄそｚ）、及び管理血清を、カラム
入口手前に設けた注入口より、マイクロシリンジにて５
０山そ注入し、電極に発生する電流値を読み取り、クレ
アチニン値を測定した。この時のクレアチニン濃度と電
流値との関係を示す標準曲線を第２図に示す。また管理
血清を試料とした場合の測定値の再現性は第２表に示す
通りであった。またこの装置において、不溶化酵素が劣
化して感度が低下し、測定不能になるまで約１５００回
の測定が可能であった。第２表 管理血清でのクレァチ
ニンの測定値実施例 ３アセチルセルロース滋、アセト
ン３０肌、シクロヘキサノン２０泌から成る溶液を水平
に支持したガラス板上にナイフコーターを用いて８００
仏ｍの厚さに流延した。

１０分間室温で溶媒の一部を蒸発させた後、大過剰のｎ
ーヘキサン中に浸潰し、２時間溶媒を抽出した。風乾し
て厚さ１２．８仏ｍの白色半透明のアセチルセルロース
膜（以下ＣＡ膜と略す）を得た。このＣＡ膜を１０伽×
１０肌のガラス坂上に保持し、アクロレィン５容量％及
び硝酸第２セリウムアンモニウム塩１．５×１０−８モ
ルノ〆を溶解した水溶液５０叫を接触させ、Ｎ２置換後
密閉して８ｙｏで５時間グラフト重合させた。反応後水
で洗浄して、グラフト率８．８％のグラフト重合ＣＡ膜
を得た。次にこの膜のグラフト重合側の面に、クレアチ
ニン・アミドヒドロラーゼ（ＣＮ、（東洋紡績製）５雌
、クレアチン・アミジノヒドロラーゼ（ＣＩ、東洋紡績
製）５のｃ、ザルコシン１オキシダーゼ（Ｓ０、盛進製
薬製）７雌、および牛血清アルブミン（シグマ社製）１
０のｃ、０．０９Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）２００
仏夕より成る酵素溶液を均一に流延した。水平に保って
４℃で９劉時間反応させた。０．脚Ｍリン酸緩衝液で洗
浄して、不溶性のＣＡ膜担体のグラフト重合側面に酵素
が結合した、ＣＮ，ＣＩ，ＳＯ不溶イ技酵素１を得た。

同様にして、上記の酵素溶液の組成からＣＮのみを除い
て、ＣＩ，ＳＯ不溶化酵素膜０を得た。この不溶化酵素
膜１，ロを、酵素面が試料液に接するように２本の過酸
化水素電極にそれぞれ装着し、３ヂ０、餌７．５の０．
０９ Ｍリン酸緩衝液１．０羽を入れたセルに両電極を
浸潰した。

不落化酵素膜日を付けた電極は体照電極で、このように
して血液中にわずかに存在するクレアチンに対する応答
値を読み取り、ブランク値として、不溶イ控酵素膜１を
付けた測定電極の応答値から、前記の応答値を差引〈こ
とにより、より精度よく、血液中クレアチニン値を測定
することができた。測定は前記のセルに、クレアチニン
標準液（１〜１０のｃ／ｄ夕）、あるいは管理血清を試
料として、セル内を燈拝しながら、マイクロピペットを
用いて、５０メタ注入し、電極に発生する電流値を読み
取ることにより行なった。この時のクレアチニン濃度と
電流値との関係を示す標準曲線を第４図に示す。また管
理血清を試料とした場合の測定値の再現性は第３表に示
す通りであった。またこの装置において、不落イ協酵素
膜が劣化して感度が低下し、測定不能になるまで約１５
００回の測定が可能であった。第３表 管理血清でのク
レァチニンの測定値

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の実施例１におけるクレアチニン濃度と
電流値の関係を示す標準曲線、第２図は実施例２におけ
る標準曲線である。 また第３図は本発明における測定システムの概略図を示
し、１はＣＮ，ＣＩ不溶化酵素カラム、２はＳＯ不溶化
酵素カラム、３はカラムを収容する恒温槽で、５が電極
、４は電極に取付けられたフローセルであり、９，１０
はそれぞれ電流計と記録計である。 また６は試料注入口、７は送液ポンプ、８は緩衝液ボト
ルを示す。第４図は本発明の実施例３におけるクレアチ
ニン濃度と電流値の関係を示す標準曲線である。 第１図第２図 廉３図 ※ム遡

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 不溶性担体にクレアチニン・アミドヒドロラーゼと
   クレアチン・アミジノヒドロラーゼの両方を固定して成
   るクレアチニン測定用の不溶化酵素とザルコシン・オキ
   シダーゼとを試料に作用させ、反応で消化される酸素又
   は生成した過酸化水素を測定することを特徴とするクレ
   アチニンの測定方法。 ２ ザルコシン・オキシダーゼがクレアチニン・アミド
   ヒドロラーゼとクレアチン・アミジノヒドロラーゼの両
   方を固定化して成る不溶性担体に固定化されていること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項記載のクレアチニン
   の測定方法。 ３ 生成した過酸化水素を過酸化水素電極により測定す
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のクレア
   チニンの測定方法。